PL208421B1 - Nowy szczep Bifidobacterium longum - Google Patents
Nowy szczep Bifidobacterium longumInfo
- Publication number
- PL208421B1 PL208421B1 PL380803A PL38080306A PL208421B1 PL 208421 B1 PL208421 B1 PL 208421B1 PL 380803 A PL380803 A PL 380803A PL 38080306 A PL38080306 A PL 38080306A PL 208421 B1 PL208421 B1 PL 208421B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- strain
- bifidobacterium longum
- bifidobacterium
- strains
- longum
- Prior art date
Links
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 title claims description 37
- 229940009291 bifidobacterium longum Drugs 0.000 title claims description 32
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 9
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 4
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 4
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 4
- 239000012983 Dulbecco’s minimal essential medium Substances 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 2
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- WZRJTRPJURQBRM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-n-(5-methyl-1,2-oxazol-3-yl)benzenesulfonamide;5-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methyl]pyrimidine-2,4-diamine Chemical compound O1C(C)=CC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1.COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 WZRJTRPJURQBRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 1
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 1
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 description 1
- 241000917009 Lactobacillus rhamnosus GG Species 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000607760 Shigella sonnei Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 229940125714 antidiarrheal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003793 antidiarrheal agent Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- QYIYFLOTGYLRGG-GPCCPHFNSA-N cefaclor Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3C(=C(Cl)CS[C@@H]32)C(O)=O)=O)N)=CC=CC=C1 QYIYFLOTGYLRGG-GPCCPHFNSA-N 0.000 description 1
- 229960005361 cefaclor Drugs 0.000 description 1
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 1
- 229960002227 clindamycin Drugs 0.000 description 1
- KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N clindamycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@H](C)Cl)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N 0.000 description 1
- 229940047766 co-trimoxazole Drugs 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 210000005095 gastrointestinal system Anatomy 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 1
- 229940059406 lactobacillus rhamnosus gg Drugs 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229960000282 metronidazole Drugs 0.000 description 1
- VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N metronidazole Chemical compound CC1=NC=C([N+]([O-])=O)N1CCO VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 235000018343 nutrient deficiency Nutrition 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940115939 shigella sonnei Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013334 tissue model Methods 0.000 description 1
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O vancomycin(1+) Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C([O-])=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)[NH2+]C)[C@H]1C[C@](C)([NH3+])[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Bifidobacterium longum.
Znany jest z europejskiego opisu patentowego EP 1609852 nowy szczep Bifidobacterium longum LMG P-21587. Szczep ten stosuje się jako probiotyk do wytwarzania preparatów farmaceutycznych wspierających leczenie przewodu pokarmowego.
Znany jest z amerykańskiego opisu patentowego nr US 2005164368 nowy szczep Bifidobacterium longum AR81(KCCM-10492). Szczep posiada właściwości hamowania rozwoju rotawirusa.
W polskim opisie patentowym nr 175639 opisano szczep Bifidobacterium longum CNCM I-1228. Szczep bakterii Bifidobacterium longum CNCM I-1228 został wybrany ze względu na powinowactwo do zagnieżdżenia się we florze jelitowej. Posiada on zdolność przylegania do komórek jelitowych, eliminowania bakterii chorobotwórczych z komórek jelitowych i do immunomodulacji. Powyższy szczep przeznaczony jest do leczenia układu żołądkowo jelitowego, zwłaszcza jako środek przeciwbiegunkowy.
Celem wynalazku jest wyselekcjonowanie bakterii z rodzaju Bifidobacterium o silnych właściwościach probiotycznych. Szczep powinien poprzez swoje potwierdzone bardzo dobre właściwości probiotyczne posiadać silniejsze oddziaływanie na przewód pokarmowy niż szczepy stosowane obecnie.
Istotą wynalazku jest nowy szczep Bifidobacterium longum PL03 PCM B/00013.
1. Identyfikacja szczepów.
Nowy szczep Bifidobacterium longum pochodzi z przewodu pokarmowego zdrowych noworodków karmionych mlekiem matki. Szczep został zdeponowany zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk, 53-114 Wrocław, ul Rudolfa Weigla 12. Depozyt złożono w dniu 16.06 2005 r. Depozytowi nadano numer: Bifidobacterium longum PL03 - numer depozytu - B/00013.
2. Oznaczanie przynależności gatunkowej szczepu Bifidobacterium longum PL03.
Szczep poddany był szczegółowym badaniom potwierdzającym jego właściwości probiotyczne. W tym celu okreś lono jego przynale ż ność gatunkową metodami fenotypowymi (zestaw API 50CHL i API 20A) i genotypowymi (metoda PCR), ponadto wykonano dla szczepu sekwencjonowanie podjednostki 16S rRNA. Wykazano metodami fenotypowymi i genotypowymi, że należy do następującego gatunku: PL03 - Bifidobacterium longum
3. Oznaczanie antagonistycznych właściwości szczepu Bifidobacterium longum PL03 wobec typowych czynników patogennych przewodu pokarmowego za pomocą metody słupkowej.
Badanie antagonizmu przeprowadzono za pomocą metody słupkowej. Wybrano drobnoustroje wskaźnikowe (Tabela 1), które stanowią tlenowe i beztlenowe czynniki patogenne zakażeń ludzkiego przewodu pokarmowego, oraz stanowią element składowy lokalnej flory przewodu pokarmowego (wybrane gatunki Lactobacillus i Bifidobacterium).
T a b e l a 1: Antagonizm szczepu Bifidobacterium longum PL03 względem szczepów wskaźnikowych.
| Szczepy wskaźnikowe | Strefa zahamowania wzrostu (skala zahamowania wzrostu) |
| Stapylococcus aureus ATTC 25923 | 14 mm / 1 |
| Salmonella enteritidis | 17 mm / 2 |
| Shigella sonnei | 25 mm / 3 |
| Lactobacillus rhamnosus GG | 10 mm / 1 |
| Lactobacillus plantarum DSMZ 20174 | 10 mm / 1 |
| Bifidobacterium longum DSMZ 20219 | 10 mm / 1 |
| Campylobacter jejuni ATCC 29428 | 22 mm / 3 |
| Helicobacter pylori DSMZ 4867 | 20 mm / 2 |
| Clostridium difficile | 17 mm / 2 |
PL 208 421 B1
Skala zahamowania wzrostu:
- Ś rednica strefy zahamowania wynosi: 12-16 mm 2 - Ś rednica strefy zahamowania wynosi: 17-21 mm 3 - Ś rednica strefy zahamowania wynosi: 22-26 mm 4 - Ś rednica strefy zahamowania wynosi: 27-35 mm
Badany szczep wykazuje silne antagonistyczne właściwości wobec bakterii wskaźnikowych należących do rodzajów: Campylobacter i Shigella, zaś średnie antagonistyczne właściwości zaznaczają się wobec rodzajów: Clostridium, Salmonella i Helicobacter. Ponadto wykazano brak hamujących aktywności badanego szczepu wobec bakterii z rodzaju Lactobacillus Staphylococcus i innych bakterii z rodzaju Bifidobacterium (skala zahamowania wzrostu równa 1).
4. Oznaczanie właściwości adherencyjnych szczepu Bifidobacterium longum PL03 do ludzkiej linii tkankowej HT-29MTX.
Właściwości adherencyjne szczepu Bifidobacterium longum PL03 zostały przeprowadzone na ludzkiej linii komórek jelitowych HT-29MTX. Działanie metotrexatu (MTX) indukuje tkankę HT-29 do wydzielania zwiększonej ilości śluzu, dzięki czemu ten model tkankowy bardziej przypomina naturalne właściwości jelita grubego zdrowego człowieka. Hodowlę tkankową prowadzono metodą wielokrotnych pasaży przez okres 20 dni do uzyskania jednolitej warstwy (monolayer). Stosowano podłoże DMEM (Dulbecco Minimal Essential Medium) (Gibco), wzbogacone dodatkiem 10% inaktywowanej, płodowej surowicy cielęcej. Ponadto, podłoże to zawierało 3 mM/ml L-glutaminy oraz antybiotyki:
100 μg/ml-1 streptomycyny i 100 U/ml-1 penicyliny. Hodowle prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze o zwiększonej wilgotności zawierającej 10% CO2, zmieniając podłoże odżywcze 2 razy w tygodniu. Zliofilizowany szczep Bifidobacterium longum PL03 zawieszano w 10 ml bulionu BL i inkubowano przez pół godziny w cieplarce, w temperaturze 37°C, a następnie sprawdzono gęstość szczepu za pomocą dziesiątkowych rozcieńczeń. Do testu adherencji pobrano 500 μl kompozycji szczepów o gęstości około 2x109 i 500 μl płynu hodowlanego DMEM. Tak przygotowany szczep dodawano do dołków zawierających komórki Ht-29MTX. Komórki linii tkankowej wraz z badanym szczepem inkubowano w temperaturze 37°C, w atmosferze wzbogaconej 10% CO2 przez 30 minut. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie PBS w celu usunięcia nie przyczepionych bakterii, a następnie utrwalano 3,7% formaldehydem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po utrwaleniu komórki ponownie przemywano PBS i barwiono fioletem krystalicznym przez 3 minuty. Preparat oceniano mikroskopowo przy powiększeniu 1000 x. Liczono komórki Bifidobacterium longum w 20 polach widzenia preparatu. Badanie adherencji szczepu do tkanki HT-29MTX było przeprowadzone dwukrotnie, a wynik zatem jest średnią powyższych badań.
T a b e l a 2. Wynik adherencji szczepu Bifidobacterium longum PL03 do ludzkiej linii tkankowej HT-29MTX.
| Badanie | Stopień adherencji |
| Badanie I | ++ |
| Badanie II | ++ |
Legenda dotycząca określenia stopnia adherencji do tkanki HT-29-MTX wg standardu wewnętrznego.
| Stopień adherencji | Liczba komórek bakteryjnych |
| +++ | Powyżej 80 |
| ++ | Zakres 60^80 |
| + | Zakres 40^60 |
| - | Poniżej 40 |
• Liczbę komórek bakteryjnych podaje się jako średnią z 20 pól widzenia w preparacie.
• HT29-MTX do badań stosuje się w postaci hodowli jednowarstwowej.
Średnia z 20 pól widzenia z dwóch badań zawiera się w zakresie 60^80 komórek bakteryjnych (++).
PL 208 421 B1
Zliofilizowanych szczep Bifidobacterium longum wykazuje duży stopień adherencji do ludzkiej linii komórkowej nabłonka jelitowego HT-29MTX. Tłumaczyć to można faktem, iż został on wyizolowany z normalnej mikroflory ustroju ludzkiego.
5. Oznaczanie oporności na antybiotyki szczepu Bifidobacterium longum PL03 za pomocą metody dyfuzyjno krążkowej.
Szczep Bifidibacterium oraz jego wzorzec posiewano metodą redukcyjną na płytki ze stałym podłożem BL, a następnie inkubowano w standardowych warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C przez 24 godz. Uzyskane w ten sposób pojedyncze kolonie zawieszano w 1 ml płynnego podłoża BL i inkubowano w tych samych warunkach przez 24 godz. Następnie przy wykorzystaniu soli fizjologicznej doprowadzano gęstość hodowli do 1,0 według skali McFarland'a dla szczepów Bifidibacterium. Tak przygotowane zawiesiny bakteryjne rozprowadzano przy użyciu jałowego wacika po całej powierzchni uprzednio przygotowanych płytek ze stałym podłożem BL w objętości 20 ml. Na płytki nakładano krążki nasycone antybiotykami, a następnie inkubowano w warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C przez 24 godz.
T a b e l a 3: Wrażliwość badanego szczepu Bifidobacterium longum PL03 na antybiotyki oznaczone metodą krążkową wobec szczepów kontrolnych.
| Antybiotyk Stężenie | B. longum ATCC 20219 | B. longum PL03 |
| Penicylina 10:L | 48 | 38 |
| Ciprofloksacyna 5:L | 18 | 13 |
| Cefaklor 30:L | 36 | 30 |
| Doksacyklina 30:L | 35 | 35 |
| Oksycylina 1:L | 12 | 9 |
| Kotrymoksazol 25:L | 6 | 6 |
| Erytromycyna 15:L | 40 | 44 |
| Ampicylina 10:L | 25 | 24 |
| Klindamycyna 2:L | 40 | 43 |
| Gentamycyna 10:L | 16 | 15 |
| Wankomycyna 30:L | 26 | 28 |
| Metronidazol 5:L | 22 | 25 |
Oporność szczepów bakterii probiotycznych na leki przeciwbakteryjne jest przedmiotem szczegółowych badań ze względów bezpieczeństwa przyszłych preparatów leczniczych. Chodzi tu głównie o mo ż liwość przeniesienia genów opornoś ci na antybiotyki z podanych w preparacie, ż ywych bakterii na inne składniki flory chorego i rozpowszechnienie genów oporności wśród składników normalnej flory, co może spowodować uniemożliwienie leczenia ewentualnych zakażeń tego chorego lub jego kontaktów. Bakterie z gatunku Bifidobacterium longum w porównaniu ze szczepem wzorcowym Bifidobacterium longum ATCC 20219 wykazuje dokładnie taki sam wzór oporności na antybiotyki, czyli jest to oporność gatunkowa.
Izolacja DNA chromosomalnego metodą kolumienkową
Na zdjęciu (a) widoczny prążek odpowiadający DNA chromosomalnemu (na wysokości prążka
23130pz markera wielkości λ/Hind III). Nie widać żadnych prążków poniżej ani powyżej DNA chromosomalnego, które mogłyby świadczyć o obecności DNA plazmidowego. Kontrolą pozytywną jest szczep L. rhamnosus u którego poniżej DNA chromosomalnego (prążek na wysokości 23130pz) widoczne są dodatkowe prążki świadczące o obecności DNA plazmidowego - zdjęcie (b).
PL 208 421 B1
Izolacja DNA plazmidowego wg metody O'Sullivan
Metoda używana do rodzaju Latobacillus i Lactococcus. Na zdjęciu (c) widać niewielkie ilości
DNA chromosomalnego (na wysokości prążka 23130pz markera wielkości λ/Hind III), które pozostało w trakcie izolacji DNA plazmidowego, nie widać prążków odpowiadających wielkością DNA plazmidowemu.
Lekooporność badanego szczepu Bifidobacterium longum PL03 reprezentuje wzór oporności typowy dla danego gatunku. Ponadto w wyniku zastosowania dwóch metod wykazano brak obecności dodatkowego prążka DNA (poniżej wysokości 23130pz) co może świadczyć o braku obecności DNA plazmidowego.
6. Oznaczenie oporności szczepu Bifidobacterium longum PL03 na niskie pH.
Badany szczep Bifidobacterium longum namnożono w płynnym podłożu BL. Hodowlę prowadzono w warunkach beztlenowych w 37°C przez 24 godziny, a po upływie tego czasu, za pomocą dziesiątkowych rozcieńczeń, określono uzyskaną gęstość poszczególnych bakterii. Następnie przy pomocy 1N HCl obniżano pH medium hodowlanego do wartości 1,2 równej wartości pH soku żołąd6
PL 208 421 B1 kowego. Hodowle dalej inkubowano przez 20 minut w warunkach beztlenowych w 37°C, a następnie ponownie ją wysiewano w celu określenia stopnia redukcji badanych populacji bakterii pod wpływem niskiego pH.
T a b e l a 4: Oporność szczepów Bifidobacterium na niskie pH.
| Gęstość bakterii podana w j.t.k./1 ml | ||
| Szczep | Czas wyjściowy | 20 min. inkubacji w pH 1.2 |
| Bifidobacterium longum 20219 | 1,5 x 108 | 8 x 106 |
| Bifidobacterium longum PL03 | 7 x 107 | 2 x 106 |
7. Oznaczanie oporności szczepu Bifidobacterium longum PL03 na sole żółci.
W celu oznaczenia opornoś ci badanego szczepu Bifidobacterium longum na sole ż ó ł ci posł u ż ono się metodą Dashkevicz'a i Feighner'a. Metoda ta polegała na dodaniu do agaru BL barwnika wskaźnikowego - purpury bromokrezolowej [POCH] w ilości 0,17 g/l oraz soli żółci [OXGAL firmy
Difco], w pięciu kolejnych stężeniach: 1 g/l, 2 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l. Na tak przygotowane, stałe podłoża BL posiewano metodą redukcyjną 100 μΐ hodowli badanych szczepów Bifidobacterium, które następnie inkubowano w standardowych warunkach beztlenowych przez 48 godz. Po zakończonej inkubacji kolonie szczepów opornych na dane stężenie soli żółci nabierały koloru jasno żółtego, jak również podłoże wzrostowe zmieniało swoje zabarwienie z fioletowego na żółte.
T a b e l a 5: Oporność szczepów Bifidobacterium na sole żółci w stężeniach: 1, 2, 5, 10, 20 g/l.
| Sole żółci stężenie | B. longum 20219 | B. longum PL03 |
| 1 g/l | +++ | +++ |
| 2 g/l | + | + |
| 5 g/l | + | + |
| 10 g/l | + | + |
| 20 g/l | + | + |
Przebadane szczepy Bifidobacterium wykazały dużą oporność zarówno na niskie pH (równe wartości pH występujące w soku żołądkowym) jak i na sole żółci, co może świadczyć o i ich doskonałym przystosowaniu do niesprzyjających warunków panującym w ludzkim przewodzie pokarmowym.
Wybrany drogą selekcji szczep bakterii należący do rodzajów Bifidobacterium spełnił wszystkie wymagania stawiane szczepom probiotycznym. Wyboru dokonano spośród szczepów, które w naturalny sposób kolonizują przewód pokarmowy i egzystują obok siebie. Dzięki temu oraz specyficznym cechom indywidualnym szczepu Bifidobacterium logum PL03 jest użyteczny w profilaktyce i leczeniu stanów będących wynikiem braku właściwej flory bakteryjnej przewodu pokarmowego. Przeprowadzone badania laboratoryjne wykazały, że wybrany szczep bakterii Bifidobacterium longum spełnia wszystkie kryteria funkcjonalności i bezpieczeństwa wymagane od probiotyków doustnych i może być stosowany jako dodatek żywnościowy do uzupełniania składu fizjologicznej flory przewodu pokarmowego dzieci i dorosłych we wszystkich stanach wskazujących na zaburzenia tego składu z różnych przyczyn, np. związanych z leczeniem antybiotykami, biegunką na różnym tle, niedoborami witamin i innych składników pokarmowych.
Claims (1)
- Nowy szczep bakterii Bifidobacterium longum PL03 PCM B/00013.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL380803A PL208421B1 (pl) | 2006-10-10 | 2006-10-10 | Nowy szczep Bifidobacterium longum |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL380803A PL208421B1 (pl) | 2006-10-10 | 2006-10-10 | Nowy szczep Bifidobacterium longum |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL380803A1 PL380803A1 (pl) | 2008-04-14 |
| PL208421B1 true PL208421B1 (pl) | 2011-04-29 |
Family
ID=43033806
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL380803A PL208421B1 (pl) | 2006-10-10 | 2006-10-10 | Nowy szczep Bifidobacterium longum |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL208421B1 (pl) |
-
2006
- 2006-10-10 PL PL380803A patent/PL208421B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL380803A1 (pl) | 2008-04-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101255894B1 (ko) | 락토바실러스 플란타룸 및 그의 용도 | |
| Zuo et al. | Characterization and in vitro properties of potential probiotic Bifidobacterium strains isolated from breast-fed infant feces | |
| CN110959865B (zh) | 可调节胃肠道菌群平衡的副干酪乳杆菌k56的新应用 | |
| KR102091175B1 (ko) | 장내 항염증 및 균총 개선 활성을 갖는 락토바실러스 람노서스 균주 | |
| CN101068918B (zh) | 具有减少身体脂肪活性的鼠李糖乳杆菌以及包含它们的食品 | |
| CN110964655A (zh) | 一种可调节胃肠道菌群的乳双歧杆菌bl-99及其应用 | |
| PL210465B1 (pl) | Zastosowanie kompozycji szczepów z rodzaju Lactobacillus | |
| SK280681B6 (sk) | Kmeň baktérií lactobacillus acidophilus, prostried | |
| CN110964653A (zh) | 一种可调节肠道菌群平衡的副干酪乳杆菌et-22 | |
| CN110373368B (zh) | 一种长双歧杆菌菌株zj1及其应用 | |
| CN113913322A (zh) | 乳双歧杆菌BLa80在缓解腹泻和提升肠道免疫能力中的应用 | |
| EP3494206A1 (en) | Lactic bacteria and the use thereof for the preventive, inhibitory and/or reductive treatment of the formation of bacterial biofilms | |
| KR102036275B1 (ko) | 항-염증 활성이 우수한 페디오코커스 악시딜락티시 ldtm 5201 신균주(kctc 13563bp) | |
| KR20150066772A (ko) | 신규한 유산균 및 이를 포함하는 영유아의 설사병 예방 또는 치료용 조성물 | |
| CN117106628A (zh) | 一种具有免疫调节能力的嗜酸乳杆菌la15及其应用、产品与方法 | |
| CN117511809A (zh) | 一种抗幽门螺杆菌的干酪乳酪杆菌hy001及其用途、产品和方法 | |
| Mandal | Curd lactobacilli with probiotic potentiality | |
| Tinrat et al. | Isolation and characterization of Lactobacillus salivarius MTC 1026 as a potential probiotic | |
| CA2890965C (en) | Probiotic strains isolated from dogs for use in dog food, treats and/or supplements | |
| WO2005095656A1 (en) | Lactic acid bacteria strains exhibiting probiotic properties and compositions comprising the same | |
| Englerová et al. | The study of the probiotic potential of the beneficial bacteria isolated from kefir grains | |
| PL208421B1 (pl) | Nowy szczep Bifidobacterium longum | |
| PL208422B1 (pl) | Nowy szczep Lactobacillus rhamnosus | |
| CN102337227B (zh) | 胚芽乳酸杆菌及其用途 | |
| PL208420B1 (pl) | Nowy szczep Lactobacillus plantarum i kompozycja zawierająca nowy szczep Lactobacillus plantarum |