PL208584B1 - Nowe pochodne N-acylo-dipeptydu o ogólnym wzorze 1, sposoby ich wytwarzania, kompozycje farmaceutyczne zawierające takie związki, enancjomery tych związków, oraz zastosowanie tych związków - Google Patents

Nowe pochodne N-acylo-dipeptydu o ogólnym wzorze 1, sposoby ich wytwarzania, kompozycje farmaceutyczne zawierające takie związki, enancjomery tych związków, oraz zastosowanie tych związków

Info

Publication number
PL208584B1
PL208584B1 PL356405A PL35640500A PL208584B1 PL 208584 B1 PL208584 B1 PL 208584B1 PL 356405 A PL356405 A PL 356405A PL 35640500 A PL35640500 A PL 35640500A PL 208584 B1 PL208584 B1 PL 208584B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
acid
group
general formula
derivative
hydroxytetradecanoylamino
Prior art date
Application number
PL356405A
Other languages
English (en)
Other versions
PL356405A1 (pl
Inventor
Jacques Bauer
Olivier Richard Martin
Sylvan Rodiguez
Original Assignee
Om Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Om Pharma filed Critical Om Pharma
Publication of PL356405A1 publication Critical patent/PL356405A1/pl
Publication of PL208584B1 publication Critical patent/PL208584B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/22—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton having nitrogen atoms of amino groups bound to the carbon skeleton of the acid part, further acylated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/60—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton with the carbon atom of at least one of the carboxyl groups bound to nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/091—Esters of phosphoric acids with hydroxyalkyl compounds with further substituents on alkyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne N-acylo-dipeptydu zawierające grupę kwasową w stanie oboję tnym lub naładowanym w części swego jednego końca i pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego w części swego drugiego końca o ogólnym wzorze 1, sposób ich wytwarzania, kompozycje farmaceutyczne zawierające takie związki, enancjomery tych związków, oraz zastosowanie tych związków.
Tło wynalazku
Niniejszy wynalazek odnosi się do dziedziny chemii, a konkretniej do dziedziny chemii peptydów. Bardziej szczegółowo, dotyczy on związków pochodnych acylo-dipeptydu zawierających pomocniczą funkcjonalnie podstawioną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, którą można ewentualnie wszczepić w postaci koniugatów, która to pomocnicza sekwencja rozdzielająca łańcucha bocznego dodatkowo nadaje cząsteczce niezwykłe właściwości, w kategoriach aktywności biologicznej oraz cech fizyko-chemicznych. W zależności od zaangażowanych rodzajów związków chemicznych, pomocnicza rozdzielająca sekwencja łańcucha bocznego daje związkowi podobnemu do acylo-dipeptydu dodatkową funkcjonalną zdolność poprzez dokładne dostrojenie jego niezwykłych właściwości oraz przez nadanie mu także nowych. Te cząsteczki niosące pomocniczą funkcjonalną rozdzielającą sekwencję łańcucha bocznego, można sprzęgać z nośnikiem farmaceutycznym, antygenem lub podłożem. Biokoniugacja obejmuje sprzęganie dwóch lub więcej rodzajów chemicznych, tworząc nowy kompleks cząsteczkowy mający właściwości inne od tych z poszczególnych związków. Produkty naturalne lub syntetyczne, mające nieodłączne właściwości farmakologiczne, można obustronnie łączyć, tworząc nowy rodzaj związku mający początkowe lub ulepszone farmakologiczne i fizyko-chemiczne właściwości w porównaniu ze związkami wyjściowymi. Biokoniugaty mają wiele różnych zastosowań we wszystkich dziedzinach medycyny ludzkiej i opieki nad zwierzętami, jak również diagnostyce.
Opisano już wiele homo- lub heterobifunkcjonalnych czynników sprzęgających i można je stosować dla cząsteczek sprzęgających w zakresie od aminokwasów do peptydów, białek, cukrów, oligosacharydów, polisacharydów, kwasów nukleinowych, oligonukleotydów, polinukleotydów, lipidów i prawie każdej pojedynczej czą steczki niosą cej grupę funkcyjną zdolną do wią zania. W ostatnich latach uczyniono istotny wysiłek w odniesieniu do syntezy konstrukcji antygenowych wykonanych z dwóch cząsteczek zawierają cych róż ne informacje. Good i inni [(1987), Science, 35:1059-1062], opisał np. syntezę peptydu zawierającego zarówno epitopy rozpoznawania limfocytu pomocnicznego T jak i limfocytu B. Bessler i Jung [(1992) Res. Immunol. 5:548-553] opisał koniugaty składające się z peptydu i immunostymulanta. Hoffmann i inni [(1997) FEMS Immunol. Med. Microbiol., 17:225-234] opisali koniugaty lipopeptydu i peptydu syntetycznego otrzymanego z melityny.
Ulrich i Meyers [(1995) Vaccine Design. Plenum Press, Nowy Jork, 495-524], zaobserwowali, że odpowiedź immunologiczna była nieskuteczna chyba, że hapten i adjuwant MPL (Monophosphoryl Lipid A) znajdowały się w tym samym liposomie. Sugerowali oni możliwość istnienia wiązania kowalencyjnego między MPL i haptenem. W rzeczywistości, koniugat hapten-adjuwant może okazać się bardzo skuteczny, jeśli stosuje się go jako adjuwant szczepionki. Ikeda i inni [(1999) Chem. Pharm. Bull., 47 (4), 563-568] opisywali syntezę analogi strukturalnego Lipid A sprzężonego z peptydem antygenu pochodzącego od nowotworu i pokazali, że posiada on aktywność mitogeniczną in vitro.
Koncepcję koniugacji można również stosować do białka lub nawet koniugatów białko-polisacharyd. Rzeczywiście, dobrze wiadomo, że stosowanie samych polisacharydów jako szczepionek, poprawia słabą odpowiedź immunologiczną jedynie u dzieci w wieku poniżej 5 lat jako, że brak jest udziału odpowiedzi za pośrednictwem limfocytów T. [Gotschlich i inni (1977); Antibodies in Human Diagnosis i Therapy. Peltola i inni, (1977), Pediatrics: 60: 730-737]. Dla kontrastu, łączenie polisacharydów z nośnikami białkowymi wywołuje znacznie silniejszą odpowiedź immunologiczną. Zjawisko to odkryli w 1931 Avery i Goebel [(1931), J. Exp. Med., 54:437-447]. Wiele ostatnio opracowanych szczepionek odzwierciedla postęp osiągnięty jak dotąd w tej dziedzinie. Należy wymienić szczepionki wobec Haemophilus influenzae i różne serotypy Streptococcus pneumoniae [Powell i Newman, (1995), Vaccine Design. Plenum Press, Nowy Jork]. W ostatnim przypadku, opracowano szczepionkę multiwalentną [Sood i Fatten, (1998), Exp. Qpin. Invest. Drugs. 7: (3), 333-347].
Kompleks obejmujący adjuwant związany z ugrupowaniem polisacharyd-białko, wzbudza nowe możliwości. Technologia syntezy chemicznej, jaką stosuje się dla biokoniugatów, jest aktualnie dobrze opracowana i można przeprowadzić wiele projektów, jakie jeszcze kilka lat temu były niemożliwe do podjęcia, polegających na szerokim zakresie obecnie dostępnych odczynników homo- lub heterobiPL 208 584 B1 funkcjonalnych, i stosowaniu procedur koniugacji szeroko opisanych w literaturze [Hermanson, (1996), Biokoniugat Techniques, Academic Press, Nowy Jork].
Tak więc należy wymienić np. metodę aminowania redukcyjnego [Roy i inni, (1984), Ganad. J. Biochem. Cell Biol., 62:270-279, Hermansson, strona 472] pozwalającą na koniugację cząsteczki nośnika z aldehydową grupą funkcyjną, mającą aminę pierwszorzędową na peptydzie lub cząsteczkę białka, z koniugatem białko-polisacharyd lub z nośnikiem farmaceutycznym. Reakcja ta daje w wyniku utworzenie bardzo stabilnego związku dialkiloaminowego.
Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy konkretniej związków pochodnych dipeptydu otrzymanych z funkcjonalnie podstawionych aminokwasów, których wolne funkcyjne grupy aminowe poddano amidowaniu przez kwasy tłuszczowe, i których część końcowa niesie pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego.
Dokładniej, wynalazek odnosi się do pochodnych N-acylo-dipeptydu zawierających grupę kwasową w stanie obojętnym lub naładowanym w części swego jednego końca i pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego w części swego drugiego końca, o ogólnym wzorze I:
X- (CH2)m-CH- (CH2)n-CO-Y- (CH2)p-CH- (CH2)q-Z
NHRi NHR2 (I) w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego, prostołańcuchowego lub rozgałęzionego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony albo zawiera jeden lub więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i (C1-24)alkilotio, indeksy dolne m, n oznaczają liczby całkowite w zakresie od 0 do 10, indeksy dolne p, q oznaczają liczby całkowite w zakresie od 1 do 10,
Y oznacza O lub NH,
X i Z oznacza pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielając ą łańcucha bocznego lub grupę kwasową albo w stanie obojętnym albo naładowanym wybrane z następującej grupy:
- karboksyl
- karboksy[(C1-5)alkoksy]
- karboksy[(C1-5)alkilotio]
- fosfono[(C1-5)alkoksy]
- fosfono[(C1-5)alkilotio]
- dihydroksyfosforyloksy[(C1-5)alkoksy]
- dihydroksyfosforyloksy[(C1-5)alkilotio]
- dihydroksyfosforyloksy
- hydroksysulfonyloksy
- hydroksysulfonylo[(C1-5)alkoksy]
- hydroksysulfonylo[(C1-5)alkilotio]
- hydroksysulfonyloksy[(C1-5)alkoksy]
- hydroksysulfonyloksy[(C1-5)alkilotio]
- [karboksy(C1-5)alkilo]aminokarbonyl
- [dikarboksy(C1-5)alkilo]aminokarbonyl
- [amonio(C1-5)alkilo]aminokarbonyl
- {karboksy[amino(C1-5)alkilo]}aminokarbonyl
Grupa pomocnicza oznaczona przez X lub Z ma ogólny wzór (II):
A-(CO)r-(CH2)s-W (II) gdzie A oznacza albo O, S albo NH indeks r oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 0 do 1;
indeks s oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10;
W jest wybrany z grupy obejmują cej cyjano, chlorowco, amino, bromo, lub jodoacetamido, acyloamido, diacyloimido, sulfhydryl, alkilotio, hydroksyl, 1,2-dihydroksyetyl, alkoksy, acyloksy, winyl, etynyl, wolny karboksyl, zestryfikowany karboksyl lub w postaci mieszanego bezwodnika, amidu lub hydrazydku, azydek, tiocyjano, oraz ich enancjomery i diastereoizomery.
PL 208 584 B1
Wynalazek dotyczy zwłaszcza nowych związków pochodnych N-acylo-dipeptydu zawierających grupę kwasową w stanie albo obojętnym albo naładowanym, na swoim jednym końcu i zawierających pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego na drugim, mających ogólny wzór I:
X- (CH2)m-CH- (CH2)n-CO-Y- (CH2)p-CH- (CH2)q-Z
NHRi NHR2 (I) w którym każ dy R1 i R2 oznacza grupę acylow ą pochodzą cą od nasyconego lub nienasyconego prostołańcuchowego lub rozgałęzionego kwasu karboksylowego, mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden albo więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i (C1-24)alkilotio grup, indeksy m oraz n oznaczają liczby całkowite w zakresie od 0 do 10, indeksy dolne p oraz q oznaczają liczby całkowite w zakresie od 1 do 10,
X i Z każdy oznacza grupę kwasową albo w stanie obojętnym albo naładowanym lub pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, pod warunkiem, że co najmniej jeden z podstawników X lub Z oznacza pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego,
Y oznacza O lub NH,
Grupę kwasową X lub Y korzystnie wybiera się z grupy obejmującej:
- karboksyl
- karboksy[(C1-5)alkoksy]
- karboksy[(C1-5)alkilotio]
- fosfono[(C1-5)alkoksy]
- fosfono[(C1-5)alkilotio]
- dihydroksyfosforyloksy[(C1-5)alkoksy]
- dihydroksyfosforyloksy
- hydroksysulfonyloksy
- hydroksysulfonylo[(C1-5)alkoksy]
- hydroksysulfonylo[(C1-5)alkilotio]
- hydroksysulfonyloksy[(C1-5)alkoksy]
- hydroksysulfonyloksy[(C1-5)alkilotio] i grupa pomocnicza oznaczona przez X lub Z posiada ogólny wzór II, wyłączywszy rodnik dihydroksyetylowy.
Jeżeli podstawniki X lub Z w związku o wzorze I oznaczają grupę kwasową w stanie obojętnym, wymieniony związek oznacza wolny związek karboksylowy, sulfonowy, fosfoniowy lub fosforowy wymienionego kwasu.
Jeżeli podstawniki X lub Z w związku o wzorze I oznaczają grupę kwasową w stanie naładowanym, to wymieniony związek oznacza postać soli karboksylowej, sulfonowej, fosfoniowej lub fosforowej, mianowicie przez dodanie zasady mineralnej lub organicznej, korzystnie przeznaczonej do zastosowania terapeutycznego.
Jeśli podstawniki X lub Z oznaczają grupę kwasową w stanie obojętnym, odnosi się do wolnego związku karboksylowego, sulfonowego, fosfoniowego lub fosforowego. Jeśli grupa kwasowa jest w stanie naładowanym, odnosi się do postaci soli karboksylowej, sulfonowej, fosfoniowej lub fosforowej, mianowicie przez dodanie zasady organicznej lub mineralnej, korzystnie przeznaczonej do zastosowania terapeutycznego. Jeśli chodzi o zasady nie przeznaczone do zastosowania terapeutycznego, takie zasady zapewniają środki do łatwej identyfikacji, oczyszczania i rozdzielania.
Sól tworząca zasady przeznaczone do zastosowania terapeutycznego obejmują głównie zasady alkaliczne, takie jak wodorotlenki sodowe, potasowe lub litowe, amoniowe sole, zasady metali ziem alkalicznych, takie jak wodorotlenek wapniowy lub strontowy, sole magnezu, żelazawe sole metaliczne i inne, organiczne zasady, takie jak te pochodzące od pierwszorzędowych, drugorzędowych, trzeciorzędowych amin aminokwasów zasadowych, takich jak lizyna i ornityna lub aminocukrów.
PL 208 584 B1
Przykłady zasad nie przeznaczonych do zastosowania terapeutycznego to brucyna, strychnina, N-metyloglukozamina lub N-metylomorfolina. Jak ustalono wcześniej, sole od nich otrzymane będą służyć jako środki do rozdzielania, identyfikacji lub oczyszczania.
Gdy m jest równe 1 i n jest równe 0, cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania pochodzi od seryny lub kwasu asparaginowego. Gdy m jest równe 2 i n jest równe 0, cząsteczka brana pod uwagę głównie pochodzi od homoseryny lub kwasu glutaminowego.
Jeśli Y = NH, p jest równe 3 i q jest równe 1, produkt będący przedmiotem zainteresowania może być związkiem cytruliny, ornityny lub argininy.
Jeśli p jest równe 4 i q jest równe 1, odnosi się do związku homoargininy lub lizyny.
Jeśli podstawniki X lub Z oznaczają grupę pomocniczą o ogólnym wzorze (III)
O-CO-(CH2)s-W (III) indeks dolny s oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10, w szczególności równą 4, 5 lub 6
W korzystnie wybiera się z grupy obejmują cej:
formyl, amino, hydroksyl, 1,2-dihydroksyetyl, karboksyl.
Wśród pochodnych dipeptydu, które są zawarte w niniejszym, szczególną uwagę zwraca się na związki o ogólnym wzorze IV, które są aktualnie zalecane:
X- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2)p-CH- (CH2)q-Z
NHRi NHR2 (IV) w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego, prostołańcuchowego lub rozgałęzionego kwasu karboksylowego, mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawwiera jeden lub więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i grupy (C1-24)alkilotio;
indeksy dolne m i n oznaczają liczby całkowite w zakresie od 0 do 10, indeksy dolne p i q oznaczają liczby całkowite w zakresie od 1 do 10, i w którym jeden z podstawników X lub Z oznacza karboksyl lub grupę dihydroksyfosforyloksy lub grupę karboksy[(C1-5)alkoksy] lub grupę karboksy[(C1-5)alkilotio] lub karboksy[(C1-5)alkilo]aminokarbonylową lub [dikarboksy(C1-5)alkilo]aminokarbonylową lub grupę {karboksy[amino(C1-5)alkilo]}aminokarbonylową, i w którym drugi podstawnik oznacza grupę acyloksy wybraną spośród jednej z grup 6-aminoheksanoiloksy, 6-oksoheksanoyloksy, 6-hydroksyheksanoiloksy, 6,7-dihydroksyheptanoiloksy lub 3-karboksypropanoiloksy.
Uważa się, że R1 i R2 obejmują nasycone lub nienasycone, rozgałęzione lub prostołańcuchowe pochodne acylowe mające zmienną wielkość łańcucha wynoszącą od 2 do 24 atomów węgla, o różnym lub identycznym charakterze, która może nieść jeden lub więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej alkil, amino, acylamino, hydroksyl, alkoksy, acyloksy acylotio i alkilotio. Wśród grup acylowych, w niniejszym będących przedmiotem zainteresowania, należy wymienić te pochodzące kwasu laurynowego, kwasu 2-hydroksyoktanowego, kwasu 2-dekanoiloksyoktanowego, kwasu 3-lauryloksymirystynowego, kwasu 3-hydroksymirystynowego, kwasu 3-mirystoilomirystynowego i kwasu 3-palmitoilomirystynowego które są aktualnie zalecane.
Wynalazek odnosi się w szczególności do następujących związków pochodnych dipeptydu, wymienionych w tablicy poniżej jako związki zalecane:
* -k -k
X- (CH2)m-CH- (CH2)n-CO-Y- (CH2)p-CH- (CH2)q-Z
NHRi NHR2
Z=OR3
Z=A(CO)r-(CH2)s-W
PL 208 584 B1
1 [ CG O X O X O CC O CHO | CG o X u CG O CC u CHO CG O X 2 CG 2 X 2 X O CHO | _1 CHO X 2 CHO id X X u o u X 2
in t i *3* 'ŚT LO ir> ŁTJ LO ΙΓ) LO fjl x> O1 LTJ
Μ 1 1 «—f l-1 >—1 rd rd τ—i e—ł i—1 rd O rd «—1 rd
< 1 ! O O O O O O O O O X 2 O O O O
X X x o o X 1 1 I 1 1 1 1 i i 1 1 i 1 1
u o o o U U o (J O U o o (J O u O
O o o o O o o O o o o O o O o o
x CG X CG cc CG CG cc X X X X X X X X
X co CO m CO co CO CO co co co co co co co co co
U o U U u u O o u o u O u o O u
a o o O o o o o o o o n o o o o
o o o U u CJ o u o o u u u o o u
cd co CO CO CO co co CO co co CO co co ro co CO CO
σ rd I—1 rd rd rd rd rd rd rd t—1 rd rd rd rd rd rd
a ro CO co CO CO CO CO 00 co co CO ro co co CO CO
α o O o O o O O O o o O O o o O o
e rd i—1 OJ OJ rd rd *-· OJ OJ OJ C\1 OJ rd I-1 OJ
> X 2 CG 2 CG 2 cc 2 CC 2 CG Z, CG 'Z CG 2 X 2 X 2 X 2 O X 2 X 2 X 2 2
* -k cd Cd X Cd Cd Cd cd X X X X X X X X X
H, » M. «, M. S. ω h. W X. ω
-k X cd cd cd cd cd cd cd X ω X X X co X X
o o O 1 o X o 1 o CU o o O o 1 o X o 1 O X O 1 O X o 1 O X o i o X o X o o o X U o X O X o o o O 1 O X
o o o o o o <) o o o o o < > <> o o
o u cc cc o O o X X X X X o o X X
X cc x CG CG — '— X X — o
=#= TJ nj rM Jd 1 >1 N OJ co 1—f OJ co •tF uO kO 00 Cft o i-d i—i i—1 OJ co rd «3» rd
Sd
CM I—1 T—1 OJ OJ OJ OJ Od OJ OJ OJ OJ OJ OJ OJ OJ OJ
PL 208 584 B1
3 CHO X X X o o o X u o o X X OJ X X COOK 1 1 X X 1 X X X X X X
tn M1 © © t—1 © 1 1 © 1 © © ©
Μ r*d i—1 T—1 i—l rd 1 1 rd 1 I-1 ,—1 !—I
< O o o o o 1 1 o 1 o o o
X 1 1 1 1 X X 1 X 1 1 I
X Ó o ó © o o X © o o X © o o X © u o X © o o X © u o X © U o X © o X © o o X © u o X © u o X ©
X o o X © u o u © ó' o CJ © ó o ć> ca u o u © o o u © o o o © u o u © cj o o © o o o © OJ o u o o ©
σ α c e V-1 © o © r~11 © o rd t—i © o 1-1 t—1 © o t—ł i—1 © o rd rd © o i—1 rd © O rd1 rd © o I—1 rd © o V—1 rd © o I—ł 1-) © o i—I V-1 © o t-1
>4 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
* -K * X w X X X X X X X X X X X* X X X X X X X X X X X X
XJ o 1 o X o X o o o X o o o X u o o X o o o X O U X X X o X X X o o u X u χ θ 3 X — X o o o X o X O o u tS x X ©J 1 X — X o o o X o X o o o o O X O X X 1 X o o o X o X o o u o O X O X X 1 o o o X u o o X
Przykład # © 1—1 © © 1—1 © Γ V-i © co ,—1 © en <—1 © o © © t—1 © © © © © © © © ©* © © © © © © © ©
PL 208 584 B1
Związki określone w zastrzeżeniach 1 do 7, wybrane z grupy utworzonej przez;
- a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowego, oraz jego sole addycyjne z zasadą mineraln ą lub organiczn ą ;
- 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6,7-dihydroksyheptanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-oksoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną (Przykład 2.2);
- kwas -N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid 5-O-(6,7-dihydroksyheptanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid 5-O-(6-oksoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid 5-O-(6-hydroksyheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- (3RS,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-aminoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- (3R,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-aminoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-aminoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-hydroksyheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- 2-[(R)-3-hydroksytetradekanolamino]-5-(6-oksoheksylo)amino}pentylo-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-(dihydroksyfosforyloksy)butanian oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- (2R,8R)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanolamino]-3-okso-4-aza-8-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]nonan-1,9-diol, eter 1-O-karboksymetylowo-9-O-(6-oksohaksanianowy) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- (2S,8R)-1-(karboksymetylo)-tio-2-[(R)-3-tetradodekanoiloksytetradekanolamino]-3-okso-4-aza-8-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]nonan-9-ol 9-O-(7-aminoheptanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- (2R,8R)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanolamino]-3-okso-4-aza-8-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]nonan-1 9-ol 1-O-(2,2-dikarboksyetylo)eter 9-O-(6-heksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-1,10-diol, 1-diwodorofosforan 10-(6-bromoacetamidoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- (3RS,9R)-3-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]dekan-1,10-diol, 1-diwodorofosforan 10-(6-oksoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-sukcynyloamidoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
PL 208 584 B1
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, α -N-{(4R)-5-glicynyloksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-sukcynyloksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczn ą ;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1-karboksy-5-aminopentylo]amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-[(1S)-1-karboksy-5-aminopentylo]amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-[(1S)-1,2-dikarboksyetylo]amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid β-Ν-[(1 S)-1,2-dikarboksyetylo]amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-acetylo-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-(2-dekanoiloksyoktanoilo)-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną.
Związki określone w zastrzeżeniach od 1 do 7 o ogólnym wzorze I, wybrane z grupy obejmującej:
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną; (Przykład 1.2)
- 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6,7-dihydroksyheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną; (Przykład 2.1)
- 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-oksoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną; (Przykład 2.2)
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid 5-O-(6,7-dihydroksyheptanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną; (Przykład 2.3)
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid 5-O-(6-oksoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną; (Przykład 2.4)
- związki - (3RS,9R), (3R,9R) i (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-aminoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną; (Przykład 2.6, 2.7 i 2.8) związki - 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-5 (6-hydroksyheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną; (Przykład 2.9)
- {2-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-5-(6-oksoheksylo)amino}pentyl 2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-(dihydroksyfosforyloksy)-butanian oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną; (Przykład 2.10)
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną; (Przykład 2.16)
PL 208 584 B1
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-sukcynyloksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną; (Przykład 2.19)
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1-karboksy-5-amino]pentylo]amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną; (Przykład 2.22)
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1,2-dikarboksyetylo]amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczne; (Przykład 2.24).
Związki te mają szczególnie interesujące właściwości farmakologiczne, głównie ze względu na immunomodulację. Są one szczególnie istotne przy sporządzaniu kompozycji szczepionek, w preparatach jako domieszka lub jako kowalentne koniugaty z antygenami polipeptydowymi lub polisacharydowymi lub związkami wytworzonymi z polipeptydów sprzężonych z polisacharydem. Można je stosować głównie przy zapobieganiu infekcjom pierwotniakowym, wirusowym i drobnoustrojowym lub przy leczeniu pewnych chorób autoimmunologicznych.
Inne zastosowania obejmują stosowanie jako wektorów dla cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania terapeutycznego, z powodu ich zdolności do tworzenia kompleksów kowalentnych w oparciu o zmienny charakter hydrofilowy lub hydrofobowy ich pomocniczej sekwencji rozdzielającej łańcucha bocznego. Ich właściwości chemiczne pozwalają na sprzęganie ich z cząsteczkami będącymi przedmiotem zainteresowania terapeutycznego. Podobnie, ich charakter amfofilowy wzmacnia tworzenie i transport cząsteczek związanych z nimi do receptorów błonowych, jak również do błon komórkowych i cytoplazmy.
Można je stosować pojedynczo lub albo powiązanych kowalentnie lub nie, z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania terapeutycznego, za pomocą podawania drogą doustną, pozajelitową, doodbytniczą, miejscową lub podśluzówkową.
Można je stosować pojedynczo albo powiązane kowalentnie lub nie, z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania terapeutycznego, przez przeprowadzenie od ręki inkubacji krwinek ex vivo, a celu pobudzenia tworzenia się komórek immunokompetentnych przed wstrzyknięciem ich spowrotem in vivo, podając pozajelitowego.
Cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania obrazują podobne właściwości, jako adjuwanty dla układu odpornościowego przy stosowaniu np. w szczepionkach, albo w związku kowalentnym albo nie, z odpowiednimi antygenami, przeciwko chorobie pochodzenia wirusowego, drobnoustrojowego lub grzybowego. Te ewentualnie sprzężone cząsteczki można dodatkowo stosować przy leczeniu pewnych chorób autoimmunologicznych.
Przeciwnie, niektóre związki według wynalazku wykazują następujący związek kowalentny albo nie zupełnie różne właściwości biorąc pod uwagę ich zdolność do indukcji wytwarzania cytokin lub dojrzewania immunokompetentnych komórek macierzystych pochodzących z narządów krwiotwórczych i limfoidowych.
Niektóre związki według wynalazku pobudzają dojrzewanie i różnicowanie monocytów do funkcjonalnych komórek dendrytycznych, w obecności lub przy braku odpowiedniego antygenu, i działają przy pobudzeniu odporności humoralnej i za pośrednictwem komórek.
Pewne związki rozważane w niniejszym pobudzają różnicowanie komórek, które są częścią układu krwiotwórczego, zwłaszcza wewnątrz szpiku kostnego i wywołują poprawę lub naprawę pewnych schorzeń układu odpornościowego. W szczególności obrazują właściwości przeciwwirusowe.
Związki według wynalazku są szczególnie interesujące z powodu ich niskiej toksyczności. Stosuje się je albo w kowalentnym związku z antygenami albo nie, przy zapobieganiu lub leczeniu chorób zakaźnych u ludzi i zwierząt, w dawkach w zakresie od 0,005 mg do 100 mg na dawkę jednostkową oraz od 0,005 do 200 mg dziennie, w zależności od poszczególnego wskazania i ciężaru ciała osobnika.
Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu otrzymywania pochodnych N-acylo-dipeptydu, zawierających grupę kwasową w stanie obojętnym lub naładowanym na części jednego końca, i zawierających pomocniczą funkcyjną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego na drugim, o ogólnym wzorze I, który obejmuje etapy blokowania aminowych grup funkcyjnych w pozycji (q+1) i YH w ω pozycji ω-funkcjonalnie derywatyzowanego aminokwasu, za pomocą odczynników blokujących poprzecznie, poddając reakcji wciąż wolną funkcyjną grupę karboksylową z czynnikiem redukującym, z otrzymaniem odpowiadającego alkoholu, uwalniając aminową grupę funkcyjną w pozycji (q+1),
PL 208 584 B1 a następnie acylując ją za pomocą pochodnej funkcyjnej kwasu karboksylowego o wzorze R2OH jaki określono powyżej, a potem uwalniając końcową aminową grupę funkcyjną z otrzymaniem funkcjonalnie derywatyzowanego aminoalkoholu o ogólnym wzorze V
Y- (CH2) p-CH- (CH2) q—OH
I
NHR2 (V) w którym Y oznacza HO lub korzystnie NH2,
R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników jakie określono powyżej, każdy p i q oznaczają liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10, który to aminoalkohol poddaje się kondensacji w obecności peptydowego czynnika kondensującego w obojętnym rozpuszczalniku, razem z ω-funkcjonalną pochodną związku aminokwasowego o ogólnym wzorze VI
X- (CH2)m-CH- (CH2)n-COOH
NHR2 (VI) w którym R1 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników jakie wymieniono powyżej, m i n oznaczają liczby całkowite w zakresie od 0 do 10, oraz X oznacza grupę kwasową jaką określono powyżej, która może występować w postaci estru, uzyskując pochodną dipeptydu o ogólnym wzorze VII x- (CH2)m-CH- (CH2)n-CO-Y- (CH2)p-CH- (CH2)q-OH
NHRX NHR2 (VII) w którym podstawniki R1 i R2 i indeksy dolne m, n, p i q są takie jak wymieniono powyżej, wolna końcowa alkoholowa grupa funkcyjna, która może być, jeśli trzeba, podstawiona przez alkil lub acyl lub inaczej przez alkilowy lub acylowy albo inny odczynnik podstawiający o ogólnym wzorze VI,
A-(CO)r(CH2)s-W (VIII) przy czym A oznacza grupę opuszczającą, funkcyjną grupę OH, SH lub NH2 indeks dolny r korzystnie jest równy 1, lub ewentualnie równy 0.
indeks dolny s korzystnie wynosi od 2 do 6, ewentualnie jest zawarty między 1 i 10
W jest korzystnie wybrany spośród grupy obejmującej -formyl, -acetyl, -cyjano, -chlorowco,
-amino, -bromo- lub jodoacetamid, -acylamid, -diacylimid, -sulfohydryl, -alkilotio, -hydroksyl, -1,2-dihydroksyetyl, -acyloksy, -winyl, etynyl, wolny lub zestryfikowany karboksyl lub w postaci mieszanego bezwodnika, amid lub hydrazydek, -azydek, -tiocyjano lub ich prekursory, w obecności czynnika sprzęgającego, i poddając produkt katalitycznemu uwodornieniu lub stosując kwasową hydrolizę w celu odbezpieczania, do otrzymania pochodnej o wzorze I:
X- (CH2)m-CH- (CH2)n-CO-Y- (CH2)p-CH- (CH2)q-Z
NH NH
Ri R2 (I) w którym podstawniki i indeksy dolne X, Y, Z, R1, R2, n, m, p i q mają takie same znaczenia jak te podane powyżej.
PL 208 584 B1
Wynalazek dotyczy również sposobów otrzymywania pochodnych fosfodipeptydu, o ogólnym wzorze IV,
X- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2)p-CH- (CH2)q-Z
NHRi NHR2 (IV) w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego, prostołańcuchowego lub rozgałęzionego kwasu karboksylowego, mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i (C1-24)alkilotio, indeksy m, p i q oznaczają liczby w zakresie od 1 do 10, indeks n oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 0 do 10, każdy X i Z oznacza grupę kwasową w stanie obojętnym lub naładowanym lub pomocniczą funkcjonalną rozdzielającą sekwencję łańcucha bocznego, który charakteryzuje się tym, że polega na zablokowaniu aminowych grup funkcyjnych w pozycjach (q+1) i ω kwasu diaminowego o wzorze H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH przez odczynniki blokujące, które łatwo ulegają odpowiednio rozkładowi kwasowemu i wodorolizie, reakcji wciąż wolnej karboksylowej grupy funkcyjnej z czynnikiem redukującym, uzyskując odpowiadający alkohol, uwolnieniu aminowej grupy funkcyjnej w pozycji (q+1), a następnie acylowaniu jej za pomocą pochodnej funkcjonalnej kwasu karboksylowego o wzorze R2OH, w którym R2 jest taki jak określono powyżej, następnie uwolnieniu końcowej aminowej grupy funkcyjnej przez wodorolizę, otrzymując aminoalkohol o ogólnym wzorze IX,
H2N- (CH2) p-CH- (CH2) q-OH
NHR2 (IX) w którym R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników jakie wymieniono powyżej, p i q oznaczają liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10, który to aminoalkohol poddaje się kondensacji w obecności peptydowego czynnika kondensującego w obojętnym rozpuszczalniku, razem z pochodną ω-hydroksyaminokwasowej o ogólnym wzorze VI:
X- (CH2)m-CH- (CH2) n-COOH
NHR2 (VI) w którym R1 oznacza grupę acylową, pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego, mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników, m oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 0 do 10, a X oznacza grupę dialkiloksy- lub diaryloksyfosforyloksy o wzorze (R0)2P-0
Φ
O uzyskując pochodną dipeptydu o ogólnym wzorze X, (RO)2PO- (CH2)m-CH- (CH2) n-CONH- (CH2)p-CH- (CH2)q-OH
Φ I I
O NHRi NHR2 (X) w którym podstawniki R1, R2, oraz indeksy dolne m, n, p i q są takie jak określono powyżej, a R oznacza grupę, która łatwo ulega wodorolizie, wolna końcowa alkoholowa grupa funkcyjna, która moPL 208 584 B1 że być, jeśli trzeba, podstawiona przez alkil lub acyl lub inaczej przez alkilowy lub acylowy albo inny odczynnik podstawiający o ogólnym wzorze VIII,
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII) gdzie A oznacza grupę opuszczającą, grupę funkcyjną OH, SH lub NH2, indeks dolny r oznacza liczbę całkowitą korzystnie równą 1, ewentualnie równą 0, indeks dolny s oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 2 do 6, ewentualnie w zakresie od 1 do 10,
W ma znaczenie wybrane z grupy obejmują cej -formyl, -acetyl, -cyjano, -chlorowco, -amino,
-bromo- lub jodoacetamid, -acylamid, -diacyloimido, -sulfhydryl, -alkilotio, -hydroksyl, 1,2-dihydroksyetyl, -acyloksy, -winyl, -etynyl, wolny lub zestryfikowany karboksyl lub w postaci mieszanego bezwodnika, amid lub hydrazyd, azydek, -tiocyjano, w obecnoś ci czynnika sprzę gają cego, i poddają c go katalitycznemu uwodornieniu lub kwasowej hydrolizie w celu odbezpieczania, tak aby otrzymać pochodną o ogólnym wzorze XI (HO) 2PO- (CH2) m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2) p-CH- (CHo) q-O- (CO) r (CH2) S-W Φ I I
O NH NH
I I
Ri R2 (XI) w którym podstawniki W, R1, R2 i indeksy dolne m, n, p, q, r, s mają takie same znaczenia jak powyżej.
Wynalazek odnosi się jeszcze do sposobu otrzymywania pochodnych fosfodipeptydu o ogólnym wzorze XII
X- (CH2) m-CH- (CH2) n-CO-O- (CH2) p-CH- (CH2) q-Z I I
NHRi NHR2 (XII) i w którym każ dy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzą c ą od nasyconego lub nienasyconego, prostołańcuchowego lub rozgałę zionego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i (C1-24)alkilotio, indeksy dolne m, p i q oznaczają liczby całkowite od 1 do 10, indeks dolny n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, i w którym każ dy X i Z oznacza grupę kwasową lub pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, który polega na blokowaniu aminowych grup funkcyjnych w pozycjach (q+1) i ω kwasu diaminowego o wzorze H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH przez odczynniki blokujące, które łatwo ulegają odpowiednio, rozkładowi kwasowemu i wodorolizie, reakcji wciąż wolnej karboksylowej grupy funkcyjnej z czynnikiem redukującym, uzyskując odpowiadający alkohol, uwolnieniu aminowej grupy funkcyjnej w pozycji (q+1), następnie acylowaniu jej za pomocą pochodnej funkcjonalnej kwasu karboksylowego o wzorze R2OH, w którym R2 jest taki jak okre ślono powyżej, następnie uwolnieniu końcowej aminowej grupy funkcyjnej przez wodorolizę i potem podstawieniu alkilem aminowej grupy funkcyjnej przez ω-funkcjonalny triflan alkilu, otrzymując aminoalkohol o ogólnym wzorze XIII,
W- <CH2) sNH- (CH2)p-CH- (CH2) q-OH
NHR2 (XIII) w którym R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników jakie wymieniono powyżej, p i q oznaczają liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10, indeks dolny s jest korzystnie zawarty między 2 i 7, lecz może wynosić od 1 do 10, który to aminoalkohol poddaje się kondensacji w obecności czynnika kondensującego w obojętnym rozpuszczalniku, razem z pochodną ω-hydroksyaminokwasu o ogólnym wzorze VI:
PL 208 584 B1
X- (CH2)m-CH- (CH2)n-COOH
NHRi (VI) w którym R1 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników, m oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 0 do 10,
X oznacza grupę dialkiloksy- lub diaryloksyfosforyloksy o wzorze (RO)2P-0
Φ
O uzyskując pochodną dipeptydu o ogólnym wzorze XIV (RO) 2PO- (CH2)m-CH- (CH2)n-CO-O- (CH2) q-CH- (CH2)p-NH- (CH2) s- W
Φ I I
O NHRi NHR2 (XIV) w którym podstawniki R1, R2, i indeksy dolne m, n, p, q i s są takie jak określono powyżej, i R oznacza grupę, która łatwo ulega wodorolizie, a następnie poddaje się produkt katalitycznemu uwodornieniu lub kwasowej hydrolizie w celu odbezpieczania, tak aby otrzymać pochodnej o ogólnym wzorze XV:
(HO) 2PO- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-O- (CH2) q-CH- (CH2) p-NH- (CH2) S-W
Φ I I
O NHRi NHR2 (XV) w którym podstawniki W, R1, R2 i indeksy dolne m, n, p, q, r i s są takie jak wymieniono powyżej,
W ma znaczenie wybrane spośród grupy obejmującej -formyl, -acetyl, -cyjano, -chlorowco, -bromo- lub jodoacetamido, -acylamido, -diacyloimido, -acyloksy, -winyl, etynyl, wolny lub zestryfikowany karboksyl lub mający postać mieszanego bezwodnika, amid lub hydrazydek, -azydek, -tiocyjano.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania pochodnych karboksydipeptydu o ogólnym wzorze IV,
X- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2)p-CH- (CH2) -Z
NHRi NHR2 (IV) w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego, prostołańcuchowego lub rozgałęzionego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i (C1-24)alkilotio, indeksy dolne m, p i q oznaczają liczby całkowite od 1 do 10, indeks dolny n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, i w którym każdy X i Z oznacza grupę kwasową lub pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, który polega na blokowaniu aminowych grup funkcyjnych w pozycjach (q+1) i ω kwasu diaminowego o wzorze H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH przez odczynniki blokujące, które łatwo ulegają odpowiednio, rozkładowi kwasowemu i wodorolizie, reakcji wciąż wolnej karboksylowej grupy funkcyjnej z czynnikiem redukującym, uzyskując odpowiadający alkohol, uwolnieniu aminowej grupy funkcyjnej w pozycji (q+1), a następnie acylowaniu jej za pomocą pochodnej funkcjonalnej kwasu karboksyPL 208 584 B1 lowego o wzorze R2OH, w którym R2 jest taki jak określono powyżej, następnie uwolnieniu końcowej aminowej grupy funkcyjnej przez wodorolizę, otrzymując aminoalkohol o wzorze IX
H2N- (CH2) p-CH- (CH2) q-0H
NHR2 (IX) w którym R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników jakie wymieniono powyżej, p i q oznaczają liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10, który to aminoalkohol poddaje się kondensacji w obecności peptydowego czynnika kondensującego w obojętnym rozpuszczalniku, razem z funkcjonalną pochodną ω-karboksyaminokwasu o ogólnym wzorze VI:
x- (CH2) m-CH- (CH2) n-COOH
I
NHRi (VI) w którym R1 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników, m oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 0 do 10, a X oznacza grupę RO-COtworząc pochodną dipeptydu o ogólnym wzorze XVI,
RO-CO- (CH2) m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2) p-CH- (CH2) q-OH
NHRi NHR2 (XVI) w którym podstawniki R1, R2 i indeksy dolne m, n, p i q mają takie same znaczenia jak powyżej, i R oznacza grupę, która łatwo ulega wodorolizie, taką jak grupa benzylowa np., wolna końcowa alkoholowa grupa funkcyjna, która może być, jeśli trzeba, podstawiona przez alkil lub acyl lub inaczej przez alkilowy lub acylowy albo inny odczynnik podstawiający o ogólnym wzorze VIII,
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII) gdzie A oznacza grupę opuszczającą, grupę funkcyjną OH, SH lub NH2, indeks dolny r oznacza liczbę całkowitą korzystnie równą 1, ewentualnie równą 0, indeks dolny s oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 2 do 6, ewentualnie w zakresie od 1 do 10,
W korzystnie wybiera się z grupy obejmującej -formyl, -acetyl, -cyjano, -chlorowco, -amino, -bromo- lub jodoacetamido, -acylamido, -diacyloimido, -sulfhydryl, -alkilotio, -hydroksyl, -1,2-dihydroksyetyl, -acyloksy, -winyl, -etynyl, wolny lub zestryfikowany karboksyl lub w postaci pewnej innej pochodnej, jeśli trzeba, w obecności czynnika sprzęgającego, i poddając go katalitycznemu uwodornieniu lub kwasowej hydrolizie w celu odbezpieczania, tak aby otrzymać pochodną o ogólnym wzorze XI (HO) 2PO- (CH2) m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2) p-CH- (CH->) q-O- (CO) r (CH2)
Φ I
O NH
I
Ri (XI) w którym podstawniki W, R1, R2 i indeksy dolne m, n, p, q, r i s są takie jak wymieniono powyżej.
NH
I
R2
PL 208 584 B1
Wynalazek dotyczy także sposobu otrzymywania pochodnych fosfodipeptydu o ogólnym wzorze IV,
X- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2)p-CH- (CH2)q-Z
I I
NHRi NHR2 (IV) w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego, prostołańcuchowego lub rozgałęzionego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i (C1-24)alkilotio, indeksy dolne m, p i q oznaczają liczby całkowite od 1 do 10, indeks dolny n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, i w którym każdy X i Z oznacza grupę kwasową lub pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, który polega na odbezpieczeniu zestryfikowanej karboksylowej grupy funkcyjnej pochodnej dipeptydu o wzorze XVI
RO-CO- (CH2)m-CH- {CH2) n-CO-NH- (CH2) p-CH- (CH2) q-OH
NHRi NHR2 (XVI) w którym podstawniki R1, R2 i indeksy dolne m, n, p i q mają takie same znaczenia jak powyżej, i R oznacza grupę, która łatwo ulega wodorolizie, następnie poddaniu otrzymanego kwasu reakcji sprzęgania peptydu z częściowo zabezpieczonym aminokwasem lub diamino-alkanem takim jak 3-benzyloksykarbonyloamino-1-aminopropan, dibenzylo-L-asparaginian lub ε-N-benzyloksykarbonylo-L-lizyna, w obecności czynnika sprzęgającego peptyd, i potem poddając, jeśli trzeba, produkt reakcji sprzęgania reakcji podstawienia acylem-, alkilem- lub innym, za pomocą odczynnika o ogólnym wzorze VIII
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII) gdzie A może oznaczać grupę opuszczającą, grupę funkcyjną OH, SH lub NH2, indeks dolny r oznacza liczbę całkowitą równą 1 lub 0, indeks dolny s oznacza liczbę całkowitą w zakresie ogólnie od 1 do 10, korzystnie od 2 do 6,
W jest wybrany z grupy obejmującej -formyl, -acetyl, -cyjano, -chlorowco, -amino, -bromo- lub jodoacetamido, acylamido, -diacyloimido, -sulfhydryl, -alkilotio, hydroksyl, 1,2-dihydroksyetyl-, -acyloksy, -winyl, -etynyl, wolny lub zestryfikowany lub inna pochodna karboksylu.
Reakcję prowadzi się w obecności czynnika aktywującego, i odbezpiecza otrzymany produkt, np. przez wodorolizę , do otrzymania zwi ązku o ogólnym wzorze XVIII
R3-NH-CO- (CH2) ra-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2) p-CH- (CH2) q-O- (CO) r- (CH2) S-W
NH NH
Ri R2 (XVIII) w którym podstawniki W, R1, R2 i indeksy dolne m, n, p, q, r i s są takie jak wymieniono powyżej, a grupa R3 oznacza aminoalkil, karboksyalkil, dikarboksyalkil lub aminokarboksyalkil.
Stereochemia centrów chiralnych zawierających grupy acyloaminowe, jest determinowana przez początkowo stosowane konfiguracje aminokwasów, podczas gdy stereochemia grup acyloaminowych zależy od początkowo stosowanej konsfiguracji kwasu tłuszczowego. Można wyjść od diaminokwasu mającego konfigurację L lub D albo mieszaniny racemicznej. Można wyjść od hydroksylowanego aminokwasu o konfiguracja L, D lub mieszaniny racemicznej. Wszystkie takie stereoizomery lub diastereoizomery związków o ogólnym wzorze I lub IV, albo XII, albo XVI wchodzą w zakres niniejszego wynalazku.
PL 208 584 B1
Generalnie, związki według wynalazku wytwarza się przez sprzęganie kwasowej grupy funkcyjnej N-acylo-, ω- funkcjonalnie podstawionego aminokwasu aminową grupą funkcyjną aminoalkoholu, otrzymaną z redukcji grupy karboksylowej kwasu mono-N-acylodiaminowego, po czym substytucję O-acylową lub -alkilową wciąż wolnej alkoholowej grupy funkcyjnej, w celu wprowadzenia pomocniczej funkcyjnej sekwencji rozdzielającej łańcucha bocznego, który można ewentualnie modyfikować po związaniu w celu wystawienia reaktywnej grupy funkcyjnej. Odbezpieczenie produktu końcowego uwalnia kwasową grupę funkcyjną.
W aktualnie zalecanej metodzie wytwarzania związków według wynalazku (fig. 1), ω-funkcjonalnie derywatyzowanym aminokwasem, jest kwas a-amino-m-hydroksylowy, taki jak seryna lub homoseryna, którą poddaje się seriom reakcji N-zabezpieczenia (np. w postaci pochodnej t-butoksykarbonylowej), utworzenie estru benzylowego przez podstawienie O-alkilowe karboksylanu oraz fosforylację grupy funkcyjnej OH w celu wprowadzenia zabezpieczonej grupy fosforanowej. Typowymi grupami zabezpieczającymi fosforanów mogą być grupa fenylowa, benzylowa lub o-ksylilowa. Grupa fenylowa jest aktualnie zalecana. Następnie, aminową grupę funkcyjną uwalnia się przez usunięcie grupy zabezpieczającej (np. przez traktowanie pochodnej t-butoksykarbonylowej kwasem trifluorooctowym), następnie podstawionej acylem przez aktywowaną pochodną kwasu tłuszczowego, korzystnie pochodną kwasu 3-hydroksytetradekanowego, takiego jak kwas 3-dodekanoiloksytetradekanowy. Formą aktywowaną może być chlorek acylu, aktywowany ester, mieszany bezwodnik lub każdy inny rodzaj pozwalający na tworzenie wiązania amidowego. Następnie, ester benzylowy usuwa się przez selektywną wodorlizę, z uzyskaniem kwasu karboksylowego niosącego grupę acyloamidową w pozycji α oraz grupy (RO)2P(O)- w pozycji ω.
Partnera reakcji sprzęgania peptydu otrzymuje się korzystnie z α,ω-diaminokwasu, takiego jak ornityna lub lizyna, przez serie etapów reakcji zabezpieczania, które są selektywne w stosunku do aminowej grupy funkcyjnej w pozycji ω, np. w postaci pochodnej benzyloksykarbonylowej, za pomocą kompleksu miedziowego zgodnie z metodą opisaną w [Organic Preparations and Procedures International, 23 (1992): 191-194], usunięcie kompleksu miedziowego i zabezpieczenie aminowej grupy funkcyjnej w pozycji α np. w postaci pochodnej t-butoksykarbonylowej. Można stosować inne grupy zabezpieczające. Wolną karboksylową grupę funkcyjną przekształca się przez redukcję do alkoholu pierwszorzędowego przy użyciu, np. kompleksu borowodorowodimetylosiarczkowego albo przez traktowanie wstępnie utworzonego mieszanego bezwodnika borowodorkiem sodu, zgodnie z metodą opisaną w [Tetrahedron Letters, 32 (1991) 923-926]. Aminową grupę funkcyjną w pozycji α uwalnia się w środowisku kwaśnym (np. przez traktowanie kwasem trifluorooctowym), następnie poddaje podstawieniu N-acylowemu aktywowaną pochodną kwasu tłuszczowego, korzystnie pochodną kwasu 3-hydroksytetradekanowego, taką jak kwas 3-benzyloksytetradekanowy. Jeśli trzeba, wolną grupę funkcyjną OH zabezpiecza się na tym etapie np. w postaci eteru benzyloksymetylowego. Funkcyjną grupę ω-aminową uwalnia się przez traktowanie odczynnikiem zgodnym z innymi obecnymi grupami zabezpieczającymi np. przez selektywną wodorolizę w rozpuszczalniku typu alkoholowego, zawierającym trietyloaminę, jeśli grupą zabezpieczającą jest grupa benzyloksykarbonylowa.
W aktualnie zalecanej metodzie syntezy, tak otrzymaną aminę sprzęga się za pomocą kwasu a-acyloamino-ff>-fosforylokarboksylowego, wytworzonego jak opisano powyżej, w obecności IIDQ lub innego odczynnika sprzęgającego peptyd, uzyskując zabezpieczony fosforylowany związek podobny do dipeptydu. Ten produkt podstawia się O-acylo przy wciąż wolnej hydroksylowej grupie funkcyjnej z użyciem ω-funkcjonalną pochodną kwasu, takiego jak kwas 6-heptenowego, w obecności EDCl lub innego odczynnika estryfikującego (fig. 5). Alkenylową grupę funkcyjną tego estru poddaje się reakcji dihydroksylowania w obecności tetratlenku osmu, w ilościach katalitycznych albo stechiometrycznych, następnie grupy zabezpieczające fosforanu oraz hydroksylową grupę funkcyjną ewentualnie obecną w postaci eteru benzylowego, usuwa się przez wodorolizę w obecności odpowiedniego katalizatora (przykład 2.1). W ostatnim etapie, sąsiednią grupę diolową poddaje się reakcji utlenienia, tak jak np. przy użyciu przejściowego kwasu, w celu utworzenia reaktywnej aldehydowej grupy funkcyjnej (przykład 2.2). Redukacja aldehydowej grupy funkcyjnej do alkoholu pierwszorzędowego powoduje powstanie pochodnej niosącej grupę ω-hydroksyacylową (przykład 2.9).
Jako alternatywa do tej metody, otrzymany produkt sprzężenia peptydu poddaje się podstawieniu O-acylowemu przy użyciu pochodnej kwasu ω-aminoalkanowego, takiej jak kwas 6-benzyloksykarbanoiloaminoheksanowego (fig. 11). Produkt tak otrzymany poddaje się pełnej reakcji odbezpieczania przez wodorolizę w obecności odpowiedniego katalizatora, w celu zapewnienia związku
PL 208 584 B1 podobnego do dipeptydu, niosącego aminoalkanoilową pomocniczą sekwencję łańcucha bocznego (przykład 2.6).
W drugiej zalecanej metodzie, pertnerem kwasowym reakcji sprzęgania peptydu jest pochodna kwasu D- lub L-asparaginowego lub ewentualnie kwasu D- lub L-glutaminowego (fig. 2). Pochodną kwasu asparaginowego otrzymuje się przez N-acylowanie aminowej grupy funkcyjnej tego estru β-benzylowego aminokwasu, przez reakcję z kwasem tłuszczowym, korzystnie pochodną kwasu 3-hydroksy tłuszczowego, taką jak kwas 3-dodekanoiloksytetradekanowy, w obecności czynnika podstawiania acylowego. Produkt ten sprzęga się z aminoalkoholem wcześniej wymienionego typu, i tak otrzymany związek podobny do dipeptydu poddaje się następnie albo reakcji wodorolizy w obecności katalizatora, takiego jak pallad na węglu lub substrat powlekany platyną, w celu zapewnienia związku podobnego do dipeptydu niosącego grupę funkcyjną kwasu karboksylowego (przykład 1.2), albo reakcji fosforylacji, np. metodą fosforoamidynową, po czym reakcji wodorolizy z uzyskaniem związku podobnego do dipeptydu niosącego grupę funkcjonalną kwasu karboksylowego i kwasu fosforowego (przykład 1.3).
Alternatywnie, hydroksylową grupę funkcyjną poprzednio otrzymanego związku podobnego do dipeptydu (fig. 2) acyluje się kwas podstawionym ω-funkcjonalnie. Korzystnie, ten kwas podstawiony ω-funkcjonalnie jest kwasem ω-alkenowym lub kwasem ω-alkanowym. W przypadku stosowania kwasu heptenowego (fig. 8), związek podobny do dipeptydu ostatecznie daje pochodną O-heptenoilową, którą później poddaje się reakcjom dihydroksylowania w obecności tetratlenku osmu, a potem reakcjom odbezpieczenia (przykład 2.3) i okresowego utlenienia (przykład 2.4), przez co redukcja tak utworzonej aldehydowej grupy funkcyjnej czynnikiem redukującym, takim jak np. borowodorek sodu, daje związek podobny do dipeptydu niosący ω-hydroksyalkanoilową grupę funkcyjną (przykład 2.5). W przypadku stosowania kwasu ω-aminoalkanowego, takiego jak kwas N-benzyloksykarbonylo-6-aminoheksanowego lub pochodnej glicynowej (fig. 24), acylowanie związku podobnego do dipeptydu daje zabezpieczone pochodne O-aminoacylowe, które następnie poddaje się reakcji odbezpieczenia przez wodorolizę (przykład 2.13 i 2.18).
W drugim wariancie tej procedury (fig. 13), pośredni związek podobny do dipeptydu, opisany w fig. 2, poddaje się reakcji zabezpieczenia przy wolnej hydroksylowej grupie funkcyjnej, korzystnie w postaci eteru etrahydropiranylowego, następnie estryfikowaną karboksylową grupę funkcyjną odbezpiecza się kolejno przez wodorolizę lub jakąś inną metodą odbezpieczania, redukuje, korzystnie po aktywacji do mieszanego bezwodnika, za pomocą czynnika redukującego, takiego jak borowodorek sodu; otrzymaną hydroksylową grupę funkcyjną poddaje się reakcji fosforylacji, korzystnie metodą fosforoamidynową, a następnie eter tetrahydropiranylowy hydrolizuje się w warunkach kwasowych, a regenerowaną przez to hydroksylową grupę funkcyjną poddaje się reakcji acylowania z użyciem kwasu karboksylowego podstawionego ω-funkcjonalnie. Korzystnie, kwasem karboksylowym podstawionym ω-funkcjonalnie jest kwas ω-alkenowy lub kwas ω-aminoalkanowy. W przypadku kwasu 6-benzyloksykarbonyloaminokeksanowego, związek podobny do dipeptydu daje zabezpieczoną pochodną O-aminoacylową, którą potem poddaje się reakcji wodorolizy (przykład 2,7, 2,8). Alternatywnie, monofosforylowany związek pośredni z poprzedniej sekcji, można otrzymać (fig. 15) przez sprzęganie peptydu β-benzyloestru kwasu N-acyloasparaginowego, redukując go do alkoholu pierwszorzędowego, fosforylując wymienioną grupę funkcyjną i odbezpieczając zabezpieczoną alkoholową grupę funkcyjną w postaci albo eteru benzyloksymetylu, tetrahydropiranylu albo sililu.
W trzecim wariancie tej procedury, pośredni związek podobny do dipeptydu, opisany w fig. 2, poddaje się reakcji O-acylowania (fig. 27) przy użyciu pochodnej kwasu dikarboksylowego, korzystnie bezwodnika bursztynowego, w obecności zasady lub czynnika sprzęgającego, następnie nowo utworzony ester poddaje się reakcji odbezpieczenia przez wodorolizę (przykład 2.19). Traktowanie odbezpieczonych pochodnych O-aminoacylowych bezwodnikiem bursztynowym daje związki pochodne dipeptydu niosące grupę sukcynyloaminoacylową (przykład 2.17).
Zgodnie z trzecią zalecaną metodą, aminoalkoholem otrzy manym z ornityny lub lizyny jak opisano powyżej, jest ω-alkenylotriflan, taki jak hept-6-enylotriflan (fig. 17). Sprzęganie tego aminoalkoholu, niosącego drugorzędową aminę z kwasem a-acyloamino-rn-fosforylowym opisanym powyżej, w obecności EDCl lub innego czynnika acylującego, daje ester. Następnie grupę alkenylową poddaje się reakcji dihydroksylowania, w obecności tetratlenku osmu, a potem usuwa grupy zabezpieczające, przez wodorolizę w obecności odpowiedniego katalizatora, a sąsiednią diolową grupę funkcyjną utlenia się nadjodanem sodu z utworzeniem reaktywnej aldehydowej grupy funkcyjnej (przykład 2.10).
PL 208 584 B1
Zgodnie z czwartą zalecaną metodą (fig. 19), N-zabezpieczoną pochodną serynową, np. pochodną p-metoksybenzyloksykarbonylową wytworzoną zgodnie z metodą opisaną w Synthesis (1989), 36-37, podstawia się O-alkilem z użyciem bromooctanu benzylu. Grupę zabezpieczającą aminowej grupy funkcyjnej usuwa się, np. traktując kwasem trifluorooctowym w dichlorometanie, a aminową grupę funkcyjną N-acyluje się, korzystnie pochodną kwasu 3-hydroksytłuszczowego, takiego jak kwas 3-dodekanoiloksytetradekanowy, w obecności czynnika acylującego lub przy użyciu chlorku kwasowego albo każdej innej aktywowanej postaci kwasu tłuszczowego. Tak otrzymaną pochodną N-acylo-O-alkiloseryny sprzęga się z aminoalkoholem opisanym powyżej (fig. 1), w obecności czynnika sprzęgającego peptyd, takiego jak IIDQ, a wolną grupę funkcyjną OH podstawia się następnie acylem, z użyciem kwasu alkanowego derywatyzowanego ω-funkcjonalnie, w obecności odczynnika, takiego jak karbodiimid. Korzystnie, tym funkcjonalnie derywatyzowanym kwasem jest kwas ω-alkenowy lub pochodna kwasu ω-aminoalkanowego. Przykładowo, przy użyciu kwasu hept-6-enowego, związek podobny do dipeptydu ostatecznie daje pochodną O-(6-heptenoilo), którą poddaje się w kolejności reakcjom dihydroksylowania w obecności tetratlenku osmu, po czym wodorolizy i reakcjom odbezpieczenia przez utlenienie nadjodanem (przykład 2.11).
Zgodnie z piątą aktualnie zalecaną metodą, wyjściowym aminokwasem jest cysteina lub homocysteina (fig. 20). Przykładowo, cysteinę podstawia się S-alkilem z użyciem p-metoksybenzyloboromooctanem, następnie podstawia przy N-acylu korzystnie z użyciem pochodnej kwasu 3-hydroksytłuszczowego, w obecności czynnika acylującego lub przy użyciu halogenku kwasowego albo każdej innej aktywowanej postaci takiego kwasu tłuszczowego. Tak otrzymaną pochodną S-alkilo-N-acylocysteiny sprzęga się z 5-amino[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-pentan-1-olem w obecności IIDQ lub innego czynnika sprzęgania peptydu. Wolną grupę funkcyjną OH poddaje się następnie podstawieniu O-acylowemu z użyciem kwasu alkanowego podstawionego ω-funkcjonalnie, stosowanego w postaci aktywowanego estru, takiego jak ester O-benzotraolilowego. Korzystnie, tym kwasem jest kwas ω-aminoalkanowy, taki jak kwas 7-(p-metoksybenzyloksykarbonyloamino)heptanowy. Tak otrzymany produkt poddaje się pełnej reakcji odbezpieczania w wodnym środowisku kwasowym, aby przez to zapewnić związek podobny do dipeptydu, niosący pomocniczą 7-aminoheptanoilową sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego (przykład 2.12).
W innej zalecanej metodzie (fig. 21), serynową pochodną N-p-metoksybenzyloksykarbonylową podstawia się O-alkilem z użyciem dibenzylometylenomalonianu w warunkach alkalicznych. Aminową grupę zabezpieczającą usuwa się przez traktowanie kwasem, następnie tak uwolnioną aminową grupę funkcyjną poddaje się podstawieniu N-acylowemu, korzystnie pochodną kwasu 3-acylohydroksytłuszczowego, takiego jak kwas 3-dodekanoiloksytetradekanowego, w obecności czynnika acylującego lub pochodnej funkcjonalnej kwasu tłuszczowego, takiej jak chlorek kwasowy lub każda inna aktywowana postać takiego kwasu tłuszczowego. Tak otrzymaną pochodną N-acylo-O-alkiloseryny sprzęga się z aminoalkoholem opisanym powyżej (fig. 1) w obecności IIDQ lub każdego innego czynnika sprzęgania peptydu. Następnie, związek podobny do dipeptydu podstawia się O-acylem przy wolnej grupie funkcyjnej OH, z użyciem pochodnej ω-funkcjonalnie derywatyzowanego kwasu, np. przy użyciu kwasu hept-6-enowego. Wobec tego, związek podobny do dipeptydu daje pochodną O-(6-heptenoilową), którą następnie poddaje się reakcjom dihydroksylowania w obecności tetra-tlenku sodmu, potem reakcjom odbezpieczania przez wodorolizę i reakcji utlenienia nadjodanem, aby ostatecznie otrzymać pochodną mającą 6-oksoheksanoilową pomocniczą sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, jak również grupę malonylową (przykład 2. 13).
W równie zalecanej alternatywnej metodzie (fig. 22), pochodną 6-aminoheksanoilową wymienioną powyżej (fig. 11) N-acyluje się grupą bromoacetamidową, przy użyciu np. kwasu estru kwasu bromooctowego i O-sukcynoimidylu jako czynnika acylującego. Reakcja ta prowadzi do pochodnej niosącej 6-(bromoacetamido)heksanoilową pomocniczą sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego (przykład 2.14).
Zgodnie z ósmą zalecaną metodą (fig. 23), ester benzylowy O-fosforyloseryny (patrz fig. 1) poddaje się podstawieniu N-acylu kwasem 3-benzyloksytetradekanowym, korzystnie z użyciem mieszanego bezwodnika wytworzonego z kwasu 3-benzylotetradekanowego i chloromrówczanu izobutylu. Następnie, ester benzylowy poddaje się selektywej wodorolizie, jak ustalono powyżej. W ω-N-benzyloksykarbonylodiaminoalkoholu otrzymanym z ornityny (patrz fig. 1) Na-acyl podstawia się kwasem 3-dodekanoiloksytetradekanowym w obecności czynnika sprzęgającego lub przy użyciu aktywowanego estru lub każdej innej aktywowanej postaci kwasu tłuszczowego, a grupę funkcyjną ω-aminową uwalnia się przez selektywną wodorolizę. Tę aminę sprzęga się z pochodną N-(3-benzyloksytetra20
PL 208 584 B1 dekanoilo-O-(difenylooksyfosforylo)homoserynową w obecności IIDQ lub innego czynnika sprzęgającego peptyd. Tak otrzymany związek podobny do dipeptydu podstawia się przy O-acylu ω-funkcjonalnie derywatyzowanym kwasem alkanowym, np. w obecności karbodiimidu. Korzystnie, kwasem tym jest pochodna O-(6-heptenoilowa), którą kolejno poddaje się reakcjom dihydroksylowania w obecności tetratlenku osmu, potem procesowi odbezpieczania przez wodorolizę w obecności odpowiedniego katalizatora, oraz reakcji utlenienia nadjodanem, aby wreszcie zapewnić pochodną niosącą 6-oksoheksanoilową grupę pomocniczą.
Zgodnie z dziewiątą zalecaną metodą (fig. 29, 31 i 34), pośredni związek podobny do dipeptydu, opisany w fig. 2, poddaje się reakcji odbezpieczenia przy zestryfikowanej karboksylowej grupie funkcyjnej, a następnie tę karboksylową grupę funkcyjną sprzęga się z funkcjonalnie podstawionym aminoalkanem, w obecności czynnika sprzęgającego. Korzystnie, funkcjonalnie podstawionym aminoalkanem jest pochodna ω-diaminoalkanowa lub aminokwasowa. W przypadku 1-amino-3-benzyloksykarbonyloaminopropanu (fig. 29), produkt reakcji sprzęgania poddaje się potem reakcji wodorolizy (przykład 2.20). W przypadku N\Z-lizynobenzyloestru, (fig. 31) oraz α,β-dibenzyloasparaginianu (fig. 34), produkt reakcji sprzęgania poddaje się albo reakcji odbezpieczania, korzystnie przez wodorolizę (przykład 2.21 i 2.23) albo reakcji O-acylowania za pomocą ω-funkcjonalnie podstawionego kwasu alkanowego, korzystnie pochodnej kwasu N-benzyloksykarbonylo-6-aminoheksanowego. Otrzymany ester odbezpiecza się później przez wodorolizę lub inną metodą odbezpieczania (przykład 2.22 i 2.24).
Przedmiotem wynalazku są także enancjomery i diastereo-izomery związków o ogólnych wzorach I, IV, XI, XII i XVI lub XVIII.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca składnik aktywny w połączeniu lub w domieszce z farmaceutycznie dopuszczalnym obojętnym, nietoksycznym nośnikiem lub zaróbką, gdzie jako składnik aktywny zawiera co najmniej jeden związek o ogólnym wzorze I albo w postaci mieszaniny racemicznej lub postaci aktywnej optycznie, w postaci czystych diastereoizomerów lub ich mieszaniny, w stanie obojętnym lub naładowanym.
Wynalazek obejmuje także kompozycję farmaceutyczną zawierającą jako składnik aktywny, co najmniej jedną sól związku o ogólnym wzorze I, razem z zasadą organiczną lub mineralną przeznaczoną do stosowania terapeutycznego.
Wynalazek odnosi się także do kompozycji farmaceutycznych zawierających związek o ogólnym wzorze I, w postaci czystego enancjomeru lub diastereoizomeru lub ich mieszaniny, w połączeniu lub w domieszce z farmaceutyczną zaróbką lub nośnikiem.
Wynalazek obejmuje także kompozycję zawierającą związek określony w zastrz. 1, szczepiony na antygenie lub na nośniku farmaceutycznym.
Wśród preparatów farmaceutycznych według wynalazku, odpowiednie są te, do podawania drogą śluzówkową, przezskórną, miejscową, pozajelitową, doustną lub przez inhalację, tak jak np. w tabletkach, kapsułkach, roztworach lub zawiesinach do wstrzyknięć, sprejach, żelach, plastrach lub roztworach do szybkiej absorpcji.
Korzystnie, związki według wynalazku można szczepić na antygenie w celu modulacji odpowiedzi immunologicznej lub także szczepić na nośniku farmaceutycznym, w celu wzmocnienia efektu terapeutycznego lub jego nacelowania i podawać przez wstrzyknięcie w postaci koniugatów w roztworach wodnych lub zawiesinach, ewentualnie zobojętnionych aminą lub hydroksyalkiloaminą. Przykładowo, należy wymienić antygen H1N1, antygen nonapeptydowy SYVPSAEQI z Plasmodium oraz nośniki farmaceutyczne, takie jak AZT, d4T, jak również antybiotyki, takie jak makrolidy i substancje, które działają na centralny układ nerwowy CNS.
Wynalazek obejmuje także zastosowanie związku określonego w zastrz. 1, szczepionego na antygenie, albo szczepiongo na nośniku farmaceutycznym, do wytwarzania kompozycji określonej przeznaczonej do terapii w chorobach immunologicznych.
Następujące nieograniczające przykłady są przeznaczone do dodatkowego zilustrowania wynalazku. Są one opisane w fig. 1 do 86.
P r z y k ł a d y
1-sza seria przykładów: Wytwarzanie pośrednich związków syntezy;
P r z y k ł a d 1.1
1-(difenyloksyfosforyloksy)-3-[(R)-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-dekan-10-ol (fig. 1)
PL 208 584 B1
1.1.1. Kwas 4-(difenyloksyfosforyloksy)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]butanowy
a. N-Terbutyloksykarbonylo-DL-homoseryna
Do roztworu bromowodzianu homoseryny (2 g; 16,78 mmola) w H2O (20 ml), dodano, w kolejności, 1 M roztwór NaOH (16,78 ml) i węglan cezu (3,01 g; 9,23 mmola). Po mieszaniu przez 5 minut, roztwór ochłodzono w łaźni lód/woda. Następnie dodano dioksan (60 ml) i pirowęglan t-butylu. Mieszaninę reakcyjną utrzymywano przy mieszaniu w łaźni z lodowatą wodą przez 1 godzinę, a potem w temperaturze pokojowej przez 5 godzin. Rozpuszczalnik odparowano następnie pod próżnią i suchą pozostałość użyto bezpośrednio w następnym etapie.
b. Benzylo-N-t-butyloksykarbonylo-DL-homoserynian
Do pozostałości z etapu poprzedniego, dodano dimetyloformamid (20 ml) i rozpuszczalnik odparowano do sucha. Następnie, do mieszaniny reakcyjnej dodano dimetyloformamid (60 ml) i bromek benzylu (4,5 ml; 20,13 mmola). W tym momencie utworzył się biały osad. Mieszaninę utrzymywano przy mieszaniu przez 16 godzin. Rozpuszczalnik następnie odciągnięto pod próżnią i pozostałość ekstrahowano octanem etylu (2 x 20 ml). Warstwę organiczną przemywano kolejno H2O (20 ml) i solanką (20 ml). Po wysuszeniu nad MgSO4, rozpuszczalnik odparowano i pozostałość stosowano jako taką w następnym etapie.
c. Benzylo-N-t-butyloksykarbonylo-O-(difenyloksyfosforylo)-DL-homoserynian
Do suchej pozostałości z etapu poprzedniego rozpuszczonej w CH2CI2 (60 ml), dodano 4-N,N-dimetyloaminopirydynę (DMAP) (4,11 g; 33,56 mmola). Mieszaninę reakcyjną miesza przez 10 minut, i następnie dodano pirydynę (12 ml) oraz difenylochlorofosforan (6,95 ml; 33,56 mmola). Roztwór miesza w temperaturze pokojowej przez 18 godzin, a następnie przemywa kolejno 1N HCl (5 x 20 ml), H2O (30 ml) i solanką (30 ml). Warstwę organiczną wysuszy nad MgSO4 i rozpuszczalnik odprowadzono pod próżnią. Przeprowadzając oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (wymywanie z użyciem mieszaniny heksan/octan etylu 4/1), fosforylowany produkt (7,49 g; 82,4%) odzyskano w postaci krystalicznego ciała stałego. Temperatura topnienia: 63,5-64,0°C.
d. Sól trifluorooctowa benzylo-O-(difenyloksyfosforylo)-DL-homoserynianu.
Fosforylowany produkt z etapu poprzedniego (7,88 g; 15,4 mmola) rozpuszczony w kwasie trifluorooctowym (15 ml) utrzymywano przy mieszaniu w temperaturze pokojowej przez 2,5 godziny. Następnie rozpuszczalnik odciągnięto pod wysoką próżnią i prowadzono etap oczyszczania przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (10/1 MeOH/CH2Cl2 eluent), aby odzyskać odbezpieczoną sól aminotrifluorooctową (7,17 g; 88,9%) w postaci krystalicznego ciała stałego.
Temperatura topnienia = 73,0-73,5°C.
e. 2-[(R)-3-Dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-(difenyloksyfosforyloksy)butanian benzylu
Kwas (R)-3-dodekanoiloksytetradekanowy (4,284 g; 10,07 mmola, 1 równoważnik) wytworzony zgodnie z metodą opisaną w [Bull. Chem. Soc. Jpn., 60 (1987), 2205-2214], rozpuszczono w tetrahydrofuranie THF (30 ml) i roztwór ochłodzono do temperatury -15°C. Następnie dodano N-metylomorfolinę (1,108 ml; 10,07 mmola, 1 równoważnik) i chloromrówczan izobutylu (1,31 ml; 10,07 mmola; 1 równoważnik). Mieszaninę reakcyjną utrzymywano przy mieszaniu przez 30 minut w temperaturze -15°C. Do mieszaniny reakcyjnej, dodano następnie O-(difenyloksyfosforylo)-DL-homoserynian benzylu (5,724 g; 10,07 mmola; 1 równoważnik) w mieszaninie THF/Et3N (30 ml/5 ml). Po mieszaniu przez 18 godzin w temperaturze pokojowej, rozpuszczalnik odprowadzono pod próżnią. Pozostałość rozcieńczono H2O (20 ml), a następnie ekstrahowano octanem etylu (2 x 30 ml). Warstwy organiczne zlano, przemywa w kolejności wodą (20 ml) i solanką (20 ml) i wysuszy nad MgSO4 z odparowaniem rozpuszczalnika. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent heksan/octan etylu 2/1), żądany benzyl ester odzyskano (7,455 g; 87%) w postaci krystalicznego ciała stałego.
Temperatura topnienia = 31,0°-32,1°C,
NMR 1H (CDCI3, 250 MHz), δ w ppm: 7,4-7,1 (m, 15H), 6,90 (2d, 1H, 3J= 7,6 Hz, NH), 5,3-5,1 (m, 3H), 4,7 (m, 1H), 4,35 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 2,4-2,1 (m, 4H), 1,6 (m, 4H), 1,4-1,1 (m, 34H), 0,9 (t, 6H).
NMR 13C (CDCl3, 63 MHz), δ w ppm: 173,01, 171,08, 169,66, 150,18, (d, 2JP,C = 7,1 Hz), 135,01, 129,60, 128,33, 128,14, 127,96, 125,21, 119,80 (d, 3JP,C = 5,0 Hz), 70,69, 67,05, 65,19 (d, 2JP,C = 5,6 Hz), 49,13, 40,97, 40,77 (2 diast.), 34,20, 33,98, 33,82, 31,70, 29,42, 29,34, 29,14, 28,94, 25,01, 24,77, 22,47, 13,91.
PL 208 584 B1
f. Kwas 4-(difenyloksyfosforyioksy)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]butanowy
Roztwór estru benzylowego otrzymany w poprzednim etapie (2,23 g; 2,6 mmola) w metanolu MeOH stopnia HPLC (300 ml) uwodorniano w trójszyjnej kolbie okrągłodennej, w obecności 10% palladu na węglu (1 g) w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru przez 1 godzinę. Katalizator odsączono następnie i przesącz zatężono, otrzymując bezbarwną ciecz. Produkt ten był jednorodny co oszacowano przez chromatografię cienkowarstwową i NMR, i stosowano bezpośrednio bez dodatkowego oczyszczania w etapie sprzęgania;
Rf = 0,75 (CH2Cl2-MeOH - Et3N, 10/1/0,5).
NMR 1H (CDCI3, 250 MHz), δ w ppm: 7, 4-7,1 (m, 10H), 6,85 (2d, 1H, NH), 5,15 (m, 1H), 4,6 (m, 1H), 4,35 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 2,4-2,15 (m, 4H), 1,6 (m, 4H), 1,4-1,1 (m, 34H), 0,9 (t, 6H).
NMR 13C (CDCI3, 63 MHz), δ w ppm: 173,35, 173,30 (2 diast.), 172,75, 170,37, 150,0 (d, 2JP,C = 7,5 Hz), 129,55, 125,28, 119,71 (d, 3JP,C = 4,4 Hz), 70,78, 65,65, (d, 2JP,C = 5,9 Hz), 49,00, 40,77, 40,63 (2 diast.), 34,13, 33,86, 33,76, 31,59, 29,31, 29,25, 29,03, 28,82, 24,88, 24,68, 22,36,
13,76.
1.1.2. (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentan-1-ol
1. Sól miedziowa D-ornityny
Do roztworu D-ornityny (5,25 g; 30 mmoli) w 1 M NaOH (30 ml), dodano roztwór pięciowodzianu siarczanu miedzi (3,814 g; 15,3 mmola) w wodzie (50 ml). Po mieszaniu przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, rozpuszczalnik odparowano do sucha. Do pozostałości dodano metanol (60 ml) tworząc purpurowe ciało stałe, które oddziela, przemywa w kolejności dioksanem i metanolem, do bezpośredniego użycia w następnym etapie.
b. (2R)-2-Amino-5-(benzyloksykarbonyloamino)pentanian miedzi
Purpurowo zabarwione ciało stałe rozpuszczono w 1N NaOH (40 ml) i dioksanie (70 ml), mieszaninę reakcyjną ochłodzono w łaźni z lodowatą wodą i następnie dodano chloromrówczan benzylu (5,14 ml; 36 mmoli). Po mieszaniu w łaźni z lodowatą wodą przez 3 godziny i potem w temperaturze pokojowej przez 15 godzin, purpurowy osad odzyskano przez filtrację i przemywano kolejno 95% EtOH (40 ml), H2O (50 ml) i EtOH (60 ml). Osad wysuszono w piecu (T < 45°C, pod próżnią); wydajność dwuetapowego procesu wynosiła 8,27 g, czyli 93% wydajności przewidywanej, (odniesienie: Organic Preparations i Procedures International. 23: (1992) 191 - 194).
c. Kwas (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-(terbutyloksykarbonyloamino)pentanowy
Sól miedzi otrzymaną w poprzednim etapie rozpuszczono w 2N HCl (400 ml) i dodano do niej kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) (8,15 g, 27,8 mmola). Mieszaninę miesza przez 2,5 godziny, i zobojętniono do pH 7 przez dodanie 5N NaOH (około 160 ml). W tym momencie wytworzył się biały osad. Mieszaninę następnie mieszano przez 2,5 godziny w łaźni z lodowatą wodą. Osad przesączono, przemyto zimną wodą do uzyskania bezbarwnego wymywanego płynu, następnie suszono w piecu poniżej 60°C. To ciało stałe rozpuszczono w 1N NaOH (156 ml) i roztwór ochłodzono w łaźni z lodowatą wodą. Do tego roztworu, dodano pirowęglan t-butylu (7,7 g; 35,2 mmola) w dioksanie (160 ml). Mieszaninę mieszano w temperaturze 0°C przez 45 minut i potem przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik organiczny odparowano i dodano octan etylu (70 ml) aby rozpuścić pozostałość. Warstwę wodną zakwaszono następnie przez dodanie 2N HCl do pH = 3, przemyto AcOEt (100 ml). Warstwy organiczne połączono i przemyto H2O (30 ml) i solanką (30 ml), następnie odparowano pod próżnią. Prowadząc oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/MeOH 20/1), żądany product odzyskano w postaci bezbarwnego oleju (Wydajność: 8,42 g w dwóch etapach czyli 76,6% wydajności przewidywanej).
(Rf = 0,19, 20/lCH2Cl2/MeOH)
d. (2R)-5-(Benzyloksykarbonyloamino)-2-(terbutyloksykarbonyloamino)pentan-1-ol
Do zimnego roztworu (-15°C) pochodnej kwasu diaminopentanowego otrzymanego poprzednio (5,45 g; 14,8 mmola) w THF < (60 ml), dodano N-metylomorfolinę (1,654 ml; 14,8 mmola) i chloromrówczan izobutylu (IBCF) (9,6 ml; 14,8 mmola). Mieszaninę reakcyjną miesza w temperaturze -15°C przez 1 minutę po czym dodano borowodorek sodu (5,1 g; 44,6 mmola) w 10 ml wody. Po dodatkowym mieszaniu przez 10 minut w temperaturze -15°C, do mieszaniny dodano H2O (400 ml) aby zatrzymać reakcję. Roztwór następnie przemyto octanem etylu AcOEt (100 ml x 2). Warstwy organiczne połączono i przemyto H2O (50 ml) i solanką (60 ml) następnie wysuszono nad MgSO4. Rozpuszczalnik usunięto i pozostałość rekrystalizowano z mieszaniny octan etylu/heksan zapewniając oczekiwany krystaliczny produkt (4,94 g; wydajność 94,9%).
Temperatura topnienia = 47,5-48°C.
PL 208 584 B1
e. Sól trifluorooctowa (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino-2-amino-pentan-1-olu.
Wytworzono roztwór (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-(terbutyloksykarbonyloamino)-pentan-1-olu (6,32 g; 18 mmoli) jaki otrzymano powyżej w kwasie trifluorooctowym (25 ml) poddano następnie mieszaniu przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik potem odparowano i pozostałość oczyszczono przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent MeOH/CH2Cl2 10/1) aby odzyskać sól trifluorooctową w postaci oleju (5,45 g; 82,7%). Związek chlorowodorowy topi się w temperaturze 133,00-134,3°C (rekrystalizacja z metanolu).
f. (2R)-5-(Benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentan-1-ol.
Do roztworu kwasu (R)-S-benzyloksytetradekanowego (5,27 g; 15,8 mmola) [Bull. Chem. Soc. Jpn.. 60: (1987), 2197-2204] w THF (30 ml), który ochłodzono do temperatury -15°C, dodano N-metylomorfoliny (1,89 ml 15,8 mmola) i chloromrówczanu izo-butylu (2,21 ml, 15,8 mmola). Po mieszaniu mieszaniny reakcyjnej w temperaturze -15°C przez 30 minut, dodano roztwór soli trifluorooctanowej jaki otrzymano powyżej (15,25 g; 14,4 mmola) w mieszaninie THF/Et3N (30 ml, 1,44 ml). Mieszanie kontynuowano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin, następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono H2O (30 ml) i AcOEt (60 ml). Warstwę organiczną oddzielono i warstwę wodną przemyto octanem etylu AcOEt (60 ml). Warstwy organiczne zlano i przemyto H2O (30 ml) i solanką (30 ml), następnie wysuszono nad MgSO4 przed przeprowadzeniem odparowania rozpuszczalnika pod próżnią. Pozostałość rekrystalizowano z mieszaniny octan etylu/heksan z ostatecznym uzyskaniem oczekiwanego produktu w stanie krystalicznym (5,8 g; wydajność 71,2%).
Temperatura topnienia = 117,5-118°C.
Rf = 0,32, 3/1 octan etylu-eter naftowy.
NMR 1H (CDCl3, 250 MHz), δ w ppm: 7,4-7,2 (m, 10H), 6,5 (d, 1H, NH), 5,1 (s, 2H), 4,9 (m, 1H, NH), 4,5 (2d, AB, 2H), 3,8 (m, 2H), 3,5 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 2,4 (m, 2H) 1,6-1,4 (m, 6H), 1,4-1,2 (m, 18H), 0,9 (t, 3H).
NMR 13C (CDCI3, 63 MHz), δ w ppm: 172,24, 156,49, 138,06, 136,53, 128,46, 128,04, 127,87,
76,76, 71,39, 66,60, 65,44, 51,54, 41,43, 40,65, 33,76, 31,87, 29,61, 29,30, 28,01, 26,47, 25,05, 22,65, 14,09.
g. (2R)-5-Amino-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentan-1-ol
Do roztworu (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentan-1-olu (3,0 g; 5,27 mmola) w mieszaninie trietyloaminy Et3N (6 ml)/etanol EtOH stopnia HPLC (300 ml) w trójszyjnej kolbie, dodano katalizator (150 mg 20% pallad/węgiel). Powietrze wyładowano pod próżnią następnie kolbę załadowano wodorem. Mieszaninę reakcyjną uwodorniano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny następnie katalizator odsączono i przesącz zatężono, zapewniając żądany produkt w postaci jednorodnego ciała stałego.
Rf = 0,2, 5/1 0/0,5 CH2Cl2-MeOH-Et3N.
Temperatura topnienia= 47-48°C.
NMR 1H (CDCl3, 250 MHz), δ w ppm: 7,4-7,2 (m, 5H), 6,75 (d, 1H, NH) 4,5 (2d, AB, 2H), 3,9 (m, 2H), 3,5 (m, 2H), 2,3-2,6 (m, 7H), 1,7-1,2 (m, 24H), 0,9 (t, 3H).
NMR 13C (CDCI3, 63 MHz), δ w ppm: 171, 86, 138, 13, 128, 37, 127,87, 127,75, 76,81, 71,50, 64,57, 51,38, 41,51, 41,17, 33,89, 31,82, 29,26, 28,57, 28,03, 25,07, 22,60, 14,04.
1.1.3. 1-(Difenyloksyfosforyloksy)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]dekan-10-ol
Do roztworu kwasu (2RS)-4-(difenyloksyfosforyloksy)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-butanowego (850 g; 1,0 mmol; 1 równoważnik) w bezwodnym chlorku metylenu CH2Cl2 (20 ml) w temperaturze pokojowej i w atmosferze argonu, dodano IIDQ (2-izobutoksy-1-izobutoksykarbonylo1,2-dihydrochinolina) 364 g; 1,2 mmola, 1,2 równoważnika). Po mieszaniu przez 15 minut, dodano roztwór (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentan-1-olu (757; 1,0 mmol; 1 równoważnik) w bezwodnym CH2Cl2 (10 ml). Po mieszaniu przez 4 godziny, roztwór odparowano do sucha. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2//aceton 5/2), odzyskano fosforylowany związek podobny do dipeptydu (620 mg; 53%) w postaci bezkształtnego ciała stałego.
(Rf = 0,49, w mieszaninie dichlorometan-metanol-trietyloamina, 10/1/0,5).
NMR 1H (CDCI3, 250 MHz), δ w ppm: 7,40-7,15 (m, 15H), 7,00 (m, 1H), 6,90 i 6,80 (2d, 2 diast., 1H), 6,65 (d, 1H) (3 x NH), 5,15 (m, 1H), 4,50 (m, 3H), 4,30 (m, 2H), 3,85 (m, 2H), 3,45 (m, 2H), 3,15 (m, 2H), 2,41-2,14 (m, 8H), 1,6-1,4 (m, 8H), 1,4-1,1 (m, 54H), 0,9 (t, 9H, 3CH3).
PL 208 584 B1
NMR 13C (CDCI3, 63 MHz), δ w ppm: 173,11, 171,68, 170,52 (2 diast.), 169, 94 (2 diast), 150,0 (d, 2JP,C = 7,2 Hz), 138,0 (2 diast.), 129,58, 127,99, 127,49, 127,26, 125,24, 119,73 (t, 3JP,C = 5,0 Hz), 76,48, 71,12, 70,71, 65,86 (szeroki spin), 64,22, 50,96, 49,71 (szeroki spin), 41,46, 41,05, 39,07, 34,13, 34,00, 32,70, 31,61, 29,34, 29,06, 28,87, 27,98, 25,25, 24,92, 24,72, 22,38, 13,80.
P r z y k ł a d 1.2 a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowwego (=OM-197-MC) (fig. 2)
1.2.1. Ester β-benzylowy kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo-D-asparaginowy
Do roztworu kwasu (R)-3-dodekanoiloksytetradekanowego (3,35 g; 7,85 mmola) w bezwodnym THF (25 ml) w temperaturze -15°C i w atmosferze argonu, dodano w kolejności N-metylomorfolinę (0,86 ml; 7,85 mmola; 1 równoważnik) i chloromrówczan izobutylu (1,02 ml; 7,85 mmola; 1 równoważnik). Obserwowano szybkie tworzenie osadu chlorowodorku N-metylomorfoliny. Po mieszaniu przez 30 minut w temperaturze -15°C, dodano dostępny na rynku roztwór H-D-Asp(OBn)-OH (Senn Chemicals AG, Switzerland-Dielsdorf) (1,75 g; 7,85 mmola; 1 równoważnik) w mieszaninie 3,5/1 CH3CN/ /H2O (85 ml) zawierającej Et3N (3,7 ml). Mieszaninę reakcyjną następnie mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik organiczny odparowano następnie i warstwę wodną ochłodzono do temperatury 0°C, zakwaszono 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego do pH = 3 i ekstrahowano AcOEt (2x). Warstwę organiczną wysuszono nad MgSO4, przesączono i odparowano. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent eter naftowy/AcOEt zawierający 2% kwasu octowego, 2/1) po czym współodparowanie toluenu, odzyskano kwas [(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino-D-asparaginowy, ester β-benzylowy (4,00 g; 81%) w postaci białego krystalicznego ciała stałego.
(Rf = 0,42 w mieszaninie 1/1 eter naftowy/EtOAc zawierającej 2% kwasu octowego; związek fosfomolibdenowy i czynnik wywołujący barwę U.V.).
Temperatura topnienia = 67-69°C.
1.2.2. Ester β-benzylowy a-N-((4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloaminopentylo}amidu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego, (ASM-1)
Do roztworu estru β-benzylowego jaki otrzymano powyżej (363 mg; 0,57 mmola) i (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentan-1-olu (sekcja 1.1.2.) (250 mg; 0,57 mmola; 1,0 równoważnik) w bezwodnym CH2CI2 (6 ml) w temperaturze 0°C (łaźnia lód/woda), dodano w kolejności, w atmosferze argonu, dostępnego na rynku HOAt (1-hydroksy-7-azabenzotriazol) (94 mg, 0,69 mmola, 1,2 równoważnika) i dostępnego na rynku N,N'-diizopropylokarbodiimidu (109 μ!, 0,69 mmola, 1,2 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę w temperaturze 0°C i potem przez noc w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną następnie przemyto wodą, roztworem 1N HCl, i nasyconym roztworem NaHCO3 po czym oddzielono warstwy. Warstwę organiczną wysuszono nad MgSO4, przesączono i odparowano. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton 3/1), odzyskano produkt reakcji sprzęgania (436 mg; 72%) w postaci białego krystalicznego ciała stałego.
(Rf = 0,27 w mieszaninie CH2Cl2-aceton 5/1; związek fosfomolibdenowy i czynnik wywołujący barwę U.V.).
Temperatura topnienia = 106-108°C.
NMR 13C (62,89 MHz, CDCl3), δ w ppm: 173,66; 172,09; 171,73; 170,33; 170,12; 138,23; 135,28; 128,53; 128,37; 128,13; 127,81; 127,71; 125,81; 76,71; 71,40; 71,16; 66,77; 65,01; 51,36; 49,39; 41,66; 39,25; 34,40; 33,98; 31,85; 29,58; 29,47; 29,29; 29,11; 28,00; 25,57; 25,17; 25,08; 24,94; 22,62; 14,05.
1.2.3. a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloaminopentylo}amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowego (=OM-197-MC)
Roztwór kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego, estru β-benzylowego, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloaminopentylo}amidu (417 mg; 0,40 mmola) w mieszaninie 1/1 MeOH/EtOAc (36 ml) uwodorniano w obecności 10% Pd/węgiel (20 mg), w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru, przez 3 godziny. Katalizator odsączono, przemyto mieszaniną CH2Cl2/MeOH 4/1 (50 ml) i przesącz odparowano do sucha przez ssanie pompy próżniowej, uzyskując wolny kwas (345 mg; 100%) w postaci białego krystalicznego ciała stałego.
PL 208 584 B1 (Rf = 0,30 w mieszaninie 9/1 CH2Cl2/MeOH zawierającej 0,5% kwasu octowego; związek fosfomolibdenowy, wywoływacz barwy).
Temperatura topnienia 135-137°C.
ES/MS: współczynnik m/z 868,7 [M+H]+, 890,7 [M+Na]+, 868,7 [M+K]+, 912,7 [M-H+2Na]+ (fig. 3).
1.2.4. a-N-((4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloaminopentylo}amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego.
Postępowano według tego samego schematu reakcji, stosując dostępny na rynku H-L-Asp(Obn)-OH (Fluka, Buchs, Szwajcaria) aby ostatecznie otrzymać produkt epimerowy z szeregu L-asparaginowego.
P r z y k ł a d 1.3.
a-N-{(4R)-5-dihydroksyfosforyloksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego, (=OM-197-MC-MP) (fig. 2)
1.3.1. Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-dibenzyloksyfosforyloksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloaminopentylo}amid, ester β-benzylowy
Do roztworu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-pentylo]amidu, estru β-benzylowego, jaki otrzymano powyżej (300 mg; 0,29 mmola) oraz 1H-tetrazolu (60 mg; 0,86 mmola) w bezwodnym THF (12 ml) w temperaturze pokojowej i w atmosferze argonu, dodano 85% dibenzylodietylofosforamidyn (231 μ|; 0,66 mmola). Obserwowano szybkie tworzenie białych kryształów w środowisku reakcyjnym. Po mieszaniu przez 30 minut, mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury -20°C, następnie dodano roztwór mCPBA (57-86%; 183 mg; 1,06 mmo|a) w CH2C|2 (8 m|). Zauważono znikanie kryształów. Po mieszaniu przez 45 minut w temperaturze pokojowej, dodano nasycony roztwór Na2S2O3 następnie mieszaninę reakcyjną mieszano ponownie przez 10 minut. Roztwór rozcieńczono eterem, następnie warstwę organiczną oddzie|a i przemyto nasyconym roztworem Na2S2O3 (5x), nasyconym roztworem NaHCO3 (2x) i roztworem 1 M HC| (1x). Warstwę organiczną wysuszono nad MgSO4, przesączono i odparowano. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na że|u krzemionkowym (e|uent CH2C|2/aceton 5/1), odzyskano fosforotriester (294 mg; 79%) w postaci białego ciała stałego.
(Rf = -0,27 w mieszaninie 5/1 CH2C|2-aceton; związek fosfomo|ibdenowy i czynnik wywołujący barwę U.V.)
NMR 13C (62,89 MHz, CDC|3), δ w ppm: 173,66; 171,73; 171,01; 170,60; 170,03; 138,22; 135,50; 135,40; 135,28; 128,40; 128,33; 128,16; 128,08; 127,94; 127,82; 127,76; 127,53; 127,41; 76,43; 71,03; 70,90; 69,28; 66,47; 49,09; 48,37; 41,62; 41,36; 41,24; 39,02; 38,88; 25,05; 24,94; 24,82; 22,48; 13,90.
1.3.2. Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-((4R)-5-dihydroksyfosfory|oksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoi|oamino]penty|o}amid (=OM-197-MC-MP)
Roztwór dibenzy|ofosforanu jaki wytworzono powyżej (249 mg; 190 μ|) w EtOH stopnia HPLC (12 m|) uwodornia się w obecności 10% Pd/węgie| (30 mg) w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru, przez 4 godziny. Kata|izator odsącza się na fi|trze mi||ipore i przesącz odparowuje się do sucha, następnie pozostałość suszy się pompą próżniową otrzymując surowy wo|ny fosforan (180 mg; 100%).
ES/MS: m/z 850,7 [M+H-P(O)(OH)3+], 948,5 [M+H]+ 970,5 [M+Na]+ (fig. 4).
P r z y k ł a d 2.
Okreś|anie współczynnika epimeryzacji związków pośrednich syntezy
Stereochemię centrów chira|nych zawierających grupy acy|oaminowe okreś|a się przez konfigurację początkowo użytego aminokwasu. Jednakże sprzęganie peptydu przeprowadzone między pochodną kwasu asparaginowego |ub g|utaminowego i aminoa|koho|u otrzymanego od ornityny |ub |izyny, może prowadzić, w pewnych warunkach, do epimeryzacji przy Ca partnera kwasowego zaangażowanego w reakcję sprzęgania. Aby oszacować współczynnik epimeryzacji takiej reakcji, postępowano zgodnie z następującą metodą d|a związków pochodzących od kwasu asparaginowego.
Próbkę (30 μg) odparowano do mikrofiolki, następnie rozpuszczono w 40 μl 6M HCl. Hydroliza postępowała przez 24 godziny w temperaturze 110°C w atmosferze argonu. Próbkę następnie odparowano do sucha, i potem rozpuszczono w 100 0,1M buforu tetraboranowego, pH 9,2. Następnie przeprowadzono derywatyzację na kolumnie wstępnej z użyciem odczynnika OPA-IBLC (o-ftalodialdehydo-N-izobutyrylo-L-cysteina) w następujących proporcjach:
PL 208 584 B1 gl 0,1 M roztwór buforu tetraboranu sodu, pH 9,2 gl metanolu 170 mM OPA, roztwór 260 mM IBLC gl roztworu do testowania
Wykonując rozdzielanie HPLC na kolumnie Hypersil ODS (250 x 4,6 mm, 5 μm, Supelco), obie pochodne pochodzące od form L- i D- kwasu asparaginowego obecnego w próbce początkowej oceniono ilościowo (Bruckner i inni, 1995, J. Chromatography. A 711,201-215). Stosowane warunki dla przeprowadzenia HPLC były następujące:
Column: Hypersil ODS (250 x 4,6, 5 μm, Supelco)
Faza ruchoma: A: 23 mM octan sodu, pH 5,9
B: metanol-acetonitryl (121)
Wstrzyk: 5 μl
Prędkość przepływu: 1 ml/min
Etap wymywania: gradient A:B 96:4 do 80:20 w ciągu 25 minut
Detekcja: UV: 338
W tych warunkach chromatograficznych, obserwowano czas retencji wynoszący 16,1 i 17,2 minut dla pochodnych kwasu, odpowiednio, L- i D-asparaginowego.
2- ga seria przykładów: Wytwarzanie związków podobnych do dipeptydu zawierających pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego.
P r z y k ł a d 2.1.
3- [(R)-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-dihydrogenofosforan 10-(6,7-dihydroksyheptanian) (=OM-197-FV6) (fig. 5)
2.1.1. 1-(Difenyloksyfosforyloksy)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]dekan-10-ol (6-heptenian)
Do roztworu 1-(difenyloksyfosforyloksy)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-10-olu (fig. 1,1) (875 mg; 0,74 mmola) w bezwodnym CH2Cl2 (25 ml), dodano kwas 6-heptenowy (141 gl; 1,04 mmola; 1,4 równoważnika). Roztwór ochłodzono do temperatury 0°C. Następnie, dodano EDCl (64 mg; 0,33 mmola; 1,4 równoważnika) i DMAP (41 mg; 0,33 mmola; 0,14 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 minut w temperaturze 0°C i potem 3 godziny w temperaturze pokojowej. Po rozcieńczeniu CH2Cl2, warstwę organiczną przemyto w kolejności H2O, 1N roztworem HCl i H2O. Warstwę organiczną następnie wysuszono nad MgSO4, potem odparowano w temperaturze 40°C pod próżnią. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent eter naftowy/AcOEt 1/1), odzyskano 1-(difenyloksyfosforyloksy)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-dekan-10-ol 6-heptenian (820 mg; 85%) w postaci białej piany.
(Rf = 0,18 w mieszaninie 1/1 eter naftowy/AcOEt; kwas fosfomolibdenowy wywoływacz barwy).
NMR 13C (62,89 MHz, CDCl3), δ w ppm: 173,30; 171,18; 170,4; 169,91; 169,73; 150,10; 138,21; 138,14; 129,77; 128,25; 127,49; 125,44; 119,88; 114,56; 76,48; 71,11; 70,90; 66,01; 65,52; 49,90; 47,80; 41,34; 39,07; 33,92; 33,76; 33,69; 33,61; 33,17; 31,75; 29,47; 29,19; 29,00; 28,46; 28,11; 25,34; 25,05; 24,85; 22,52; 13,96.
2.1.2. 1-(Difenyloksyfosforyloksy)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-10-ol (6,7-dihydroksyheptenian)
Do roztworu zawierającego K3Fe(CN)6 (373 mg; 1,13 mmola; 3 równoważniki) K2CO3 (157 mg; 1,13 mmola; 3 równoważniki) i 1,4-diazabicyklo[2,2,2.]oktan (DABCO) (10,7 mg; 0,095 mmola; 0,25 równoważnika) w mieszaninie t-butanol/woda (5 ml/5 ml), dodano związek otrzymany powyżej (486 mg, 0,38 mmola), następnie tetratlenek osmu rozpuszczony w 2,5% t-butanolu (48 gl; 4,75 gmola; 0,0125 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną mieszano silnie przez 16 godzin w temperaturze pokojowej (27°C). Dodano Na22O5 (60 mg) i mieszanie kontynuowano przez prawie 1 godzinę, aż środowisko zmieniło barwę od brązowej do zielonej lub niebieskiej. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono eterem i oddzielono warstwę organiczną. Warstwę wodną dokładnie przemyto eterem i warstwy organiczne zlano, wysuszono nad MgSO4, następnie odparowano w temperaturze 40°C pod próżnią. W ten sposób otrzymano oczekiwany surowy diol w postaci zielonego oleju. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (5/2 CH2Cl2/aceton), odzyskano czysty
PL 208 584 B1
1-(difenyloksyfosforyloksy)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-10-ol 6,7-dihydroksyheptanian (198 mg; 40%) w postaci bezpostaciowego ciała stałego.
(Rf = 0,24 w mieszaninie 5/2 CH2Cl2/aceton; kwas fosfomolibdenowy, wywoływacz barwy).
NMR 13C (62,89 MHz, CDCl3) δ w ppm: 173,46; 173,33; 171,34; 170,58; 170,02; 150,13; 138,23; 129,80; 128,26; 127,87; 127,54; 125,50; 120,01; 119,80; 71,79; 71,23; 70,97; 66,63; 66,03; 65,54; 49,93; 47,90; 41,46; 39,17; 33,98; 33,79; 32,86; 32,45; 31,77; 29,49; 29,21; 29,03; 28,51; 25,50; 25,07; 24,87; 24,77; 24,66; 22,54; 13,99.
HPLC (210 nm): TR = 32,535 min (czas retencji)
ES/MS: współczynnik m/z 1343,0 (M+Na+); 1321,0 (M+H+); 1071,0 (M+H+ fosforan monofenylu).
2.1.3. 1-(-Difenyloksyfosforyloksy)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-10-ol (6,7-dihydroksyheptanian)
Roztwór powyższego diolu (198 mg, 0,15 mmola) w mieszaninie EtOH czystości HPLC (20 ml)/AcOEt (1,4 ml) uwodornia się w obecności Pd na węglu zawierającej 10% Pd (70 mg) w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru, przez 2,5 godziny. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje się do sucha i następnie pozostałość suszy się przez ssanie pompy próżniowej, zapewniając surowy odbenzylowany produkt (168 mg; 91%) w postaci bezpostaciowego ciała stałego.
NMR 13C (62-89 MHz, CDCl3), δ w ppm: 173,15; 173,51; 172,82; 171,04; 170,49; 170,35; 150,05; 129,79; 129,42; 125,53; 119,91; 119,83; 119,72; 71,80; 70,93; 68,58; 66,47; 65,94; 65,52; 50,02; 48,12; 42,59; 41,26; 39,13; 36,92; 34,29; 33,85; 32,32; 31,74; 29,50; 29,18; 29,00; 28,15; 25,47; 25,07; 24,85; 24,73; 24,56; 22,51; 13,99.
HPLC (210 nm): TR = 30,7 min
ES/MS: współczynnik m/z 1253,0 [M+Na]+; 1231,0 [M+H]+.
P r z y k ł a d 2.1.4. 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekan-1,10-diolo-1-diwodorofosforan 10-(6,7-dihydroksyheptanian) (=OM197-FV6)
Zawiesinę tlenku platyny PtO2 (91 mg) (wstępnie aktywowany z uzyskaniem czerni platynowej pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru przez 10 minut) w etanolu czystości HPLC (1 ml), dodaje się do roztworu poprzednio otrzymanego trójwartościowego alkoholu (168 mg; 0,14 mmola) w EtOH czystości HPLC (mieszanina 8 ml)/AcOEt (8 ml). Roztwór uwodornia się w temperaturze pokojowej (27°C) pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru, przez 24 godziny. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje się do sucha, następnie pozostałość suszy się przez ssanie pompy próżniowej, otrzymując przez to surowy produkt fosforanowy (130 mg; 88%).
HPLC (210 nm): TR = 23,6 min
ES/MS: współczynnik m/z 1078,9 [M+H], 1100,8 [M+Na]+, 116,8 [M+K]+ (fig. 6).
P r z y k ł a d 2.2.
3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-oksoheksanian) (=OM-197-FV7)
2.2.1. 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-oksoheksanian) (=OM-197-FV7) (fig. 5)
Przeprowadzono reakcję utleniania nadjodanem przez dodanie 1,86 ml 0,1 M NaIO4 (39,62 mg, 20 równoważników) do 10 mg (9,28 μmol, 1 równoważnik) odbezpieczonego triolu jaki wytworzono powyżej w mieszaninie woda/izopropanol (1:1). Reakcję monitoruje się przez detekcję LC/UV i pokazuje ilościową przemianę diolowej grupy funkcyjnej w aldehyd, dwie godziny później. Oczekiwana reakcja następuje przez obserwację współczynnika m/z 1046,8 jonu cząsteczkowego w widmie ES/MS po etapie utlenienia nadjodanem (fig. 7). oglądając widmo, współczynnik m/z 1068,8 ([M+Na]+) sodu i współczynnik m/z 1084,8 ([M+K]+) adduktów potasowych, są wyraźnie widoczne, jak również fragment odpowiadający utracie współczynnika m/z 948,8 grupy fosforylowej. Reakcję kończy się przez dodanie 1 do 2 kropli glikolu etylenowego. Oczyszczanie produktu można przeprowadzić przez SPE na fazie C18 z wydajnością 90% (5 mg analizowanego diolu).
P r z y k ł a d 2.3.
a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid 5-O-(6,7-dihydroksyheptanian) kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowy (=OM-197-MC-FV5) (fig. 8)
PL 208 584 B1
2.3.1. Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo-amino]-D-asparaginowy, ester a-N-((4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo)-amido-e-benzylowy, 5-O-(6-heptenian)
Do roztworu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowego, estru a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amido-e-benzylowego (sekcja
1.2.2.) (122 mg; 0,116 mmola) w bezwodnym dichlorometanie (5 ml), dodaje się kwas 6-heptenowy (22 μβ 0,160 mmol; 1,4 równoważnika). Roztwór chłodzi się do temperatury 0°C. Następnie wykonuje się dodawanie EDCl (49,3 mg; 0,25 mmola; 2,1 równoważnika) oraz DMAP (5,6 mg; 0,046 mmola; 0,4 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze 0°C przez 30 minut, i potem przez 6 godzin w temperaturze pokojowej. Po rozcieńczeniu CH2CI2, warstwę organiczną przemywa się w kolejności H2O, 1N HCl (2x), NaHCO3 (2x) i H2O (2x). Oczekiwany ester kwasu heptenowego otrzymuje się przez to w stanie czystym (119 mg; 89%) w postaci białego ciała stałego (Rf = 0,62 w mieszaninie CH2Cl2/aceton 5/1, wywoływacz barwy: kwas fosfomolibdenowy).
NMR 13C (62,89 MHz, CDCl3), δ w ppm: 173,63; 173,38, 171,72; 171,11, 170,08; 138,14; 135,28; 128,46, 128,34; 128,24; 128,05; 127,64; 127,53; 114,62; 76,49; 71,14, 66,66; 65,49; 49,17; 47,79; 41,69; 41,35; 39,09; 35,46; 34,33; 33,80; 33,65; 33,21; 31,79, 29,52; 29,23; 29,06; 28,46; 28,16; 22,56; 14,00.
HPLC (210 nm): TR = 36,9 minut
ES/MS: współczynnik m/z 1159,0 [M+H]+; 1176,0 [M+NH4]+
Temperatura topnienia = 81,5-84°C
[a]o20 = +7,3 (CHCls).
2.3.2. Ester a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amido-e-benzylowy, 5-O-(6,7-dihydroksyheptanian) kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowego
Do roztworu estru kwasu heptenowego jaki otrzymano powyżej (60 mg; 0,052 mmola) w mieszaninie (5/3 ml) H2O/aceton, dodaje się tlenek N-metylomorfoliny (9 mg; 0,076 mmola; 1,5) równoważnika), i potem kroplami roztwór OsO4 w 2,5% t-butanolu (123 μ^ 0,012 mmola; 0,23 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się Na22O5 (20 mg), który jest potem mieszany przez 1 godzinę do 2 godzin w temperaturze pokojowej. Roztwór jest następnie ekstrahowany kilka razy eterem, i warstwy organiczne są następnie zlewane, suszone nad MgSO4 i zatężane. Wykonując chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton 5/2), odzyskuje się oczekiwany diol w stanie czystym (35 mg; 57%) w postaci białego ciała stałego.
(Rf = 0,15 w mieszaninie CH2Cl2/aceton 5/1; wywoływacz barwy: kwas fosfomolibdenowy).
NMR 13C (62,89 MHz, CDCl3), δ w ppm: 173,67; 173,39; 171,81; 171,34; 170,27; 170,01; 138,18; 135,27; 128,56; 128,42; 128,18; 127,50; 127,68; 76,68; 71,82; 71,37; 71,17; 66,85; 66,74; 65,66; 49,27; 47,99; 41,88; 41,51; 39,31; 35,60; 34,42; 33,95; 33,51; 31,80; 29,60; 29,49; 29,30; 28,55; 25,65; 25,60; 25,19; 25,12; 24,97; 24,77; 24,14; 22,65; 14,08.
HPLC (210 nm): TR = 34,16 min
ES/MS: współczynnik m/z 1193,0 [M+H+]; 1212,0 [M+NH4]+.
2.3.3. a-N-((4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid, 5-O-(6,7-dihydroksyheptanian) kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowego (= OM-197MC-FV5)
Roztwór wyżej otrzymanego diolu (35 mg; 0,029 mmola) w mieszaninie MeOH czystości HPLC (2 ml)/AcOEt (2 ml) uwodornia się w obecności Pd na węglu zawierającego 10% palladu (10 mg) w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru przez 2,5 godziny. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje się do sucha następnie pozostałość suszy się przez ssanie pompy próżniowej otrzymując surowy kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-pentylo}amid, 5-O-(6,7-dihydroksyheptanian) (26 mg; 88%) w postaci białego ciała stałego.
HPLC (210 nm): TR = 26,90 min
Temperatura topnienia = 94-97°C
[a]D 20= +11,1° (CHCls/MeOH = 1:0,1)
ES/MS: współczynnik m/z 1012,7 [M+H]+; 1034,7 [M+Na]+, 1050,7 [M+K]+ (fig. 9).
PL 208 584 B1
P r z y k ł a d 2.4.
a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid, 5-O-(6-oksoheksanian) kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowego (=OM-197-MC-FV7) (fig. 8)
1,98 ml 0,1 M NalO4 (42,25 mg, 20 równoważników) dodaje się do 10 mg (9,88 μM, 1 równoważnik) odbezpieczonego triolu wytworzonego powyżej (sekcja 2.3.3.) w mieszaninie izopropanol-woda (1:1). Roztwór miesza się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymuje się przez dodanie 1 do 2 kropli glikolu etylenowego. Podczas tego etapu utleniania nadjodowego, obserwuje się współczynnik m/z 980,6 [M+H]+ jonu cząsteczkowego w widmie ES/MS (fig. 10), wykazując obecność aldehydowej grupy funkcyjnej. Piki odpowiadające współczynnikowi m/z 1002,8 ([M+Na]+) sodu i współczynnikowi m/z 1018,6 ([M+K]+) adduktów potasu, są także widoczne. Oczyszczanie SPE na kolumnie fazowej C18 daje odzyskanie produktu OM-197-MC-FV6 z 90% wydajnością.
P r z y k ł a d 2.5.
a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-F(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid 5-O-(6-hydroksyheksanian) kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowego (=OM-197-MC-FV7) (fig. 81)
2.5.1. a-N-((4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid 5-O-(6-hydroksyheksanian) kwasu
N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]D-asparaginowego (=OM-197-MC-FV7)
Do roztworu pochodnej kwasu 6-oksoheksanowego, jaki otrzymano powyżej (4,5 mg, 0,0043 mmola), w 90% izopropanolu (20 ml), dodaje się roztwór NaBH4 w metanolu (1 mg/ml) (0,2 ml). Mieszaninę miesza się przez 3 minuty w temperaturze 25°C, następnie dodaje się nadmiar kwasu octowego (0,2 ml). Oczyszczanie przez preparatywną HPLC na kolumnie C18, umożliwia odzyskanie produktu OM-197-MC-FV7 (2,3 mg, 51%) rozpuszczonego w 90% izopropanolu.
P r z y k ł a d 2.6.
(3RS,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-10-ol 1-diwodorofosforan (6-aminoheksanian) (=OM-287-AC-RS,R) (fig. 11)
2.6.1. 1-(Difenyloksyfosforyloksy)-3-[(R)-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]dekan-10-ol (6-benzyloksykarbonyloaminoheksanian)
Do roztworu 1-(difenyloksyfosforyloksy)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]dekan-10-olu (fig. 1) (230 mg; 0:20 mmola) w bezwodnym CH2CI2 (8 ml), dodaje się kwas 6-benzyloksykarbanoiloaminoheksanowy (88 mg; 0,33 mmola; 1,65 równoważnika). Roztwór chłodzi się do temperatury 0°C. Następnie dodaje się EDCl (200 mg, 1,04 mmola, 5,2 równoważnika) i DMAP (13 mg; 0,10 mmola; 0,5 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 30 minut w temperaturze 0°C, i potem przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Po rozcieńczeniu CH2Cl2, warstwę organiczną oddziela się i przemywa w kolejności H2O, 1N HCl, H2O. Warstwę organiczną suszy się następnie nad MgSO4, i odparowuje w temperaturze 40°C pod próżnią. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/Aceton 7/1,2), odzyskuje się czysty ester (115 mg; 41%) w postaci bezkształtnego ciała stałego (Rf = 0,77 w mieszaninie CH2Cl2/Aceton 5/2, kwas fosfomolibdenowy wywoływacz barwy).
NMR 13C (62,89 MHz, CDCl3), δ w ppm: 173,27; 171,20; 170,34; 169,88; 156,36; 150,16; 150,13; 138,28; 136,56; 129,80; 128,35; 128,26; 127,90; 127,51; 125,45; 119,97; 119,83; 71,05; 66,37; 65,97; 65,61; 49,94; 47,81; 41,39; 40,66; 39,09; 34,32; 34,25; 33,95; 33,65; 31,78; 29,50; 29,38; 29,22; 29,03; 28,55; 28,44; 25,95; 25,06; 24,87; 24,26; 22,55; 14,00.
HPLC (210 nm): TR = 33,497 min
ES/MS: współczynnik m/z 1424,0 [M+H]+; 1174,0 [M+H-(PhO)2OPOH]+.
2.6.2. 1-(Difenyloksyfosforyloksy)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekan-10-ol 10-(6-aminoheksanian)
Roztwór powyżej otrzymanego produktu (115 mg; 0,81 μmol) w mieszaninie EtOH czystości HPLC (15 ml)/lodowaty kwas octowy (0,4 ml), uwodornia się w obecności palladu (10% Pd-węgiel) (80 mg) w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru przez 4 godziny. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje się do sucha i następnie pozostałość suszy przez ssanie pompy próżniowej, otrzymując odbenzylowany produkt (90 mg, 97%), w postaci bezkształtnego ciała stałego.
HPLC (210 nm): TR = 29,185 min
ES/MS: współczynnik m/z 1200,0 [M+H]+; 952,0 [M+H-(PhO)2OPOH]+.
PL 208 584 B1
2.6.3. 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-1,10-diol-diwodorofosforan 10-(6-aminoheksanian) (=OM-197-MP-AC)
Do roztworu tlenku platyny PtO2 (30 mg) w etanolu (czystość HPLC) (1 ml) (wstępnie aktywowanego z uzyskaniem czerni platynowej pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru przez 10 minut), dodaje się roztworu amino alkohol jaki otrzymano powyżej (90 mg, 75 μmola) w mieszaninie EtOH czystości HPLC (5 ml)/1N HCl (0,1 ml). Roztwór uwodornia się w temperaturze pokojowej, pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru, przez 24 godziny. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje się do sucha i następnie pozostałość suszy przez ssanie pompy próżniowej, otrzymując żądany aminofosforan (60 mg, 79%).
HPLC (210 nm): TR = 28,51 min
ES/MS: współczynnik m/z 1047,5 [M+H]+; 1069,6 (M+Na)+, 949,6 [M+H-(HO)2OPOH]+ (fig. 12).
P r z y k ł a d 2.7 (3R,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-aminoheksanian) (OM-197-MP-AC) (fig. 13)
2.7.1. a-N-{(4R)-5-(2-tetrahydroksypiranylo)oksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid ester β-benzylowy kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego, (ASMO-THP)
Do roztworu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu estru β-benzylowego (1,5 g; 1,43 mmola) w bezwodnym CH2Cl2 (30 ml), dodaje się w kolejności, w temperaturze pokojowej i przy przepływie argonu 3,4-dihydro-2H-piran (DHP) (327 gl, 3,58 mmola) i p-toluenosulfonian pirydyny (PPTS) (108 mg, 429 gmol). Po mieszaniu przez 18 godzin w temperaturze pokojowej, dodaje się ponownie 3,
4-Dihydro-2H-piran (DHP) (130 gl, 1,43 mmola). Roztwór miesza się następnie przez dodatkowe 9 godzin w temperaturze pokojowej, następnie rozcieńcza CH2Cl2 i kolejno przemywa 5% roztworem NaHCO3 i H2O. Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton kolejno 6/1 i 7/1), odzyskuje się kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(2-tetrahydroksypiranyl)oksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}-amid, ester β-benzylowy (1,45 g; 90%) w postaci białego krystalicznego ciała stałego.
(Rf = 0,57 w mieszaninie CH2Cl2/aceton 5/1; związek fosfomolibdenowy i czynnik wywołujący barwę U.V.
2.7.2. a-N-{(4R)-5-(2-tetrahydroksypiranylo)oksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego
Roztwór związku otrzymanego powyżej (250 mg; 0,22 mmola) w mieszaninie EtOH/EtOAc 1/1 (16 ml) zawierającej Et3N (0,4 ml) uwodornia się w obecności Pd na węglu zawierającego 10% Pd (10 mg) w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru, przez 2 godziny. Katalizator odsącza się i przesącz odparowuje do sucha, a następnie suszy przez ssanie pompy próżniowej, aby odzyskać kwas w postaci soli trietyloamoniowej (250 mg).
2.7.3. 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]10-(2-tetrahydropiranylo)oksydekan-1-ol
Do roztworu kwasu otrzymanego powyżej (=250 mg) w mieszaninie CH2Cl2/bezwodny THF 2/1 (3 ml) w temperaturze 0°C i w atmosferze argonu, dodaje się N-metylomorfolinę (72 gl; 0,66 mmola; 3 równoważniki) następnie chloromrówczan izo-butylu (86 gl; 0,66 mmola; 3 równoważniki). Obserwuje się szybkie tworzenie osadu chlorowodorku N-metylomorfoliny. Postęp reakcji monitoruje się przez TLC. (Rf = 0,90 w mieszaninie CH2Cl2/aceton 2/1). Po mieszaniu przez 30 minut w temperaturze pokojowej, mieszaninę reakcyjną chłodzi się do temperatury 0°C i następnie szybko dodaje roztwór NaBH4 (33 mg; 0,88 mmola; 4 równoważniki) w H2O (1 ml). Po zaniknięciu emisji gazu (5 min), roztwór rozcieńcza się H2O (1 ml) i THF (1 ml), a następnie miesza przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór zatęża się, rozcieńcza CH2Cl2 i H2O, po czym oddziela warstwy. Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton 2/1), odzyskuje się alkohol (138 mg; 61% w dwóch etapach) w postaci białego krystalicznego ciała stałego. (Rf = 0,33 w mieszaninie 3/1 CH2Cl2/aceton; związek fosfomolibdenowy i czynnik wywołujący barwę U.V.).
PL 208 584 B1
2.7.4. Fosforan dibenzylu 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-10-(2-tetrahydropiranylo)oksydekan-1-olu
Do roztworu tego alkoholu jaki wytworzono powyżej (210 mg; 0,12 mmola) i 1H-tetrazolu (25 mg; 0,35 mmola; 3 równoważniki) w bezwodnym THF (5 ml), w temperaturze pokojowej i w atmosferze argonu, dodaje się 85% dibenzylodietylofosforoamidyn (95 gl; 0,27 mmola; 2,3 równoważnika). Można zobaczyć szybkie tworzenie się białych kryształów w środowisku reakcyjnym. Po mieszaniu przez 30 minut, mieszaninę reakcyjną chłodzi się do temperatury -20°C i następnie dodaje roztwór mCPBA (57-86%; 75 mg; 0,43 mmola; 3,7 równoważnika) w CH2Cl2 (3 ml). Widoczne jest znikanie kryształów. Po mieszaniu przez 45 minut w temperaturze pokojowej; dodaje się nasycony roztwór Na2S2O3 (3 ml) i następnie mieszaninę reakcyjną miesza się przez 10 minut. Roztwór rozcieńcza się następnie eterem, a potem oddziela warstwę organiczną i przemywa nasyconym roztworem Na2S2O3 (5x), i nasyconym roztworem NaHCO3 (2x). Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton 4/1 następnie 2/1), odzyskuje się dibenzylofosforan (126 mg; 84%) w postaci bezpostaciowego ciała stałego (Rf = 0,53 w mieszaninie 3/1 CH2Cl2/aceton; związek fosfomolibdenowy i czynnik wywołujący barwę U.V.).
2.7.5. 1-(dibenzylofosforan) 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-1,10-diolu
Roztwór 1% HCl w metanolu (25 ml) w temperaturze 0°C dodaje się do roztworu związku wytworzonego powyżej (700 mg, 0,54 mmola) w CH2Cl2 (2,5 ml). Po mieszaniu przez 45 minut w temperaturze 0°C, środowisko reakcyjne zobojętnia się 5% roztworem NaHCO3, rozcieńcza CH2Cl2 i oddziela się warstwę organiczną. Otrzymaną fazę wodną ekstrahuje się następnie CH2Cl2 (3x) i zlewa warstwy organiczne. Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje uzyskując surowy alkohol (640 mg; 98%) (Rf = 0,50 w mieszaninie 3/1 CH2Cl2/aceton; związek fosfomolibdenowy i czynnik wywołujący barwę U.V.).
2.7.6. 1-dibenzylofosforan 10-(6-benzyloksykarbonyloaminoheksanian 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]dekan-1,10-diolu)
Do roztworu związku wytworzonego powyżej (640 mg, 0,53 mmola) i kwasu 6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanowego (423 mg, 1,60 mmola) w suchym CH2Cl2 (25 ml) w temperaturze 0°C i w atmosferze argonu, dodaje się w kolejności dostępny na rynku chlorowodorek 1-(3-dimetylaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (306 mg, 1,60 mmola) i 4-dimetyloaminopirydynę (20 mg, 160 gmola). Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 30 minut w temperaturze 0°C i potem przez noc w temperaturze pokojowej. Środowisko przemywa się następnie wodą i roztworem 1N HCl po czym oddziela warstwy. Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton 4/1 następnie 2/1), odzyskuje się produkt reakcji sprzęgania (537 mg; 71%).
NMR 13C (62,89 MHz, CDCl3), δ w ppm: 173,18, 171,16, 170,38, 169,60, 156,30, 138,23, 136,50, 135,38, 135,28, 128,42, 128,26, 128,17, 127,79, 127,74, 127,44, 76,48, 71,15, 70,84, 69,47, 69,39, 69,31, 66,25, 65,62, 64,37, 49,78, 47,76, 41,41, 41,34, 40,57, 38,97, 34,22, 34,16, 33,96, 33,57, 32,95, 31,70, 29,15, 28,95, 28,32, 25,87, 25,46, 25,02, 28,80, 24,18, 22,49, 13,94.
2.7.7. 1-diwodorofosforan 10-(6-aminoheksanian) 3-[(R)-3-dodekanoilooksytetradekanoiloamino]4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekan-1,10-diolu (= OM-197-MP-AC-R,R) (fig. 13)
Roztwór związku jaki wytworzono powyżej (500 mg, 0,35 mmola) w mieszaninie CH2Cl2/etanol 5/2 (70 ml) zawierającej kwas octowy (10 ml), uwodornia się w obecności Pd na węglu zawierającego 10% Pd, w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru, przez 12 do 24 godzin. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje się do sucha i pozostałość suszy się następnie przez ssanie pompy próżniowej, otrzymując 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-aminoheksanian) (368 mg, wydajność ilościowa).
ES/MS: współczynnik m/z 1047,9 [M+H]+; 1069,8 (fig. 14).
P r z y k ł a d 2.8 (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-hydroksyheksanian)(=OM-197-MP-AC-S,R)
Postępując zgodnie z takim samym schematem reakcji dla kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego, a-N-{(4R)-5-hydroksyoksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloami32
PL 208 584 B1 no]pentylo}amid, estru β-benzylowego (sekcja 1,2,4.), uzyskuje się ostatecznie syntezę produktu dla przykładu 2.8..
P r z y k ł a d 2.9.
1-diwodorofosforan 10-(6-hydroksyheksanian) 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diolu (=OM-197-FV8) (fig. 15)
2.9.1. Eter (2R)-5-(amino)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentan-1-ol benzyloksymetylowy
Do roztworu (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentan-1-olu (sekcja 1.1.2.) (2,05 g; 3,60 mmola) w bezwodnym CH2CI2 (40 ml) w temperaturze pokojowej i w atmosferze argonu, dodaje się w kolejności BOMCl (eter benzylowo-chlorometylowy) (czystość odczynnikowa 60%, 1,25 ml; 5,41 mmola; 1,5 równoważnika) i diizopropyletylaminę (942 gl; 5,41 mmola; 1,5 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez noc w temperaturze pokojowej i potem odparowuje do sucha. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent eter naftowy/EtOAc 2/1), odzyskuje się pochodną O-benzyloksymetylową (2,28 g; 92%) w postaci białego krystalicznego ciała stałego. (Rf = 0,70 w mieszaninie eter naftowy/EtOAc 1/3, kwas fosfomolibdenowy i UV wywoływacz barwy). Temperatura topnienia = 97-100°C. Roztwór tego produktu (2,00 g; 2,90 mmola) w EtOH czystości HPLC (220 ml) zawierającym Et3N (4 ml) uwodornia się w obecności 20% Pd(OH)2 na węglu (200 mg) w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru przez okres godziny. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje się do sucha i następnie pozostałość suszy się przez ssanie pompy próżniowej otrzymując wolną aminę (1,58 g; 98%) w postaci bezkształtnego ciała stałego.
[a]D = 1° (c = 1,20; CHCfe)
NMR 1H (250 MHz, CDCl3), δ w ppm: 7,45-7,21 (m, 10H, Ar), 6,52 (d, 1H, NH), 4,80-4,45 (m, 6H, 2 x CH2-ph, O-CH2-O), 4,10 (m, 1H, H-3'), 3,83 (m, 1H, H-2), 3,62 (dd, 1H, H-1), 3,47 (dd, 1H, H-1), 2,65 (t, 2 x H-5), 2,40 (m, 2H, 2 x H-21), 1,80-1,40 (m, 8H, 2 x H-4, 2 x H-3, 2 x H-4, NH2), 1,40-1,20 (m, 18H, 9 x CH2), 0,88 (t, 3H, CH3).
NMR 13C (62,89 MHz, CDCl3), δ w ppm: 170,78; 138,24; 137,63; 128,38; 128,32; 127,66; 127,62; 94,82; 76,70; 71,26; 69,63; 69,44; 48,48; 41,82; 41,47; 33,83; 31,84; 29,88; 29,58; 29,56; 29,51; 29,27; 29,04; 25,11; 22,62; 14,06.
2.9.2. Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-L-asparaginowy, a-N-((4R)-5-(benzyloksymetoksy)-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid, ester β-benzylowy
Aminę wytworzoną jak przedłożono powyżej sprzęga się z estrem β-benzylowym kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-L-asparaginowego (wytworzonym z estru β-benzylowego kwasu L-asparaginowego, patrz sekcja 1.2.1) w obecności IIDQ, postępując w takich samych warunkach jak w sekcji 1.2.2. Oczyszczanie produktu na żelu krzemionkowym (eter naftowy/EtOAc 2:1 następnie 1:1) dało odpowiadający amid z wydajnością 65%.
ES/MS: współczynnik m/z 1169,7 ([M+H]+).
2.9.3. (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]dekan-1,10-diolo-1-dibenzylofosforan
Roztwór produktu reakcji sprzęgania otrzymany powyżej (1,05 g; 0,90 mmola) w mieszaninie 1/1 EtOH/EtOAc (65 ml) zawierającej Et3N (1,5 ml) uwodornia się w obecności Pd na węglu zawierającym 10% Pd (50 mg) w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru, przez 1 godzinę. Katalizator odsącza się i przesącz odparowuje się do sucha, a następnie suszy przez ssanie pompy próżniowej. Pozostałość rozpuszcza się następnie w mieszaninie i-PrOH/CH2Cl2 1/1 (50 ml) i mieszano przez 10 minut w temperaturze pokojowej z żywicą Amberlite IR-120 (H+) (3 ml). Żywicę odsącza się i przesącz odparowuje do sucha zapewniając wolny kwas (956 mg; 99%) w postaci białego krystalicznego ciała stałego.
Do roztworu kwasu otrzymanego powyżej (855 mg; 0,79 mmola) w bezwodnym THF (5 ml) w temperaturze 0°C i w atmosferze argonu, dodaje się N-metylomorfolinę (87 gl; 0,79 mmola; 1 równoważnik), następnie chloromrówczan izobutylu (103 gl; 0,79 mmola; 1 równoważnik). Obserwuje się szybkie tworzenie osadu chlorowodorku N-metylomorfoliny. Po mieszaniu przez 30 minut w temperaturze pokojowej, mieszaninę reakcyjną chłodzi się do temperatury 0°C i następnie szybko dodaje roztwór NaBH4 (60 mg; 1,58 mmola; 2 równoważniki) w H2O (2 ml). Po zaniknięciu emisji gazu (5 min), roztwór rozcieńcza się H2O (2 ml) i THF (2 ml), a następnie miesza 5 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór zatęża się, rozcieńcza CH2Cl2 i H2O, zobojętnia roztworem 1 M HCl, po czym oddziela warstwy. Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Wykonując oczyszczanie
PL 208 584 B1 przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton 4/1), odzyskuje się produkt w stanie zredukowanym (387 mg; 46%) w postaci białego krystalicznego ciała stałego.
Do roztworu tego alkoholu (313 mg; 0,29 mmola) i 1H-tetrazolu (62 mg; 0,88 mmola; 3 równoważniki) w bezwodnym THF (12 ml) w temperaturze pokojowej i w atmosferze argonu, dodaje się 85% dibenzylodietylofosfoamidyn (267 gl; 0,67 mmola; 2,3 równoważnika). Można zobaczyć szybkie tworzenie białych kryształów w środowisku reakcyjnym. Po mieszaniu przez 30 minut, mieszaninę reakcyjną chłodzi się do temperatury -20°C i następnie dodaje roztwór mCPBA (57-85%; 187 mg; 1,08 mmola; 3,7 równoważnika) w CH2Cl2 (8 ml). Zauważa się znikanie kryształów. Po mieszaniu przez 45 minut w temperaturze pokojowej; dodaje się nasycony roztwór Na2S2O3 (5 ml) i następnie mieszaninę reakcyjną miesza się przez 10 minut. Roztwór rozcieńcza się potem eterem, a następnie oddziela warstwę organiczną i przemywa nasyconym roztworem Na2S2O3 (5x), nasyconym roztworem NaHCO3 (2x) i roztworem 1 M HCl (1x). Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton 8/1 następnie 5/1), odzyskuje się fosfotriester (361 mg; 93%) w postaci bezkształtnego ciała stałego.
Produkt ten poddaje się reakcji hydrolizy aby oddzielić benzyloksymetyloacetal w wodnym środowisku THF-HCl otrzymując przez to (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-dibenzylofosforan.
2.9.4. (3S,9R-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforano-10-(6,7-dihydroksyheptanian)
Produkt otrzymany powyżej poddaje się O-acylowaniu na węglu numer 10 z użyciem kwasu hept-6-enowego, w obecności zarówno EDCl w dichlorometanie w temperaturze 0°C jak i DMAP (patrz sekcja 2.3.1.). Ten ester kwasu heptenowego poddaje się następnie reakcji hydroksylowania w obecności (katalitycznej ilości) tetratlenku osmu i tlenku N-metylomorfoliny (patrz sekcja 2.2.2.) uzyskując przez to odpowiadający diol (ester kwasu 6,7-dihydroksyheptanowego). Produkt ten odbezpiecza się przez wodorolizę w etanolu pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru, w obecności katalizatora palladu na węglu (patrz sekcja 2.2.3.).
2.9.5. (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekan-1,10-diolo-1-diwodorofosforano-10-(6-oksoheksanian)
Powyżej odbezpieczony diol poddaje się reakcji utleniania nadjodowego w mieszaninie izopropanol-woda (procedura doświadczalna, patrz sekcja 2.2.1.)
2.9.6. (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekan-1,10-diolo-1-diwodorofosforano-10-(6-hydroksyheksanian) (=OM-197-FV8)
Do roztworu 6-oksoheksanowej pochodnej kwasu, jaki otrzymano powyżej (4,5 mg, 0,0043 mmola) w 90% izopropanolu (20 ml), dodaje się roztworem NaBH4 (0,2 ml) w metanolu (1 mg/ml). Mieszaninę miesza się przez 3 minuty w temperaturze 25°C, następnie dodaje się nadmiar kwasu octowego (0,2 ml). Wykonując oczyszczanie przez preparatywną HPLC na kolumnie C18, odzyskuje się produkt OM-197-FV8 (2 mg, 44%), w 90% izopropanolu.
ES/MS: m/z 1048,5 [M+H]+; 950,5 [M+H -(HO)2OPOH]+ (fig. 16).
P r z y k ł a d 2.10.
2-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-5-(6-oksoheksylo)amino}-pentyl 2-((R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-(dihydroksyfosforyloksy)butanian (=OM-144-FP9) (fig. 17)
2.10.1. Hept-6-enylotrifluorometansulfonian
Bezwodnik triflanowy Tf2O ((CF3.SO2)2O, 11 ml; 6,67 mmola) dodaje się kroplami w temperaturze -15°C do roztworu hept-6-en-1-olu (515 mg; 4,51 mmola) i Et3N (627 gl; 4,51 mmola) w CH2Cl2 (10 ml) i mieszaninę miesza się przez 30-45 minut w temperaturze -15°C aż nie pozostaje więcej alkoholu. Po ogrzaniu do temperatury pokojowej, środowisko rozcieńcza się CH2Cl2 i przemywa w kolejności H2O, nasyconym wodnym roztworem NaHCO3, nasyconym wodnym roztworem NaCl. Warstwę organiczną tak otrzymaną suszy się nad MgSO4 i zatęża pod próżnią z ostatecznym uzyskaniem pozostałości, którą odbiera się w mieszaninie octan etylu/eter naftowy (1/2) i przesącza na żelu krzemionkowym (usuwanie soli trietyloaminy utworzonych podczas reakcji). Po odparowaniu przesączu, otrzymuje się żądany związek triflanowy z 87% wydajnością (956 mg) i używa w następnym etapie bez dodatkowego oczyszczania.
Rf = 0,8 w mieszaninie octan etylu/eter naftowy 1/2
NMR 1H (CDCI3, 250 MHz), δ w ppm: 5,7, 5,0, 4,45, 2,0, 1,8, 1,4.
NMR 13C (CDCI3, 62,89 MHz), δ w ppm: 138,21, 114,95, 77,68, 33,40, 29,13, 28,10, 24,53.
PL 208 584 B1
2.10.2. (2R)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]5-(hept-6-enylo)amino-pentan-1-ol
Roztwór triflanu świeżo wytworzonego w niniejszym powyżej (956 mg; 3,88 mmola) w CH2Cl2 (10 ml), dodaje się kroplami do roztworu (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentan-1-olu (sekcja 1.1.2.) (1,69 g; 3,88 mmol) w CH2Cl2 (10 ml) i mieszaninę miesza się przez 4 godziny w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu. Po rozcieńczeniu CH2Cl2, środowisko reakcyjne przemywa się kolejno wodnym nasyconym roztworem NaHCO3 i H2O. Warstwę organiczną tak otrzymaną suszy się nad MgSO4 i zatęża pod próżnią. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/MeOH 15/1), odzyskuje się żądaną drugorzędową aminę (862 mg; 43%)
Rf = 0,3 (8/1 CH2Cl2/MeOH)
ES/MS: współczynnik m/z 532,0 [M+H]+
NMR 1H (CDCI3, 250 MHz), δ w ppm: 7,2-7,4; 7,1; 5,8; 5,0; 4,6; 3,95; 3,5; 2,9; 2,5; 2,1; 1,9-1,5; 1,5-1,2; 0,9.
NMR 13C (CDCI3, 62,89 MHz), δ w ppm: 172,17; 138,28; 138,21; 128,39; 127,96; 127,71; 114,82; 76,80; 71,40; 63,81; 50,87; 48,30; 47,75; 41,57; 34,10; 33,39; 31,89; 29,66; 29,62; 29,33; 28,19; 28,03; 25,21; 26,11; 25,78; 22,82; 22,66; 14,10.
NMR 1H (CDCl3, 250 MHz), δ w ppm: 7,2-7,4; 6,75; 5,8; 5,0; 4,5; 3,9; 3,5; 2,5; 2,0; 2,1; 1,7-1,2; 0,9.
NMR 13C (CDCI3, 62,89 MHz), δ w ppm: 172,77; 138,68; 138,14; 128,23; 127,72; 127,56; 114,22; 76,64; 71,37; 64,58; 51,45; 49,79; 49,37; 41,53; 33,90; 33,53; 31,77; 29,65; 29,20; 28,64; 28,57; 25,00; 26,68; 25,93; 22,53; 13,98 (widma odpowiednio soli amoniowej i wolnej zasady).
2.10.3. {2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-5-(hept-6-enylo)amino}pentylo 2-((R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-(difenyloksyfosforyloksy)butanian
Do roztworu drugorzędowej aminy otrzymanej powyżej (163 mg; 0,307 mmola; 1 równoważnik) i kwasu 4-(difenyloksyfosforyloksy)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]butanowego (sekcja
1.1.1.) (278 mg; 0,368 mmola; 1,2 równoważnika) w CH2Cl2 (25 ml), dodaje się N,N-diizopropyloaminę (DIEA) (54 μ^ 1 równoważnik). Środowisko chłodzi się do temperatury 0°C i następnie dodaje EDCl (71 mg; 1,2 równoważnik) i 1-hydroksy-7-azabenzotriazol (HOAt) (41 mg; 1 równoważnik). Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 2 godziny w temperaturze 0°C i potem przez 90 godzin w temperaturze pokojowej. Środowisko przemywa się następnie H2O i warstwę organiczną suszy się nad MgSO4 i następnie odparowuje pod próżnią w temperaturze 40°C. Wykonując oczyszczanie na żelu krzemionkowym przez chromatografię rzutową (eluent CH2Cl2/MeOH 15/1), odzyskuje się O-acylowany produkt (126 mg; 32%).
2.10.4. (2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-5-(6,7-dihydroksyheptylo)amino}pentyl 2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-(difenyloksyfosforyloksy)butanian
Świeżo wytworzony 2,5% roztwór OsO4 w pirydynie (1,1 ml; 1,9 równoważnika) dodaje się kroplami w temperaturze 25°C do roztworu produktu reakcji O-acylowania wytworzonego powyżej (70 mg, 0,055 mmola) w bezwodnej pirydynie (5 ml). Mieszaninę miesza się przez 24 do 48 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie traktuje przez dodanie Na2S2 i na koniec rozcieńcza CH2Cl2, przemywa w kolejności H2O, wodnym roztworem 1N HCl i ponownie H2O. Otrzymaną warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza, odparowuje i pozostałość poddaje się oczyszczaniu przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (gradient eluenta CH2Cl2/MeOH 15/1-10/1) w celu odzyskania żądanego diolu (27 mg; 38%).
HPLC (210 nm): TR = 37,25 minut
ES/MS: współczynnik m/z 1307,0 [M+H]+.
2.10.5. (2-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-(6,7-dihydroksyheptylo)amino]pentylo 2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-(dihydroksyfosforyloksy)butanian
a. Odbenzylowywanie
Do roztworu wyżej otrzymanego diolu (50 mg; 0,038 mmola) w mieszaninie MeOH/AcOH czystości HPLC (5/0,2 ml), dodaje się katalizator (10% Pd/C) (10 mg). Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 4 godziny w atomosferze H2 (ciśnienie atmosferyczne) w temperaturze pokojowej. Katalizator odsącza się na filtrze millipore i przesącz odparowuje odzyskując ostatecznie, bez dodatkowego oczyszczania, odbenzylowany produkt (46 mg; 99%).
HPLC (210 nm): TR = 35,13 i 35,51 minut (wykrywa się dwa diastereoizomery).
ES/MS: współczynnik m/z 1217,0 [M+H]+
PL 208 584 B1
b. Odfenylowywanie:
Prowadzi się wstępną aktywację zawiesiny katalizatora (PtO2) (25 mg; 3,8 równoważnika) w EtOH czystości HPLC (0,5 ml) w atmosferze H2 przez 10 minut. Roztwór odbenzylowanego produktu otrzymanego powyżej (35 mg, 0,029 mmola) w EtOH czystości HPLC (2 ml), z którego usuwa się powietrze w atmosferze argonu, dodaje się do zawiesiny katalizatora. Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 2 godziny w atmosferze H2 w temperaturze pokojowej. Katalizator odsącza się na filtrze millipore i odparowuje przesącz odzyskując ostatecznie, bez dodatkowego oczyszczania, żądany ester fosforanowy. (26 mg; 87%).
HPLC (210 nm): TR = 29,3 i 30,9 minut (wykryto dwa diastereoizomery).
ES/MS: współczynnik m/z 1064,8 [M+H]+, 1086,8 [M+Na]+, 1108,8 [M-H+2Na]+ (fig. 18).
2.10.6. (2-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-5-(6,7-oksoheksylo)amino]pentyl 2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-(dihydroksyfosforyloksy)butanian (=OM 144-FP9)
1,87 ml 0,1 M NaIO4 (40,17 mg, 20 równoważników) dodaje się do 10 mg (9,39 μ^Ό^, 1 równoważnik) odbezpieczonego produktu wytworzonego powyżej w mieszaninie izopropanol-woda (1:1). Roztwór miesza się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymuje się przez dodanie 1 do 2 kropli glikolu etylenowego.
TR = 30,0 i 31,5 min (wykryto dwa diastereoizomery).
ES/MS: współczynnik m/z 1032,8 [M+H]+, 1054,8 [M+Na]+.
P r z y k ł a d 2.11.
(2R,8R)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-3-okso-4-aza-8-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-nonan-1,9-diol eter 1-O-karboksymetylowy 9-O-(6-oksoheksanian) (=OM-112-FV7) (fig. 19)
Zabezpiecza się D-serynę w postaci pochodnej N-(p-metoksybenzyloksykarbonylo) [odniesienie Chen. i Wang, Synthesis (1989): 36-37], następnie grupę funkcyjną OH podstawia się alkilem z użyciem bromooctanu benzylu w obecności NaH (2 równoważniki). Aminową grupę funkcyjną uwalnia się przez traktowanie kwasem trifluorooctowym w dichlorometanie, następnie acyluje przez traktowanie chlorkiem kwasu (R)-3-dodekanoiloksytetradekanowego w obecności trietyloaminy. Tak otrzymaną pochodną seryny sprzęga się z (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-pentan-1-oloaminą (patrz sekcja 4.1.1.) w obecności IIDQ uzyskując (2R,8R)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-3-okso-4-aza-8-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]nonan-1,9-diol eter 1-Obenzyloksykarbonylometylowy. Produkt ten następnie O-acyluje się z użyciem kwasu hept-6-enowego w obecności EDCl. Podwójne wiązanie pomocniczego estru hydroksyluje się tetratlenkiem osmu (katalityczna ilość, w obecności N-tlenku N-metylomorfoliny), i następnie odbezpiecza diol przez wodorolizę w obecności palladu na węglu w roztworze etanolu. Produkt OM-112-FV-7 otrzymuje się przez traktowanie nadjodanem sodu w mieszaninie izopropanol-woda.
C65H103N3O12. MM: 1010,45.
P r z y k ł a d 2.12.
(2S,8R)-1-(karboksymetylo)-tio-2-[(R)-3-tetradekanoiloksytetradekanoiloamino]-3-okso-4-aza-8-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino}-nonan-9-ol 9-O-(7-aminoheptanian) (=OM-212-AH1) (fig. 20)
D-cysteinę podstawia się przy S-alkilu z użyciem bromooctanu p-metoksybenzylu w obecności węglanu sodu w środowisku THF-woda. Tak otrzymaną S-benzyloksykarbonylometylocysteinę N-acyluje się chlorkiem kwasu(R)-3-tetradekanoiloksytetradekanowego, i następnie sprzęga się pochodną S-alkilo-N-acylo-D-cysteiny z (2R)-5-amino-2-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentan-1-oloaminą (otrzymaną przez wodorolizę (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentan-1-olu, patrz 4.1.1.) w obecności IIDQ. Tak otrzymany produkt selektywnie O-acyluje się w jego pierwszorzędowej pozycji z estrem pochodzącym z reakcji HOBt z kwasem 7-(p-metoksybenzyloksykarbonyloamino)heptanowym. Dwie grupy p-metoksybenzylowe usuwa się następnie przez traktowanie estru wodnym roztworem kwasu trifluorooctowego.
C59H112N4O10S. MM 1069, 64.
P r z y k ł a d 2.13.
(2R,8R)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-3-okso-4-aza-8-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-nonan-1,9-diol eter 1-O-(2,2-dikarboksyetylo) 9-O-(6-oksoheksanian) (=OM-312-FV7) (fig. 21)
Pochodną N-(p-metoksybenzyloksykarbonylo)-D-seryny podstawia się przy O-alkilu metylenomalonianem dibenzylu w obecności NaH. Aminową grupę funkcyjną uwalnia się przez traktowanie kwasem trifluorooctowym w dichlorometanie, a następnie acyluje przez traktowanie chlorkiem kwasu
PL 208 584 B1 (R)-S-dodekanyloksytetradekanowego w obecności trietyloaminy. Tak otrzymaną pochodną seryny sprzęga się z (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentan-1-oloaminą (patrz sekcja
4.1.1.) w obecności IIDQ, uzyskując (2R,8R)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-3-okso-4-aza-8-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]nonan-1,9-diol eter 1-O-[2,2-bis-(benzyloksykarbonylo)etylu]. Produkt ten poddaje się O-acylowaniu z użyciem kwasu hept-6-enowego w obecności EDCl, następnie ester heptenoilowy poddaje się reakcji hydroksylowania za pomocą tetratlenku osmu. Grupy benzylowe odszczepia się przez wodorolizę w obecności palladu na węglu, w roztworze etanolu. Produkt OM-312-FV-7 otrzymuje się przez traktowanie odbenzylowanego produktu nadjodanem sodu w mieszaninie izopropanol-woda.
C58H105N3O14. MM:1068,49.
P r z y k ł a d 2.14.
3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-1,10-diolo-1-diwodorofosforan 10-(6-bromoacetamidoheksanian) (=OM-412-BA7) (fig. 22)
3-[(R)-Dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-1,10-diolo-1-diwodorofosforan 10-(6-aminoheksanian) (patrz sekcja 4.2.3.3.) poddaje się reakcji bromoacetylowania za pomocą związku estru sukcynoimidyloksy kwasu bromooctowego w środowisku woda-DHF, w obecności trietyloaminy. Ostateczny produkt oczyszcza się HPLC.
C57H108BrN4O13P. MM: 1168,4.
P r z y k ł a d 2.15.
(3R,9R)-3-[(R)-hydroksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-O-(6-oksoheksanian) (OM-512-FV7) (fig. 23)
Kwas [(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-4-difenyloksyfosforyloksybutanowy [otrzymany przez N-acylowanie soli trifluorooctowej benzylo-O-(difenyloksyfosforylo)-DL-homoserynianu z użyciem chlorku kwasu (R)-3-benzyloksytetradekanowego, następnie rozszczepienie estru benzylowego przez wodorolizę w etanolu, w obecności trietyloaminy i katalizatora w postaci palladu na węglu], sprzęga się z (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentan-1-olem [otrzymanym przez N-acylowanie soli trifluorooctanowej (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-aminopentanolu chlorkiem kwasu (R)-3-dodekanoiloksytetradekanowego, następnie odbezpieczenie grupy aminowej w pozycji C5 przez wodorolizę w etanolu, w obecności trietyloaminy i katalizatora palladu na węglu], w obecności IIDQ. Tak otrzymany amid poddaje się O-acylowaniu przy wolnych grupach funkcyjnych OH z użyciem kwasu 6-heptenowego, w obecności EDCl, uzyskując odpowiadający ester. Podwójne wiązanie dodatkowego estru poddaje się reakcji hydroksylowania tetratlenkiem osmu; i następnie usuwa się grupę benzylową przez wodorolizę z użyciem katalizatora palladu na węglu i uwalnia się związek fosforanowy przez wodorolizę nad czernią platynową. Diolową grupę funkcyjną poddaje się reakcji utleniania nadjodowego, tworząc pochodną 6-oksoheksanoilową OM-512-FV7.
C55H104N3O13P. MM:1046,42.
P r z y k ł a d 2.16.
a-N-{(4R)-5-(6-benzyloksykarbonyloaminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego, (=OM-197-MCAC) (fig. 24)
2.16.1. a-N-((4R)-5-(aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid ester β-benzylowy kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy
Do roztworu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu estru β-benzylowego) (400 mg, 0,38 mmola) oraz kwasu 6-(benzyloksykarbonyloamino)-heksanowego (220 mg, 0,83 mmola) w suchym CH2CI2 (15 ml) w temperaturze 0°C i w atmosferze argonu, dodaje się w kolejno dostępny na rynku chlorowodorek 1-(3-dimetylaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (162 mg, 0,85 mmola) i 4-dimetyloaminopirydynę (13 mg, 98 μmola). Mieszaninę reakcyjną następnie miesza się przez 30 minut w temperaturze 0°C i potem przez noc w temperaturze pokojowej. Środowisko przemywa się następnie wodą i 1N roztworem HCl po czym oddziela warstwy. Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje.
Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton 9/1 następnie 4/1), odzyskuje się produkt reakcji sprzęgania (395 mg; 81%) w postaci białego ciała stałego.
NMR 13C (62,89 MHz, CDCl3), δ w ppm: 173,46, 173,29, 171,83, 171,14, 170,12, 156,38, 138,19, 136,60, 133,30, 128,51, 128,42, 128,31, 127,70, 127,58, 119,97, 76,49, 71,23, 71,06, 66,73,
PL 208 584 B1
66,47, 49,21, 47,83, 41,42, 40,73, 39,14, 35,46, 34,86, 33,70, 31,84, 29,57, 29,46, 29,28, 29,10, 26,01, 25,54, 25,17, 25,08, 24,94, 24,31, 22,61, 14,05.
P r z y k ł a d 2.16.2 a-N-((4R)-5-(aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoill-D-asparaginowy
Roztwór związku wytworzonego powyżej (340 mg, 0,26 mmola) w mieszaninie 5/1 CH2Cl2/etanol (24 ml) zawierającej kwas octowy (2 ml), uwodornia się w obecności Pd na węglu zawierającego 10% Pd (40 mg), w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru przez 12 do 24 godzin. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje się do sucha i następnie suszy pozostałość przez ssanie pompy próżniowej otrzymując kwas N-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}-amid (238 mg, wydajność ilościowa).
C55H104N4O10: ES/MS: współczynnik m/z 981,9 ([M+H]+) (fig. 25).
P r z y k ł a d 2.17.
Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-sukcynyloamidoheksanoksyloksy)4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid (=OM-197-MC-AC-Succ) (fig. 24)
Do roztworu produktu z przykładu 2.16. (sekcja 2.16.2) (50 mg; 0,051 mmola) w pirydynie (3 ml), dodaje się w kolejności bezwodnik bursztynowy (11 mg, 0,11 mmola) i 4-N,N'-dimetyloaminopirydynę (7 mg; 0,57 mmola). Po mieszaniu przez 6 godzin w temperaturze 50°C w atmosferze argonu, dodaje się metanol (2 ml) i środowisko reakcyjne miesza się przez dodatkowe 15 minut w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik odparowuje się i produkt oczyszcza się przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/MeOH 7:1 następnie 5:1); otrzymując przez to produkt w postaci białego ciała stałego (42 mg; 74%).
C59H108N4O13: ES/MS; współczynnik m/z 1082 ([M+H])+
Rf = 0,1 (4:1 CH2Cl2/MeOH).
P r z y k ł a d 2.18.
a-N-{(4R)-5-glicynyloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego (=OM-197-MC-AC-Gly) (fig. 24)
2.18.1. Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-((4R)-5-(benzyloksykarbonyloaminoacetoksy)-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid ester β-benzylowy
Do roztworu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}-amidu estru β-benzylowego (300 mg, 0,29 mmola) i dostępnej na rynku N-benzyloksykarbonyloglicyny (101 mg, 0,49 mmola) w suchym CH2Cl2 (10 ml) w temperaturze 0°C i w atmosferze argonu, dodaje się w kolejności dostępny na rynku chlorowodorek 1-(3-dimetylaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (93 mg, 0,48 mmola) i 4-dimetyloaminopirydynę (6 mg, 49 gmola). Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 30 minut w temperaturze 0°C i potem przez noc w temperaturze pokojowej. Środowisko przemywa się następnie wodą i roztworem 1N HCl po czym warstwy oddziela. Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton 8/1 następnie 6/1), odzyskuje się produkt reakcji sprzęgania (313 mg; 88%) w postaci białego ciała stałego.
NMR 13C (62,89 MHz, CDCl3), δ w ppm: 173,71, 173,49, 171,80, 171,68, 171,21, 170,21, 170,06, 169,94, 169,84, 156,41, 138,18, 136,16, 135,26, 128,46, 128,33, 128,26, 128,04, 127,93, 127,65, 127,55, 76,49, 71,14, 71,07, 70,93, 66,90, 66,67, 66,38, 66,26, 49,21, 49,03, 47,72, 47,66, 42,58, 41,83, 41,68, 41,32, 39,02, 35,58, 35,39, 34,34, 33,84, 31,81, 29,52, 29,24, 29,06, 28,31, 28,13, 25,34, 25,12, 25,03, 24,89, 22,57, 14,01.
2.18.2. a-N-((4R)-5-(glicynyloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego
Roztwór związku wytworzonego powyżej (268 mg, 0,22 mmola) w mieszaninie 5/1 CH2Cl2/etanol (12 ml) zawierającej kwas octowy (2 ml), uwodornia się w obecności Pd na węglu zawierającego 10% Pd (30 mg) w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru przez 12 do 24 godziny. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje się do sucha i następnie pozostałość suszy się przez ssanie pompy próżniowej otrzymując kwas N-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(glicynyloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-pentylo}amid (200 mg, wydajność ilościowa).
PL 208 584 B1
C51H104N4O10: ES/MS: współczynnik m/z 925,7 ([M+H]+), 947,8 ([M+Na]+) (fig. 26).
P r z y k ł a d 2.19.
a-N-{(4R)-5-sukcynyloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego (=OM-197-MC-Succ) (fig. 27)
2.19.1. a-N-((4R)-5-sukcynyloksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid ester β-benzylowy kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilol-D-asparaginowego
Do roztworu bezwodnika bursztynowego (25 mg, 0,25 mmol) w suchym CH2CI2 (2 ml) w obecności Et3N (40 gl, 0,29 mmola) w temperaturze 0°C, dodaje się roztwór kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu estru β-benzylowego (sekcja 1.2.2.) (150 mg, 0,14 mmol) w CH2CI2 (5 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 10 minut w temperaturze 0°C i potem w temperaturze pokojowej. Środowisko następnie rozcieńcza się CH2CI2, przemywa 1N roztworem HCl po czym oddziela warstwy. Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton 9/1, zawierający 2% kwasu octowego), odzyskuje się produkt kwasowy (148 mg; 90%) w postaci białego ciała stałego.
NMR 13C (62,89 MHz, CDCl3), δ w ppm: 175,03, 173,55, 173,35, 171,68, 171,92, 171,72, 171,36, 170,97, 170,60, 170,46, 170,41, 138,05, 135,24, 128,85, 128,76, 128,41, 128,27, 128,20, 128,03, 127,59; 76,48, 71,31, 70,77, 66,67, 65,08, 49,20, 48,11, 41,48, 41,31, 39,02, 35,80, 34,26, 34,13, 33,84, 31,77, 29,50, 29,21, 29,03, 25,05, 24,99, 24,83, 22,54, 13,98.
2.19.2. a-N-1(4R)-5-sukcynyloksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego, (=OM-197-MC-Succ) (fig. 27)
Roztwór związku wytworzonego powyżej (124 mg, 0,11 mmola) rozpuszcza się w gorącym (czystość HPLC) EtOH (12 ml) zawierającym kwas octowy (1 ml), a następnie uwodornia w obecności Pd na węglu zawierającej 10% Pd (15 mg), w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru przez 10 godzin. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje się do sucha i następnie pozostałość suszy się przez ssanie pompy próżniowej, aby odzyskać dikwasowy produkt (102 mg, 97%).
C53H97N3O12: ES/MS: współczynnik m/z 968,6 ([M+H]+), 990,7 ([M+Na]+) (fig. 28).
P r z y k ł a d 2.20.
a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-(3-aminopropylo)amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego (=OM-197-AP) (fig. 29)
2.20.1. a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego
Roztwór kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowego, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu estru β-benzylowego (sekcja 1.2.2.) (2,53 g; 2,4 mmola) w mieszaninie 1/1 EtOH/EtOAc (150 ml) zawierającej Et3N (4 ml) uwodornia się w obecności Pd na węglu zawierającej 10% Pd (120 mg) w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru przez 2 godziny. Katalizator odsącza się i przesącz odparowuje się do sucha, a następnie suszy przez ssanie pompy próżniowej.
Pozostałość rozpuszcza się następnie w mieszaninie 1/1-ProOH/CH2Cl2 (100 ml) i miesza się przez 10 minut w temperaturze pokojowej z żywicą Amberlite IR-120 (H+) (5 ml). Żywicę odsącza się i przesącz odparowuje się do sucha zapewniając wolny kwas (2,25 g; 97%) w postaci białego krystalicznego ciała stałego. (Rf = 0,45 w mieszaninie 9/1 CH2Cl2/MeOH zawierającej 1% kwasu octowego, związek fosfomolibdenowy i czynnik wywołujący barwę U.V.).
Temperatura topnienia = 115 - 117°C.
2.20.2. Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-((4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid β-N-(3-benzyloksykarbonyloaminopropylo))amid
Roztwór IIDQ (2-izobutoksy-1-izobutoksykarbonylo-1,2-dihydrochinolina) (98 g; 0,32 mmola) w bezwodnym CH2Cl2 (3 ml) dodaje się do roztworu związku wytworzonego powyżej (250 mg, 0,26 mmola), w bezwodnym CH2Cl2 (15 ml) w temperaturze 0°C i w atmosferze argonu. Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 15 minut w temperaturze 0°C i dodaje się roztwór dostępnego na rynku chlorowodorku 3-benzyloksykarbonyloaminopropyloaminy (70 mg, 0,29 mmola) w bezwodnym CH2Cl2 (7 ml) zawierającym trietyloaminę (40 gl, 0,29 mmola). Po mieszaniu przez 18 godzin, roztwór odparowuje się do sucha. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (20/1 CH2Cl2/MeOH eluent), odzyskuje się produkt reakcji sprzęgania (217 mg; 78%) w postaci białego ciała stałego.
PL 208 584 B1
2.20.3. Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-(3-aminopropylo)amid (=OM-197-AP)
Roztwór związku wytworzonego powyżej (50 mg, 44 mmola) w mieszaninie 1/1 CH2Cl2/izopropanol (8 ml) zawierającej kwas octowy (1 ml), uwodornia się w obecności Pd na węglu zawierającej 10% Pd (10 mg), w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru przez 6 do 8 godzin. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje się do sucha i pozostałość suszy się następnie przez ssanie pompy próżniowej, otrzymując kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-(3-aminopropylo)amid (32 mg, 80%).
C52H101N5O8: ES/MS: współczynnik m/z 924,8 ([M+H]+); 1848,8 ([2M+H]+) (fig. 30).
P r z y k ł a d 2.21.
Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1 S)-1-karboksy-5-aminopentyloamid (=OM-197-Lys) (fig. 31)
2.21.1. Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-((4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1-benzyloksykarbonylo-5-benzyloksykarbonyloaminopentylo]amid
Roztwór IIDQ (2-izobutoksy-1-izobutoksykarbonylo-1,2-dihydrochinoliny) (114 mg; 0,38 mmola) w bezwodnym CH2Cl2 (5 ml) dodaje się do roztworu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu (sekcja 2.20.1.) (300 mg, 0,31 mmola) w bezwodnym CH2Cl2 (20 ml) w temperaturze pokojowej i w atmosferze argonu. Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 15 minut w temperaturze pokojowej następnie dodaje się roztwór dostępnego na rynku roztworu chlorowodorku estru benzylowego ε-N-benzyloksykarbonylo-L-lizyny (140 mg, 0,31 mmola) w bezwodnym CH2Cl2 (5 ml), zawierającej trietyloaminę (48 0,34 mmola). Po mieszaniu przez 18 godzin, roztwór odparowuje się do sucha. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/MeOH 30/1 następnie 20/1), odzyskuje się produkt reakcji sprzęgania (317 mg; 77%) w postaci białego ciała stałego.
NMR 13C (62,89 MHz, CDCl3), δ w ppm: 173,68, 172,35, 171,92, 170,74, 170,62, 170,54, 156,75, 156,52, 138,31, 136,54, 135,12, 128,54, 128,40, 128,28, 128,21, 127,96, 127,577, 127,59, 76,67, 71,40, 71,18, 67,20, 67,09, 66,48, 64,67, 52,30, 51,19, 41,64, 40,34, 39,24, 37,58, 34,40, 34,10, 31,83, 29,58, 29,27, 29,09, 25,16, 25,11, 24,93, 22,60, 14,04.
2.21.2. Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy. a-N-1(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1-karboksy-5-aminopentylo]amid
Roztwór wyżej wytworzonego związku (93 mg; 71 μmoli) w mieszaninie 1/1 CH2Cl2/etanol (20 ml) zawierającej lodowaty kwas octowy (0,5 ml), uwodornia się w obecności palladu na węglu zawierającego 10% Pd (17 mg) w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru przez 12 do 24 godziny. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje do sucha i następnie pozostałość suszy się przez ssanie pompy próżniowej, zapewniając kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1-karboksy-5-aminopentylo]amid (71 mg, wydajność stechiometryczna).
C55H105N5O10: ES/MS: współczynnik m/z 996,9 ([M+H]+); 1018,9 ([M+Na]+) (fig. 32).
P r z y k ł a d 2.22.
Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1-karboksy-5-aminopentyloamid (=OM-197-Lys-AC) (fig. 31)
2.22.1. Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-benzyloksykarbonyloaminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1-benzyloksykarbonylo-5-benzyloksykarbonyloaminopentylo]amid
Do roztworu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu e-N-[(1S)-1-benzyloksykarbonylo-5-benzyloksykarbonyloaminopentylo]amidu (sekcja 2.21.1.) (317 mg, 0,48 mmola) i kwasu 6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanowego (128 mg, 0,48 mmola) w suchym CH2CI2 (15 ml), w temperaturze 0°C i w atmosferze argonu, dodaje się w kolejności chlorowodorek 1-(3-dimetylaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (93 mg, 0,48 mmola) i 4-dimetyloaminopirydynę (12 mg, 0,98 μmol). Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 30 minut w temperaturze 0°C i potem przez noc
PL 208 584 B1 w temperaturze pokojowej. Środowisko przemywa się następnie wodą i 1N roztworem HCl po czym oddziela warstwy. Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Wykonując chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton 5/1), odzyskuje się produkt reakcji sprzęgania (226 mg; 71%) w postaci białego ciała stałego.
2.22.2. Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-((4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1-karboksy-5-aminopentylo]amid (=OM-197-Lys-AC)
Roztwór wyżej wytworzonego związku (236 mg; 151 gmol) w mieszaninie 1/1 CH2Cl2/izopropanol (20 ml) zawierającej kwas octowy (1 ml) uwodornia się w obecności palladu na węglu zawierającego 10% Pd (100 mg), w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru, przez 12 do 24 godzin. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje się do sucha i pozostałość suszy się następnie przez ssanie pompy próżniowej, zapewniając kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1-karboksy-5-aminopentylo]amid (140 mg, 83%).
C61H116N6O11: ES/MS: współczynnik m/z 555,5 ([M+H]+2); 1110,0 ([M+H]) (fig. 33).
P r z y k ł a d 2.23.
Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1 S)-1,2-dikarboksyetylo]amid (=OM-197-Asp) (fig. 34)
2.23.1. Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-((4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1,2-bis(benzyloksykarbonylo)etylo]amid
Roztwór IIDQ (2-izobutoksy-1-izobutoksykarbonylo-1,2-dihydrochinolina) (96 g; 0,32 mmola) w bezwodnym CH2Cl2 (5 ml) dodaje się do roztworu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu (sekcja 2.20.1.) (252 mg, 0,26 mmola) w bezwodnym CH2Cl2 (20 ml), w temperaturze pokojowej i w atmosferze argonu. Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 15 minut w temperaturze pokojowej i dodaje się roztwór dostępnego na rynku soli paratoluenesulfonianowej estru dibenzylowego kwasu L-asparaginowego (141 mg, 0,29 mmola) w bezwodnym CH2Cl2 (5 ml) zawierającym trietyloaminę (40 gl, 0,29, mmola). Po mieszaniu przez 18 godzin, roztwór odparowuje się do sucha. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/MeOH 20/1), odzyskuje się produkt reakcji sprzęgania (260 mg; 78%)).
NMR 13C (62,89 MHz, CDCl3), δ w ppm: 173,68, 171,92, 171,17, 170,60, 170,46, 170,37, 170,18, 170,06, 138,31, 138,19, 135,20, 135,12, 134,87, 128,48, 128,26, 128,18, 127,75, 127,63, 127,56, 76,66, 71,40, 71,19, 70,98, 68,79, 67,59, 66,85, 65,14, 64,73, 51,25, 50,17, 48,78, 48,67, 41,70, 39,37, 39,21, 37,50, 35,94, 34,48, 34,10, 31,81, 29,54, 29,25, 29,08, 27,93, 25,56, 25,14, 25,09, 24,91, 22,58, 14,02.
2.23.2. Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-[(1S)-1,2-dikarboksyetylo]amid (=OM-197-Asp)
Roztwór wyżej wytworzonego związku (260 mg; 207 gmoli) w mieszaninie 1/1 CH2Cl2/izopropanol (20 ml) uwodornia się w obecności palladu na węglu zawierającego 10% Pd (50 mg), w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru, przez 4 godziny. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje się do sucha i pozostałość suszy się następnie przez ssanie pompy próżniowej zapewniając dikwas (108 mg, 88%).
C53H98N4O12: ES/MS: współczynnik m/z 983, 7 ([M+H]+); 1005,8 ([M+Na]+) (fig. 35).
P r z y k ł a d 2.24.
Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1,2-dikarboksyetylo]amid(=OM197-Asp-A C) (fig. 34)
2.24.1. Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-benzyloksyaminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-benzyloksytetradodekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1,2-bis(benzyloksykarbonylo)etyloamid
Do roztworu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowego, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu e-N-[(1S)-1,2-bis(benzyloksykarbonylo)etyloamidu (sekcja 2.23.1.) (158 mg, 0,13 mmola) i kwasu 6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanowego (84 mg, 0,32 mmola) w suchym CH2Cl2 (6 ml), w temperaturze 0°C i w atmosferze
PL 208 584 B1 argonu, dodaje się w kolejności, dostępny na rynku chlorowodorek 1-(3-dimetylaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (61 mg, 0,32 mmola) i 4-dimetyloaminopirydynę (4 mg, 33 gmole). Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 30 minut w temperaturze 0°C, a potem przez noc w temperaturze pokojowej. Środowisko następnie przemywa się wodą i 1N roztworem HCl po czym oddziela warstwy. Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton 6/1), odzyskuje się produkt reakcji sprzęgania (83 mg; 44%).
NMR 13C (62,89 MHz, CDCl3), δ w ppm: 173,69, 173,53, 173,26, 171,21, 171,11, 170,61, 170,38, 170,31, 170,22, 156,36, 138,26, 136,58, 135,20, 134,87, 128,48, 128,38, 128,31, 128,27, 128,19, 127,95, 127,55, 76,50, 71,24, 71,10, 67,58, 67,48, 66,79, 66,42, 65,69, 49,99, 48,77, 47,86, 41,70, 41,49, 40,70, 39,15, 37,50, 35,94, 34,44, 34,37, 33,97, 33,67, 31,80, 29,54, 29,24, 29,07, 28,37, 25,98, 25,55, 25,13, 25,08, 24,91, 24,28, 22,58, 14,02.
2.24.2. Kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-((4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid β-Ν-[(1 S)-1,2-dikarboksyetylo]amid (=OM-197-Asp-AC)
Roztwór wyżej wytworzonego związku (80 mg; 0,053 gmol) w mieszaninie 1/4 CH2Cl2/etanol (10 ml) zawierającej kwas octowy (1 ml), uwodornia się w obecności palladu na węglu zawierającego 10% Pd (50 mg), w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru przez 12 do 24 godzin. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje się do sucha i następnie pozostałość suszy się przez ssanie pompy próżniowej, zapewniając dikwas (61 mg, wydajność stechiometryczna).
Spektrometria masowa MS: Obliczone dla C59H109N5O13: 1095,8;
Znalezione ES/MS: współczynnik m/z 1097,0 ([M+H]+) (fig. 36).
P r z y k ł a d 2.25.
Kwas N-acetylo-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-pentylo}amid (=OM-197-N'C2-AC) (fig. 37)
2.25.1. Kwas N-acetylo-D-asparaginowy, ester β-benzylowy
Do roztworu bezwodnika octowego (85 gl, 0,90 mmola) w acetonitrylu (1 ml), dodaje się roztwór dostępnego na rynku H-D-Asp(OBn)-OH (Senn Chemicals, CH-Dielsdorf) (200 mg, 0,90 mmola) w mieszaninie CH3CN.H2O/Et3N (3,5/1,0/0,4 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 18 godzin w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik organiczny odparowuje się i pozostałą fazę wodną chłodzi się do temperatury 0°C, zakwasza 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego do pH = 3 i ekstrahuje EtOAc (2x). Warstwy organiczne zlewa i suszy nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Ester benzylowy kwasu N-acetylo-D-asparaginowego otrzymanego w postaci białego krystalicznego ciała stałego (192 mg, 81%), używa się w następnym etapie bez dodatkowego oczyszczania. (Rf = 0,45 w mieszaninie 20/1 CH2Cl2/MeOH zawierającej 2% kwasu octowego, związek fosfomolibdenowy i czynnik wywołujący barwę U.V.).
2.25.2. Kwas N-acetylo-D-asparaginowy, a-N-((4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid ester β-benzylowy
Roztwór IIDQ (2-izobutoksy-1-izobutoksykarbonylo-1,2-dihydrochinoliny) (254 g; 0,84 mmola, 1,2 równoważnika) w bezwodnym CH2Cl2 (5 ml) dodaje się do roztworu estru β-benzylowego kwasu N-acetylo-D-asparaginowego wytworzonego powyżej (185 mg, 0,70 mmola), w bezwodnym CH2Cl2 (15 ml), w temperaturze pokojowej i w atmosferze argonu. Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 15 minut i potem dodaje się roztwór (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentan-1-olu (sekcja 1.1.2.) (334 mg, 0,77 mmola, 1 równoważnik) w bezwodnym CH2CI2 (10 ml). Po mieszaniu przez 3 godziny, roztwór odparowuje się do sucha. Poddając pozostający produkt oczyszczaniu przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton 5/3 następnie czysty aceton), odzyskuje się produkt reakcji sprzęgania (369 mg; 78%).
(Rf = 0,22 w mieszaninie 5/2 CH2Cl2/aceton, związek fosfomolibdenowy i czynnik wywołujący barwę U.V.).
NMR 13C (62,89 MHz, CD3OD), δ w ppm: 171,92, 171,23, 171,07, 170,61, 170,35, 138,11, 135,24, 128,40, 128,24, 128,02, 127,69, 127,59, 71,25, 67,57, 64,56, 51,03, 49,41, 41,51, 39,21, 35,90, 33,88, 31,73, 29,46, 29,17, 28,32, 28,02, 25,35, 25,24, 24,97, 22,83, 22,51, 13,97.
MS: Obliczone dla C39H59N3O7 681,4;
Znalezione: m/z 682,5 ([M+H]+), 704,5 ([M+Na]+).
2.25.3. Kwas N-acetylo-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid ester β-benzylowy
PL 208 584 B1
Do roztworu kwasu N-acetylo-D-asparaginowego, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-pentylo}amidu estru β-benzylowego (200 mg; 0,29 mmola) i kwasu 6-(benzyloksykarbanoiloamino)heksanowego (156 mg; 0,59 mmola) w suchym CH2CI2 (8 ml), w temperaturze 0°C i w atmosferze argonu, dodaje się w kolejności dostępny na rynku chlorowodorek 1-(3-dimetylaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (112 mg, 0,59 mmola) i 4-dimetyloaminopirydynę (7 mg, 59 μmoli). Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 30 minut w temperaturze 0°C, i potem przez noc w temperaturze pokojowej. Środowisko przemywa się następnie w kolejności wodą i 1N roztworem HCl po czym oddziela warstwy. Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton 6/1), odzyskuje się produkt reakcji sprzęgania (200 mg; 73%) w postaci białego ciała stałego.
NMR 13C (62,89 MHz, CDCl3), δ w ppm: 173,65, 171,71, 171,26, 170,30, 156,41, 138,16, 136,60, 135,33, 128,57, 128,46, 128,38, 128,20, 128,04, 127,76, 127,62, 71,21, 66,80, 66,53, 65,72, 65,63, 49,36, 47,80, 41,36, 40,76, 39,22, 39,13, 35,79, 33,75, 31,88, 29,61, 29,31, 28,58, 28,52, 26,04, 25,48, 25,11, 24,36, 23,13, 22,64, 14,09.
2.25.4. Kwas N-acetylo-D-asparaginowy, a-N-((4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid (OM-197-N'C2-AC)
Roztwór związku otrzymany powyżej (200 mg; 0,22 mmola) w mieszaninie 1/1 CH2Cl2/etanol (16 ml) zawierającej kwas octowy (2 ml), uwodornia się w obecności Pd na węglu zawierającego 10% Pd (40 mg), w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru przez 12 do 24 godzin. Katalizator odsącza się i przesącz odparowuje się do sucha, a następnie suszy przez ssanie pompy próżniowej zapewniając kwas N-acetylo-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid (132 mg, wydajność stechiometryczna).
MS: Obliczone dla C31H58N4O8 614,43
Znalezione: m/z 615,5 ([M+H]+, 629,5 ([M+NH4]+), 637,5 ([M+Na]+) (fig. 38).
P r z y k ł a d 2.26.
Kwas N-(2-dekanoiloksyoktanoil)-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid (=OM-197-N'(C10-2O8C)-AC) (fig. 39)
2.26.1. 2-Hydroksyoktanian benzylu
Do roztworu dostępnej na rynku mieszaniny racemicznej kwasu 2-hydroksyoktanowego (1,00 g, 6,2 mmola) w octanie etylu o czystości HPLC (30 ml), dodaje się w kolejności bromek benzylu (2,22 ml; 18,7 mmola), trietyloaminę (2,6 ml, 18,7 mmola) i jodek tetrabutylamoniowy (1,15 g; 3,12 mmola). Roztwór miesza się przez 18 godzin w temperaturze pokojowej i potem rozpuszczalnik odparowuje. Pozostałość odbiera się w eterze i następnie warstwę organiczną przemywa się nasyconym roztworem NaHCO3 i H2O (2x). Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje uzyskując surowy 2-hydroksyoktanian benzylu (Rf = 0,57 w mieszaninie 3/1 eter naftowy/-EtOAc; związek fosfomolibdenowy i czynnik wywołujący barwę U.V.).
2.26.2. 2-Dekanoiloksyoktanian benzylu
Do roztworu estru jaki otrzymano powyżej (780 mg; 3,12 mmola) w suchym CH2CI2 (15 ml) w temperaturze 0°C, dodaje się kroplami, w kolejności, pirydynę (0,9 ml) i chlorek dekanoilu (654 mg; 3,43 mmola). Mieszaninę miesza się przez 20 godzin w temperaturze pokojowej i środowisku reakcyjnym i następnie wylewa do lodowatej wody zawierającej (5%) NaHCO3. Warstwę organiczną oddziela się, kolejno przemywa 1N roztworem HCl i wodą (2x). Warstwę organiczną suszy się następnie nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent eter naftowy/EtOAc 30/1), odzyskuje się czysty 2-dekanoiloksyooktanian benzylu.
2.26.3. Kwas 2-dekanoilooksyoktanowy
Roztwór 2-hydroksyoktanianu benzylu, jaki wytworzono powyżej (515 mg; 1,27 mmola) w EtOH o czystości HPLC (40 ml), uwodornia się w obecności Pd na węglu zawierającego 10% Pd (100 mg), w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru, przez 2 godziny. Katalizator odsącza się na filtrze millipore. Przesącz odparowuje się do sucha i pozostałość suszy się następnie w warunkach ssania pompy próżniowej, otrzymując kwas 2-dekanoiloksyoktanowy (wydajność stechiometryczna).
2.26.4. Ester β-benzylowy kwasu N-(2-dekanoilooksyoktanoil)-D-asparaginowego
Do roztworu kwasu 2-dekanoiloksyoktanowego (317 mg; 1,01 mmola) w bezwodnym THF (2 ml) w temperaturze -15°C i w atmosferze argonu, dodaje się w kolejności N-metylomorfolinę (111 μβ
PL 208 584 B1
1,01 mmola; 1 równoważnik) i chloromrówczan izobutylu (131 gl; 1,01 mmola; 1 równoważnik). Obserwuje się szybkie tworzenie osadu chlorowodorku N-metylomorfoliny. Po mieszaniu przez 30 minut w temperaturze -15°C, dodaje się dostępny na rynku roztwór H-D-Asp(OBn)-OH (Senn Chemicals AG, Szwajcaria-Dielsdorf) (225 mg; 1,01 mmola; 1 równoważnik) w mieszaninie 3,5/1 CH3CN/H2O (9 ml) zawierającej Et3N (0,4 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez noc w temperaturze pokojowej. Warstwę organiczną następnie odparowuje się i chłodzi warstwę wodną do temperatury 0°C, zakwasza 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego do pH = 3 i ekstrahuje EtOAc (2x). Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent eter naftowy/ EtOAc 2/1, zawierający 2% kwasu octowego) po czym współodparowanie toluenu, odzyskuje się kwas N-(2-dekanoiloksyoktanoil)-D-asparaginowy, ester β-benzylowy (140 mg; 27%).
2.26.5. a-N-((4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid ester β-benzylowy kwasu N-(2-dekanoilooksyoktanoilo-D-asparaginowego
Do roztworu kwasu N-(2-dekanoiloksyoktanoil)-D-asparaginowego, estru β-benzylowego (140 g; 0,27 mmola) w bezwodnym CH2Cl2 (15 ml) dodaje się IIDQ (98 mg; 0,32 mmola; 1,2 równoważnika) w temperaturze pokojowej i w atmosferze argonu. Po mieszaniu przez 15 minut, dodaje się roztwór (2R)-5-amino-2-[(R)-benzyloksytetradekanoiloamino]pentan-1-olu (sekcja 1.1.2.) (129 mg; 0,30 mmola; 1,1 równoważnika) w bezwodnym CH2CI2 (5 ml). Po mieszaniu przez 18 godzin, roztwór odparowuje się do sucha. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent kolejno CH2Cl2/aceton 5/1 i CH2Cl2/aceton 1/1), odzyskuje się produkt reakcji sprzęgania (197 mg; 78%).
(Rf = 0,30 w mieszaninie 5/1 CH2Cl2/aceton; związek fosfomolibdenowy i czynnik wywołujący barwę U.V.).
2.26.6. Kwas N-(2-dekanoilooksyoktanoilo)-D-asparaginowy, a-N-((4R)-5-[6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanoiloksy]-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid ester β-benzylowy
Do roztworu kwasu N-(2-dekanoiloksyoktanoil)-D-asparaginowego, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu estru β-benzylowego (97 mg; 0,21 mmola) i kwasu 6-(benzyloksykarbanoiloamino)heksanowego (112 mg, 0,42 mmola) w suchym CH2CI2 (8 ml), w temperaturze 0°C i w atmosferze argonu, dodaje się w kolejności chlorowodorek 1-(3-dimetylaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (81 mg, 0,42 mmol) i 4-dimetyloaminopirydynę (6 mg, 42 gmol). Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 30 minut w temperaturze 0°C i potem przez noc w temperaturze pokojowej. Środowisko przemywa się następnie w kolejności wodą i 1N roztworem HCl; po czym oddziela warstwy. Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2/aceton 6/1), odzyskuje się produkt reakcji sprzęgania (170 mg; 68%).
2.26.7. a-N-{(4R)-5-[6-(aminoheksanoiloksy]-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-(2-dekanoilooksyoktanoilo)-D-asparaginowego
Roztwór związku jaki wytworzono powyżej (150 mg; 0,13 mmola) w mieszaninie 1/1 CH2Cl2/etanol (16 ml) zawierającej kwas octowy (2 ml), uwodornia się w obecności Pd na węglu zawierającego 10% Pd (40 mg) w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym wodoru przez 12 do 24 godzin. Katalizator odsącza się. Przesącz odparowuje się do sucha i następnie pozostałość suszy przez ssanie pompy próżniowej, zapewniając kwas N-(2-dekanoiloksyoktanoil)-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-[6-(aminoheksanoiloksy]-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid (110 mg, wydajność stechiometryczna).
MS (spektrometria masowa) obliczone dla C47H88N4O10: 868,65
Znalezione: współczynnik m/z 870,0 ([M+H]+); 884,0 ([M+NH4]+), 891,5 ([M+Na]+) (fig. 40).
P r z y k ł a d 2.27.
Oczyszczanie i analiza związków według wynalazku
Produkt syntezy i związki pochodne acylo-dipeptydu, niosące pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, rozpuszcza się w mieszaninie woda-izopropanol (1:1 objętościowo). Następnie dodaje się wymaganą ilość 2M wodorowęglanu amonu, do stężenia wynoszącego 50 mM.
2.27.1. Oczyszczanie
Proces oczyszczania przeprowadza się przez odwrotnofazową preparatywną HPLC zgodnie z następującymi warunkami:
Kolumna: Bondapack C18 PrepPak, 40x200 mm, 15-20 gm, 300A, Waters
PL 208 584 B1
Faza ruchoma:
A: izopropanol-woda (9:1 objętościowo), 50 mM wodorowęglan amonu
B: izopropanol-woda (2:8 objętościowo), 50 mM wodorowęglan amonu
Szybkość przepływu: 40 ml/min
Wymywanie: Adsorpcja izokratyczna na kolumnie: 40% B (60% A), 10 min
Gradient: A:B: 40-80% B w ciągu 10 minut
Wymywanie izokratyczne: 80% B, 30 minut
Etap mycia: 100% B, 10 minut
Detekcja: UV, 210 nm.
Jeśli zaobserwuje się jakikolwiek produkt aromatyczny (niepełny etap odbezpieczania), należy przeprowadzić dokładniejszy etap oczyszczania. Ten proces dodatkowego oczyszczania przeprowadza się zgodnie z następującymi warunkami:
Kolumna: Kromasil C18, 21 x 250 mm, 5 μυι, 100 A, Macherey-Nagel.
Faza ruchoma:
A: izopropanol-woda (9:1 objętościowo) 50 mM wodorowęglan amonu
B: izopropanol-woda (2:8 objętościowo), 50 mM wodorowęglan amonu
Szybkość przepływu: 5 ml/minutę
Wymywanie: Adsorpcja izokratyczna na kolumnie: 40% B (60% A), 10 minut
Wymywanie izokratyczne: 84% B, 30 minut
Etap mycia: 100% B, 10 minut
Detekcja: UV,210 nm.
System: Waters 2000.
Frakcje zawierające istotne związki w postaci soli amoniowych, zlewa się i zatęża przez adsorpcję na C18 Bondapack, 15-20 μm, 300 A, Waters. Przeciwjon można następnie wymienić przez mycie wodnym roztworem soli metanolu alkalicznego (takiej jak np. NaCl lub KCl) przy stężeniu wynoszącym 10 g/l w mieszaninie woda-izopropanol (9:1, objętościowo). Podczas usuwania nadmiaru soli przez przepuszczenie przez kolumnę 5 objętości mieszaniny woda-izopropanol (9:1, objętościowo), związek jest wymywany czystym izopropanolem.
2.27.2. Monitoring procesu oczyszczania
Po każdym etapie, frakcje analizuje się przez analityczną chromatografię odwrotno-fazową HPLC, zgodnie z następującymi warunkami:
Kolumna: Supelcosil C18, 3 μm, 4,6 x 150 mm, 100 A, Supelco.
Faza ruchoma:
A: woda-acetonitryl (1:1, objętościowo), 5 mM TBAP
B: woda-izopropanol (1:9, objętościowo) 5 mM, TBAP fosforan tetrabutylamoniowy Szybkość przepływu: 1 ml/minutę
Etap wymywania: Gradient A:B (zakres 75:25 do 0:100) w ciągu 37,5 minuty
Detekcja: UV, 210 nm i 254 nm.
Urządzenie do chromatografii: Do tych testów, używano różnych urządzeń do chromatografii HPLC (HP1050 serie Ti, HP1090 serie M, LabChromShimadzu). Czas retencji odczytywany przez poszczególny używany system, może różnić się o około 1 minutę dla danego związku.
2.27.3. Test i analiza czystości produktów końcowych
Test i analizę czystości otrzymanych produktów przeprowadza się techniką HPLC/UV zgodnie z warunkami prowadzenia chromatografii, wymienionymi powyżej. Na podstawie tej analizy, czystość produktów wynosi od 97 do 100%. Aby pokazać, że występują nieaktywne zanieczyszczenia, co oceniono przez wykrywanie UV, przeprowadzono analizy LC/ES-MS (jonizacja typu elektrospraju, ustawienie dodatnie). Aby spełnić warunki jonizacji, przeprowadzono rozdzielanie chromatograficzne, zgodnie z następującymi warunkami:
Kolumna: Vydac C4, 5 μm, 4,6 x 150 mm, 300 A
Faza ruchoma:
A: woda-acetonitryl (1:1, objętościowo), 0,05% TFA
B: woda-izopropanol (1:9, objętościowo), 0,05% TFA
PL 208 584 B1
Szybkość przepływu: 1 ml/minutę
Wymywanie: gradient A/B (zakres 80:20-0:100) w ciągu 20 minut
Temperatura: 40°C.
2.27.4. Analiza spektroskopowa
Spektrometria masowa
Widma ES/MS (ustawienia dodatnie i ujemne) zapisywano na różnych spektrometrach masowych (Finnigan LCQ, pułapka jonowa; Micromass Quattro II, trzyetapowy kwadrupol; Micromass Z-Bio-Q, trzyetapowy kwadrupol). Przeprowadzono dodatkową analizę na podstawie pomiarów MS/MS.
Jądrowy rezonans magnetyczny
Widma NMR 1H i NMR 13C zapisywano na urządzeniu typu DPX Bruker przy 250,13 i 62,89 MHz.
P r z y k ł a d 2.28
-(6-aminoheksanian)-10-diwodorofosforan (3S,9R) 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu (=OM-197-AC MP) (fig. 1)
2.28.1. 10-(2-tetrahydropiranylo)-1-(6-benzyloksykarbonyloaminoheksanian) (3S,9R) 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino-1-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
Handlowy chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (393 mg; 2,04 mmol; 3 równoważniki) i 4-dimetyloaminopirydynę (26 mg, 0,21 mmol; 0,3 równoważnika) dodaje się kolejno do roztworu (3S,9R) 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-10-(2-tetrahydropiranylo)oksydekano-1-olu (Przykład 2,7) (700 mg, 0,68 mmol) i kwasu 6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanowego (541 mg, 2,04 mmol) w suchym dichlorometanie (30 ml) w temperaturze 0°C i pod argonem. Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 30 minut w temperaturze 0°C, następnie przez noc w temperaturze otoczenia. Środowisko reakcji rozcieńcza się następnie dichlorometanem (w przybliżeniu 40 ml), przemywa wodą, następnie 1N roztworem HCl, następnie wodą, aż faza wodna osiągnie obojętny odczyn pH. Fazę organiczną oddziela się, osusza nad mgSO4, przesącza i zatęża. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2CI2/acetonem 7/1, następnie 5/1) pozwala zebrać produkt sprzęgania (711 mg; 81%).
(Rf = 0,75 w CH2Cl2/acetonie 7/1; wywoływacz UV kwas fosfomolibdenowy).
13C-NMR (62,89 MHz, CDCI3), δ w ppm 173,7, 173,3, 171,1, 170,7, 169,7, 156,4, 138,2, 136,6, 127,5-128,3, 100,1, 98,7, 77,0, 71,2, 70,9, 69,8, 68,5, 66,3, 63,2, 62,3, 60,5, 50,1, 48,6, 48,3, 41,8, 41,5, 40,6, 39,2, 34,2, 33,9, 31,7, 30,5, 30,3, 29,0-29,5, 26,0, 25,1, 24,9, 24,4, 22,5, 14,0.
2.28.2. 1-(6-benzyloksykarbonyloaminoheksanian) (3S,9R) 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
Roztwór związku wytworzonego powyżej (700 mg, 0,55 mmol) w CH2CI2 (7 ml) dodaje się do 1% roztworu HCl w metanolu (21 ml) w temperaturze 0°C. Po wymieszaniu przez 45 minut w temperaturze 0°C, środowisko reakcji zobojętnia się 20% roztworem NaHCO3, rozcieńcza CH2CI2 (50 ml) następnie fazę organiczną oddziela się. Powstałą fazę wodną ekstrahuje się następnie CH2CI2 (3x), i fazy organiczne łączy się. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje dla wytworzenia surowego alkoholu (651 mg; 99%).
(Rf=0,55 w CH2Cl2/acetonie 4/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy)
2.28.3. 1-(6-benzyloksykarbonylaminoheksaniano)-10-(dibenzylofosforan) (3S,9R) 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
85% fosforamidyn dibenzylo-dietylu (453 gl; 1,25 mmol; 2,3 równoważnika) dodaje się w temperaturze otoczenia i pod argonem do roztworu alkoholu wytworzonego powyżej (650 mg; 0,55 mmol) i 1H-tetrazolu (115 mg; 1,64 mmol; 3 równoważniki) w bezwodnym THF (25 ml). Obserwuje się szybkie tworzenie białych kryształów w środowisku reakcji. Po wymieszaniu przez 30 minut, mieszaninę reakcyjną ochładza się do -18°C, następnie dodaje się roztwór mCPBA (57-86%; 335 mg; 2,0 mmol; 3,7 równoważnika) w CH2CI2 (20 ml). Zauważa się zanik kryształów. Po wymieszaniu przez 45 minut w temperaturze otoczenia, dodaje się nasycony roztwór Na2S2O3 (20 ml), następnie mieszaninę reakcyjną miesza się przez 10 minut. Roztwór rozcieńcza się eterem (40 ml), następnie fazę organiczną oddziela się i przemywa nasyconym roztworem NaHCO3 (5x) i nasyconym roztworem Na2S2O3 (2x). Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromato46
PL 208 584 B1 grafii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2CI2/acetonem 5/1, 4/1, 2/1 następnie 1/1) pozwala otrzymać dibenzylofosforan (645 mg; 82%) w formie bezpostaciowej stałej substancji.
(Rf=0,40 w CH2CI2/acetonie 4/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy).
13C-NMR (62,89 MHz, CDCI3), δ w ppm 173,6, 173,4, 171,0, 170,7, 169,7, 156,4, 138,2, 136,7, 135,5, 127,6-128,6, ~77,0, 71,1, 71,0, 69,5, 68,6, 66,4, 60,6, 50,0, 48,4, 41,6, 41,3, 40,7, 38,8, 34,3, 33,9, 31,8, 31,6, 29,0-29,5, 27,7, 26,1, 25,0, 24,4, 22,6, 14,1.
C84H131N4O14P. IS/MS: m/z 1453,0 ([M+H]+), 1469,0 ([M+NH4]+), δ 1475,0 ([M+Na]+).
2.28.4. 1-(6-aminoheksaniano)-10-diwodorofosforan (3S,9R) 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
Roztwór związku wytworzonego powyżej (540 mg, 0,37 mmol) i w mieszaninie CH2Cl2/etanol 5/2 (70 ml) zawierającej kwas octowy (10 ml) uwodornia się w obecności 10% Pd na węglu (270 mg) w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 48 godzin. Katalizator usuwa się przez filtrację. Przesącz odparowuje się do suchej masy, odparowuje z toluenem (2x) następnie pozostałość osusza się pompą łopatkową dla wytworzenia 1-(6-aminoheksaniano)-10-diwodorofosforanu (3S,9R) 3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu (380 mg, 98%).
C55H107N4O12P. ES/MS: m/z 1047,9 [M+H]+ (fig. 2)
P r z y k ł a d 2.29.
a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amido-e-N-(6-aminoheksylo)amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego, (=OM-197AH AC) (fig. 3)
Ta sama sekwencja reakcji (por. dział 1.2.1; dział 1.2.2; dział 2.7.1 i dział 2.7.2) prowadzona na handlowym H-L-Asp(OBn)-OH (Fluka, Buchs, Szwajcaria) prowadzi do soli trietyloamoniowej a-N{(4R)-5-(2-tetrahydropiranylo)oksy-4[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu kwasu N[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego.
2.29.1. a-N-((4R)-5-(2-tetrahydropiranylo)oksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amido-e-N-(6-benzyloksykarbonyloaminoheksylo)amidu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego
IIDQ (2-izobutoksy-1-izobutoksykarbonylo-1,2-dihydrochinolinę) (101 mg, 0,33 mmol) dodaje się w temperaturze 0°C i pod argonem do roztworu soli trietyloamoniowej a-N-{(4R)-5-(2-tetrahydropiranylo)oksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego (250 mg, 0,22 mmol) i handlowego chlorowodorku 6-benzyloksykarbonyloaminoheksyloaminy (70 mg, 0,24 mmol) w bezwodnym CH2CI2 (15 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 5 godzin w temperaturze 0°C, następnie roztwór odparowuje się do suchej masy. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2CI2//acetonem 3/1) pozwala otrzymać produkt sprzęgania (128 mg; 46% w 2 etapach) w formie bezpostaciowej stałej substancji. (Rf=0,48 w CH2Cl2/metanolu 9/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy).
C75H127N5O11. IS/MS: m/z 1275,0 ([M+H]+), 1289,0 ([M+NH4]+), 1297,0 ([M+Na]+).
2.29.2. a-N-[(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amido-e-N-(6-benzyloksykarbonyloaminoheksyloamid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego
Roztwór związku wytworzonego powyżej (900 mg, 0,70 mmol) w CH2CI2 (3 ml) dodaje się w temperaturze 0°C do 1% roztworu HCl w metanolu (30 ml). Po wymieszaniu przez 45 minut w temperaturze 0°C, środowisko reakcji zobojętnia się 10% roztworem NaHCO3, rozcieńcza CH2CI2 (100 ml) następnie fazę organiczną oddziela się. Powstałą fazę wodną ekstrahuje się następnie CH2CI2 (3x), fazy organiczne łączy się. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje dla wytworzenia surowego alkoholu (826 mg; 98%).
(Rf=0,15 w CH2CI2/acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy)
C70H119N5O10. IS/MS: m/z 1191,0 ([M+H]+), 1213,0 ([M+Na]+).
Temperatura topnienia = 148-149°C.
2.29.3. a-N-((4R)-5-[6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanoiloksy]-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amido-e-N-(6-benzyloksykarbonyloaminoheksylo)amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego
Handlowy chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (309 mg, 1,62 mmol) i 4-dimetyloaminopirydynę (20 mg, 0,17 mmol) dodaje się kolejno w temperaturze otoczenia i pod
PL 208 584 B1 argonem do roztworu a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amido-e-N-(6-benzyloksykarbonyloaminoheksylo)amidu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego, (641 mg, 0,54 mmol) i kwasu 6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanowego (428 mg, 1,62 mmol) w suchym CH2CI2 (30 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez noc w temperaturze otoczenia. Środowisko reakcji przemywa się wodą, następnie 1N roztworem HCl i fazy oddziela się. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie przez rekrystalizację (octan etylu) pozwala zebrać produkt sprzęgania (717 mg; 100%).
(Rf=0,66 w CH2CI2/acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy)
Temperatura topnienia = 150-152°C.
13C-NMR (62,89 MHz, CDCI3), δ w ppm 173,64, 173,26, 171,32, 171,11, 170,60, 170,00, 156,42, 138,20, 136,59 (d), 128,38, 128,33, 127,95, 127,61, 127,52, 71,24, 70,99, 66,42, 65,71, 49,89, 47,80, 41,97, 41,45, 40,72, 40,67, 39,23, 39,11, 37,21, 34,49, 34,37, 33,90, 31,81, 29,54, 29,43, 29,25, 29,07, 28,40, 26,11, 26,00, 25,74, 25,15, 25,05, 24,90, 24,31, 22,59, 14,02.
2.29.4. a-N-((4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amido-3-N-(6-aminoheksylo)amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego
Roztwór związku wytworzonego powyżej (690 mg, 0,48 mmol) w mieszaninie CH2CI2/etanol 7/3 (100 ml) zawierającej kwas octowy (15 ml), uwodornia się w obecności 10% Pd na węglu w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 3 do 8 dni. Katalizator usuwa się przez filtrację. Przesącz odparowuje się do suchej masy, pozostałość odparowuje się z toluenem, następnie osusza pompą łopatkową dla wytworzenia a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amido-e-N-(6-aminoheksylo)-amidu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego, (420 mg, 75%).
C61H118N6O9. ES/MS: m/z 1080,0 ([M+H]+) (fig. 4) a-N-{(4R)-5-dihydroksyfosforyloksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amido-e-N-(6-aminoheksylo)amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego, (=OM-197AH MP) (fig. 5).
2.30.1. a-N-{(4R)-5-dibenzyloksyfosforyloksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amido-e-N-(6-benzyloksykarbonyloaminoheksylo)amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]L-asparaginowego
85% fosforamidyn dibenzylo-dietylu (120 0,34 mmol) dodaje się w temperaturze otoczenia i pod argonem do roztworu a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-pentylo}amido-e-N-(6-benzyloksykarbonyloaminoheksylo)amidu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego, (dział 2.29.2) (174 mg; 0,15 mmol) i 1H-tetrazolu (31 mg; 0,44 mmol) w bezwodnym THF (8 ml). Obserwuje się szybkie tworzenie białych kryształów w środowisku reakcji. Po wymieszaniu przez 1 godzinę i 15 minut, mieszaninę reakcyjną ochładza się do 0°C, następnie dodaje się roztwór mCPBA (57-86%; 93 mg; 0,54 mmol) w CH2CI2 (4 ml). Zauważa się zanik kryształów. Po wymieszaniu przez 1 godzinę 15 minut w temperaturze otoczenia, dodaje się nasycony roztwór Na2S2O3 (6 ml) następnie mieszaninę reakcyjną miesza się przez 10 minut. Roztwór rozcieńcza się następnie eterem, następnie fazę organiczną oddziela i przemywa nasyconym roztworem Na2S2O3 (5x), nasyconym roztworem NaHCO3 (2x). Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2Cl2/acetonem 2,5/1 następnie 1/1) pozwala otrzymać a-N-{(4R)-5-diben-zyloksyfosforyloksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-pentylo}amido-e-N-(6-benzyloksykarbonyloaminoheksylo)amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego, (168 mg; 79%) w formie bezpostaciowej stałej substancji.
(Rf=0,44 w CH2Cl2/acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy)
C84H132N5O13P. IS/MS: m/z 1451,0 ([M+H]+), 1474,0 ([M+Na]+)
Temperatura topnienia = 109-112°C.
13C-NMR (62,89 MHz, CDCl3), δ w ppm 173,67, 171,37, 171,16, 170,73, 170,04, 156,48, 138,38, 136,69, 135,69, 135,59, 128,60, 128,48, 128,36, 128,02, 127,98, 127,73, 127,61, 71,22, 71,05, 69,47, 69,12, 66,51, 53,40, 50,05, 48,66, 47,55, 48,46, 41,99, 41,44, 40,71, 39,34, 39,02, 37,52, 34,52, 34,46, 34,00, 31,90, 29,61, 29,51, 29,34, 29,14, 27,53, 26,20, 26,08, 25,72, 25,23, 24,97, 22,66, 14,10.
PL 208 584 B1
2.30.2. a-N-((4R)-5-dihydroksyfosforyloksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amido-e-N-(6-aminoheksylo)amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego
Roztwór związku wytworzonego powyżej (140 mg, 96 gmol) w mieszaninie CH2CI2 (14 ml) i etanolu (6 ml) zawierającej kwas octowy (3 ml) uwodornia się w obecności 10% Pd na węglu, w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 3 do 8 dni. Katalizator usuwa się przez filtrację. Przesącz odparowuje się do suchej masy, pozostałość odparowuje się z toluenem, następnie osusza pompą łopatkową dla wytworzenia a-N-{(4R)-5-dihydroksyfosforyloksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amido-e-N-(6-aminoheksylo)amidu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego (98 mg, 97%).
C55H108N5O11P. IS/MS: m/z 1046,7 ([M+H]+) (fig. 7).
P r z y k ł a d 2.31.
a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-[(R)-3-hydroksytetradekanoilo]-L-asparaginowego (= OM-197-MC-AC-inv) (fig. 8)
2.31.1. Chlorowodorek (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-amino-pentan-1-olu
1% roztwór HCl (wagowo) w metanolu (200 ml) dodaje się do roztworu związku [(2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-(terbutoksykarbonyloamino)pentan-1-olowego] (dział 1.1.2.d) (2,5 g, 7,09 mmol) w czystości chromatograficznej octanie etylu (25 ml) w temperaturze 0°C. Po wymieszaniu przez 14 godzin w temperaturze otoczenia, rozpuszczalnik odparowuje się dla wytworzenia chlorowodorku (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-amino-pentan-1-olu (1,98 g, 97%) w formie żółtawego syropu.
2.31.2. (2R)-5-(Benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilamino]pentan-1-ol
N-metylomorfolinę (0,78 ml; 7,09 mmol) i chloromrówczan izobutylu (0,92 ml; 7,09 mmol) dodaje się do roztworu ochłodzonego do -15°C kwasu (R)-3-dodekanoilooksytetradekanowego (3,03 g, 7,09 mmol) w bezwodnym THF (40 ml). Po wymieszaniu w temperaturze -10°C przez 1 godzinę, dodaje się roztwór chlorowodorku (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-amino-pentan-1-olu (dział 2.31.1) (1,98 g; 7,09 mmol) w bezwodnym THF (1 ml) i NaHCO3 (1,19 g, 14,2 mmol). Kontynuuje się mieszanie w temperaturze otoczenia przez 16 godzin, następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się H2O i eterem. Fazę organiczną oddziela się, przemywa H2O (2x), następnie osusza nad MgSO4 i odparowuje pod zmniejszonym ciśnieniem. Tak otrzymuje się (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentan-1-ol (4,54 g; 97%), bez dalszego oczyszczania, w formie bezpostaciowej stałej substancji. (Rf=0,22 w CH2Cl2/acetonie 6/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy).
1H-NMR (CDCI3, 250 MHz), δ w ppm: 7,4 (s, 5H); 6,1 (m, 1H, NH); 5,2 (m, 1H); 5,1 (s, 2H); 4,9 (m, 1H, NH); 4,0-3,8 (m, 1H); 3,8-3,5 (m, 2H); 3,2 (m, 2H); 2,5 (d, 2H); 2,3 (t, 2H); 1,7-1,5 (m, 8H);
1,4-1,2 (m, 34H); 0,9 (m, 6H).
C39H68N2O6. IS/MS: m/z 661,5 ([M+H]+), 683,5 ([M+Na]+), 699,5 ([M+K]+).
2.31.3. (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentan-1-ol
Roztwór (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-dode-kanoiloksytetradekanoiloamino]pentan-1-olu (189 mg; 0,29 mmol) w etanolu (17 ml) uwodornia się w obecności 10% Pd na węglu w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 2 godziny 30 minut. Katalizator usuwa się przez filtrację, a następnie przemywa etanolem i przesącz odparowuje się do suchej masy, następnie osusza pompą łopatkową dla wytworzenia wolnej aminy (123 mg; 81%) w formie przejrzystej bezpostaciowej substancji stałej.
1H-NMR (CDCI3, 250 MHz), δ w ppm: 5,2 (m, 1H); 3,9 (m, 1H); 3,6 (m, 2H); 3,1 (m, 2H); 2,5 (m, 2H); 2,3 (t, 2H); 1,9-1,5 (m, 8H); 1,3 (m, 34H); 0,9 (m, 6H).
2.31.4. Ester β-benzylowy kwasu N-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-L-asparaginowego
N-metylomorfolinę (250 gl; 2,2 mmol; 1 równoważnik) i chloromrówczan izobutylu (291 gl;
2,2 mmol; 1 równoważnik) dodaje się kolejno do roztworu kwasu (R)-3-benzyloksytetradekanowego (750 mg; 2,2 mmol) [Bull. Chem. Soc. Jpn, 60 (1987), 2197-2204] w bezwodnym THF (7,2 ml) w temperaturze -15°C i pod argonem. Po wymieszaniu przez 45 minut w temperaturze -15°C, dodaje się roztwór handlowego H-L-Asp(OBn)-OH (Fluka, Buchs, Szwajcaria) (500 mg; 2,2 mmol; 1 równoważnik) w mieszaninie CH3CN/H2O 3,5/1 (24 ml) zawierającej Et3N (1 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez noc w temperaturze otoczenia. Organiczny rozpuszczalnik odparowuje się, następnie fazę wodną ochładza się do 0°C, zakwasza do pH=3 10% roztworem wodnym kwasu cytrynowego, a następnie ekstrahuje AcOEt (3x). Fazę organiczną osusza się nad
PL 208 584 B1
MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją eterem naftowym/-AcOEt 2/1 zawierającym 2% kwas octowy), a następnie odparowanie toluenem pozwala otrzymać ester β-benzylowy kwasu N-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-L-asparaginowego (1,19 g; 99%) w formie białej krystalicznej stałej substancji (Rf=0,27 w eterze naftowym/EtOAc 1/1 zawierającym 2% kwasu octowego; światło nadfioletowe i wywoływacze fosfomolibdenowe).
1H-NMR (CDCI3, 250 MHz), δ w ppm: 7,3 (m, 10H); 5,0 (s, 2H); 4,9 (m, 1H); 4,5 (q, 2H); 3,8 (m, 1H); 3,1-2,8 (dd, 2H); 2,5 (m, 2H); 1,6 (m, 2H); 1,3 (m, 18H); 0,9 (m, 3H).
2.31.5. Ester β-benzylowy a-N-((4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu kwasu N-[(R)-3-benzyloksytetradekanoilo]-R-asparaginowego
Handlowy HOOBt (3-hydroksy-1,2,3-benzotriazyn-4(3H)-on) (ACROS, Basel, Szwajcaria) (19 mg, 114 μmol, 1 równoważnik) następnie handlowy N,N'-diizopropylokarbodiimidu (23 l1, 114 μmol, 1 równoważnik) dodaje się kolejno do roztworu estru β-benzylowego otrzymanego powyżej (61 mg; 114 Limol) i (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentan-1-olu (dział 2.31.3) (60 mg; 114 (Lmol; 1,0 równoważnika) w bezwodnym CH2CI2 (1,4 ml) w temperaturze otoczenia i pod argonem. Mieszaninę reakcyjną miesza się przez noc w temperaturze otoczenia. Środowisko reakcji rozcieńcza się następnie CH2CI2, przemywa wodą, 1N roztworem HCl, nasyconym roztworem NaHCO3 następnie fazy oddziela się. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza odparowuje. Pozostałość rozpuszcza się w CH2CI2, następnie roztwór ochładza się do 0°C przez godziny. Osad diizopropylomocznika usuwa się następnie przez filtrację, przemywa zimnym CH2CI2 i rozpuszczalnik odparowuje się. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2Cl2/acetonem 3/1) pozwala otrzymać produkt sprzęgania (58 mg; 49%) w formie białej krystalicznej stałej substancji (Rf=0,50 w CH2CI2/acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacze fosfomolibdenowe).
13C-NMR (62,89 MHz, CDCI3), δ w ppm 174,21; 171,91; 170,78; 170,62; 138,25; 135,67; 128,9; 128,8; 128,7; 128,5; 128,21; 76,88; 71,78; 71,66; 67,1; 64,89; 51,71; 49,79; 42,31; 41,62; 39,34; 35,78; 34,86; 34,7; 32,22; 29,95; 29,66; 29,49; 28,02; 26,24; 25,6; 25,54; 25,33; 23,75; 22,99; 14,43.
2.31.6. Ester β-benzylowy a-N-((4R)-5-(6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanoiloksy)-4-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu kwasu N-[(R)-3-benzyloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego
Handlowy chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (33 mg, 168 L mol) i 4-dimetyloaminopirydynę (3 mg, 17 Lmol) dodaje się kolejno do roztworu estru β-benzylowego otrzymanego powyżej (58 mg, 56 L mol) i kwasu 6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanowego (45 mg, 168 L mol) w suchym CH2CI2 (2,6 ml) w temperaturze 0°C i pod argonem. Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 30 minut w temperaturze 0°C i następnie przez noc w temperaturze otoczenia. Środowisko reakcji rozcieńcza się następnie CH2CI2, przemywa wodą z 1N roztworem HCl, następnie fazy oddziela się. Fazę organiczną osusza się nad mgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2CI2/aceton 5/1) pozwala otrzymać produkt sprzęgania (57 mg; 79%) w formie białej krystalicznej stałej substancji (Rf=0,80 w CH2Cl2/acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy).
13C-NMR (62,89 MHz, CDCI3), δ w ppm 173,83; 173,77; 171,9; 171,72; 170,79; 169,94; 156,79; 138,32; 136,96; 135,71; 128,89; 128,81; 128,68; 128,49; 128,37; 128,20; 76,89; 71,81; 71,56; 67,04; 66,87; 66,03; 49,62; 48,52; 42,06; 41,65; 41,1; 39,25; 35,83; 34,86; 34,53; 34,19; 34,08; 32,22; 29,95; 29,72; 29,66; 29,50; 28,43; 26,42; 26,23; 26,0; 25,58; 25,36; 22,99; 14,43.
2.31.7. a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-[(R)-3-hydroksytetradekanoilo]-L-asparaginowego
Roztwór związku wytworzonego powyżej (47 mg, 36 L mol) w mieszaninie CH2CI2/metanol 5/1 (3,3 ml) zawierającej kwas octowy (280 L l) uwodornia się w obecności 10% Pd na węglu w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 72 godziny. Katalizator usuwa się przez filtrację. Przesącz odparowuje się do suchej masy, następnie osusza pompą łopatkową dla wytworzenia a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu kwasu N-[(R)-3-hydroksytetradekanoilo]-L-asparaginowego, (35 mg, wydajność ilościowa).
ES/MS: m/z 981,9 ([M+H]+) (fig. 9).
PL 208 584 B1
P r z y k ł a d 2.32.
a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego, (=OM-197-MC-AC tetracyl) (fig. 10)
Taka sama reakcja (por. dział 1.2.1) prowadzona na handlowym H-L-Asp(OBn)-OH (Fluka, Buchs, Szwajcaria) prowadzi do estru β-benzylowego kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego.
2.32.1. Ester β-benzylowy a-N-[(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego
Handlowy HOOBt (3-hydroksy-1,2,3-benzotriazyn-4(3H)-on) (ACROS, Basel, Szwajcaria) (349 mg, 207 gmol, 1 równoważnik) następnie handlowy N,N'-diizopropylkarbodiimid (41 gl, 207 gmol, 1 równoważnik) dodaje się kolejno do roztworu estru β-benzylowego kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego (131 mg; 207 gmol) i (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentan-1-olu (dział 2.31.3) (109 mg; 207 gmol; 1,0 równoważnika) w bezwodnym CH2CI2 (2,6 ml) w temperaturze otoczenia i pod argonem. Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 4 godziny w temperaturze otoczenia. Środowisko reakcji rozcieńcza się następnie CH2CI2, przemywa wodą, 1N roztworem HCl, nasyconym roztworem NaHCO3, następnie fazy oddziela się. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2CI2/acetonem 3/1 następnie 2/1) pozwala otrzymać produkt sprzęgania (122 mg; 52%) w formie białej krystalicznej stałej substancji (Rf=0,55 w CH2CI2/acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacze fosfomolibdenowe).
13C-NMR (62,89 MHz, CDCI3), δ w ppm 174,18; 172,02; 170,72; 170,60; 157,53; 135,67; 128,87; 128,65; 128,43; 71,69; 71,36; 67,07; 64,81; 51,68; 49,63; 42,33; 42,15; 39,58; 36,08; 34,87; 34,77; 32,21; 29,94; 29,83; 29,72; 29,65; 29,49; 26,09; 25,6; 25,54; 25,34; 25,29; 22,98; 14,41.
2.32.2. Ester β-benzylowy e-N-((4R)-5-(6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanoiloksy)-4-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego
Handlowy chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (85 mg, 321 gmol) i 4-dimetyloaminopirydynę (4 mg, 32 gmol) dodaje się kolejno do roztworu estru β-benzylowego otrzymanego powyżej (122 mg, 107 gmol) i kwasu 6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanowego (86 mg, 107 gmol) w suchym CH2CI2 (5 ml) w temperaturze 0°C i pod argonem. Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 30 minut w temperaturze 0°C i następnie miesza przez noc w temperaturze otoczenia. Środowisko reakcji rozcieńcza się następnie CH2CI2, przemywa wodą, następnie 1N roztworem HCl i fazy oddziela się. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2Cl2/acetonem 5/1) pozwala otrzymać produkt sprzęgania (97 mg; 65%) w formie białej krystalicznej stałej substancji (Rf=0,77 w CH2CI2/acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy).
13C-NMR (62,89 MHz, CDCI3), δ w ppm 172,13; 170,7; 170,43; 169,93; 156,76; 136,93; 135,68; 128,88; 128,78; 128,64; 128,4; 128,34; 71,60; 71,34; 67,03; 66,83; 65,97; 49,46; 48,55; 42,20; 42,10; 41,08; 39,35; 36,00; 34,86; 34,74; 34,51; 34,17; 32,20; 29,93; 29,81; 29,70; 29,63; 29,48; 29,44; 28,57; 26,39; 26,10; 25,60; 25,56; 25,35; 25,27; 24,71; 22,97; 14,40.
2.32.3. a-N-((4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego
Roztwór związku wytworzonego powyżej (90 mg, 65 gmol) w mieszaninie CH2Cl2/metanolu 5/1 (6 ml) zawierającej kwas octowy (500 gl) uwodornia się w obecności 10% Pd na węglu w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 72 godziny. Katalizator usuwa się przez filtrację. Przesącz odparowuje się do suchej masy, następnie osusza pompą łopatkową dla wytworzenia a-N-{(4R)-5-(S-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentylo}-amidu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego, (76 mg, wydajność ilościowa).
C67H126N4O11. ES/MS: m/z 1163,9 ([M+H]+) (fig. 11).
P r z y k ł a d 2.33.
1-diwodorofosforano-10-(3-aminopropanian) (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu (=OM-197-MP-AP) (fig. 12)
PL 208 584 B1
2.33.1. (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-1-(2-tetrahydropiranyloksy)-pentan
3,4-dihydro-2H-piran (DHP) (1,4 ml, 15,38 mmol), następnie p-toluenosulfonian pirydyniowy (PPTS) (441 mg, 1,75 mmol) dodaje się kolejno do roztworu (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentan-1-olu (dział 1.1.2.f) (2,5 g; 4,39 mmol) w bezwodnym CH2Cl2 (83 ml) w temperaturze otoczenia i pod argonem. Roztwór miesza się następnie przez 18 godzin w temperaturze otoczenia następnie rozcieńcza CH2CI2 (100 ml), przemywa 5% roztworem NaHCO3, następnie H2O. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją AcOEt/eterem naftowym 4/1) pozwala otrzymać (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-1-(2-tetrahydropiranyloksy)-pentan (2,86 g; 100%) w formie białej krystalicznej stałej substancji.
(Rf=0,66 w AcOEt/eterze naftowym 4/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy)
C39H54N2O6. IS/MS: m/z 653,5 ([M+H]+), 675,5 ([M+Na]+)
Temperatura topnienia = 84-86°C.
2.33.2. (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-1-(2-tetrahydropiranyloksy)-pentan
Roztwór (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-1-(2-tetrahydropiranyloksy)-pentan (2,5 g; 4,4 mmol) w etanolu (150 ml) zawierającym trietyloaminę (4 ml) uwodornia się w obecności 10% Pd na węglu w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 3 godziny 30 minut. Katalizator usuwa się przez filtraację, a następnie przemywa etanolem i przesącz odparowuje się do suchej masy, następnie osusza pompą łopatkową dla wytworzenia wolnej aminy (2,15 g; 96%) w formie bezpostaciowej stałej substancji.
C31H54N2O4. IS/MS: m/z 519,5 ([M+H]+).
2.33.3. (S)-(a-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-Y-butyrolakton
N-metylomorfolina (0,56 ml; 5,1 mmol; 1 równoważnik) i chloromrówczan izobutylu (657 gl;
5,1 mmol; 1 równoważnik) dodaje się kolejno do roztworu kwasu (R)-3-dodekanoiloksytetradekanowego (2,16 g; 5,1 mmol) w bezwodnym THF (28 ml) w temperaturze -15°C i pod argonem. Po wymieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze -15°C, dodaje się handlowy bromowodorek laktonu L-homoseryny (916 mg; 5,1 mmol; 1 równoważnik) rozpuszcza się w 0,72M roztworze NaHCO3 (14 ml, 2 równoważniki). Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 20 godzin w temperaturze otoczenia. Środowisko reakcji rozcieńcza się Et2O (130 ml), fazę organiczną oddziela się i przemywa H2O, następnie osusza nad MgSO4, przesącza, i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Oczyszczanie przez krystalizację (minimalna ilość CH2CI2 i nadmiar pentanu w temperaturze 0°C) pozwala otrzymać produkt sprzęgania (2,17 g; 85%) w formie białego ciała stałego. (Rf=0,41 w eterze naftowym/EtOAc 1/1; wywoływacz fosfomolibdenowy).
C30H55NO5. IS/MS: m/z 510,5 ([M+H]+), 532,5 [(M+Na)]+)
Temperatura topnienia = 79-80°C.
2.33.4. (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-10-(2-tetrahydropiranylo)oksydekan-1-ol (S)-(a)-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-Y-butyrolakton (dział 2.33.3) (483 mg, 0,95 mmol) dodaje się w temperaturze 20-21°C do roztworu (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-1-(2-tetrahydropiranyloksy)-pentan (dział 2.33.2) (638 mg, 1,23 mmol, 1,3 równoważnika) w bezwodnym CH2CI2 (1,5 ml). Roztwór miesza się przez 3 dni w temperaturze 20-21°C, następnie rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2Cl2/acetonem 5/1 do 1/1) pozwala otrzymać alkohol (829 mg, 85%) w formie białego ciała stałego.
(Rf=0,37 w CH2Cl2/acetonie 2/1; światło nadfioletowe i wywoływacze fosfomolibdenowe)
C61H109N3O9. IS/MS: m/z 1029,0 ([M+H]+), 1051,0 ([M+Na]+)
Temperatura topnienia = 81-82°C.
2.33.5. 1-(dibenzylofosforano)-10-(3-benzyloksykarbonyloaminopropanian) (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diol
Taka sama sekwencja reakcji (por. dział 2.7.4 i dział 2.7.5) zastosowana do produktu wytworzonego powyżej, (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-10-(2-tetrahydropiranylo)oksydekan-1-olu (dział 2.33.4) prowadzi do 1-(di52
PL 208 584 B1 benzylofosforanu) (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu.
Handlowy chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (239 mg, 1,25 mmol) i 4-dimetyloaminopirydynę (15 mg, 125 μmol) dodaje się kolejno do roztworu tego związku (500 mg, 0,41 mmol) i handlowej N-CBz-e-alaniny (278 mg, 1,24 mmol) w suchym CH2Cl2 (20 ml) w temperaturze 0°C i pod argonem. Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 30 minut w temperaturze 0°C, następnie przez noc w temperaturze otoczenia. Środowisko reakcji przemywa się wodą, następnie 1N roztworem HCl, i fazy oddziela się. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2CI2/acetonem 5/1, potem 1/2) pozwala otrzymać produkt sprzęgania (562 mg; 96%).
(Rf=0,68 w CH2Cl2/acetonie 2/1; światło nadfioletowe i wywoływacze fosfomolibdenowe)
C84H125N4O14P. IS/MS: m/z 1410,0 ([M+H]+), 1432,0 ([M+Na]+).
2.33.6. 1-diwodorofosforano-10-(3-aminopropanian)(3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
Roztwór związku wytworzonego powyżej (540 mg, 0,38 mmol) w mieszaninie CH2CI2 (54 ml) i etanol (20 ml) zawierającej kwas octowy (10,8 ml) uwodornia się w obecności 10% Pd na węglu w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 36 godzin. Katalizator usuwa się przez filtrację. Przesącz odparowuje się do suchej masy, następnie osusza pompą łopatkową dla wytworzenia 1-diwodorofosforanu-10-(3-aminopropanianu) (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu (358 mg, 93%).
C52H101N4O12P. ES/MS: m/z 1005,6 ([M+H]+) (fig. 13).
P r z y k ł a d 2.34.
1-diwodorofosforan-10-(12-aminododekanian)(3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu (=OM-197-MP-AD) (fig. 14)
2.34.1. 1-(dibenzylofosforano)-10-(12-benzyloksykarbonyloaminododekanian) (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
Handlowy chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (157 mg, 0,82 mmol) i 4-dimetyloaminopirydynę (10 mg, 82 μmol) dodaje się kolejno do roztworu 1-(dibenzylofosforanu) (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu (dział 2.33.5) (659 mg, 0,55 mmol) i handlowego kwasu 12-(benzyloksykarbonyloamino)dodekanowego (287 mg, 0,82 mmol) w suchym CH2CI2 (25 ml) w temperaturze 0°C i pod argonem. Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 30 minut w temperaturze 0°C, następnie przez noc w temperaturze otoczenia. Środowisko reakcji przemywa się wodą, następnie 1N roztworem HCl, następnie fazy oddziela się. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2Cl2/acetonem 4/1, potem 2/1) pozwala otrzymać produkt sprzęgania (840 mg; 80%).
(Rf=0,70 w CH2Cl2/acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacze fosfomolibdenowe).
13C-NMR (62,89 MHz, CDCI3), δ w ppm: 173,35, 171,18, 170,49, 169,40, 156,31, 138,28, 136,61, 135,53, 135,43, 135,36, 128,54, 128,41, 128,33, 127,97, 127,88, 127,57, 76,49, 71,25, 71,01, 69,74, 69,63, 69,52, 66,46, 65,64, 64,67, 64,58, 53,36, 49,85, 47,89, 41,62, 41,52, 41,03, 39,15, 34,41, 34,33, 34,00, 33,91, 33,57, 33,49, 31,82, 30,84, 29,87, 29,56, 29,42, 29,27, 29,17, 29,09, 29,04, 28,59, 26,64, 25,39, 25,15, 25,09, 24,94, 24,72, 22,61, 14,05.
2.34.2. 1-diwodorofosforano-10-(12-aminododekanian)(3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu.
Roztwór związku wytworzonego powyżej (607 mg, 0,40 mmol) w mieszaninie CH2Cl2/etanolu 5/2 (70 ml) zawierającej kwas octowy (12 ml) uwodornia się w obecności 10% Pd na węglu w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 12 do 24 godzin. Katalizator usuwa się przez filtrację. Przesącz odparowuje się do suchej masy, następnie osusza pompą łopatkową dla wytworzenia 1-diwodorofosforanu-10-(12-aminododekanianu)(3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu (429 mg, 96%).
C61H119N4O12P. ES/MS: m/z 1131,8 ([M+H]+), 1153,8 ([M+Na]+) (fig. 15).
PL 208 584 B1
P r z y k ł a d 2.35.
a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-pentylo}amido-e-N-(6-aminoheksylo)amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego, (=OM-197-AH OH) (fig. 5)
2.35.1. a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amido-e-N-(6-aminoheksylo)amid N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego kwasu
Roztwór a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentylo}amido-e-N-(6-benzyloksykarbonyloaminoheksylo)amidu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego (dział 2.29.2) (80 mg, 0,67 mmol) w mieszaninie CH2CI2/etanol 1/1 (10 ml) zawierającej kwas octowy (1 ml) uwodornia się w obecności 10% Pd na węglu w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 18 godzin. Katalizator usuwa się przez filtrację. Przesącz odparowuje się do suchej masy, pozostałość odparowuje z toluenem, następnie osusza pompą łopatkową dla wytworzenia a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amidu-e-N-(6-aminoheksylo)amidu kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-L-asparaginowego (65 mg, 100%).
C55H107N5O8. ES/MS: m/z 967,0 ([M+H]+), 989,0 ([M+Na]+) (fig. 6).
P r z y k ł a d 2.36.
(3S,9R)-3-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu 1-diwodorofosforano-10-(6-aminoheksanian) (=OM-197-MP AC-inv) (fig. 16)
2.36.1. (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-1-(2-tetrahydropiranyloksy)-pentan
3,4-dihydro-2H-piran (DHP) (2,19 ml, 0,024 mol) następnie p-toluenosulfonian pirydyniowy (PPTS) (961 mg, 2,75 mmol) dodaje się kolejno do roztworu (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]pentan-1-olu (dział 2.31.2) (4,54 g, 6,87 mmol) w bezwodnym CH2CI2 (130 ml) w temperaturze otoczenia i pod argonem. Roztwór miesza się następnie przez 16 godzin w temperaturze otoczenia, rozcieńcza CH2CI2 (100 ml), przemywa 5% roztworem NaHCO3, następnie H2O. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2CI2/acetonem 9/1) pozwala otrzymać (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-1-(2-tetrahydropiranyloksy)-pentan (3,88 g; 76%) w formie bezpostaciowej stałej substancji.
(Rf=0,74 w CH2CI2/acetonie 5/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy)
C44H76N2O7. IS/MS: m/z. 745,5 ([M+H]+), 768,0 ([M+Na]+), 783,5.
2.36.2. (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-1-(2-tetrahydropiranyloksy)pentan
Roztwór (2R)-5-(benzyloksykarbonyloamino)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-1-(2-tetrahydropiranyloksy)-pentanu (3,79 g, 5,21 mmol) w etanolu (150 ml) zawierającym trietyloaminę (4,6 ml) uwodornia się w obecności 10% Pd na węglu w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 3 godziny. Katalizator usuwa się przez filtrację, przemywa etanolem i przesącz odparowuje się do suchej masy, następnie osusza pompą łopatkową dla wytworzenia wolnej aminy (3,2 g, 100%) w formie bladożółtej substancji stałej.
C36H70N2O5. IS/MS: m/z 611,5 ([M+H]+), 633,5 ([M+Na]+).
2.36.3. (S)-(a)-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-Y-butyrolakton
N-metylomorfolinę (497 μ|, 4,48 mmol; 1 równoważnik) i chloromrówczan izobutylu (585 μ|, 4,48 mmol; 1 równoważnik) dodaje się kolejno do roztworu kwasu (R)-3-benzyloksytetradekanowego (1,5 g, 4,48 mmol) [Bull. Chem. Soc. Jpn, 60 (1987), 2197-2204] w bezwodnym THF (25 ml) w temperaturze -15°C i pod argonem. Po wymieszaniu przez 1 godzinę 15 minut w temperaturze -15°C, dodaje się handlowy bromowodorek laktonu L-homoseryny (815 mg, 4,48 mmol) i następnie roztwór NaHCO3 (757 mg) w H2O (12 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 16 godzin w temperaturze otoczenia. Środowisko reakcji rozcieńcza się Et2O (50 ml), fazę organiczną oddziela się i przemywa H2O, następnie osusza nad MgSO4, przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Oczyszczanie metodą krystalizacji (minimalna ilość CH2CI2 i nadmiar pentanu w temperaturze 0°C) pozwala otrzymać produkt sprzęgania (1,59 g; 85%) w formie białej substancji stałej. (Rf=0,80 w CH2Cl2/acetonie 2/1; wywoływacz fosfomolibdenowy). C25H39NO4. IS/MS: m/z 418,5 ([M+H]+), 440,5 ([M+Na]+).
PL 208 584 B1
2.36.4. (3S, 9R)-3-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanooiloksytetradekano-iloamino]-10-(2-tetrahydropiranylo)oksy-dekano-1-ol (S)-(a)-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-Y-butyrolakton (dział 2.36.3) (421 mg, 1 mmol) dodaje się w temperaturze 25°C do roztworu (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-1-(2-tetrahydropiranyloksy)pentanu (dział 2.36.2) (800 mg, 1,3 mmol, 1,3 równoważnika) w bezwodnym CH2CI2 (2 ml). Roztwór miesza się przez 72 godziny w temperaturze 25°C, następnie dodaje się trietyloaminę (140 1 mmol, 1 równoważnik). Mieszaninę reakcyjną miesza się w tej temperaturze przez 10 dni, następnie rozpuszczalnik odparowuje pod zmniejszonym ciśnieniem. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2CI2/acetonem 4/3, następnie acetonem) pozwala otrzymać alkohol (587 mg, 57%) w formie bezpostaciowej stałej substancji. (Rf=0,52 w CH2Cl2/acetonie 2/1; światło nadfioletowe i wywoływacze fosfomolibdenowe). C61H109N3O9. IS/MS: m/z 1029,0 ([M+H]+), 1151,0 ([M+Na]+).
2.36.5. 1-(dibenzylofosforan) (3S, 9R)-3-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-10-(2-tetrahydropiranylo)oksy-dekano-1-olu
85% fosforamidyn dibenzylo-dietylu (392 μβ 1,31 mmol; 2,3 równoważnika) dodaje się do roztworu alkoholu wytworzonego powyżej (585 mg; 0,57 mmol) i 1H-tetrazolu (120 mg; 1,71 mmol; 3 równoważniki) w bezwodnym THF (23 ml) w temperaturze otoczenia i pod argonem. Obserwuje się szybkie tworzenie białych kryształów w środowisku reakcji. Po wymieszaniu przez 45 minut w temperaturze otoczenia dodaje się roztwór mCPBA (57-86%; 360 mg; 2,10 mmol; 3,7 równoważnika) w CH2CI2 (15 ml). Zauważa się zanik kryształów. Po wymieszaniu przez 45 minut w temperaturze otoczenia, dodaje się nasycony roztwór Na2S2O3 (20 ml), następnie mieszaninę reakcyjną miesza się przez 10 minut. Roztwór rozcieńcza się eterem, fazę organiczną oddziela i przemywa nasyconym roztworem Na2S2O3 (5x), i nasyconym roztworem NaHCO3 (2x).
Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2CI2/acetonem 6/1, 5/1 potem 1/1) pozwala otrzymać dibenzylofosforan (644 mg; 88%) w formie bezpostaciowej stałej substancji. (Rf=0,25 w CH2CI2/acetonie 4/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy). C75H122N3O12P. IS/MS: m/z 1289,0 ([M+H]+), 1312,0 ([M+Na]+).
2.36.6. 1-(dibenzylofosforan) (3S,9R)-3-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
Roztwór związku wytworzonego powyżej (634 mg, 0,49 mmol) w CH2CI2 (2 ml) dodaje się w temperaturze 0°C do 1% roztworu HCl w metanolu (23 ml). Po wymieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze 0°C, środowisko reakcji zobojętnia się 10% roztworem NaHCO3, rozcieńcza CH2CI2, następnie fazę organiczną oddziela się. Powstałą fazę wodną ekstrahuje się CH2CI2 (3x) i fazy organiczne łączy się. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje dla wytworzenia surowego alkoholu (579 mg; 98%) w formie bezpostaciowej stałej substancji. (Rf=0,29 w CH2Cl2//acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy). C70H114N3O11P. IS/MS: m/z 1204,5 ([M+H]+).
2.36.7. 1-(dibenzylofosforano)-10-(6-benzyloksykarbonyloaminoheksanian) (3S,9R)-3-[(R)3-benzyloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
Handlowy chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (173 mg, 0,90 mmol) i 4-dimetyloaminopirydynę (11 mg, 90 μmol) dodaje się kolejno do roztworu związku wytworzonego powyżej (542 mg, 0,45 mmol) i handlowego kwasu 6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanowego (238 mg, 0,90 mmol) w suchym CH2CI2 (15 ml) w temperaturze 0°C i pod argonem. Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 30 minut w temperaturze 0°C następnie przez noc w temperaturze otoczenia. Środowisko reakcji przemywa się wodą, następnie 1N roztworem HCl, fazy oddziela się. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (elucja eterem naftowym/EtOAc 1/2) pozwala otrzymać produkt sprzęgania (537 mg; 82%) w formie bezpostaciowej stałej substancji. (Rf=0,69 w CH2Cl2/acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy). C84H131N4O14P. IS/MS: m/z 1451,8 ([M+H]+), 1475,0 ([M+Na]+), 1174,0 ([M-(BnO)2OPOH])+.
PL 208 584 B1
2.36.8. 1-diwodorofosforano-10-(6-aminoheksanian) (3S,9R)-3-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
Roztwór związku wytworzonego powyżej (500 mg, 0,34 mmol) w mieszaninie CH2CI2/etanol 5/2 (70 ml) zawierającej kwas octowy (10 ml) uwodornia się w obecności 10% Pd na węglu w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 36 godzin. Katalizator usuwa się przez filtrację. Przesącz odparowuje się do suchej masy, następnie osusza pompą łopatkową dla wytworzenia 1-diwodorofosforano-10-(6-aminoheksanianu) (3S,9R)-3-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]dekano-1,10-diolu (301 mg, 84%) w formie bezpostaciowej stałej substancji. C55H106N4O12P. ES/MS: m/z 1047,8 ([M+H]+), 1069,8 ([M+Na]+). (fig. 17).
P r z y k ł a d 2.37.
1-diwodorofosforano-10-(6-aminoheksanian) (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu (=OM-197-MP AC-tetracyl) (fig. 18)
2.37.1. (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-10-(2-tetrahydropiranylo)oksy-dekan-1-ol (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-1-(2-tetrahydropiranyloksy)-pentan (dział 2.36.2) (800 mg, 1,3 mmol, 1,3 równoważnika) dodaje się w temperaturze 25°C do roztworu (S)(a)-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-Y-butyrolaktonu (dział 2.33.3) (514 mg, 1,00 mmol) w bezwodnym CH2CI2 (2 ml). Roztwór miesza się przez 6 dni w temperaturze 25°C (zauważa się brak zmian w reakcji), następnie dodaje się izopropanol (2 ml) i trietyloaminę (140 gl, 1 mmol, 1 równoważnik). Roztwór miesza się przez 10 dni w temperaturze 25°C, następnie rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2CI2/acetonem 3,5/1 do 1/1) pozwala otrzymać alkohol (394 mg, 35%) w formie bezpostaciowej stałej substancji. (Rf=0,34 w CH2Cl2/acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacze fosfomolibdenowe). C66H125N3O10. IS/MS: m/z 1121,0 ([M+H]+).
2.37.2. 1-(dibenzylofosforan) (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-10-(2-tetrahydropiranylo)oksydekano-1-olu
85% fosforamidyn dibenzylodietylu (242 gl, 0,807 mmol, 2,3 równoważnika) dodaje się do roztworu alkoholu wytworzonego powyżej (393 mg, 0,35 mmol) i 1H-tetrazolu (74 mg, 1,05 mmol, 3 równoważniki) w bezwodnym THF (15 ml) w temperaturze otoczenia i pod argonem. Obserwuje się szybkie tworzenie białych kryształów w środowisku reakcji. Po wymieszaniu przez 1 godzinę 45 minut w temperaturze otoczenia, dodaje się roztwór mCPBA (57-86%; 221 mg, 1,3 mmol, 3,7 równoważnika) w CH2CI2 (10 ml). Zauważa się zanik kryształów. Po wymieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia dodaje się nasycony roztwór Na2S2O3 (20 ml), następnie mieszaninę reakcyjną miesza się przez 10 minut. Roztwór rozcieńcza się następnie eterem, fazę organiczną oddziela się i przemywa nasyconym roztworem Na2S2O3 (5x) i nasyconym roztworem NaHCO3 (2x). Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2Cl2/acetonem 6/1, 5/1 potem 1/1) pozwala otrzymać dibenzylofosforan (450 mg; 92%) w formie bezpostaciowej stałej substancji. (Rf=0,29 w CH2Cl2/acetonie 4/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy). C80H138N3O13P. IS/MS: m/z 1381,0 ([M+H]+), 1403,0 ([M+Na]+).
2.37.3. 1-(dibenzylofosforan) (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
Roztwór związku wytworzonego powyżej (429 mg, 0,31 mmol) w CH2CI2 (15 ml) dodaje się w temperaturze otoczenia do 1% roztworu HCl w metanolu (14 ml). Po wymieszaniu przez 2 godziny w temperaturze otoczenia, środowisko reakcji zobojętnia się 10% roztworem NaHCO3, rozcieńcza CH2CI2, następnie fazę organiczną oddziela się. Powstałą fazę wodną ekstrahuje się CH2CI2 (3x), następnie fazy organiczne łączy się. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2Cl2//acetonem 4/1, 2/1 następnie 1/1) pozwala otrzymać dibenzylofosforan (186 mg; 46%) w formie bezpostaciowej stałej substancji. (Rf=0,39 w CH2Cl2/acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy).
C75H130N3O12P. IS/MS: m/z 1297,0 ([M+H]+), 1319,0 ([M+Na]+), 1019,0 ([M-(BnO)2OPOH]+)
PL 208 584 B1
2.37.4. 1-(dibenzylofosforano)-10-(6-benzyloksykarbonyloaminoheksanian) (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]dekano-1,10-diolu
Handlowy chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etyokarbodiimidu (46 mg; 0,24 mmol, 2 równoważniki) i 4-dimetyloaminopirydynę (3 mg, 0,02 mmol, 0,2 równoważnika) kolejno dodaje się do roztworu związku wytworzonego powyżej (154 mg, 0,12 mmol) i handlowego kwasu 6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanowego (63 mg, 0,24 mmol, 2 równoważniki) w suchym CH2CI2 (5 ml) w temperaturze 0°C i pod argonem. Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 30 minut w temperaturze 0°C, następnie przez noc w temperaturze otoczenia. Środowisko reakcji rozcieńcza się następnie CH2CI2, przemywa wodą, 1N roztworem HCl, następnie fazy oddziela się. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (elucja CH2CI2/acetonem 3/1) pozwala otrzymać produkt sprzęgania (149 mg; 81%) w formie bezpostaciowej stałej substancji. (Rf=0,75 w CH2Cl2/acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy). C89H147N4O15P. IS/MS: m/z 1545,5 ([M+H]+).
2.37.5. 1-diwodorofosforano-10-(6-aminoheksanian) (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
Roztwór związku wytworzonego powyżej (140 mg; 0,091 mmol) w mieszaninie CH2Cl2/etanol 3/1 (20 ml) uwodornia się w obecności 10% Pd na węglu w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 24 godziny. Katalizator usuwa się przez filtrację. Przesącz odparowuje się do suchej masy, następnie osusza pompą łopatkową dla wytworzenia 1-diwodorofosforano-10-(6-aminoheksanianu) (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu (92 mg, 83%). C67H129N4O13P. ES/MS: m/z 1229,9 ([M+H]+). (fig. 19)
P r z y k ł a d 2.38.
1-diwodorofosforanu-10-(6-aminoheksanian) (3S,9R)-3-oktadekanoiloamino-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]dekano-1,10-diolu (=OM-197-MP AC-inv-C1») (fig. 20)
2.38.1. (S)-(a)-oktadekanoiloamino-Y-butyrolakton
N-metylomorfolinę (604 gl, 5,49 mol; 1 równoważnik) i chloromrówczan izobutylu (713 gl, 5,49 mmol; 1 równoważnik) dodaje się kolejno do roztworu handlowego kwasu oktadekanowego (1,56 g, 5,49 mmol) w bezwodnym THF (30 ml) w temperaturze -15°C i pod argonem. Po mieszaniu przez 1 godzinę 15 minut w temperaturze -10°C, handlowy bromowodorek laktonu L-homoseryny (1 g, 5,49 mmol), następnie roztwór NaHCO3 (923 mg, 11 mmol, 2 równoważniki) w H2O (14 ml) następnie dodaje się. Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 16 godzin w temperaturze otoczenia. Środowisko reakcji rozcieńcza się Et2O (50 ml), fazę organiczną oddziela się i przemywa H2O, następnie osusza nad MgSO4, przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Oczyszczanie przez krystalizację (minimalna ilość CH2CI2 i nadmiar pentanu w temperaturze 0°C) pozwala otrzymać produkt sprzęgania (1,38 g, 68%) w formie białej substancji stałej. (Rf=0,31 w CH2CI2/acetonie 2/1; wywoływacz fosfomolibdenowy). C22H41NO3. IS/MS 368,5 ([M+H]+), 390,5 ([M+Na]+).
2.38.2. (3S, 9R)-3-oktadekanoiloamino-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-10-(2-tetrahydropiranylo)oksy-dekan-1-ol (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-1-(2-tetrahydropiranyloksy)-pentan (dział 2.36.2) (800 mg, 1,3 mmol, 1,3 równoważnika) dodaje się w temperaturze 25°C do roztworu (S)-(a)-oktadekanoiloamino-Y-butyrolaktonu wytworzonego powyżej (370 mg, 1 mmol) w bezwodnym CH2CI2 (2 ml). Roztwór miesza się przez 72 godziny w temperaturze 25°C (nie stwierdza się zmian w reakcji), następnie dodaje się trietyloaminę (140 gl, 1 mmol, 1 równoważnik). Roztwór miesza się przez 40 dni w temperaturze 25°C, następnie rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2CI2/acetonem 4/3 do 1/1) pozwala otrzymać alkohol (306 mg, 31%) w formie białej substancji stałej. (Rf=0,17 w CH2Cl2/acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacze fosfomolibdenowe). C58H111N3O8. IS/MS: m/z. 979, 0 ([M+H]+), 1001,0 ([M+Na]+).
2.38.3. 1-(dibenzylofosforan) (3S,9R)-3-oktadekanoiloamino-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-10-(2-tetrahydropiranylo)oksy-dekan-1-olu
85% fosforamidyn dibenzylo-dietylu (209 gl, 0,7 mmol, 2,3 równoważnika) dodaje się w temperaturze otoczenia i pod argonem do roztworu alkoholu wytworzonego powyżej (296 mg, 0,303 mmol) i 1H-tetrazolu (296 mg, 0,303 mmol, 3 równoważniki) w bezwodnym THF (12 ml). Obserwuje się szybkie tworzenie białych kryształów w środowisku reakcji. Po wymieszaniu przez 45 minut w temperatuPL 208 584 B1 rze otoczenia, dodaje się roztwór mCPBA (57-86%; 191 mg, 1,12 mmol, 3,7 równoważnika) w CH2CI2 (17 ml). Zauważa się zanik kryształów. Po wymieszaniu przez 45 minut w temperaturze otoczenia dodaje się nasycony roztwór Na2S2O3 (20 ml), następnie mieszaninę reakcyjną miesza się przez 10 minut. Roztwór rozcieńcza się następnie eterem, fazę organiczną oddziela się i przemywa nasyconym roztworem Na2S2O3 (5x), i nasyconym roztworem NaHCO3 (2x). Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2CI2/acetonem 3/1) pozwala otrzymać dibenzylofosforan (330 mg; 89%) w formie bezpostaciowej stałej substancji. (Rf=0,40 w CH2CI2/acetonie 2/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy). C72H124N3O11P. IS/MS: m/z 1239,0 ([M+H]+), 1261,0 ([M+Na]+).
2.38.4. 1-(dibenzylofosforan) (3S,9R)-3-oktadekanoiloamino-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
Roztwór związku wytworzonego powyżej (320 mg; 0,258 mmol) w CH2CI2 (2 ml) dodaje się w temperaturze 0°C do 1% roztworu HCl w metanolu (11 ml). Po wymieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze 0°C, środowisko reakcji zobojętnia się 10% roztworem NaHCO3, rozcieńcza CH2CI2, następnie fazę organiczną oddziela się. Powstałą fazę wodną ekstrahuje się następnie CH2CI2 (3x), i fazy organiczne łączy się. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje dla wytworzenia alkoholu (254 mg; 85%) w formie bezpostaciowej stałej substancji. (Rf= 0,20 w CH2CI2//acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy).
2.38.5. 1-(dibenzylofosforano)-10-(6-benzyloksykarbonylaminoheksanian) (3S,9R)-3-oktadekanoiloamino-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
Handlowy chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (73 mg; 0,379 mmol; 1,8 równoważnika) i 4-dimetyloaminopirydynę (1 mg, 0,038 mmol; 0,18 równoważnika) dodaje się kolejno do roztworu związku wytworzonego powyżej (243 mg, 0,211 mmol) i handlowego kwasu 6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanowego (101 mg, 0,379 mmol; 1,8 równoważnika) w suchym CH2CI2 (9,5 ml) w temperaturze 0°C i pod argonem. Mieszaninę reakcyjną miesza się następnie przez 30 minut w temperaturze 0°C, następnie przez noc w temperaturze otoczenia. Środowisko reakcji rozcieńcza się następnie CH2CI2, przemywa wodą, następnie 1N roztworem HCl, i fazy oddziela się. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją AcOEt/eterem naftowym 2/1) pozwala otrzymać produkt sprzęgania (226 mg; 77%) w formie bezpostaciowej stałej substancji. (Rf=0,53 w CH2Cl2/acetonie 3/1; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy). C81H133N4O13P. IS/MS: m/z 1402,0 ([M+H]+), 1425,0 ([M+Na]+).
2.38.6. 1-diwodorofosforano-10-(6-aminoheksanian) (3S,9R)-3-oktadekanoiloamino-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
Roztwór związku wytworzonego powyżej (220 mg; 0,157 mmol) w mieszaninie CH2CI2 (20 ml) i etanolu (9 ml) zawierającej kwas octowy (10 ml) uwodornia się w obecności 10% Pd na węglu w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 24 godziny. Katalizator usuwa się przez filtrację. Przesącz odparowuje się do suchej masy, następnie osusza pompą łopatkową dla wytworzenia 1-diwodorofosforano-10-(6-aminoheksanianu) (3S,9R)-3-oktadekanoiloamino-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu (134 mg; 81%). C59H115O11P. ES//MS: m/z 1087,7 ([M+H]+). (fig. 21).
P r z y k ł a d 2.39.
1-diwodorofosforano-10-bursztynian (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu (=OM-197-MP-Succ) (fig. 22)
2.39.1. 1-(dibenzylofosforano)-10-bursztynian (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]- 4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
Taka sama sekwencja reakcji (por. dział 2.7.4 i dział 2.7.5) zastosowana do (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-10-(2-tetrahydropiranylo)oksy-dekan-1-olu (dział 2.33.4) prowadzi do (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu.
Bezwodnik bursztynowy (22 mg, 0,22 mmol) dodaje się w temperaturze otoczenia do roztworu 1-(dibenzylofosforanu) (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu (176 mg, 0,15 mmol) w suchym CH2CI2 (5 ml) w obecności Et3N (41 gl, 0,29 mmol). Środowisko reakcji miesza się przez noc w temperaturze otoczenia, rozcieńcza CH2CI2, przemywa 1N roztworem HCl, następnie fazy oddziela się. Fazę organiczną osusza się nad MgSO4, przesącza i odparowuje. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krze58
PL 208 584 B1 mionkowym (z elucją CH2CI2/acetonem = 4/1 zawierającym 1% kwasu octowego, następnie CH2CI2//acetonem = 2/1 zawierającym 1% kwasu octowego) pozwala otrzymać kwas (186 mg, 97%) w formie białej substancji stałej. (Rf=0,65 w CH2CI2/acetonie 2/1 zawierającym 1% kwasu octowego; światło nadfioletowe i wywoływacz fosfomolibdenowy). C74H118N3O14P. ES/MS: m/z 1327,0 [M+Na]+, 1027 [M-(BnO)2P(O)OH+H]+
2.39.2. 1-diwodorofosforano-10-bursztynian (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu
Roztwór związku wytworzonego powyżej (54 mg; 0,041 mmol) w etanolu (6 ml) uwodornia się w obecności 10% Pd na węglu w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 4 godziny 30 minut. Katalizator usuwa się przez filtrację. Przesącz odparowuje się do suchej masy, następnie osusza pompą łopatkową dla wytworzenia 1-diwodorofosforano-10-bursztynianu (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekano-1,10-diolu (33 mg, 77%) w formie białej substancji stałej. C53H100N3O14P. ES/MS: m/z 1034,5 [M+H]+. (fig. 23).
P r z y k ł a d 2.40.
ester O-{(2R)-2-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-5-(6-aminoheksanoiloamino)-pentylowy}
N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-O-(fosfono)-DL-homoseryny, (=OM-197-MP-AC-ester) (fig. 24)
2.40.1. (2R)-5-[6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanoiloamino]-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-pentan-1-ol
Roztwór IIDQ (181 mg, 0,598 mmol, 1,3 równoważnika) w bezwodnym CH2CI2 (5 ml) dodaje się do roztworu (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]pentan-1-olu (dział 1.1.2.g) (200 mg, 0,46 mmol) w bezwodnym CH2CI2 (15 ml) i pod argonem. Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 15 minut w temperaturze otoczenia, następnie dodaje się pod argonem roztwór kwasu 6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanowego (122 mg, 0,46 mmol, 1 równoważnik) w bezwodnym CH2CI2 (5 ml). Środowisko reakcji miesza się następnie przez 48 godzin w temperaturze otoczenia, następnie rozpuszczalnik odparowuje się. Oczyszczanie pozostałości metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2CI2/acetonem 3/2) pozwala otrzymać produkt sprzęgania (216 mg; 69%).
2.40.2. Ester O-{(2R)-2-[(R)-3-benzyloksytetradekanoiloamino]-5-[6-(benzyloksykarbonyloamino)heksanoiloamino]-pentylowy} N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo-O-(difenyloksyfosforylo)-DL-homoseryny
Dicykloheksylokarbodiimid (34 mg, 0,164 mmol, 1,02 równoważnika) i 4-dimetyloaminopirydynę (3 mg, 0,024 mmol, 0,15 równoważnika) dodaje się kolejno do roztworu związku wytworzonego powyżej (110 mg, 0,161 mmol) i kwasu 4-(difenyloksyfosforyloksy)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]butanowego (dział 1.1.1.f) (122 mg, 0,161 mmol) w bezwodnym CH2CI2 (5 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 24 godziny w temperaturze otoczenia, rozcieńcza eterem, ochładza do 0°C, następnie przesącza na filtrze Millipore dla usunięcia zanieczyszczenia dicykloheksylomocznikiem. Rozpuszczalnik następnie odparowuje się. Oczyszczanie metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (z elucją CH2CI2/acetonem 3/1) pozwala otrzymać spodziewany produkt sprzęgania (70 mg; 30%).
2.40.3. Ester O-{(2R)-2-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-5-(6-aminoheksanoiloamino)pentylowy} N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-O-(difenyloksyfosforylo)-DL-homoseryny
Roztwór związku wytworzonego powyżej (100 mg, 0,070 mmol) w etanolu do HPLC (10 ml) zawierający kwas octowy (8 2 równoważniki) uwodornia się w obecności nadmiaru palladu na węglu (10%) w temperaturze otoczenia i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru przez 18 godzin. Katalizator następnie usuwa się przez filtrację. Przesącz odparowuje się do suchej masy, następnie pozostałość osusza się pompą dla wytworzenia estru O-{(2R)-2-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-5-(6-aminoheksanoiloamino)-pentylowego} N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-O-(difenyloksyforylo)-DL-homoseryny, (65 mg, 77%). C67H115N4O12P. IS/MS: m/z 1222,5 [M+Na]+, 1200,0 [M+H]+
2.40.4. Ester O-{(2R)-2-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-5-(6-aminoheksanoiloamino)pentylowy} N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo-O-(fosfono)-DL-homoseryny
PtO2 aktywuje się najpierw w czerni platynowej, w zawiesinie w etanolu do HPLC (1 ml) traktując wodorem w temperaturze otoczenia i pod ciśnieniem atmosferycznym przez 15 minut. Taką aktywowaną zawiesinę platynową przenosi się następnie do roztworu związku otrzymanego powyżej (60 mg) w MeOH do HPLC (10 ml) zawierającym kwas octowy (10 ml). Mieszaninę reakcyjną odgazowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, następnie umieszcza pod atmosferycznym ciśnieniem woPL 208 584 B1 doru w temperaturze otoczenia na 48 godzin. Wodór w kolbie reakcyjnej zastępuje się następnie obojętnym gazem, takim jak argon dla uniknięcia ryzyka zapłonu platyny, następnie katalizator przesącza się na filtrze Millipore i rozpuszczalnik odparowuje dla wytworzenia estru O-{(2R)-2-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-5-(6-aminoheksanoiloamino)-pentylowy} N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo-O-(fosfono)-DL-homoseryny (40 mg, 76%).
2 1 <\ X 2 i A X 2 <N X 2 (\ X 2 t\ X 2 1 c\ X 2 c\ X 2 c\ X 2 C00H c\ X 2
σι 1 Lf) t Lf) Lf> CM »—1 i-H 1 m Lf) Lf) CM Lf)
J-S 1 t—1 l i—1 r~i <—1 1—1 t <—l i—t r—ł rU 1-1
1 O 1 o O o o 1 o O O O X 2
C\ Cs
X X
co Pi o 1 o 1 1 1 1 X 1 1 1 1 1
o ό
CU CU
4 *4 <4 <4 <4
*4 *4 'σ l— 1— *4 *4 *4 r— I- 1- vr 'KT
t— r— ł— o o r- r— 1- o U o <— r—
u u u u u u .—. u o
CS o o o o o
(ź o o a Cs Cs o o o C\ CS cs o o
X X X r- «— X X X »— «- <— X X
— — '— u u —- '— o o u —
co co co co co co co co
co co co co co
*4- *4 ”4 *4 4 *4 *4 *4 *4 «=4
i— ł— r— 4 r- r- T~ *4 r- «—
u o u łr- u U u o T~ O U U
_____ ,—* ---. O — .—- O .—, co .-s
r~ o o o o o o o o o o
Pi Cs C\ CS o C\ CS CS CS o CS υ Cs CS
(— ,—1 I- X <— t- T— t— X t— i— r—
O o o o u u u — a a U
—- - co '—- •— '—- —-· co '—' '—'
CO co co co co co co co co co
σ i—ł i—1 i—1 i—1 i—1 i—1 τ—1 ł—1 T—ł r—ł «—ł r—1 co
a co co co co co co co co co CO co CO τ—1
2* «, K,
o o o o o o o o o o o o o
g s. «»
CM ł—i i—1 τ—1 τ—1 CM CM '—1 CM CM CM CM CM
>> X X X X X X X X X X X X o
% X X X X X 2 2 2 2 2 2
Pi
-X Pi & (X Pi pc PC PC Pi Pi Pi Pi Pi co
oo oo oo oo oo oo oo oo ω oo 00 co \
pi
o o o o o o o
o o 1 1 o i 1 l 1 1
o u u ,—„ „—. u ,—, ,— .—„
X X o § X o o o X o o X o o o o o
X ID U % £ SC % SC CU CU X sc CU CU CU Cu Cu
C) ζ) C\ Cs t) c\ CS c\ cs c\
% % 2 — .
X c\ Cs o o Cs o o o o o
X X X X X X X X X X
'—
£ co <x o ,—1 CM co vr Lf) sc c~ co σ> o
CM CM co CO CO co co CO co co CO co
N Uł CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
CU
PL 208 584 B1
3-cia seria przykładów: Wytwarzanie koniugatów
P r z y k ł a d 3.1.
Koniugaty peptydu FGFG
Jak ukazano w schematach syntezy przedłożonych w fig. 5, 8, 15, 17, 19, 21 i 23, przeprowadza się sąsiadującą reakcję hydroksylacji na związkach podobnych do dipeptydu, zawierających pomocniczą sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego typu olefiny, aby ostatecznie otrzymać stabilną diolową grupę funkcyjną. Następnie prowadzi się reakcję utleniania nadjodanem tworząc aldehydową grupę funkcyjną na pomocniczej sekwencji rozdzielającej łańcucha bocznego. Następnie można przeprowadzić reakcję redukcyjnego aminowania, stosując tę grupę funkcyjną do sprzęgania, np. peptydu małego rozmiaru, takiego jak FGFG (Fenyloalanina-Glicyna-Fenyloalanina-Glicyna, Sigma). Jednakże, związek aldehydowy korzystnie poddaje się etapowi oczyszczania w celu usunięcia soli obecnych w roztworze. To oczyszczanie związku aldehydowego uzyskuje się na fazie C18 Bondapack (Waters), 15-20 gm, 300 A, zgodnie z następującą procedurą:
- adsorpcja próbki po rozcieńczeniu w mieszaninie izopropanol-woda (1:3).
- wymywanie soli z mieszaniny izopropanol-woda (1:9).
- wymywanie związku aldehydowego najmniejszą objętością izopropanolu
Reakcję sprzęgania na podstawie redukcyjnego aminowania przeprowadzono w wodnym roztworze przy stechiometrycznym stosunku 1:1 aldehydu (pomocnicza sekwencja rozdzielająca łańcucha bocznego związku podobnego do acylo-dipeptydu) i aminowych grup funkcjonalnych dostępnych na sprzęganym peptydzie lub białku.
W przypadku peptydu FGFG, 2 mg oczyszczonego OM-197-FV7 (1,86 gmola, 1 równoważnik) dodaje się do roztworu 0,8 mg FGFG (1,86 gmola, 1 równoważnik) rozpuszczonego w 1 ml (1:1) H2O-MeCN. Roztwór miesza się przez okres 30 minut w temperaturze pokojowej, tworząc iminę. Następnie przeprowadzono etap redukcji przez dodanie 92 gl 1M NaBH3CN (5,77 mg, 50 równoważnik), tworząc bardzo stabilne wiązanie węgiel-azot (fig. 41). Koniugat poddano wstępnemu etapowi oczyszczania na kolumnie Vydac 64 w celu usunięcia peptydu, który nie przereagował, i potem na Bondapack fazie C18 (Waters) otrzymując sól sodową (patrz sekcja oczyszczanie i analiza związków według wynalazku). Następnie, koniugat rozpuszczono ponownie w mieszaninie jałowa H2O/0,01% trietanolamina (TEoA) aby napotkać wymogi testowania aktywności biologicznej. Widmo masowe ES/MS zapisane po procesie oczyszczania, jest ukazane w fig. 43 i wyraźnie pokazuje [M+H]+ jonu cząsteczkowego przy współczynniku m/z 1457,4, co dowodzi, że nastąpiło żądane sprzęganie. Widoczne jony między współczynnikiem m/z 400 i 900 identyfikowano przez analizę MS/MS fragmentów powstających z piku cząsteczek sprzęganego peptydu. Nie wykryto jonów odpowiadających początkowemu peptydowi FGFG (współczynnik m/z 427,1 [M+H]+, współczynnik m/z 853,0 [2M+H]+, fig. 42).
P r z y k ł a d 3.2.
Koniugaty peptydu (NANP)6P2P30
Związek OM-197-FV7 otrzymany zgodnie ze schematem syntezy przedłożonym w fig. 5 można sprzęgać np. z peptydem będącym przedmiotem zainteresowania farmaceutycznego, takim jak (NANP)6P2P30 [Valmori i inni, 1992, JL Immunol. 149:717-721] mającym następującą sekwencję:
(NANP)6QYIKANSKFIGITEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
Peptyd (NANP)6P30 wykazuje cztery potencjalne miejsca sprzęgania (amina terminalna + trzy lizyny). Do roztworu 7,49 mg (NANP)6P30 (1,16 gmola, 1 równoważnik) rozpuszczonego w 1 ml mieszaniny H2O-izopropanol (1:1), dodano 5 mg oczyszczonego OM-197-FV7 (4,64 gmola, 4 równoważniki). Roztwór mieszano przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie prowadzono etap redukcji prze dodanie 230 gl 1M NaBH3CN (14,43 mg, 50 równoważników). Roztwór mieszano przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a potem prowadzono etap redukcji przez dodanie 230 gl 1M NaBH3CN (14,43 mg, 50 równoważników). Mieszaninę reakcyjną dializowano potem przeciwko H2O przez 24 godziny (kaseta do dializy 3,5 kDa, Slide-A-Lyzer, Pierce). Analiza LC/ES-MS mieszaniny reakcyjnej pokazuje obecność trzech rodzajów cząsteczek, jak ukazano w chromatogramach opisanych w fig. 44. Wyraźnie widoczne są piki odpowiadające wolnemu peptydowi (pik A), peptydowi pojedynczo sprzężonemu (pik B) i peptydowi podwójnie sprzężonemu (pik C). Chmura jonowa zapisywana dla każdego z nich jest opisana w fig. 45, 46 i 47 i dowodzi, że miało miejsce kowalentne sprzężenie z jedną lub dwoma cząsteczkami OM-197-FV, jako dla pojedynczego koniugatu i podwójnego koniugatu, odpowiednio.
Fig. 45: Peptyd (NANP)6P30 (wolny peptyd) MW: 6451. Jony przy współczynniku m/z wynoszącym 1076,2 (A6), 1291,2 (A5), 1613,7 (A4)
PL 208 584 B1
Fig. 46: Pojedynczy koniugat OM-197-FV(NANP)6P30 MW: 7481
Jony przy współczynniku m/z wynoszącym 1247,8 (B6), 1497,4 (B5), 1871,2 (B4)
Fig. 47: Podwójny koniugat OM-197-FV(NANP)6P30 MW: 8511
Jony przy współczynniku m/z wynoszącym 1419,6 (C6), 1703,3 (C5), 2129,1 (C4)
Analiza SDS-PAGE koniugatów OM-197-FV(NANP)6P30 pokazują różne oddzielne prążki odpowiadające peptydowi który nie uległ reakcji, pojedynczemu koniugatowi i podwójnemu koniugatowi. W warunkach elektroforetycznych stosowanych w niniejszym (10-20% gradient poliakrylamidu, bufor tris-tricynowy, Bio-Rad, # 161-1108), różnicę między istotnymi prążkami szacowano przy 1000 amu, na podstawie standardowych markerów, które dowodzą, że nastąpiło sprzężenie jednej lub dwóch cząsteczek OM-197-FV z peptydem.
P r z y k ł a d 3.3.
Koniugaty peptydu P2P30
Można także sprzęgać inne peptydy przez reakcję redukcyjnego aminowania, ze związkami niosącymi pomocniczą sekwencję łańcucha bocznego typu aldehydowego. Przykład sprzężenia OM-197-FV z peptydem P2P30 jest podany w celu ilustracyjnym. Ten ostatni odpowiada części T epitopu toksoidu tężca i ma następującą sekwencję:
KQYIKANSKFIGITEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
Peptyd P2P30 obrazuje pięć potencjalnych miejsc sprzęgania (amina terminalna + cztery reszty lizynowe) i widmo masowe wynoszące 4200 amu. Skutkiem tego, użyto pięć równoważników OM-197-FV7. Obserwowano warunki reakcji wymienione powyżej. Po dializie w H2O (kaseta do dializy 3,5 kDa, Slide-A-Lyzer, Pierce), widma masowe otrzymanych koniugatów mierzono techniką LC/ES-MS i porównano z widmami zapisanymi dla wolnego peptydu P2P30, który obrazuje jony poliwalentne przy współczynniku m/z wynoszącym 840,9 (A5) 1050,9 (A4) i 1401,0 (A3), które tworzą otaczający ładunek jonowy (fig. 48) peptydu mającego masę cząsteczkową 420 amu. Widmo ES/MS monokoniugatu OM-197-FV- P2P30 obrazuje jony poliwalentne przy współczynniku m/z wynoszącym 872,8 (A6) 1047,1 (A5), 1308,6 (A4) i 1744,4 (A3) (fig. 49), które stanowią otaczające ładunki jonowe koniugatu mającego masę cząsteczkową wynoszącą 5230 amu, co odpowiada szczepieniu cząsteczki OM-197-FV na cząsteczce peptydu P2P30 przez redukcyjne aminowanie.
Podobnie, widmo masowe otrzymane dla podwójnego koniugatu (OM-197-FV)2-P2P30 stwierdza obecność dwóch cząsteczek OM-197-FV na jednostkę peptydu. Otaczający ładunek jonowy jest utworzony przez jony przy współczynniku m/z wynoszącym 1044,5 (A6), 1253,1 (A5), 1566,3 (A4) i 2088,4 (A3) (fig. 50), co po analizie widma transformowanego sprawdza się z oczekiwaną masą cząsteczkową podwójnego koniugatu (6261 amu).
P r z y k ł a d 3.4.
Koniugaty peptydu (NANP)3CS.T3
Podobną πρoχεδυρ| sprzęgania można prowadzić dla peptydu (NANP)3CS.T3 (TNO, MW: 3527 amu) mającego następującą sekwencję:
NANPNANPNANPDIEKKIAKMEKASSVFNVVNS
Po dializie H2O, obserwowane jony na widmach ES/MS odzwierciedlają masę cząsteczkową wynoszącą 4557 i 5587 amu, odpowiadając oczekiwanym wartościom dla związków jednosprzężonych i podwójnie sprzężonych.
P r z y k ł a d 3.5.
Koniugaty peptydu MR99B
Związek OM-197-MC-FV6 otrzymany zgodnie ze schematem reakcji ukazanym w fig. 8, można sprzęgać, np. z peptydem bądącym obiektem zainteresowania farmaceutycznego, takiego jak PyCS 245-253. Peptyd ten odpowiadający części epitopu T Plasmodium Yoelii [Franke, E.D. i inni, 1997, J.Immunol., 159: 3424-2433] ma następującą sekwencję:
SYVPSAEQI (PyCS 245-253)
Aby nie modyfikować części epitopu T podczas etapu sprzęgania, aminokwasy dodano SER tworząc peptyd przytaczany jako MR99B o następującej sekwencji:
SERSYVPSAEQI (MR99B)
Ponieważ niniejsza sekwencja jest pozbawiona lizyny, peptydy MR99B mają unikatowe miejsce sprzęgania przez redukcyjne aminowanie (przy terminalnej aminie). Tak więc, 2 mg oczyszczonego OM-197-MC-FV6 (2,04 μmola, 1,4 równoważnika) dodano do roztworu 2 mg MR99B (1,47 μmola, 1 równoważnik) rozpuszczonego w 1 ml mieszaniny H2O-izopropanol (1:1). Roztwór miesza się przez 30 minut w temperaturze pokojowej, potem prowadzi etap redukcji przez dodanie 29,4 μmoli (1M)
PL 208 584 B1
NaBH3CN (29,4 gmola, 2 równoważniki). Roztwór miesza się przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Analiza LC/ES-MS mieszaniny reakcyjnej dowodzi tworzenia koniugatu OM-197-MC-FVMF99B o oczekiwanej masie cząsteczkowej (2330,4 amu, fig. 51), jak ukazano w widmach opisanych w fig. 52 (otaczający ładunek jonowy) i 53 (widmo transformowane).
Oczyszczanie koniugatu OM-197-MC-FVMF99B przeprowadza się przez semi-preparatywną chromatografię cieczową na fazie C4 zgodnie z następującymi warunkami.
Kolumna: Vydac C4, 250x10 mm, 5 gm, 300 A (Vydac)
Faza ruchoma:
A: woda-MeCN, 0,05% TFA (9:1, objętościowo)
B: izopropanol-woda, 0,05% TFA (9:1, objętościowo)
Prędkość przepływu: 2,5 ml/minutę
Wymywanie: Wymywanie izokratyczne: 65% B, 20 minut Mycie: 100% B, 10 minut
Detekcja: UV, 210 nm
System: HPLC 1050
Aby pokazać, że część antygenowa peptydu nie jest zmieniona przez sprzęganie, prowadzi się trawienie trypsynowe OM-197-MC-FVMF99B. 0,5 mg koniugatu inkubuje się przez 24 godziny z 83 gg trypsyny (Roche # 109819) (stosunek substrat-enzym (6:1)) w 1 ml 50 mM buforu Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 8.
Analiza LC/ES-MS po tej reakcji, jest ukazana w fig. 54 i stwerdza obecność dwóch fragmentów z odpowiadającymi widmami ES/MS, ukazanymi w fig. 55 i 56. Pierwszy fragment wyraźnie pokazuje jony przy stosunku m/z wynoszącym 993,5 ([M+H+]) i 1015,6 ([M+Na]+) i odpowiada peptydowi CSPy 145-253 (fig. 55). Drugi fragment pokazuje jony przy stosunku m/z wynoszącym 678,1 ([M+H+]) i 1355,0 ([M+H+]), pokazując obecność struktury typu OM-FV-SER (fig. 56). Trzeci pik jest także widoczny. Pik ten odpowiada fragmentom zarówno SYVPS jak i EQI (wspólne substancje wymywane zgodnie ze stosowanymi w niniejszym warunkami rozdzialania chromatograficznymi). Tę reakcję obserwuje się także, gdy MR99B jest trawiony sam.
Wyniki te jasno pokazują, że koniugacja nie zmienia części epitopu T peptydu MR99B, jak schematycznie opisano w fig. 51.
P r z y k ł a d 3.6.
Koniugaty peptydu MR99A
Aby zwiększyć szybkość koniugacji OM-197-MC-FV z danym peptydem i zwiększyć proporcję adiuwant/antygen bez zmieniania części epitopu T, na szczepionym peptydzie można szczepić sekwencje typu KGG. Tak więc, można szczepić sekwencję KGGKGGK np. na peptydzie MR99B, uzyskując peptyd MR99A jak następuje:
KGGKGGKSERSYVVYPSAEQ (MR99A)
W związku z tym, ten peptyd ma cztery potencjalne miejsca sprzęgania dla reakcji redukcyjnego aminowania (trzy lizyny i aminę terminalną). Tak więc, 12 mg oczyszczonego OM-197-MC-FV6 (12,2 gmola, 12 równoważników) dodaje się do roztworu 2 mg MR99A rozpuszczonego w 1 ml H2O-izopropanol 1:1. Roztwór miesza się przez 30 minut w temperaturze pokojowej, następnie prowadzi się etap redukcji przez dodanie 242 gl 1M NaBH3CN (244 gmole, 242 równoważniki). Roztwór miesza się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Analiza LC/ES-MS mieszaniny reakcyjnej pokazuje różne piki odpowiadające zmiennym prędkościom koniugacji cząsteczek OM-197-MC-FV z peptydem MR99A. Widma masowe odpowiadające potrójnemu koniugatowi (OM-197-MC-FV)3-MR99A (4870 amu) są ukazane na fig. 57 (chmura jonowa) i 58 (widmo transformowane), podczas gdy widma ukazane w fig. 59 (chmura jonowa) i 60 (widmo transformowane), pokazują tworzenie poczwórnego koniugatu (OM-197-MC-FV)4-MR99A (5834 amu). Obserwuje się również jony odpowiadające formie pięciokoniugatu. Wynik ten pokazuje, że lizyna, w pewnych warunkach reakcyjnych (nadmiar OM-197-MC-FV) nie jest jedynym reaktywnym aminokwasem w reakcji redukcyjnego aminowania.
Oczyszczanie koniugatów potrójnego i poczwórnego (OM-197-MC-FV)3,4-MR99A prowadzi się przez semi-preparatywną chromatografię cieczową na fazie C4 zgodnie z następującymi warunkami.
Kolumna: Vydac C4, 250x10 mm, 5 gm, 300 A (Vydac)
Faza ruchoma:
A: woda-MeCN, 0,05% TFA (9:1, objętościowo)
B: izopropanol-woda, 0,05% TFA (9:1, objętościowo)
PL 208 584 B1
Prędkość przepływu: 2,5 ml/minutę
Wymywanie: Wymywanie izokratyczne: 65% B, 20 minut Mycie: 100% B, 10 minut
Detekcja: UV, 210 nm
System: HPLC 1050
Jak dla pojedynczego koniugatu OM-197-MC-FV-MR99A, wielokrotne koniugaty (OM-197-MC-FV)n-MR99A poddaje się trawieniu trypsyną w celu określenia, czy część antygenowa (CSPy 245-253) jest zmieniona przez koniugację, czy nie. 1 mg wielokrotnego koniugatu inkubuje się przez 24 godziny w temperaturze 25°C z 166 μg trypsyny (Roche, # 109819) (stosunek substrat-enzym: (6:1)) w 1 ml 50 mM buforu Tris HCl, 2 mMCaCl, pH 8.
Analiza LC/ES-MS przeprowadzona po reakcji stwierdza obecność wielkiej liczby produktów rozszczepienia w zmiennych położeniach peptydu MR99A. Wśród tych produktów, zauważa się fragment przy współczynniku m/z wynoszącym 993,5 ([M+H]+) i 1015,6 ([M+Na]+), który odpowiada peptydowi CSPy 245-253. Obecność tego peptydu jest dowodem spójności części epitopu T peptydu nawet po reakcji wielokrotnego sprzęgania. Dwa fragmenty, wykrywane przez ich potrójny ładunek jonowy przy współczynniku m/z wynoszącym 1621,4 ([M+H]+) i 1942,8 ([M+H]+) są szczególnie interesujące. W rzeczywistości, takie fragmenty odpowiadają, odpowiednio, fragmentom (OM-197-MC-FV)-4-KGGKGGKSER i (OM-197-MC-FV)5-KGGKGGKSER. Detekcja ich pokazuje, że można właściwie szczepić różne cząsteczki OM-197-MC-FV na sekwencji dodanej do CSPy 245-253, nawet w przypadku, gdy w reakcji redukcyjnego aminowania brały udział aminokwasy inne niż lizyna. Należy zauważyć, że obecność kilku sferycznie istotnych cząsteczek OM-197-MC-FV na peptydzie, nie wpływa na aktywność proteazy, jak w przypadku trypsyny. Wynik ten jest niezwykle interesujący, biorąc pod uwagę sprzęganie z prolekiem, w którym aktywny składnik może być uwalniany np. po selektywnym rozszczepieniu rozszczepialnego wiązania.
P r z y k ł a d 3.7.
Koniugaty peptydu Ag85c
Struktury niosące pomocniczą sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego typu formylowalerylu, można sprzęgać z wielką ilością peptydów będących przedmiotem zainteresowania farmaceutycznego. Należy wymienić np. szczepienie cząsteczek OM-197-MC-FV przez reakcję redukcyjnego aminowania, do aminy terminalnej syntetycznych peptydów mających sekwencje pochodzące z sekwencji antygenowych białka Mycobacterium tuberculosis. Peptydy początkowo stosowane były następujące:
MR 100 YLQVPSASMGR: 1208,4 amu
MR 101 MVQIRPRLVANNTRIWVYC 217 6,6 amu
LR72 PYAASLSGFFLNPSEGWWPTIGLAM 2 676,1 amu
Po reakcji z OM-197-MC-FV, wykrywano następujące koniugaty przez analizę LC/ES-MS: np. OM-197-MC-FV-MR100, który obrazuje ciężar cząsteczkowy wynoszący 2171,0 amu (fig 61 i 62). Alternatywnie, otrzymano także OM-197-MC-FV-MR101 o 3140,0 amu i OM-197-MC-FV-LR72 o 3643,0 amu.
P r z y k ł a d 3.8.
Dimery mające strukturę typu OM-197
Metodę redukcyjnego aminowania można również stosować przy syntezie dimerów mających strukturę typu OM-197.
Przykładowo, można utworzyć dimer, wychodząc od dwóch związków zawierających pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, takich jak OM-197-MC-FV i OM-197-MC-AC. A więc, 1 mg oczyszczonego OM-197-MC-FV6 (0,98 μ^Ό^, 1 równoważnik) dodaje się do roztworu 1 mg OM-197-MC-AC (0,98 μmola, 1 równoważnik) rozpuszczonego w 1 ml mieszaniny H2O-izopropanol (1:9). Roztwór miesza się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, następnie prowadzi się etap redukcyjny przez dodanie 19,6 μ 1M NaBH3CN (19,6 μ^β, 20 równoważników). Następnie roztwór miesza się przez 12 godzin w temperaturze pokojowej. Analiza LC/ES-MS środowiska reakcyjnego pokazuje tworzenie dimeru OM-197-MC-FV-OM-197-MC-AC o oczekiwanym ciężarze cząsteczkowym (1945,5 amu) co wykazano przez widmo z fig. 63. Ta cząsteczka zatem, ukazuje dwie grupy funkcyjne kwasu karboksylowego przy końcowych częściach łańcucha głównego niosącego łańcuchy acylowe.
PL 208 584 B1
W strukturze ukazanej w fig. 63, jedna z grup karboksylowych może być zastąpiona np. grupą fosforylową, przez przeprowadzenie powyższego procesu syntezy, wychodząc od związku typu OM-197-MC-FV lub OM-197-MC-AC. Przeprowadzając aminowanie redukcyjne podobnie do tego opisanego powyżej między dwoma związkami niosącymi sekwencję rozdzielającą funkcjonalnego łańcucha bocznego (OM-197-MC-FV i OM-197-MC-AC), można otrzymać dimer OM-197-MC-FV-OM-197-MC-AC. Widmo ES/MS opisane w fig. 64 potwierdza oczekiwaną masę cząsteczkową dla tego związku (2011,9 amu).
P r z y k ł a d 3.9.
Koniugacja związków zawierających pomocniczą sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego typu aminy
Związki niosące pomocniczą sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego typu aminy można także sprzęgać z antygenami peptydowymi, przez reakcję aminowania redukcyjnego. Dodatkowo, możliwe jest wykorzystanie obecności np. terminalnej seryny w sekwencji sprzęganych peptydów. W pierwszym etapie prowadzi się na peptydzie reakcję utleniania nadjodanowego, w wyniku której tworzy się bardzo reaktywna grupa glioksylilowa (-CO-CHO). Grupę tę można potem poddać reakcji poprzez reakcję redukcyjnego aminowania z pierwszorzędową aminą występującą na pomocniczej sekwencji rozdzielającej funkcjonalnego łańcucha bocznego związku typu OM-197.
Przykładowo, syntetyczny peptyd MR99B można sprzęgać ze związkiem OM-197-MC-AC, jak ukazano w schemacie syntezy z fig. 65. W tym celu, 147 gl 0,1 M NaIO4 (14,6 gmola, 1 równoważnik) rozpuszczono w 1 ml wody. Roztwór miesza się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Tak utworzony związek aldehydowy oczyszcza się na fazie C18 i odzyskuje w 1 ml mieszaniny izopropanol-woda (1:1). Następnie dodaje się 0,72 mg związku OM-197-MC-AC (0,73 gmola, 1 równoważnik), jak również 1 ml 0,2 M buforu boranowego, pH 9,2. Po mieszaniu w temperaturze pokojowej przez 30 minut, prowadzi się etap redukcji przez dodanie 14,6 gl 1M NaBH3CN (14,6 gmola, 20 równoważników). Roztwór miesza się przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
Analiza LC/ES-MS mieszaniny reakcyjnej pokazuje tworzenie koniugatu OM-197-MC-AC-MR99B o oczekiwanej masie cząsteczkowej (2299,1 amu, fig. 65) co wykazano w widmach opisanych w fig. 66 (chmura jonowa) i 67 (widmo transformowane).
W podobny sposób można sprzęgać inne związki niosące pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego typu aminy. Należy wymienić np. OM-197-MC-AP, OM-197-MC-AC, OM-212-AH1, OM-197-MC-Gly, OM-197-MC-Lys, OM-197-Lys-AC lub OM-197-Asp-AC.
P r z y k ł a d 3.10.
Koniugaty owoalbuminy
Białko,takie jak np. owoalbumina, jest szczególnie dostosowane do sprzęgania przez redukcyjne aminowanie. Wielka liczba reszt lizynowych zawarta w sekwencji (20 reszt lizynowych dla owoalbuminy) są potencjalnymi miejscami sprzęgania dla związków podobnych do dipeptydów zawierających pomocniczą sekwencję funkcjonalnego łańcucha bocznego z aldehydową grupą funkcyjną. Zmieniając stosunek stechiometryczny w reakcji redukcyjnego aminowania (związek podobny do dipeptydu/białko), można uzyskać zmienny stopień sprzęgania.
mg oczyszczonego OM-197-FV7 (0,928 gmola, 10 równoważników) dodano do roztworu 4 mg owoalbuminy (0,09 gmola, 1 równoważnik) rozpuszczonej w 5 ml H2O. Roztwór mieszano przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przed nastąpieniem etapu redukcji przez dodanie 46 gl 1M NaBH3CN (2,89 mg, 50 równoważników). Roztwór mieszano przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną dializowano następnie przeciwko H2O przez okres czasu wynoszący 24 godzin (kaseta do dializy 3,5 kDa, Slide-A-Lyzer, Pierce).
Z powodu wielkości i jej naturalnego charakteru heterogenicznego, owoalbumina przedstawia wielką liczbę problemów analitycznych. Z tego powodu, charakteryzacja koniugatu OM-197-MC-FV-owoalbumina przez spektrometrię masową, może okazać się bardzo trudnym zadaniem. Aby ukazać, że reakcja koniugacji nastąpiła, przeprowadzono analizę SDS-PAGE na różnych partiach koniugatów OM-197-FV-owoalbumina. Jak widać z żelu ukazanego w fig. 68 (B)(gradient 4-20% żelu poliakrylamidowego), obserwuje się przekroczenie masowe początkowej masy owoalbuminy o około 3000 amu (tor 2) dla koniugatów OM-1976FV-owoalbumina (tory 3,4 i 5). Ta różnica mas sugeruje, że na każdej cząsteczce owoalbuminy obecnych jest kilka cząsteczek OM-197-FV-owoalbumina. Analiza LC/UV prowadzona na fazie C4 potwierdza ten wynik. Nie da się ukryć, że w tych warunkach, początkowo stosowana owoalbumina wyraźnie pojawia się przy RT = 11,3 minut, podczas gdy po reakcji koniugacji, pik odpowiadający początkowo stosowanej owoalbuminie nie jest już widoczny, fakt, który pokazuPL 208 584 B1 je, że reakcja z owoalbuminą była stechiometryczna. Jednakże koniugat OM-197-FV-owoalbumina nie jest wymyty. Ten profil chromatograficzny wskazuje także, że więcej niż jedna pojedyncza cząsteczka jest obecna na owoalbuminie, zapobiegając w ten sposób wymywaniu koniugatu w takich warunkach.
P r z y k ł a d 3.11.
Koniugaty hemaglutyniny 3.6.H1N1
Białko hemaglutyniny H1N1 także stanowi świetny przykład przeznaczony do zilustrowania sprzęgania między cząsteczkami typu OM-197 i antygenem białkowym.
mg oczyszczonego OM-197-FV7 (0,928 μmola, 15 równoważników dodaje się do roztworu 5 mg H1N1 (hemaglutyniny A/Beijig 262.95, Solvay Duphar, Weesp, NL) (0,06 μmola, 1 równoważnik) rozpuszczonej w 8 ml H2O. Roztwór miesza się przez 30 minut w temperaturze pokojowej, następnie przeprowadza się etap redukcji przez dodanie 46 μl 1M NaBH3CN (2,89 mg, 50 równoważników). Roztwór miesza się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie, mieszaninę reakcyjną dializuje się przeciwko H2O przez 24 godziny (kaseta dializacyjna 3,5 kDa).
Koniugat OM-197-FV-H1N1 analizuje się przez SDS-PAGE w tych samych warunkach stosowanych dla koniugatu OM-197-FV-owoalbumina (gradient poliakrylamidu 4-20%). Profile elektroforetyczne otrzymane dla wyjściowego białka (tor 6) oraz koniugatu przed i po dializie (tory 8 i 7, odpowiednio) są ukazane w fig. 68 (C). Białko H1N1 widać w postaci trzech prążków, z których dwa odpowiadają podjednostkom HA1 i HA2 opisywanym w literaturze (Swiss-Prot, Swiss Institute of Biological Computer Science, Genewa). W przypadku koniugatów OM-197-FV-H1N1, obserwowana jest różnica mas dla każdego prążka, pokazując, że uzyskano sprzęganie cząsteczek OM-197-FV z białkiem H1N1.
P r z y k ł a d 3.12.
Koniugaty AZT (fig. 69)
Do roztworu AZT (200 mg; 0,749 mmola) w pirydynie (4 ml) dodaje się kolejno bezwodnik bursztynowy (150 mg; 0,5 mmola) i 4-dimetyloaminopirydynę (50 mg; 0,41 mmola). Po pozostawieniu na 12 godzin w temperaturze 50°C, dodaje się metanol (2 ml) i środowisko reakcyjne miesza przez dodatkowe 15 minut w temperaturze pokojowej. Środowisko reakcyjne zatęża się następnie i oczyszcza produkt przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym, z użyciem następującego eluenta: CH2Cl2:/MeOH 5/1. W wyniku tego otrzymuje się produkt w postaci białego ciała stałego (266 mg; 97%). C14H17H5O7 (M=367 g/mol); Rf = 0,25 (CH2Cl2/MeOH 4/1).
Do roztworu tak otrzymanej pochodnej sukcynylo-AZT (60 mg; 0,163 mmola) w THF (3 ml) w temperaturze 0°C i przy przepływie argonu, dodaje się kolejno trietyloaminę (24 0,172 mmola) i chloromrówczan etylu (14 ^; 0,172 mmola). Obserwuje się szybkie tworzenie osadu chlorowodorku trietyloaminy. Po mieszaniu przez 40 minut, dodaje się roztwór pochodnej aminokaproilu (przykład 2.16.) (160 mg; 0,163 mmola) w mieszaninie DMF:woda 9/1 (10 ml) zawierającej trietyloaminę (24 ^; 0,172 mmola). Następnie mieszaninę reakcyjną miesza się przez 15 minut w temperaturze 0°C, a potem przez noc w temperaturze pokojowej, przed odparowaniem pod częściową próżnią. Surowy produkt odbiera się potem do dichlorometanu (15 ml) i wody (5 ml). Oddziela się warstwę organiczną. Warstwę wodną zakwasza się 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, następnie ekstrahuje dichlorometanem (2x). Warstwy organiczne zlewa się, suszy nad MgSO4, filtruje i zatęża. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym z następującym eluentem (CH2Cl2/MeOH 9/1 następnie 7/1), odzyskuje się związek sprzężony z AZT (123 mg; 57%) w postaci białego ciała stałego. Rf = 0,2 CH2Cl2/MeOH 4/1); C69H119N9O16 (M = 1329 g/mol);
Znalezione: m/z 1330,9 ([M+H]+).
Analityczna HPLC: Czas retencji Tr = 24,437 minut, C18 Supelcosil Column (15 cm x 4,6 mm, 3 μm, 100 A);
Rozpuszczalnik A = 50% MeCN, 5 mM TBAP; Rozpuszczalnik B = 90% 2-propanol 5 mM TBAP. Gradient: 25-100% B w ciągu 37,5 minuty, detekcja UV przy 210 nm.
Preparatywna HPLC: Kolumna Kromasil C18 (25 cm x 21 mm, 5 μm, 100 A), rozpuszczalnik A = 50% MeCN, 5 mM TBAP; Rozpuszczalnik B = 90% 2-propanol 5 mM TBAP.
Wymywanie produktu z użyciem 80% B.
Faza końcowa: płynięcie soli Na+ przez SPE, faza Bondapack C18 15 μm, wymywanie przez 90% 2-propanol.
Koniugaty d4T (fig. 69)
Do roztworu d4T (200 mg; 0,89 mmola) w pirydynie (4 ml), dodaje się kolejno bezwodnik bursztynowy (179 mg; 0,786 mmola) i 4-dimetyloaminopirydynę (109 mg; 0,89 mmola). Po mieszaniu przez
PL 208 584 B1 godzin w temperaturze dodaje się metanol (2 ml) i mieszaninę reakcyjną miesza się przez dodatkowe 15 minut w temperaturze i na koniec odparowuje. Surowy produkt oczyszcza się następnie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym przy użyciu następującego eluenta: CH2Cl2/MeOH 5/1. Uzyskany produkt otrzymuje się w postaci białego ciała stałego (280 mg; 97%). C14H16N2O7 (M = 324 g/mol); Rf = 0,25 (CH2Cl2/MeOH 4/1).
Do roztworu tak otrzymanej pochodnej sukcynylo-d4T (60 mg; 0,185 mmola) w THF (3 ml) w temperaturze 0°C i przy przepływie argonu, dodaje się kolejno trietyloaminę (27 μ; 0,194 mmola) i chloromrówczan etylu (16 μ; 0,194 mmola). Obserwuje się szybkie tworzenie osadu chlorowodorku trietyloaminy. Po mieszaniu przez 40 minut, dodaje się w temperaturze 0°C, pochodną aminokaproilową (przykład 2.16) (181 mg; 0,185 mmola) w mieszaninie DMF:woda 9/1 (10 ml), zawierającą trietyloaminę (27 μ; 0,194 mmola). Następnie mieszaninę reakcyjną miesza się przez 15 minut w temperaturze 0°C i potem w temperaturze pokojowej przed odparowaniem pod częściową próżnią. Surowy produkt odbiera się do dichlorometanu (15 ml) i wody (5 ml). Warstwę organiczną oddziela się, warstwę wodną zakwasza się 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, następnie ekstrahuje dichlorometanem (2x). Warstwy organiczne zlewa się, suszy nad MgSO4, filtruje i zatęża. Wykonując oczyszczanie przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym z następującym eluentem (CH2Cl2/MeOH 9/1 następnie 7/1), odzyskuje się związek sprzężony z d4T (107 mg; 45%) w postaci białego ciała stałego.
Rf = 0,2 (CH2Cl2/MeOH 4/1); C69H118N6O16 (M = 1329 g/mol); Znalezione: m/z 1288, 9 (MH+); 1310 (Na).
Analityczna HPLC: Czas retencji Tr = 24,455 minut, C18 Supelcosil Column (15 cm x 4,6 mm, 3 μm, 100 A); Rozpuszczalnik A = 50% MeCN, 5 mM TBAP; Rozpuszczalnik B = 90% 2-propanol 5 mM TBAP. Gradient: 25-100% B w ciągu 37,5 minut, detekcja UV przy 210 nm.
Preparatywna HPLC: Kolumna Kromasil C18 (25 cm x 21 mm, 5 urn,100 A), rozpuszczalnik A = 50% MeCN, 5 mM TBAP; Rozpuszczalnik B = 90% 2-propanol 5 mM TBAP.
Wymywanie produktu z użyciem 80% B.
Faza końcowa: płynięcie soli Na+ przez SPE, faza Bondapack C18 15 μm, wymywanie przez 90% 2-propanol.
P r z y k ł a d 4.
4-ta seria przykładów:
Badanie farmakologiczne związku według wynalazku (in vitro)
P r z y k ł a d 4.1.
Test określenia endotoksyczności
Określono poziom endotoksyczności w teście przebiegu w czasie chromogennego Limulus Amoebocyte lysate (Charles River Endosafe, produkt R1708K, partia EK2251E).
Ten test LAL stosowano do pokazania, że antygeny sprzężone ze związkami według wynalazku, mają niską endotoksyczność.
Biologiczna zasada, o którą opiera się ten test polega na przygotowaniu proenzymu obecnego w lizacie amebocytu Limulus (LAL) przez endotoksyny bakteryjne, co aktywuje nowo utworzony enzym w jego biegu w kaskadzie seryna-proteaza. W obecności bezbarwnego substratu (peptyd S-2834 sprzężony z p-nitroaniliną), rozszczepienie chromoforu ostatecznie daje uwolnienie p-nitroaniliny (pNA) i wywołanie żółtej barwy, co można monitorować spektrofotometrycznie przy 405 nm.
endotoksyna
1. proenzym-> enzym
2. substrat ———m > peptyd + p-nitroanilina
Ten test chromogeniczny przebiegu w czasie, opiera się o fakt, że ilość endotoksyny jest proporcjonalna do odwrotności okresu czasu wymaganego do osiągnięcia gęstości optycznej (O.D.) wynoszącej 0,2. Stężenie określa się w stosunku do krzywej standardowej pokrywającej zakres 0,005-50 EU/ml.
Produkty testuje się przy użyciu (5-, 10-, 100-, 500- lub 100-krotnego) rozcieńczenia 0,1 mg/ml roztworu produktu. Wynik LAL odpowiada najniższemu rozcieńczeniu, które nie inhibituje już odzysku przeładunku LPS.
Wyniki wyraża się w EU (jednostka endotoksyny) w stosunku do roztworu standaru międzynarodowego (EC-6). Dla tych serii testów 1 EU stanowi 0,08 ng szczepu E.coli O55:B5 LPS.
PL 208 584 B1
Wartości LAL otrzymane dla różnych związków pochodnych acylodipeptydu, zawierających pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, o ogólnym wzorze I (wykaz w tablicy)
Testowane związki rozcieńczenie EU/mg produktu ng równoważnika LPS na mg produktu
OM-197-MC 50 88,6 7,4
OM-197-MC-MP 50 210,5 16,8
OM-197-FV6 50 540 43
OM-197-FV8 50 1820 145,6
OM-197-MC-FV5 50 49,3 3,9
OM-197-MC-FV7 10 <0,05 <0,004
OM-197-MP-AC(R/S,R) 25 0,14 0,011
OM-197-MP-AC (R,R) 25 0,15 0,012
OM-197-MP-AC (R,S) 25 <0,125 <0,01
OM-197-MP-AC 25 6,0 0,48
OM-197-N'C2-MC-AC 10 <0,5 <0,04
OM-197-N'(C10-20C8)-MC-AC 10 <0,5 <0,04
OM-197-MC-Sukc 25 5,3 0,42
OM-197-Lys 25 3,0 0,24
OM-197-AP 10 <0,5 <0,04
OM-197-Asp 50 <2,5 <0,2
OM-197-Asp-AC 50 2307 184,6
OM-197-Lys-Ac 50 <2,5 <0, 2
OM-197-MC-AC-Sukc-AZT 10 1,34 0,11
OM-197-MC-AC-Sukc-d4T 10 1,05 0,08
OM-197-MC-AC-Sukc 10 <0,05 <0,004
Wszystkie testowane związki pochodne dipeptydu wykazują niski poziom endotoksyczności. Dla wielu takich produktów, ta endotoksyczność jest nawet niższa niż czułość testu. Ilościowe określenie endotoksyczności jest ograniczone z powodu faktu, że próbki muszą być rozcieńczone w celu odzyskania przeładowania. Nawet najaktywniejsze związki w teście LAL obrazują poziom endotoksyczności 5000-krotnie mniejszy niż LPS.
Związki pochodne dipeptydu według wynalazku są interesujące pod względem ich aktywności biologicznej i niskiej endotoksyczności.
T a b l i c a
Wyniki LAL dla różnych produktów stosowanych w doświadczeniach immunizacji z produktami sprzężonymi z owoalbuminą
Testowany związek lub domieszka Eu/mg ng równoważnika LPS na mg produktu
Owoalbumina <0,8 <0,064
Owoalbumina+OM-197-MP 5,8 0,48
OM-197-FV-owoalbumina 99 8,21
Uważa się, że sprzęganie OM-197-FV z owoalbuminą powoduje zwiększenie właściwie wykrywanej aktywności LAL. Ten wzrost można przypisać zmianie prezentacji cząsteczki OM-197-FV.
PL 208 584 B1
Wszystkie inne produkty z szeregu owoalbuminy mają równoważną aktywność LaL. Wyniki LAL są wysoce zmienne i 3-krotna do 4-krotnej różnica między grupami, nie jest istotna. Pikowa aktywność LAL jest równa 2,4 równoważnika LPS na wstrzyk (25 gg/wstrzyk) dla produktów reakcji sprzęgania, jak dla innych grup, pikowa aktywność LAL jest równa 0,012 ng równoważnika LPS na wstrzyk.
T a b l i c a
Wyniki LAL dla różnych produktów stosowanych w doświadczeniach immunizacji z produktami sprzężonymi z hemaglutyniną H1N1
Testowany związek lub domieszka Eu/mg ng równoważnika LPS na mg produktu
H1N1 2 0,17
H1N1+OM-197-MP 20 1,67
OM-197-FV-H1N1 15,6 1,30
Wszystkie produkty z szeregu H1N1 mają porównywalną aktywność LAL. Wyniki LAL są wysoce zmienne i 3-krotna do 4-krotnej różnicy między grupami, nie jest istotna. Sprzęganie nie ma wpływu na aktywność LAL. Pikowa aktywność LAL jest równa 0,008 ng równoważnika LPS na wstrzyk (5 gg/wstrzyk).
T a b l i c a
Testowany związek lub domieszka Eu/mg ng równoważnika LPS na mg produktu
(NANP)6P2P30 16 1,33
(NANP)6P2P30 + IFA n.d. * n.d. *
(NANP)6P2P30+OM-197-FV6 13 1
(NANP)6P2P30+OM-197-MC 12 1
(OM-197-FV)1,2,3-(NANP)6P2P30 2 0,17
OM-197-FV-(NANP)6P2P30 9,4 0,78
OM-197-FV-(NANP)6P2P30+OM-197-M P 17,4 1,45
* nie moż na testować LAL ponieważ test ten jest nieodpowiedni dla próbek emulsji
Wszystkie produkty szeregu (NANP)6P2P30 mają porównywalną aktywność LAL. Wyniki LAL są wysoce zmienne i 3-krotna do 4-krotnej różnicy między grupami, nie jest istotna. Sprzęganie nie wpływa na aktywność LAL. Maksymalna aktywność LAL jest równa 0,03 ng równoważnika LPS na wstrzyk (20 gg/wstrzyk).
P r z y k ł a d 4.2.
Określanie proliferacji komórek macierzystych szpiku kostnego u myszy prowokowanych produktami według wynalazku
4.2.1. Doświadczenie proliferacji
6-tygodniowe samce myszy C57/BL6 zabija się przez inhalację CO2. Usuwa się biodro, udo, piszczel i kości tylnej łapy. Szpik ekstrahuje się ze światła kości przez wstrzyknięcie Dulbecco's Modified Eagle Medium (pożywka DH) od części końcowej, która została odcięta. Wymywa się komórki macierzyste, które zawiesza się ponownie w pożywce DH uzupełnionej 20% surowicą płodu cielęcego (FCS). Stężenie komórek reguluje się do 500000 komórek/ml.
Produkty wcześniej rozpuszczone w pożywce DH uzupełnionej 20% FCS, aminokwasami i antybiotykami, rozcieńcza się seryjnie bezpośrednio do płytki do mikromianowania. Produkty testuje się potrójnie i każda płytka do mikromianowania obejmuje kontrolę ujemną, zawierającą samą pożywkę. Końcowa objętość w każdej studzience wynosi 100 gl.
100 gl zawiesiny komórkowej dodaje się do rozcieńczonych roztworów produktów i komórki inkubuje przez 7 dni w inkubatorze w temperaturze 37°C przy 8% CO2 i atmosferze nasyconej wilgocią. Proliferację komórkową określa się mierząc utlenienie substratu chromogenicznego XTT (2,3-bis-[2-metoksy-4-nitro-5-sulfonofenylo]-2H-tetrazolium-5-karboksyanilid) w mitochondriach żywych komórek.
PL 208 584 B1
Pod koniec okresu inkubacji, do każdej studzienki dodaje się 50 μl roztworu substratu XTT (1 mg/ml XTT + 0,008 mg/ml metosiarczanu fenazyny). Po 8-godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C przy 8% CO2 i atmosferze nasyconej wilgocią, płytki do mikromianowania odczytuje się z użyciem spektrofotometru przy 492 nm przeciwko próbce odniesienia przy 690 nm.
Wyniki wyraża się jako średnia wartość ± odchylenie standardowe i nanosi jako dawka w stosunku do krzywej odpowiedzi. Wartości dla kontroli ujemnej złożonej z pożywki DH (średnia ± odchylenie standardowe) są także ukazane graficznie.
Z tej dawki w stosunku do krzywej odpowiedzi, oblicza się 3 zmienne krzywej:
Max: maksymalna amplituda krzywej i odpowiadające stężenie
EC50: stężenie odpowiadające 50% maksymalnej amplitudy
Min: najniższe stężenie indukujące istotną proliferację odpowiadające wartości pustej ± 3x wartość odchylenia standardowego.
Wartości stężenia odpowiadające EC50 i Min, określa się z segmentów linii łączących różne punkty na krzywej.
Jeśli krzywa nie ma fazy plateau lecz konfigurację wznoszącą dla najwyższego testowanego stężenia, przed wartościami Max i EC50 ukazany jest znak „>.
Jeśli krzywe nie spadają poniżej wartości pustej ± 3x wartość odchylenia standardowego, wartość minimalnego stężenia jest ukazana jako „< najniższego testowanego stężenia
4.2.2. Wyniki
Proliferacja komórek macierzystych szpiku kostnego indukowana związkami podobnymi do acylo-dipeptydu, niosącymi pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego.
Fig. 70 obrazuje aktywność różnych związków pochodnych acylo-dipeptydu i wyraźnie ukazują wpływ zdolności pomocniczej funkcjonalnej sekwencji rozdzielającej łańcucha bocznego do indukcji proliferacji komórek macierzystych szpiku kostnego u myszy.
Pewne związki pochodne acylo-dipeptydu są zdolne do indukcji proliferacji w większym stopniu niż kontrola dodatnia, sporządzona z LPS E. coli. Minimalne stężenie produktu zdolne do indukcji istotnej proliferacji jest wyższe niż stężenie stosowane w kontroli dodatniej. To minimalne stężenie produktu ulega dużemu wpływowi poszczególnej stosowanej funkcjonalnej sekwencji rozdzielającej łańcucha bocznego.
Fig. 71 ukazuje aktywność związków pochodnych acylo-dipeptydu sprzężonych z danym lekiem. Aktywność ta dowodzi, że związki pozostają częściowo aktywne mimo procesu sprzęgania. Nie było możliwe odróżnienie wewętrznej aktywności i aktywności wynikającej ze sprzęgania wiązania estrowego przez esterazy wewnątrzkomórkowe. Aktywność antywirusowa tych produktów mocno sugeruje, że wiązania estrowe ulegają co najmniej częściowemu rozszczepieniu. Bez względu na mechanizm leżący u podłoża, zachowanie aktywności biologicznej podkreśla pełną moc łączenia aktywności antywirusowej i aktywności produktu.
Wyniki indukcji proliferacji komórek macierzystych szpiku kostnego przez różne związki pochodne acylo-dipeptydu, niosące pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego mające ogólny wzór I (wykaz w tabeli).
Produkty Max amplituda/stężenie O.D/ig/ml EC50 amplituda/stężenie O.D./ig/ml Min. amplituda/stężenie O.D./μ g/ml
1 2 3 4
Pożywka DH (kontrola ujemna) 0,67 ± 0,04
LPS E.coli (kontrola dodatnia) 1,75/16 1,19/1,2 0,80/0,06
197-MC 1,75/64 1,21/19,4 0,80/1,25
197-MC-MP >1,60/>160 >1,13/>6,5 0,80/0,77
197-FV6 1,52/50 1,10/5,7 0,80/1,60
197-FV8 1,07/25 0,87/1,8 0,80/1,24
197-MC-FV5 1,75/50 1,21 132,0 0,80/8,20
197-MC-FV7 >1,83/>100 >1,25/>33,1 0,80/6,58
197-MP-AC(R/S,R) 2,12/25 1,39/3,1 0,80/0,71
PL 208 584 B1 cd. tabeli
1 2 3 4
197-MP-AC(S, R) 1,22/6,25 0,94/2,62 0,80/1,17
197-MC-AC 1,62/50 1,15/31,0 0,80/0,92
197-N'C2-MC-AC 0,75/1,56 0,71/nd 0,80/nd
97-N'(C10-20C8)-MC-AC 0,75/6,25 0,71/nd 0,80/nd
197-MC-Sukc 2,16/50 1,41/24,7 0,80/2,95
197-Lys 1,56/25 1,11/3,3 <0,86/<0,39
197-AP 1,49/25 1,08/2,2 0,80/0,41
197-Asp 1,22/25 0,94/5,0 0,80/1,89
197-Asp-AC 1,33/50 0,10/2,8 0,80/1,27
197-Lys-AC >2,02/>50 >1,34/>14,6 0,80/0,90
197-MC-AC-Sukc-AZT 1,08/12,5 0,87/3,3 0,80/2,11
197-MC-AC-Sukc-d4T 1,40/50 1,03/25,4 0,80/2,81
197-MC-AC-Sukc >1,65/>100 >1,16/33,7 0,80/2,04
nd = nie określone
Wszystkie związki pochodne acylo-dipeptydu według wynalazku, z wyjątkiem związków o krótkich łańcuchach, są zdolne do indukowania istotnej proliferacji komórek macierzystych szpiku kostnego.
Czwarta seria dodatkowych przykładów:
farmakologiczne studium związków według wynalazku (in vitro)
Przykład dodatkowy 4.2. (dodatkowy)
Określenie rozrostu komórek macierzystych w szpiku kostnym myszy stymulowanym produktami według wynalazku
4.2.1. (dodatkowy) Eksperyment rozrostu
6-tygodniowe samce myszy C57/BL6 zabija się przez inhalację CO2. Kości tylnych członków, biodro, piszczel i udo usuwa się. Szpik ekstrahuje się ze światła kości przez iniekcję zmodyfikowanej pożywki Eagle Dulbecco (pożywka DH) przez wcześniej odcięte zakończenia. Komórki macierzyste przemywa się i zawiesza w pożywce DH połączonej z 20% płodową surowicą cielęcą (PCS). Stężenie komórek ustawia się na 500000 komórek/ml.
Produkty w roztworze w pożywce DH z dodanym 20% PCS, aminokwasami i antybiotykami, rozcieńcza się kolejno bezpośrednio na mikropłytce. Produkty testuje się potrójnie i każda mikropłytka obejmuje ujemną kontrolę zawierającą samą pożywkę. Końcowa objętość w każdym dołku wynosi 100 gl.
100 gl zawiesiny komórek dodaje się do rozcieńczeń produktów i komórki inkubuje się przez 8 dni w piecu w temperaturze 37°C, w atmosferze 8% CO2, nasyconej parą wodną. Rozrost określa się mierząc utlenianie chromogennego substratu XTT (2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo]-2H-tetrazolio-5-karboksanilid) w mitochondriach żywych komórek.
Na koniec inkubacji, 50 gl roztworu substratu XTT (1 mg/ml XTT + 0,008 mg/ml metosiarczanu fenazyny) dodaje się do każdego dołka. Inkubację prowadzi się dalsze 8 godzin i mikropłytki odczytuje się spektrofotometrem przy 490 nm względem odnośnika 690 nm.
Wyniki wyrażono jako średnia ± standardowe odchylenie w formie krzywej dawka-reakcja. Wartości ujemnych kontroli zawierających pożywkę DH (średnia ± standardowe odchylenie) również pokazano na postaci graficznej. Z krzywej dawka-reakcja, oblicza się 3 konkretne punkty krzywej:
Max: maksimum amplitudy krzywej i jej odpowiednie stężenie
EC50: stężenie odpowiadające 50% maksimum amplitudy.
Min: najniższe stężenie indukujące znaczący rozrost odpowiadające ślepej próbie + 3 x standardowe odchylenie
Stężenia odpowiadające EC50 i min. określa się z prostoliniowych segmentów łączących różne punkty krzywej. Jeśli krzywa nie osiąga maksimum, lecz podnosi się wciąż dla najwyższego badanego stężenia, a znak > jest umieszczany przed wartościami Max i EC50.
PL 208 584 B1
4.2.2. (dodatkowy) Prezentacja wyników
Rozrost komórek macierzystych szpiku kostnego indukowany przez acylowane pseudodipeptydy niosące funkcjonalizowane pomocnicze odgałęzienia
Fig. 25 pokazuje aktywność różnych acylowanych pseudodipeptydów i wykazuje wpływ funkcjonalizowanych pomocniczych odgałęzień oraz dystrybucji łańcuchów acylowych na zdolność do indukowania rozrostu komórek podstawowych szpiku myszy. Modyfikacja na poziomie łańcuchów acylowych znacząco wpływa na zdolność pseudodipeptydów do indukowania rozrostu komórek macierzystych. Tetracylowane związki, jak odwrócone związki mają marginalną aktywność w tym modelu. Typ wiązania grupy funkcjonalizowanej na pseudodipeptydzie również modyfikuje krzywą dawka-reakcja dla produktów.
Minimalne stężenie produktu zdolnego do indukowania znaczącego rozrostu komórek macierzystych jest większe niż kontroli dodatniej, jednakże pewne pseudodipeptydy są zdolne do indukowania reakcji tak znacznej jak IPS E. coli. Tablica pokazuje indukowanie rozrostu komórek podstawowych szpiku przez różne acylowane pseudodipeptydy niosące funkcjonalizowane pomocnicze odgałęzienia odpowiadające ogólnemu wzorowi I:
Produkty Maks. Amplituda/stęż. O.D./gg/ml Amplituda EC50/stęż. O.D./gg/ml Min. Amplituda/stęż. O.D./gg/ml
pożywka DH (ujemna kontrola) 0,47/0 - -
IPS E. coli (dodatnia kontrola) 1,46/15,82 0,96/2,53 0,57/0,21
OM-197-AC-MP 1,25/25 0,86/3,98 0,57/1,93
OM-197-AH-AC 0,64/6,25 n.d. 0,57/4,45
OM-197-AH-MP >1,52/>100 >0,99/>34,74 0,57/6,27
OM-197-MC-AC-inv >1,07/>25 >0,77/>16,78 0,57/6,04
OM-197-MC-AC-tetracyl >0,60/>25 n.d. 0,57/22,45
OM-197-MP-AP >1,03/>50 >0,75/>7,54 0,57/1,96
OM-197-MP-AD >0,70/>25 >0,58/>14,49 0,57/13,65
OM-197-AH-OH >0,74/>100 >0,60/>41,07 0,57/29,16
OM-197-MP-AC-inv 0,68/50 n.d. 0,57/15,35
OM-197-MP-AC-tetracyl 0,66/6,25 n.d. n.d.
nd = nie do określenia
Gdy indukowana aktywność jest niska, nie jest możliwe określenie aktywności EC50, ponieważ jest niższa niż minimalna aktywność.
Acylowane pseudodipeptydy według wynalazku pokazują wielkie różnice w ich zdolność do indukowania rozrostu komórek podstawowych szpiku. Pewne związki nawet mają marginalne aktywności. W przeciwieństwie do produktów pochodzących z lipidu A, wzrost liczby łańcuchów acylowych nie jest skorelowany z aktywnością produktów.
P r z y k ł a d 4.3.
Określanie wytwarzania tlenku azotu przez mysie komórki makrofagowe sprowokowane produktami według wynalazku
4.3.1. Test doświadczalny wytwarzania tlenku azotu
Sześciotygodniowe samce myszy C57/BL6 zabija się przez inhalację CO2. Usuwa się biodro, udo, piszczel i kości tylnego wyrostka. Szpik kostny ekstrahuje się ze światła kości przez wstrzyknięcie Dulbecco's Modified Eagle Medium (pożywka DH) z części końcowej, którą odcięto. Komórki macierzyste przemywa się i zawiesza (przybliżone stężenie komórek 4000 cells/ml) w pożywce DH uzupełnionej 20% końską surowicą (SH) i 30% supernatantem komórek L929. L929 oznacza mysią linię komórkową fibroblastów, której płyn supernatantu jest bogaty w czynnik wzrostu dla komórek makrofagowych (M-CSF). Zawiesinę komórkową rozdziela się na płytki Petriego, które inkubuje się przez 8 dni w inkubatorze w temperaturze 37°C przy 8% CO2 i atmosferze nasyconej wilgocią.
PL 208 584 B1
Po 8 dniach, komórki macierzyste zróżnicowały się w dojrzałe makrofagi. Makrofagi odrywa się przez szybkie ochłodzenie, przemywa i zawiesza w pożywce DH uzupełnionej 5% płodową surowicą cielęcą (PBS), aminokwasami i antybiotykami. Gęstość komórkową reguluje się do 700 000 komórek/ml.
Produkty poprzednio rozpuszczone w pożywce DH uzupełnionej 5% PBS, aminokwasami i antybiotykami, rozcieńcza się seryjnie bezpośrednio w płytkach do mikromianowania. Produkty testuje się potrójnie i każda płytka do mikromianowania zawiera kontrolę ujemną obejmującą zwykłą pożywkę. Końcowa objętość w każdej studzience wynosi 100 μ.
100 μl zawiesiny komórkowej dodaje się do rozcieńczonych roztworów takich produktów i komórki inkubuje przez 22 godziny w inkubatorze w temperaturze 37°C, przy 8% CO2 i atmosferze nasyconej wilgocią. Pod koniec okresu inkubacji z produktami, odciąga się 100 μl supernatantu i określa się stężenie azotynu przez przeprowadzenie reakcji Griessa.
Do każdej studzienki dodaje się 100 μl odczynnika Griessa (5 mg/ml sulfanilamidu +0,5 mg/ml chlorowodorku N-(1-naftyloetylenodiaminy)) w 2,5% uwodnionego kwasu fosforowego. Płytki do mikromianowania odczytuje się na spektrofotometrze przy 562 nm długości fali przeciwko próbce odniesienia przy 690 nm. Stężenie azotynu jest proporcjonalne do zawartości utworzonego tlenku azotu. Zawartość azotynu określa się na podstawie krzywej standardowej.
Wyniki są podane jako wartość średniej + odchylenie standardowe i naniesione jako dawka w stosunku do krzywej odpowiedzi.
Z tej dawki w stosunku do krzywej odpowiedzi, oblicza się 3 zmienne krzywej:
Max: maksymalna amplituda krzywej i odpowiadające stężenie
EC50: stężenie odpowiadające 50% maksymalnej amplitudy
Min: najniższe stężenie indukujące istotną proliferację odpowiadające wartości pustej ± 3x wartość odchylenia standardowego.
Wartości stężenia odpowiadające EC50 i Min, określa się z segmentów linii łączących różne punkty na krzywej.
Jeśli krzywa nie ma fazy plateau lecz konfigurację wznoszącą dla najwyższego testowanego stężenia, przed wartościami Max i EC50 ukazany jest znak „>.
Jeśli krzywe nie spadają poniżej wartości pustej ± 3x wartość odchylenia standardowego, wartość minimalnego stężenia jest ukazana jako „< najniższego testowanego stężenia.
4.3.2. Wyniki
Tlenek azotu wytwarzany przez mysie komórki makrofagowe indukowany przez związki pochodne acylo-dipeptydu niosące pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego
Fig. 72 pokazuje aktywność różnych związków pochodnych acylodipeptydu i pokazuje wpływ pomocniczej funkcjonalnej sekwencji rozdzielającej łańcucha bocznego na zdolność do indukowania proliferacji mysich komórek macierzystych szpiku kostnego.
OM-197-MP-AC (R/S, R) jest zdolny do indukowania wyższej odpowiedzi proliferacji w porównaniu z kontrolą dodatnią wykonaną z LPS E. coli. Minimalne stężenie produktu zdolne do indukowania istotnej proliferacji, jest jednakże daleko niższe niż stężenie kontroli dodatniej. Wytwarzanie NO przez mysie komórki makrofagowe sprowokowane przez związki pochodne acylo-dipeptydu ulega dużemu wpływowi poszczególnej stosowanej pomocniczej funkcjonalnej sekwencji rozdzielającej łańcucha bocznego.
Fig. 73 pokazuje aktywność związków pochodnych acylodipeptydu sprzężonych z danym lekiem. Ta aktywność jest uważana za dowód, że związki pozostają częściowo aktywne mimo etapu sprzęgania. Nie było możliwe odróżnienie aktywności wewnętrznej i aktywności wynikającej ze sprzęgania wiązania estrowego przez esterazy wewnątrzkomórkowe. Aktywność antywirusowa tych produktów mocno sugeruje, że wiązania estrowe ulegają co najmniej częściowemu rozszczepieniu. Bez względu na mechanizm leżący u podłoża, zachowanie aktywności biologicznej podkreśla pełną moc łączenia aktywności antywirusowej i aktywności produktu.
Wyniki wytwarzania tlenku azotu indukowanego w mysich makrofagach przez różne związki pochodne acylodipeptydu niosące pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, o ogólnym wzorze I (wykaz w tabeli)
PL 208 584 B1
Produkty Max amplituda/stężenie μΜ azotynu/ig/ml) EC50 amplituda/stężenie μΜ azotynu/(ig/ml) Min amplituda/stężenie μΜ azotynu/^g/ml)
Pożywka DH (ujemna kontrola) 0,29+0,09
LPS E.coli (dodatnia kontrola) >10,37/>50 >5,33/>0,01 <1,41/<0,001
OM-197-MC 7,16/51 3,73/1,23 0,57/0,15
OM-197-MC-MP 7,94/51 4,12/1,18 0,57/0,11
OM-197-FV6 7,48/25,6 3,89/1,49 0,57/0,20
OM-197-FV8 8,00/51 4,15/7,89 0,57/1,45
OM-197-MC-FV5 5,64/16 2,97/2,56 0,57/0,67
OM-197-MC-FV7 6,17/>25,6 3,23/>3,70 0,57/0,36
OM-197-MP-AC(R/S, R) >14,09/>100 >7,19/>10,69 0,57/1,04
OM-197-MP-AC(S, R) 7,56/ 40 3,93/3,28 0,57/0,59
OM-197-MP-AC(R, R) >8,31/>100 >4,3/>15,32 0,57/3,35
OM-197-MC-AC 7,08/25 3,69/4,91 0,57/0,91
OM-197-N'C2-MC-AC >0,24/200 nd nd
OM-197-N'(C10-20C8)-MC-AC >0,96/>100 0,63/61,05 0,57/54,3
OM-197-MC-Sukc 5,84/16 3,07/0,89 0,57/0,22
OM-197-Lys 5,50/40 2,90/2,23 0,57/<0,47
OM-197-AP >9,64/>100 >4,97/>13,69 0,57/1,87
OM-197-Asp 8,26/51 4,28/0,95 0,57/0,086
OM-197-Asp-AC >7,97/>100 >4,13/>7,04 0,57/2,00
OM-197-Lys-AC >7,04/>50 >3,67/>11,06 0,57/1,46
OM-197-MC-AC-Sukc-AZT >2,53/>100 >1,41/>74,89 0,57/55,98
OM-197-MC-AC-Sukc-d4T 4,17/12,5 2,23/1,15 0,57/0,56
OM-197-MC-AC-Sukc 6,17/>16 3,23/0,72 0,57/0,28
nd = nie określony
Wszystkie związki pochodne acylo-dipeptydu według wynalazku z wyjątkiem związków o krótkich łańcuchach (mniejsze wytwarzanie dla OM-197-N'(C10-20C8)-MC-AC), są zdolne do indukowania istotnego wytwarzania tlenku azotu przez mysie komórki makrofagowe.
Przykład dodatkowy 4.3.
Określenie wytwarzania tlenku azotu przez mysie makrofagi stymulowane przez produkty według wynalazku
4.3.1. dodatkowy Eksperyment wytwarzania tlenku azotu:
6-tygodniowe samce myszy C57/BL6 zabija się przez inhalację CO2. Kości tylnych członków, biodro, piszczel i udo usuwa się. Szpik ekstrahuje się ze światła kości przez iniekcję zmodyfikowanej pożywki Eagle Dulbecco (pożywka DH) przez wcześniej odcięte zakończenia. Komórki macierzyste przemywa się i zawiesza (stężenie w przybliżeniu 40000 komórek/ml) w pożywce DH połączonej z 20% surowicą końską (HS) i 30% supernatantu L929. L929 jest linią mysich fibroblastów, których supernatant jest bogaty w czynnik wzrostu makrofagów (M-CSF). Zawiesinę komórek rozprowadza się w szalkach Petriego, które inkubuje się przez 8 dni w temperaturze 37°C w atmosferze 8% CO2, w nasyconym parą wodną piecu.
Po 8 dniach komórki macierzyste różnicują się w dojrzałe makrofagi. Makrofagi odłącza się działając zimnem, przemywa i zawiesza w pożywce DH uzupełnionej 5% płodową surowicą cielęcą
PL 208 584 B1 (PCS), aminokwasami i antybiotykami (pożywka DHE). Stężenie komórek ustawia się na 700000 komórek na ml.
Produkty rozcieńcza się kolejno w pożywce DHE bezpośrednio na mikropłytce. Produkty testuje się potrójnie i każda mikropłytka obejmuje ujemną kontrolę zawierającą samą pożywkę. Końcowa objętość w każdym dołku wynosi 100 μ. 100 μl zawiesiny komórek dodaje się do rozcieńczeń produktu i komórki inkubuje się przez 22 godziny w piecu w temperaturze 37°C, w atmosferze 8% CO2, nasyconej parą wodną. Na koniec inkubacji z produktami, 100 μl supernatantu usuwa się i stężenie azotynu określa w reakcji Griessa.
100 μl reagentu Griessa (5 mg/ml sulfanilamidu + 0,5 mg/ml chlorowodorku N-(1-naftyloetylenodiaminy) w 2,5% wodnym roztworze kwasu fosforowego), dodaje się do każdego dołka. Mikropłytki odczytuje się na spektrofotometrze przy 562 nm względem odnośnika 690 nm. Stężenie azotynu jest proporcjonalne do stężenia powstałego tlenku azotu. Stężenie azotynu określa się względem krzywej standardowej.
Wyniki wyrażono jako średnią ± standardowe odchylenie w formie krzywej dawka-reakcja.
Z krzywej dawka-reakcja, oblicza się 3 konkretne punkty krzywej:
Max: maksimum amplitudy krzywej i jej odpowiednie stężenie.
EC50: stężenie odpowiadające 50% maksimum amplitudy.
Min: najniższe stężenie indukujące znaczący rozrost odpowiadające ślepej próbie + 3 x standardowe odchylenie
Stężenia odpowiadające EC50 i min. określa się z prostoliniowych segmentów łączących różne punkty krzywej. Jeśli krzywa nie osiąga maksimum, lecz podnosi się wciąż dla najwyższego badanego stężenia, a znak > jest umieszczany przed wartościami Max i EC50. Jeśli krzywa nie opada poniżej granicy ślepej próby + 3 standardowe odchylenia, minimalne stężenie podaje się jako < najniższe testowane stężenie.
4.3.2. dodatkowy Prezentacja wyników
Wytwarzanie tlenku azotu przez mysie makrofagi indukowane przez acylowane pseudodipeptydy niosące funkcjonalizowane pomocnicze odgałęzienia
Fig. 26 pokazuje aktywność różnych acylowanych pseudodipeptydów i wykazuje wpływ funkcjonalizowanych pomocniczych odgałęzień oraz modulacji łańcuchów acylowych na zdolność indukowania wytwarzania NO przez mysie makrofagi.
Modyfikacje na poziomie łańcuchów acylowych znacząco wpływają na zdolność pseudodipeptydów do indukowania wytwarzania NO przez mysie makrofagi na poziomie amplitudy i minimalnego stężenia zdolnego do indukowania reakcji. Typ wiązania grupy funkcjonalizowanej na pseudodipeptydach również modyfikuje krzywą dawka-reakcja dla produktów.
Minimalne stężenie produktu zdolnego do indukowania znaczącego wytwarzania NO przez mysie makrofagi jest znacznie większe niż kontroli dodatniej. Ten próg stężenia może się wahać znacząco pośród związków według wynalazku. Pseudodipeptydy indukują reakcję o niższej amplitudzie względem IPS E. coli.
Tablica z wynikami pokazuje indukowanie wytwarzania tlenku azotu przez mysie makrofagi przez różne acylowane pseudodipeptydy niosące funkcjonalizowane pomocnicze odgałęzienia odpowiadające ogólnemu wzorowi I:
Produkty Maks. amplituda / stęż. μM azotynu / μg/ml Amplituda EC50 / stęż. μM azotynu / μg/ml Min amplituda / stęż. μM azotynu^g/ml
1 2 3 4
Pożywka DH (ujemna kontrola) 0,05/0 - -
IPS E. coli (dodatnia kontrola) 17,89/12,5 8,97/0,04 <0,98/<0,001
OM-197-AC-MP 12,69/12,5 6,37/1,91 0,38/0,54
OM-197-AH-AC 5,94/25 2,99/9,61 0,38/6,38
OM-197-AH-MP >8,68/>100 >4,37/>20,9 0,38/5,18
OM-197-MC-AC-inv 8,64/50 4,34/14,17 0,38/1,72
OM-197-MC-AC-tetracyl >3,13/>50 >1,59/>18,53 0,38/6,84
PL 208 584 B1 cd. tabeli
1 2 3 4
OM-197-MP-AP 12,50/25 6,27/4,43 <0,61/<0,39
OM-197-MP-AD >7,98/>50 >4,02/>25,76 0,38/9,64
OM-197-AH-OH >5,02/>50 >2,53/>13,95 0,38/5,01
OM-197-MP-AC-inv >8,05/>100 >4,05/>22,25 0,38/4,31
OM-197-MP-AC-tetracyl 8,94/12,5 4,49/3,19 0,38/0,44
OM-197-MP-AC-inv-C18 7,34/50 3,70/20,91 0,38/8,13
OM-197-MP-Succ 10,90/16 5,47/0,89 0,38/0,19
Na wytwarzanie NO przez mysie makrofagi silnie wpływają funkcjonalizowane pomocnicze odgałęzienia, jak też modulacja łańcuchów acylowych niesionych przez pseudodipeptydy. Różnorodność funkcji przenoszonych przez funkcjonalizowane odgałęzienia pozwala modulować aktywność związków, nawet jeśli jest trudne wyciągnięcie precyzyjnych wniosków dotyczących zależności struktura-aktywność. Dzięki ich niskiej aktywności, pewne związki mogą działać jako związki antagonistyczne, podczas gdy te, które są bardziej aktywne, będą potężnymi agonistami.
P r z y k ł a d 4.4.
Test różnicowania komórek dendrytycznych
Oszacowano zdolność produktów według wynalazku do indukcji dojrzewania komórek predendrytycznych do komórek dendrytycznych. Mierzono następujące parametry: wychwyt koniugatu FITC-Dextran i ekspresję markerów powierzchniowych CD83, CD86.
4.4.1. Procedura doświadczalna
Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej izoluje się górnej warstwy skrzepu zdrowych dawców. Monocyty oczyszczone przez selekcję przez przywieranie zawiesza się w pożywce RPMI-1640 zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), GM-CSF i IL-4 (10 ng/ml) przy gęstości wynoszącej 1 x 106 komórek/ml. Komórki rozdziela się na płytki Petriego (10 x 106 komórek na płytkę) i hoduje przez 6 dni zmieniając pożywkę na świeżą po 3 dniach. Tak otrzymane komórki nazywa się komórkami predendrytycznymi (DC-6). Dojrzewanie komórek predendrytycznych do dojrzałych komórek dendrytycznych uzyskuje się przez inkubację komórek z rozcieńczonymi roztworami produktów lub LPS (kontrola dodatnia) przez jeszcze 3 dni (patrz produkt, sekcja poniżej). W dniu 9 (DC-9), komórki zbiera się i analizuje pod względem różnych wskaźników dojrzewania: oszacowania komórek dendrytycznych ekspresji markerów powierzchniowych CD83, CD86, jak również ich zdolności do wychwytu koniugatu FITC-Dextran. Wszystkie te parametry analizuje się przez EPICS-XL-MCL model FACS (Coulter Immunology, Hialeah, Finlandia).
Ekspresję markerów powierzchniowych podaje się jako % średniej fluorescencji komórek aktywowanych LPS (kontrola dodatnia); szybkość wychwytu koniugatu FITC-Dextran oblicza się na podstawie wychwytu komórek utrzymywanych w pożywce podstawowej i jest wyrażona w %.
Produkty: Roztwory macierzyste OM-197-MC, OM-197-FV6 i OM-197-MP-AC (R/S, R) wytwarza się przy stężeniu wynoszącym 0,5 mg/ml w mieszaninie 0,9% NaCl/woda, z dodatkiem 0,1% trietanolaminy. Roztwory inkubuje w temperaturze 37°C przez 20 minut, poddaje się energicznemu mieszaniu przez 3 minuty, a następnie rozcieńcza do 100 gg/ml w pożywce do hodowli RPMI-1640 i stosuje w stanie rozcieńczonym o stężeniach w zakresie od 10 gg/ml do 0,03 gg/ml.
Produkt odniesienia: lipopolisacharyd E. coli (LPS, DIFCO, Detroit, MI, USA), w postaci roztworu macierzystego 5 mg/ml w PBS. Pośredni roztwór 100 gg/ml sporządza się w pożywce do hodowli RPMI 1640. Stężenia testowanych rozcieńczonych roztworów wynoszą od 1 gg/ml do 0,03 gg/ml.
W innej serii doświadczeń, wszystkie związki pochodne acylodipeptydu liofilizowano i bezpośrednio rozpuszczano w wodzie pozbawionej pirogenów. Testuje się różne produkty, jak również kontrolę LPS przy stężeniu wynoszącym 10 gg/ml. Wyniki są podane jako % komórek dendrytycznych i średnią wartość fluorescencji dla fagocytozy dekstranu lub ekspresji markerów powierzchniowych CD86. Te wyniki stanowią średnią wartość 2 do 6 doświadczeń w zależności od stosowanego produktu.
PL 208 584 B1
4.4.2. Analiza wyników
Niedojrzałe komórki dendrytyczne (DC-6) otrzymane w wyniku różnicowania monocytów, poprzez łączne działanie GM-CSF i IL-4, są zdolne do wchłaniania koniugatu FITC-Dextran. Podczas procesu dojrzewania, komórki tracą swą zdolność do pochłaniania koniugatu FITC-Dextran. Prowadzi się testy przy osiąganiu stadium różnicowania DC-9.
Wyniki (fig. 74) wyraża się w kategoriach % pochłonięcia koniugatu FITC-Dextran obserwowanego w nieprowokowanych komórkach inkubowanych w podstawowej pożywce. Komórki traktowane LPS lub OM-197-AC (R/S,R) utrzymują jedynie, odpowiednio, 15% i 22% swej zdolności fagocytowania. Należy zauważyć, że co najmniej 1 μg/ml of OM-197-MP-AC (R/S,R) jest konieczny do indukcji pełnego zmniejszenia wychwytu Dextranu podczas gdy 0,1 μg/ml LPS daje podobny spadek. 10 μg/ml OM-197-MC jest koniecznych do indukcji 22% spadku zdolności fagocytowania. Ponadto, dla stężeń niższych od 3 μg/ml, OM-197-MC nie ma wpływu na fagocytozę. OM-197-FV6 wyraźnie nie ma wpływu na dojrzewanie komórek dendrytycznych.
Ekspresja współstymulacji markerów powierzchniowych jest innym kryterium szacowania dojrzewania DC. Testuje się zwiększanie ekspresji CD83, CD86 (fig. 75 i 76, odpowiednio). Wyniki wyraża się w kategoriach % średniej fluorescencji na podstawie ekspresji indukowanej LPS tych markerów. Te wyniki są w pełni zgodne z otrzymanymi z badań fagocytozy. OM-197-MP-AC (R/S,R) indukuje zwiększenie ekspresji markerów powierzchniowych przy stężeniach tak niskich jak 0,1 μg/ml, choć jest wymagany co najmniej 1 μg/ml w przypadku OM-197-MC do zainicjowania wzrostu ekspresji markerów CD83 i CD86. OM-197-FV6 nie ma wcale wpływu na ekspresję markerów powierzchniowych, które są typowe dla komórek dendrytycznych.
Powyższe dane ukazują, że związki pochodne acylo-dipeptydu działają bardzo różnie w zależności od wybranej pomocniczej sekwencji rozdzielającej łańcucha bocznego. OM-197-MP-AC (R/S,R) obrazuje wybitną zdolność do indukcji różnicowania komórek DC-6 w komórki DC-9 w stężeniach tak niskich jak 0,1 μg/ml, podczas gdy stężenia większe niż 1 μg/ml OM-197-MC są konieczne zainicjowania różnicowania, a OM-197-FV6 całkowicie nie posiada takiej aktywności.
Fagocytoza dekstranu znakowanego fluoresceiną i ekspresja CD86 po stymulacji komórek predendrytycznych (CDS) przez związki pochodne acylo-dipeptydu, niosące pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, mające ogólny wzór I
Różnicowanie komórek predendrytycznych do dojrzałych komórek dendrytycznych
Produkty Dekstran % CD/Fluorescencja CD86 % CD/Fluorescencja
37°C 18,3/0,9 33,5/2,9
LPS E. coli 100/7,3 100/7,3
OM-197-FV6 84,5/6,3 62,9/4,9
OM-197-MC-FV5 86,5/6,4 74,5/5,6
OM-197-MP-AC(R/S,R) 84,6/6,3 80,0/6,0
OM-197-MC-AC 68,3/5,2 67,4/5,2
OM-197-M C-M C-Sukc 35,5/3,0 34,9/3,0
OM-197-Lys 12,1/0,5 21,2/2,1
OM-197-AP 56,1/74,4 62,0/4,8
OM-197-Asp 26,4/2,4 29,0/2,6
OM-197-Asp-AC 22,0/22,1 26,7/2,4
OM-197-Lys-AC 92,2/6,8 93,5/6,9
OM-197-MC-AC-Sukc-AZT 62,2/4,8 81,4/6,1
OM-197-MC-AC-Sukc-d4T 11,6/0,5 25,9/2,4
Przy stężeniu wynoszącym 10 μg/ml, wielka liczba związków pochodnych acylodipeptydu jest zdolna do indukcji różnicowania komórek predendrytycznych do komórek dendrytycznych. Grupa
PL 208 584 B1 funkcyjna niesiona przez pomocniczą sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego reguluje tę zdolność do aktywacji komórek predendrytycznych.
Związek podobny do acylodipeptydu OM-197-MC-AC-Sukc-AZT sprzężony z lekiem, posiada istotną zdolność do indukcji różnicowania do komórek dendrytycznych. Sposób w jaki związki pochodne acylodipeptydu są opracowywane ma określony wpływ na ich zdolność do indukcji różnicowania komórek predendrytycznych do komórek dendrytycznych. Aktywność pewnych produktów zmienia się w wielkim stopniu w zależności od tego, czy wymienione produkty są rozpuszczone w obecności lub przy braku 0,1%TEOA.
P r z y k ł a d d o d a t k o w y 4.4.
Test różnicowania na komórkach dendrytycznych
Oceniano zdolność produktów według wynalazku do indukowania dojrzewania przeddendrytycznych komórek do komórek dendrytycznych. Następujące parametry mierzono metodą cytometrii przepływowej: utratę zdolności fagocytozy dekstranu znakowanego fluoresceiną i ekspresję znacznika powierzchniowego CD86.
4.4.1. dodatkowy Protokół doświadczalny
Monojądrowe komórki krwi obwodowej wydziela się z kożuszka skrzepu zdrowych dawców. Monocyty oczyszczone przez adherencję zawiesza się w pożywce RPMI-1640 zawierającej 10% płodową surowicą cielęcą (PCS), GM-CSF i IL-4 do 10 ng/ml w ilości 1x106 komórek/ml. Komórki rozprowadza się w szalkach Petriego w ilości 10x106 komórek na szalkę i hoduje przez 6 dni zmieniając pożywkę po 3 dniach. Tak otrzymane komórki są nazywane komórkami predendrytycznymi (DC-6). Dojrzewanie komórek predendrytycznych do dojrzałych komórek dendrytycznych osiąga się przez inkubację z produktami w ilości 10 μg/ml lub IPS (dodatnia kontrola przy 1 lub 0,1 μg/ml) jeszcze przez 3 dni. W dniu 9 (DC-9), komórki zbiera się i parametry wskazujące na dojrzewanie w komórkach dendrytycznych (charakteryzujące się dużymi rozmiarami i złożoną budową wewnętrzną > dyfrakcja) mierzy się metodą cytometrii przepływowej (FACSCalibur BD Biosciences). Ocenia się procent komórek z ekspresją powierzchniowego markera CD86 lub komórek nie włączających dekstranu-FITC.
4.4.2. dodatkowy Ocena wyników
Niedojrzałe komórki dendrytyczne (DC-6) pochodzące z różnicowania monocytów, dzięki sprzężonemu wpływowi GM-CSF i IL-4, są zdolne do włączania dekstranu-FITC. Podczas procesu dojrzewania, komórki tracą zdolność do włączania dekstranu-FITC. Analizy prowadzi się podczas etapu różnicowania DC-9.
Fagocytoza dekstranu znakowanego fluoresceiną i ekspresja CD86 po stymulacji komórek predendrytycznych (DCS) przez acylowane pseudodipeptydy niosące funkcjonalizowane pomocnicze odgałęzienie odpowiadające ogólnemu wzorowi I.
Różnicowanie komórek predendrytycznych do dojrzałych komórek dendrytycznych.
Produkt Dekstran % DC / fluorescencja CD86% DC / fluorescencja
37°C (ujemna kontrola) 20,2/32,4 17,4/131,8
E. coli LPS 1 μg/ml 98,1/17,4 54,3/132,1
E. coli LPS 0,1 μg/ml 98,2/17,6 81,0/144,4
OM-197-AC-MP 45,3/44,9 13,0/46,9
OM-197-AH-AC 52,1/21,8 17,6/81,6
OM-197-AH-MP 17,0/18,4 52,4/71,1
OM-197-MC-AC-inv 90,8/24,1 53,5/21,1
OM-197-MC-AC-tetracyl 11,7/18,6 18,0/57,4
OM-197-MP-AP 93,4/24,5 60,4/48,1
OM-197-MP-AD 8,9/20,0 27,8/61,4
OM-197-AH-OH 25,2/15,0 37,1/74,2
OM-197-MP-AC-inv 85,8/29,5 45,7/92,0
OM-197-MP-AC-tetracyl 23,3/38,6 14,5/84,5
PL 208 584 B1
Różnice w średniej fluorescencji mierzonej w szczególności dla znakowania CD86 są spowodowane jakością komórek (dawców) i przedstawione wyniki pochodzą z kilku eksperymentów.
Przy stężeniu 10 gg/ml pewne acylowane pseudodipeptydy są zdolne do indukcji różnicowania komórek predendrytycznych do komórek dendrytycznych. Grupy funkcyjne zapewniane przez pomocnicze odgałęzienie moduluje zdolność do aktywacji komórek predendrytycznych. Odwrócenie pomiędzy X i Y o tej samej funkcjonalności może również modulować zdolność do indukowania dojrzewania w komórkach dendrytycznych. Związek OM-197-AC-MP jest praktycznie nieaktywny w tym modelu, podczas gdy związek OM-197-MP-AC (stary przykład) był bardzo aktywny.
Modyfikacja liczby łańcuchów acylowych jest jeszcze bardziej znacząca, związki tetracylowane mają marginalną aktywność w tym modelu.
Wpływ preparatu acylowanych pseudodipeptydów jest szczególnie znaczący ze względu na zdolność indukowania różnicowania komórek predendrytycznych do dendrytycznych, i pewne tetracylowane związki lub związki z bardzo długimi funkcjonalizowanymi odgałęzieniami, takie jak OM-197-MP-AD, są dzo słabo rozpuszczalne, i są bardzo słabo aktywne.
P r z y k ł a d 4.5.
Analiza indukcji białka MxA w komórkach dendrytycznych
Oszacowano zdolność produktów według wynalazku do indukcji wytwarzania antywirusowego białka MxA przez komórki predendrytyczne. Wytwarzanie MxA przez komórki mierzono po rozdzielaniu elektroforetycznym SDS-PAGE przez test Western Blot
4.5.1. Procedura doświadczalna
Komórki dendrytyczne w stadium DC-6 otrzymane jak opisano powyżej albo aktywowano albo nie, z użyciem IFN (500 U/ml), IPS (1 (gg/ml), TRANCE (100 ng/ml), CD40L (1 gg/ml), OM-197-MP-AC (1 gg/ml) lub OM-197-FV6 (1 gg/ml) przez 48 godzin. Ekstrakcję i analizę białka prowadzono w następujący sposób: komórki zebrano, następnie przemyto 3 razy PBS (roztwór soli buforowany fosforanem) i poddano lizie z użyciem 100 Mm buforu Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton-100 zawierającgo 1 mM PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu) i 1 g/ml pepstatyny jako inhibitora pepsyny. Lizę przeprowadzono przy gęstości wynoszącej 106 komórek na 100 gl buforu (5x) zawierająceego 60 mM Tris-HCl (pH 6,8), 10% glicerol, 2% SDS, 14,4 mM 2-merkaptoetanol i 0,1% bromofenol). Próbki ogrzano do temperatury 95°C przez 5 minut w szczelnych rurkach Eppendorfa. Elektroforezę przeprowadzono na 12% miniżelu akrylamidowym 10 cm x 10 cm przez przepuszczenie próbki mającej taką samą liczbę komórek. Migrację uzyskiwano z użyciem następującego buforu: 25 mM Tris, 192 mM glicyna, 0,1% SDS, pH 8,3.
Blotting: Białko odciska się z żelu SDS-PAGE na błonę nitrocelulozową (bufor do blottingu: 25 mM Tris, 192 mM glicyna, metanol pH 8,3)
Inkubacja z przeciwciałami: Blotting pokazano przez barwienie błony Ponceau Red. Niespecyficzne miejsca wiązania na błonie zablokowano 5% mlekiem odtłuszczonym w TBS (10 mM Tris-HCl, 150 Mm NaCl, pH 7,4) i odstawiono na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Błonę przemyto 3 razy TBS-0,1% Tween 20. Błonę inkubowano z roztworem przeciwciała monoklonalnego anti-MxA (klon 143) uprzednio rozcieńczonego 100-krotnie (objętościowo) w TBS-mleko. Błonę inkubowano z wtórnym anty-mysim przeciwciałem sprzężonym z peroksydazą (HRP, Sigma) uprzednio rozcieńczonym 1000-krotnie (objętościowo). Błonę przemyto trzy razy TBS-Tween. Prążki zawierające MxA ujawniono przez inkubację błony z odczynnikami chemiluminescencyjnymi (ECL, Amersham Pharmacia). W tym układzie, HRP katalizuje reakcję chemiluminescencyjną za pośrednictwem luminolu, którą można wykryć na błonie fotograficznej.
4.5.2. Wyniki
Komórki DC-9 aktywowano przez 0, 2 godziny, 4 godziny, 24 godziny (fig. 77) lub 48 godzin (fig. 78) w następujący sposób:
PL 208 584 B1
Fig. 77 Fig. 78 Położenie na Western Blot U
Próbka Test: pożywka do hodowli GMCSF/IL-4 0 godz. 2 godz. 4 godz. 24 godz. 48 godz.
1. + NaCl (kontrola ujemna) 1 2 3 4 1
2. +LPS (1 gg/ml) 5 6 7 2
3. + IFN-CX (500 U/ml) (kontrola dodatnia) dla indukcji białka MxA 8 9 10 3
4. + TRANCE (1 ng/ml) 4
5. + CD40 (1 gg/ml) 5
6. + OM-197-MP-AC (1 gg/ml) 11 12 13 6
7. + OM-197-FV6 (1 gg/ml) 14 15 16 7
Western Blot ukazany fig. 77 i 78 ilustruje wytwarzanie w czasie MxA:indukcję istotnego wzrostu białka MxA przez produkty IL-197-AC5 i OM-197-FV6, odpowiednio po 24 godzinach (fig. 77) i po 48 godzinach (fig. 78). Wytwarzanie MxA zanotowane w niniejszym, jest porównywalne z indukowanym przez kontrolę dodatnią LPS lub IFN przy poziomie wytwarzania wyższym niż poziom indukowany, odpowiednio przez kontrolę ujemną, przez TRANCE (cytokina należąca do rodziny TNF, która indukuje dojrzewanie komórek dendrytycznych) lub przez CD40L (inny czynnik pobudzający dojrzewanie komórek dendrytycznych).
Związki według wynalazku OM-197-MP-AC i OM-197-FV6 wykazują właściwości antywirusowe przez cechę zdolności do indukcji wytwarzania białka MxA
P r z y k ł a d 4.6.
Określanie zdolności związków według wynalazku do wzbudzania wytwarzania TNF przez komórki jednojądrzaste ludzkiej krwi obwodowej.
4.6.1. Procedura
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej odzyskuje się z górnej warstwy skrzepu 6 zdrowych dawców. Takie komórki z górnej warstwy skrzepu zawiesza się i izoluje komórki jednojądrzaste przez wirowanie w gradiencie Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia). Oczyszczone komórki jednojądrzaste zawiesza się w pożywce RPMI -1640 uzupełnionej 10% FCS, antybiotykami, merkaptoetanolem i L-glutaminą. Stężenie komórkowe reguluje się do 2 x 106 żywych komórek/ml
100 gl każdego z tych roztworów związków pochodnych acylodipeptydu zawierających pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, rozcieńczonego 100-, 10- lub 1-krotnie w pożywce RPMI 1640, rozdziela się do płytek do mikromianowania. Próbki testuje się potrójnie, i każda płytka do mikromianowania obejmuje kontrolę ujemną wykonaną ze zwykłej pożywki. Rozcieńczenia LPS E. coli (w zakresie gram 1 do 0,00001 gg/ml) stosuje się jako kontrolę dodatnią.
100 gl zawiesiny komórkowej dodaje się do każdej studzienki zawierającej rozcieńczone roztwory produktu lub kontroli. Komórki inkubuje się z produktami przez 18 godzin, w inkubatorze w temperaturze 37°C, przy 5% CO2 i atmosferze nasyconej wilgocią.
Pod koniec okresu inkubacji, płytki do mikromianowania wiruje się, a płyny supernatantów zlewa i zamraża w temperaturze -80°C w równych objętościach do czasu testu ELISA.
Stężenie TNF wydzielonego przez komórki jednojądrzaste określa się przez chemiluminescencyjną ELISA (zestaw QuantiGlo #QTAOO R&D). 4-krotne rozcieńczenia płynu supernatantu rozdziela się do każdej studzienki płytki do mikromianowania, z którą wiążą się przeciwciała anty-aTNF.
Płytkę do mikromianowania inkubuje się przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Po myciu, dodaje się sprzężone z peroksydazą przeciwciało przeciw ludzkiemu aTNF. Po 2 godzinnym okresie inkubacji i dokładnym myciu, dodaje się substrat chemiluminescencyjny i po 20 minutach odczytuje chemiluminescencję, zawartość aTNF w płynie supernatantu określa się w odniesieniu do krzywej standardowej pokrywającej zakres 7000 do 0,7 pg/ml.
PL 208 584 B1
Wyniki wyraża się w pg/ml wytworzonego aTNF. Wyniki pochodzą z doświadczenia reprezentatywnego dla aktywności związku podobnego do acylo-dipeptydu
4.6.2. Wyniki
Indukcja wytwarzania aTNF przez związki pochodne acylo-dipeptydu, niosące pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, mające ogólny wzór I, w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej.
Produkt 100 gg/ml 10 gg/ml 1 gg/ml
OM-197-MC 12 0 0
OM-197-MC-MP 72 0 0
OM-197-FV6 88 104 0
OM-197-FV8 252 100 12
OM-197-MC-FV5 116 104 0
OM-197-MC-FV7 76 80 0
OM-197-MP-AC(R/S,R) 160 156 244
OM-197-MP-AC(R, R) 84 88 0
OM-197-MC-AC(S,R) 80 124 488
OM-197-MC-AC 144 140 12
OM-197-N'C2-MC-AC 0 0 0
OM-197-N'(C10-20C8)-MC-AC 0 0 0
OM-197-MC-Sukc 176 96 0
OM-197-Lys 20 164 284
OM-197-AP 84 116 428
OM-197-Asp 80 28 0
OM-197-Asp-AC 132 172 20
OM-197-Lys-AC 256 184 232
OM-197-MC-AC-Sukc-AZT 64 224 108
OM-197-MC-AC-Sukc-d4T 52 40 0
OM-197-MC-AC-Sukc 40 32 0
Kontrola ujemna złożona z pożywki RPMI indukowała linię podstawową wytwarzania aTNF poniżej poziomu czułości testu wynoszącej 0,7 mg/ml.
Indukcja wytwarzania TNF przez LPS E. coli w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej.
LPS E. coli w gg/ml
Produkt 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001
TNF-α (pg/ml) 404 436 356 276 132 0
Dodatnia kontrola wykonana z LPS E. coli pobudza liczne wytwarzanie aTNF nawet dla najniższego testowanego stężenia.
Większość związków pochodnych acylo-dipeptydu indukuje istotne wytwarzanie aTNF mimo, że poziom wytwarzania jest niższy niż widoczny dla kontroli dodatniej. Większe stężenia LPS są konieczne do indukcji istotnego wytwarzania aTNF.
Pewne związki, takie jak OM-197-MC i OM-197-MC-MP indukują istotny poziom wytwarzania tylko przy stężeniu wynoszącym 100 gg/ml.
PL 208 584 B1
Aminowa grupa funkcyjna jest szczególnie interesująca pod względem indukowania wytwarzania aTNF widocznego, z jednej strony, przez zwiększanie amplitudy i zmniejszanie minimalnego stężenia produktu koniecznego do indukcji istotnego wytwarzania, z drugiej strony.
Krótkołańcuchowe związki pochodne acylo-dipeptydu OM-197-N'C2-MC-AC i OM-197-N1(C10-20C8)-MC-AC nie indukują żadnego wytwarzania aTNF, nawet przy stężeniu wynoszącym 100 μg/ml.
P r z y k ł a d 4.7.
Określanie zdolności związków według wynalazku do inhibitowania wytwarzania aTNF w komórkach jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej w odpowiedzi na lipopolisacharyd E. coli (LPS).
4.7.1. Procedura
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej odzyskuje się z górnej warstwy skrzepu 6 zdrowych dawców. Takie komórki z górnej warstwy skrzepu zawiesza się i izoluje komórki jednojądrzaste przez wirowanie w gradiencie Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia). Oczyszczone komórki jednojądrzaste zawiesza się w pożywce RPMI -1640 uzupełnionej 10% FCS, antybiotykami, merkaptoetanolem i L-glutaminą. Stężenie komórkowe reguluje się do 2 x 106 żywych komórek/ml.
Inhibicje za pośrednictwem produktu określa się przez wstępną inkubację tych produktów z komórkami jednojądrzastymi, i dodanie, 1 godzinę później, seryjnie rozcieńczonych roztworów LPS zdolnych do indukowania wytwarzania aTFN. Stężenie inhibitujące różnych produktów pochodnych acylodipeptydu niosącego pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, wynosiło jak się okazało, 10 μg/ml. LPS E. coli jest seryjnie rozcieńczony (10-krotne rozcieńczenie) w zakresie wynoszącym 1 do 0,00001 μg/ml μl 10 μg/ml rozcieńczeń roztworów produktów w pożywce RPMI 1640 rozdziela się w płytce do mikromianowania. Każdy test (10 μg/ml stężenie produktu + rozcieńczony LPS E. coli) wykonuje się potrójnie i każda płytka do mikromianowania obejmuje kontrolę ujemną złożoną ze zwykłej pożywki. Wytwarzanie aTNF indukowane LPS (bez inhibitora) określa się przez dodanie rozcieńczeń LPS E. coli do pożywki RPMI.
100 μl zawiesiny komórkowej dodaje się do każdej studzienki zawierającej albo rozcieńczenia produktu albo kontroli. Komórki inkubuje się z produktami przez 1 godzinę, w inkubatorze w temperaturze 37°C, przy 5% CO2 i atmosferze nasyconej wilgocią.
Pod koniec okresu wstępnej inkubacji, dodaje się 50 μl seryjnie rozcieńczonych roztworów LPS E. coli. Inkubację komórek jednojądrzastych z produktem i LPS ciągnie się przez 18 godzin. Pod koniec okresu aktywacji komórek, płytki do mikromianowania wiruje się i supernatanty zlewa i zamraża w temperaturze -80°C w postaci równych objętości, do czasu testu ELISA.
Stężenie aTNF wydzielonego przez komórki jednojądrzaste określa się przez chemiluminescencyjną ELISA (zestaw QuantiGlo #QTAOO R&D). 4-krotne rozcieńczenia płynu supernatantu rozdziela się do każdej studzienki płytki do mikromianowania, z którą wiążą się przeciwciała anty-aTNF. Płytkę do mikromianowania inkubuje się przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Po myciu, dodaje się sprzężone z peroksydazą przeciwciało przeciw ludzkiemu aTNF. Po 2 godzinnym okresie inkubacji i dokładnym myciu, dodaje się substrat chemiluminescencyjny i po 20 minutach odczytuje chemiluminescencję. Zawartość aTNF w płynie supernatantu określa się w odniesieniu do krzywej standardowej pokrywającej zakres 7000 do 0,7 pg/ml.
Inhibicja jest charakteryzowana przez stężenie LPS E. coli, które pobudza 50% wytwarzania aTNF podczas współinkubacji, w porównaniu z kontrolą obejmującą tylko RPMI. To stężenie zwiększa się wraz ze wzrostem siły aktywności inhibitującej produktu. Znając wartości inhibicji wytwarzania aTNF, stężenie to podaje się przez obliczenie 100-(wytwarzanie aTNF indukowanego przez produkt i LPS)/(wytwarzanie aTNF indukowanego przez sam LPS)*100. Z tych danych inhibicji, stężenie określa się przez regresję liniową wzdłuż segmentu linii, która łączy 2 rozcieńczenia LPS dając około 50% inhibicji.
Zdolność produktu do inhibitowania wytwarzania aTNF w komórkach jednojądrzastych w odpowiedzi na LPS jest dodatkowo scharakteryzowane przez maksymalną inhibicję. Stężenie LPS odpowiadające temu maksymalnemu poziomowi inhibicji (inhibicja > 95%) jest także reprezentatywna dla siły inhibitorowej produktu. Wyniki oblicza się z reprezentatywnego doświadczenia wykorzystującego wszystkie produkty.
4.7.2. Wyniki
Inhibicja wytwarzania aTNF w odpowiedzi na LPS w ludzkich komórkach jednojądrzastych przez związki pochodne acylodipeptydu niosące pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, mające ogólny wzór I
PL 208 584 B1
Produkty 50% inhibicja LPS w μ g/ml max. inhibicja (%) max. inhibicja LPS w gg/ml
OM-197-MC 1 100 0,0043
OM-197-MC-MP 0,19 100 0,001
OM-197-FV6 >1 100 0,014
OM-197-FV8 >1 100 0,0033
OM-197-MC-FV5 >1 100 0,016
OM-197-MC-FV7 >1 100 0,00035
OM-197-MP-AC(R/S,R) >1 100 0,00002
OM-197-MP-AC(R, R) 0, 68 100 0,0013
OM-197-MP-AC(S,R) >1 100 0,00002
OM-197-MC-AC 0,88 100 0,00003
OM-197-N'C2-MC-AC 0,0003 100 0,00001
OM-197-N'(C10-20C8)-MC-AC 0,0009 85 <0,00001
OM-197-MC-Sukc 1 100 0,018
OM-197-Lys 0,70 100 0,0055
OM-197-AP >1 100 0,016
OM-197-Asp >1 100 0,00036
OM-197-Asp-AC 0,29 100 0,0058
OM-197-Lys-AC >1 100 0,001
OM-197-MC-AC-Sukc-AZT 0,45 100 0,0005
OM-197-MC-AC-Sukc-d4T 0, 64 100 0,00016
OM-197-MC-AC-Sukc >1 100 0,044
Kontrola ujemna złożona z pożywki RPMI indukowała linię podstawową wytwarzania aTNF poniżej poziomu czułości testu, wynoszącej 0,7 mg/ml.
Wszystkie związki pochodne acylo-dipeptydu są zdolne do indukcji inhibicji wytwarzania TNF w odpowiedzi na LPS E. coli. Stężenie produktu konieczne do uzyskania tej inhibicji zależy od pomocniczej funkcjonalnej sekwencji rozdzielającej łańcucha bocznego i długość łańcucha kwasu tłuszczowego. Nawet związki pochodne acylo-dipeptydu sprzężone z lekiem przez wiązanie estrowe są zdolne do indukcji takiej inhibicji.
P r z y k ł a d 4.8.
Określanie zdolności związków według wynalazku do aktywacji cytotoksyczności komórek NK przeciwko komórkom docelowym z linii komórkowej K562
4.8.1. Procedura
PBMC odzyskuje się z górnej warstwy skrzepu zgodnie z procedurą opisaną wcześniej w przykładzie 4.6. W skrócie, po wirowaniu w gradiencie Ficoll i 3 etapach mycia, PBMC rozdziela się do 6-studzienkowej płytki przy gęstości wynoszącej 3 x 106 komórek/ml w 3 ml RPMI zawierającej 10% PBS i inkubuje albo w samej pożywce albo stymulowanej γ IFN (1000 U/ml), LPS (1 μg/ml), OM-197-AC5 (1 μg/ml), lub OM-197-FV6 (1 pg/ml). Komórki inkubowano w takich warunkach przez 24 godziny. Komórki K562 (ludzka linia komórkowa białaczki, ATCC #CCL 243, 20110-2209 Manassas (VA), U.S.A.) utrzymywano w hodowli stosując pożywkę RPMI zawierającą 10% FCS i poddaje się 2 pasażom na tydzień.
Aby wykonać pomiary cytotoksyczności, komórki PBMC i K562 przemyto dwukrotnie w HBSS i zawieszono w pożywce RPMI pozbawionej Phenol Red, zawierającej 5% FCS. PBMC rozdzielono do okrągłodennej 96-studzienkowej płytki, tak aby uzyskać stosunek PBMC/cel, wynoszący 20/1, 10/1 i 5/1 w objętości 50 gl. 5000 komórek K562 (cel) dodaje się do każdej studzienki przy użyciu 50 μl
PL 208 584 B1
RPMI pozbawionej Phenol Red. Końcowa objętość wynosiła 100 gl. Płytkę wirowano w celu pobudzenia stykania się, następnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 4 godziny.
Cytotoksyczność szacowano stosując nieradioaktywny zestaw CytoTox 96 na podstawie pomiaru uwalniania LDH podczas lizy komórkowej (zestaw #G1780, partia # 124100, Promega, Madison, WI) zgodnie z instrukcjami dostawcy.
Procent cytotoksyczności obliczono zgodnie z następującym równaniem:
% cytotoksyczno ść =
O.D. (K562 + PBMC) - O.D.PBMC + O.D. same K562 O.D. (całk. liza K562) - O.D. same K562.
x100
4.8.2. Wyniki
Związki OM-197-AC5 i OM-197-FV6 indukują poziom aktywności NK, który jest porównywalny lub lekko niższy od indukowanego przez LPS podczas testowania w tych samych stężeniach (1 gg/ml).
Gęstość optyczna przy 490 nm
Bodziec Stosunek PBMC:K562 Sam PBMC K562 + PBMC % cytotoksyczności
Pożywka 20:1 0,141 1,5 0,5
10:1 0,073 1,55 7,7
5:1 0,055 1,4 0
IFN-γ 20:1 0,101 2,1 39,3
10:1 0,064 1,9 29,4
5:1 0,035 1,68 17,9
IPS 20:1 0,17 2,2 42
10:1 0,122 1,9 26
5:1 0,035 1,7 19
OM-197-MP-AC 20:1 0,084 1,8 22
10:1 0,084 1,66 13,7
5:1 0,027 1,5 7,4
OM-197-MC-FV6 20:1 0,11 2,1 38,8
10:1 0,087 1,65 12,9
5:1 0,079 1,4 0
Kontrole Zwykła pożywka Same K562 K562 pełna liza
do hodowli
Gęstość optyczna przy 490 nm 0,408 1,35 3
P r z y k ł a d 4.9.
Określanie zdolności związków według wynalazku do indukcji proliferacji limfocytów u myszy
4.9.1. Szkic doświadczenia
Komórki śledziony pochodzące od grupy 4 nie traktowanych myszy CBA zlewa się, hoduje w poczwórnej próbie, przy braku albo w obecności adiuwanta OM-197-MP-AC (0,1 do 10 gg/ml). Szacuje się odpowiedź proliferacji komórkowej przez pomiar wychwytu trytowanej tymidyny (TdR 3H) po 1 lub 2 dniach hodowli. Wartości przytoczone w tablicy stanowią średnią arytmetyczną + odchylenie standardowe 4 hodowli.
Adiuwanty: sporządza się roztwór macierzysty OM-197-MP-AC o stężeniu wynoszącym 0,9 mg/ml w wodzie do wstrzyknięć, do której dodaje się 0,1% trietanolaminę.
Wyniki
Produkt OM-197-MP-AC nacelowuje proliferację komórek śledziony in vitro. Ten efekt, który jak widać ma poziom szczytowy po jednym dniu hodowli, daje 5-krotne zwiększenie wychwytu tymidyny przy stężeniu wynoszącym 1 gg/ml i 12-krotne zwiększenie wychwytu tymidyny przy stężeniu wyno84
PL 208 584 B1 szącym 10 μg/ml. Po jednym dniu hodowli, produkt OM-197-MP-AC o stężeniu wynoszącym 1 μg/ml, wywiera silny wpływ mitogenny o tej samej wielkości co konkawalina A o stężeniu 5 μg/ml. (patrz tablica 1).
T a b l i c a 1
Pomiar odpowiedzi proliferacji mysich komórek śledziony wobec adiuwanta OM-197-MP-AC
Adiuwant wychwyt TdR 3H (CPMx10-3)
Czas inkubacji (dni)
1 2
Brak adiuwanta 6,4 ± 1,0 14,3 ± 0,8
OM-197-MP-AC ^g/ml) 0,1 8,7 ± 0,7 21,1 ± 1,3
1,0 34,3 ± 2,6 55,6 ± 5,2
10 79,0 ± 12,0 92,7 ± 8,8
Dane przytoczone w powyższej tablicy stanowią średnią + SD pomiarów wychwytu, dla hodowli poczwórnych. Konkawalina A (5 μg/ml) stosowana jako kontrola dodatnia daje wychwyt tymidyny wynoszący 37,5 ± 6,2 x 103 cpm po jednym dniu hodowli.
P r z y k ł a d 4.10.
Określanie aktywności antywirusowej koniugatów związku według wynalazku otrzymanego przez sprzęganie z AZT i d4T jako prolekami
4.10.1. Procedura
Linię komórkową limfocytów T MT-4, którą transformowano w ciągłą linię komórkową przez zakażenie HTLV, wirusem związanym z jedną z form białaczki, stosowano do testowania aktywności antywirusowej (anti-HIV) związków według wynalazku sprzężonych, odpowiednio z AZTi d4T. Cechą charakterystyczną takich komórek jest brak przeżycia po zakażeniu HIV. Test jest oparty o zabezpieczenie zapewnione przez produkt (jak AZT) przeciwko temu destrukcyjnemu wpływowi wirusa.
Produkty testowano w seryjnie rozcieńczonych roztworach w 96-studzienkowej płytce. W górnej części mikropłytki, produkty testowano przez inkubację przy różnych stężeniach z komórkami i wirusem (potrójnie), aby określić stężenie produktu, które spowoduje zabezpieczenie komórek przed destrukcyjnym wpływem wirusa. IC50 produktu bierze się jako stężenie gdzie zapisuje się 50% utratę liczby żywych komórek. Zliczenia żywych komórek wykonano za pomocą MTT, żółtego związku tetrazoliowego, który ulega redukcji enzymatycznej (na poziomie mitochondrium w żywych komórkach) do purpurowo zabarwionego związku formazanowego. Studzienki zawierające żywe komórki mają barwę purpurową, podczas gdy martwe komórki dają przenikliwie żółtą barwę. Pomiar gęstości optycznej (O.D.) pozwala na ocenę ilościową tego efektu.
Cytotoksyczność danego produktu szacuje się w ten sam sposób w niższej części płytki gdzie test prowadzi się przez inkubację seryjnie rozcieńczonych produktów w komórkach pozbawionych wirusa, aby przez to określić wpływ toksyczny produktów na komórki. Wynik podaje się jako CC50, czyli stężenie przy którym 50% komórek jest martwych z powodu toksyczności produkt. Selektywność (indeks selektywności, SI) danego produktu określa się jako stosunek CC50/IC50. Parametr ten ma wielkie znaczenie, ponieważ indeks selektywności produktu całkiem skutecznego jest wysoki.
4.10.2. Wyniki
Koniugaty otrzymane przez sprzęganie produktów według wynalazku z AZT (OM-197-LCsukc-AZT) lub d4T posiadają aktywność antywirusową skierowaną przeciwko HIV 1 IIIB i HIV 2 ROD. Wyniki dwóch doświadczeń (uruchomionych potrójnie) onan komórkach MT-4, są podane poniżej:
Produkt Szczep HIV IC50 ^M) IC50 ^M)
1 2 3 4
AZT HIV-1 IIIB 0,0029 187
OM-197-MC-Sukc-AZT HIV-1 IIIB 0,0519 >94
PL 208 584 B1 ciąg dalszy
1 2 3 4
D4T HIV-1 IIIB 0,107 321
OM-197-MC-Sukc-d4T HIV-1 IIIB 0,963 +/-97
AZT HIV-2 ROD 0,0018 187
OM-197-MC-Sukc-AZT HIV-2 ROD 0,061 >94
D4T HIV-2 ROD 0,22 321
OM-197-MC-Sukc-d4T HIV-2 ROD 0,51 +/-97
Związki według wynalazku sprzężone z AZT lub d4T wykazują aktywność antywirusową w tym modelu komórek MT-4. Zaleta takich proleków leży z jednej strony w tym, że koniugaty mają strukturę lipidową, która umożliwia nacelowanie związków na zakażone komórki, przez uwolnienie substancji antywirusowych do miejsca przebywania wirusa i ich zdolności do regulowania aktywności immunologicznej komórek docelowych, z drugiej strony.
P r z y k ł a d 4.11.
Określanie zdolności związków według wynalazku do aktywowania dojrzewania mysich komórek predendrytycznych do komórek dendrytycznych
4.11.1. Procedura
Wytwarzanie komórek dendrytycznych
Z kości udowej i piszczelowej myszy (C57BI/6, 6 do 8 tygodniowej) aspirowano szpik. Zawiesinę szpiku przesiewano przez 70 μm sito komórkowe w celu otrzymania zawiesiny z pojedynczych komórek. Komórki szpiku zawieszono w pożywce Dulbecco modyfikowanej przez Isocove'a (IMDM) uzupełnionej 10% inaktywowaną gorącem płodową surowicą cielęcą (iFCS) i antybiotykami. Komórki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C, przy CO2 i atmosferze nasyconej wilgocią, wewnątrz 6-studzienkowych płytek do mikromianowania. Następnego dnia (dzień 0 nie przylepione komórki zebrano i przemyto. Żywe komórki zliczono w teście ekskluzji barwnika błękitu trypanowego. Stężenie komórkowe wyregulowano 2 x 105 komórek/ml w IMDM zawierającej 20 ng/ml mysiego rekombinowanego GM-CSF i 20 ng/ml mysiego rekombinowanego IL-4 (rmIL-4) i płytki dodatkowo inkubowano. 3-ciego dnia, dodaje się tam świeżo wytworzony mGM-CSF i rmIL-4 o stężeniu wynoszącym 10 ng/ml. 6-tego dnia, zebrano nie przylegające komórki, przemyto i zliczono przez ekskluzję barwnika błękitu trypanowego. Stężenie komórkowe wyregulowano do 2 x 105 komórek/ml w IMDM zawierającej 10 ng/ml rmGM-CSF i rmIL-4, i płytki inkubowano dodatkowo. Dnia 8-ego, zebrano nie przylegające komórki wytworzone, zarówno z dojrzałych jak i niedojrzałych komórek dendrytycznych (CD-DM) i użyto w doświadczeniach współinkubacji z produktem.
Inkubacja z produktami według wynalazku: CD-DM inkubowano przy stężeniu wynoszącym 5
5x105 komórek/ml w 24-studzienkowych płytkach do mikromianowania w obecności następujących aktywatorów: Esherichia coli szczep 0111:B4 LPS jako kontrola dodatnia, IMDM jako kontrola ujemna; jak również 2 związki według wynalazku: OM-197-MC-FV5 i OM-197-PM-AC o stężeniu wynoszącym 0,1, 1 i 10 μg/ml. Po 48 godzinnym okresie inkubacji, komórki zebrano i przechowywano do analizy przepływu cytometrycznego.
Analiza przepływu cytometrycznego: CD-DM przemyto PBS zawierającą 2% iFCS i 0,01% azydkiem sodu (bufor FACS). Następnie, komórki inkubowano na lodzie przez 30 minut z optymalnymi stężeniami przeciwciała anty-CD86; przeciwciałem anty-CD40, przeciwciałem antyMCHII sprzężonym z FITC, i przeciwciałem sprzężonym z peroksydazą anty-CD80. Następnie, komórki przemyto 3 razy. Znakowanie przeciwciał anty-CD86 i anty-CD40 przeprowadzono przez inkubację komórek na lodzie przez 30 minut z użyciem sprzężonych z peroksydazą oślich immunoglobulin anty-szczurzych. Po inkubacji, komórki przemyto i zawieszono w pożywce FACS. Fluorescencję mierzono za pomocą cytometrii przepływowej FACScan™. Analizowano 15000 pulsów na próbkę. Komórki, które inkubowano z samym koniugatem użyto jako kontrolę ujemną.
4.11.2. Wyniki
Ekspresja komórkowa
PL 208 584 B1
Markery powierzchniowe
CD40 CD80 CD86 MHCII
pg/ml MFI % Komórek MFI % Komórek MFI % Komórek MFI % Komórek
OM-197- -MCV- FV5 10 630 54 97 48 4097 51 1681 48
1 517 44 84 45 3888 43 1691 43
0,1 442 33 66 42 3437 37 1689 40
OM-197- -MC-AC 10 605 55 97 53 4162 52 1622 49
1 493 48 73 47 3791 45 1607 45
0,1 446 34 66 41 3504 37 1597 38
LPS 0,1 539 51 95 51 3445 50 1546 51
Negative kontrola 0 431 29 74 41 3011 34 1553 41
MFI: średnia intensywność fluorescencji
Produkty według wynalazku są zdolne do indukowania dojrzewania komórek predendrytycznych do komórek dendrytycznych. Te otrzymane in vitro wyniki są zgodne z obserwacjami przeprowadzonymi na myszach in vivo.
In vivo, podawanie dożylne i podskórne OM-197-MP-AC przy stężeniu wynoszącym, odpowiednio 20 pg i 5 μg na mysz, indukują dojrzewanie i migrację komórek dendrytycznych do śledziony, ze strefy brzegowej (położonej między miazgą czerwoną i białą) do miazgi białej gdzie znajdują się komórki T. Barwienie immunologiczne preparatów histologicznych pobranych ze śledziony zwierząt, traktowanych produktami według wynalazku, ujawnia współlokalizację dojrzałych komórek dendrytycznych i komórek T w białej korze, co widać przy traktowaniu IPS, podczas gdy u zwierząt nietraktowanych, nie obserwuje się migracji i dojrzewania.
5-ta Seria przykładów: badania farmakologiczne związków według wynalazku (in vivo)
P r z y k ł a d 5.1.
Ocena właściwości związków podobnych do dipeptydu zawierających pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, w domieszce lub sprzężonych z (NANP)6P2P30 w mysim modelu immunizacji
5.1.1. Procedura doświadczalna
Antygen: Peptyd (NANP)6P2P30 zawiera powtarzającą się sekwencję (NANP) Plasmodium falciparum i dwie sekwencje toksyny tężca (P2:830-843 i P30: 947-967). Peptyd ten jest znany jako epitop pomocniczy T i pokazał swą zdolność do indukcji silnej, wydłużonej odpowiedzi immunologicznej, w obecności zwykłych adiuwantów. Taki peptyd został otrzymany przez syntezę zgodnie z metodą opisaną w literaturze (Valmori i inni, 1992, J. Immunol., 149:717-721). Sporządza się roztwór macierzysty antygenu o stężeniu wynoszącym 0,4 mg/ml w mieszaninie 0,9% NaCl/woda przy pH 8,0.
Adiuwanty: Wytwarza się roztwory macierzyste związków podobnych do dipeptydu (OM-197-MP, OM-197-FV6 i OM-197-MC) o stężeniu wynoszącym 1 mg/ml w mieszaninie 0,9% NaCl-woda, do której dodaje się 0,1% trietanolaminę. Kontrola dodatnia składa się z Incomplete Freund's Adiuvant (IFA od Difco, Detroit, Ml, USA), a kontrola ujemna to roztwór mieszaniny 0,9% NaCl/woda.
W tej procedurze doświadczalnej, antygen i adiuwant opracowuje się w postaci mieszaniny lub koniugatów, jak opisano poprzednio. Testowano dwa typy koniugatów (OM-197-FV)n-(NANP)6P2P30. Stopień sprzężenia takich produktów jest zmienny, czyli na pojedynczej cząsteczce peptydu (mieszanina pojedynczych, podwójnych i potrójnych koniugatów, odpowiednio, n = 1,2 i 3) można znaleźć 1,2 lub 3 cząsteczki OM-197-FV, czyli 1 cząsteczkę OM-197-FV na jedną cząsteczkę peptydu (pojedynczy koniugat, n = 1).
Program immunizacji: 6-tygodniowe samice myszy BALB/c (6 myszy na grupę) immunizuje się dwukrotnie, przez podskórne wstrzyknięcie w koniec ogona, zawierające 0,1 ml. Podawane ilości to 20 pg antygenu plus 50 μg adiuwanta w pierwszym wstrzyknięciu i 10 μg antygenu plus 50 μg adiuwanta w drugim wstrzyknięciu. W przypadku koniugatów, część antygenowa jest krytyczna przy określaniu wstrzykniętej dawki.
PL 208 584 B1
Wykaz w tablicy grup doświadczalnych:
Grupa Ad i u want Antygen Liczba myszy
1 NaCl 6
2 - (NANP)6P2P30 6
3 IFA + (NANP)6P2P30 6
4 OM-197-FV6 + (NANP)6P2P30 6
5 OM-197-MC + (NANP)6P2P30 6
6 (OM-197-FV)1,2,3-NANP)6P2P30 6
7 OM-197-FV-(NANP)6P2P30 6
8 OM-197-MP + OM-197-FV(NANP)6P2P30 + 6
Program immunizacji i pobierania próbek:
Tygodnie 0 3 5
Wstrzyknięcia immunizacyjne (Nb) T (1) T (2)
Odpowiedź specyficznego Przeciwciała T T
Pobieranie próbek:
Wytwarzanie surowicy: Pobieranie próbek prowadzi się w tygodniu 0 i 5. Krew odstawia się na 60 minut w temperaturze 37°C, a następnie jest utrzymywana przez noc w temperaturze 4°C. Następnie surowicę zamraża się w temperaturze -80°C do czasu testu z przeciwciałem.
5.1.2. Określanie miana przeciwciała IgG anty-(NANP)6P2P30
Test przeciwciał IgG wzbudzonych specyficznie przeciwko antygenowi (NANP)6P2P30 przeprowadza się techniką ELISA.
Wiązanie antygenu wykonuje się w 96-studzienkowych płytkach do mikromianowania (Maxizorp F96, Nunc, DK) prowadząc inkubację przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze 4°C przy czym każda studzienka zawiera 0,1 ml PBS (roztwór soli buforowanej fosforanem) zawierający 0,001 mg/ml antygenu (NANP)6P2P30. Blokowanie płytki do mikromianowania przeprowadza się z użyciem PBS zawierającej 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA, Fluka, Switzerland). Płytki przemywa się PBS zawierającą 0,05% Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO, USA). Próbki surowicy zebrane po 5 tygodniach rozcieńcza się seryjnie buforem do rozcieńczania (PBS zawierająca 2,5% chudego mleka w proszku i 0,05% Tween 20), następnie przenosi do płytki do mikromianowania i odstawia na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Płytki następnie przemywa się PBS. Następnie rozcieńczony roztwór zawierający mysie poliklonalne przeciwciało immunoglobulinę G, sprzężoną z fosfatazą alkaliczną (Sigma, St. Louis, MO, USA) rozdziela się na te płytki i inkubuje przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki przemywa się PBS i ujawnia specyficzne przeciwciała przez reakcję barwną obejmującą dodawanie substratu fosfatazy alkalicznej, p-nitrofenylo-fosforanu (Sigma, St. Louis, MO, USA). Absorbancję przy 405 nm odczytuje się w czytniku płytek do mikromianowania (czytnik Dynatech 25000 ELISA, Ashford, Middlesex, UK), każdą próbkę surowicy mierzy się podwójnie.
Wyniki stanowią średnią wszystkich pomiarów absorbancji przy długości fali 405 nm w odniesieniu do myszy w każdej grupie.
5.1.3. Wyniki: specyficzna odpowiedź
Wytwarzanie przeciwciał IgG skierowanych specyficznie ku antygenowi (NANP)6P2P30, jak określono przez ELISA, jest ukazane graficznie dla myszy którym podawano jedno, dwa i trzy wstrzyknięcia immunizacyjne (fig. 79).
Dwa wstrzyknięcia mieszaniny antygen + adiuwant (OM-197-FV lub OM-197-MC), indukują odpowiedź serologiczną, która znacznie mocniejsza niż obserwowana po wstrzyknięciu samego antygenu. Immunizacja pojedynczym koniugatem OM-197-FV-(NANP)6P2P30 indukuje odpowiedź IgG, która jest nieco większa niż otrzymana dla mieszaniny antigen + OM-197-FV6. Wyższe tempo sprzęgania dla (OM-197-FV)1,2,3-(NANP)6P2P30 nie poprawia odpowiedzi serologicznej skierowanej ku temu anty88
PL 208 584 B1 genowi. Mieszanina zawierająca adiuwant OM-197-MP i pojedynczy koniugat OM-197-FV(NANP)6P2P30 powoduje znacznie mocniejszą odpowiedź serologiczną przeciwko temu antygenowi, która przekracza wartości otrzymane dla kontroli dodatniej obejmującej (NANP) 6P2P30 + IFA.
Podobne wyniki otrzymuje się przy wychwycie przeciwciała w technice ELISA przy użyciu peptydu (NANP)6NA jako antygenu (fig. 80)
P r z y k ł a d 5.2.
Grupa immunizacji owoalbuminą: Określanie specyficznych przeciwciał wzbudzonych u myszy w następstwie 1 i 2 wstrzyknięć podskórnych
5.2.1. Szkic doświadczenia
Badanie to ma na celu porównanie odpowiedzi serologicznej indukowanej przez wstrzyknięcie mieszaniny adiuwant + antigen (OM-197-MP + owoalbumina) z wywołaną przez koniugat na bazie tego samego antygenu (OM-197-FV-owoalbumina). W tym celu, 30 myszy BALB/c (samice, w wieku 8 tygodni na początku traktowania) podzielono na 3 grupy, w następujący sposób:
Grupy Adiuwant-antygen 25 pg prot/zwierzę/wstrzyknięcie Adiuwant (niezwiązany) 50 pg/zwierzę/wstrzyknięcie Wstrzyknięta objętość pl
A owoalbumina - 200
B owoalbumina OM-197-MP 200
C OM-197-FV-owoalbumina - 200
Roztwory:
• Grupa A: Sporządzono roztwór macierzysty samego antygenu (owoalbumina, Fluka AG, Buchs, Szwajcaria) o stężeniu wynoszącym 125 pg/ml w H2O + 0,01% tiomersal.
• Grupa B: Roztwór macierzysty mieszaniny antygen + adiuwant (owoalbumina + OM-197MP) zawiera 125 pg/ml owoalbuminy i 250 pg/ml OM-197-MP w H2O + 0,01% tiomersal.
• Grupa C: Roztwór macierzysty koniugatu OM-197-FV-owoalbumina o stężeniu wynoszącym 125 pg/ml białka w H2O + 0,01% tiomersal.
Wytwarzanie roztworów do wstrzyknięć: Każdy roztwór macierzysty inkubuje się przez 15 minut w temperaturze 37°C, następnie do każdego roztworu odpowiednią objętość dodaje się systematycznie NaCl (14%) otrzymując roztwór izotoniczny (0,9% NaCl). Całą mieszaninę wiruje się przez 3 minuty.
Program immunizacji: Wstrzyknięcia wykonuje się w dniu 0 i 14. Roztwory podaje się podskórnie (100 pl w 2 różne miejsca, całkowita ilość wynosi 200 pl na zwierzę). Pobieranie próbek następowało w dniu 14 i 28 (nakłucie obok oczodołu).
Test immunoglobulin anty-owoalbumina: Następujące immunoglobuliny surowicy, które są specyficznie skierowane przeciwko owoalbuminie testowano podwójnie testem ELISA: IgG1 IgG2a oraz IgM. W skrócie, płytki do mikromianowania (NUNC Immunoplate, Roskilde, DK) inkubowano (powleczenie przez noc) w temperaturze 4°C razem ze 100 pl owoalbuminy (0,5 pg) w buforze wodorowęglanowym, pH 9,6). Po przemyciu 0,5% Tween-20 (Merck Hohenbrunn, D), surowice rozcieńczono 50-, 200- i 800-krotnie (roztwór rozcieńczający: roztwór soli buforowanej fosforanem (PBS) + 1% albumina surowicy bydlęcej (BSA, Sigma, St. Louis, MO, USA) + 0,02% Tween-20)). Do studzienek dodawano 100 pl każdej rozcieńczonej próbki surowicy. Inkubacja trwała 45 minut w temperaturze 37°C.
Po drugim etapie mycia, IgG1, IgG2a i IgM specyficznie skierowane na owoalbuminę, inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C razem z 100 pl przeciwciał anty-IgG1 koniugat(antymysie szczurze przeciwciało)-peroksydaza (Serotec, Oxford, UK), koniugat IgG2a-peroksydaza (Pharmingen, San Diego, CA, USA) i koniugat IgM-biotyna (Pharmingen, San Diego, CA, USA), rozcieńczone uprzednio w buforze PBS/BSA/Tween (rozcieńczenia, odpowiednio 250-, 1000-, 500-krotne). Dla IgM, po etapie dodatkowego mycia, konieczny był 3-ci etap inkubacji (30 minut w temperaturze 37°C) z rozcieńczonym 1:100 roztworem koniugatu streptoawidyna-peroksydaza (Dako, Glostrup, DK).
Po etapie mycia, dodaje się 100 pl roztworu fenyleno-1,2-diaminy (OPD, Merck, Darmstadt, GFR) aby wykryć sprzężone z peroksydazą wtórne przeciwciała anty-IgG1, podczas gdy dla IgG2a i IgM, użytym odczynnikiem była 3',3',5',5'-tetrametylobenzydyna (TMB, Sigma, St. Louis, MO, USA). Po 20 minutowym okresie inkubacji w temperaturze pokojowej, reakcję zatrzymano
PL 208 584 B1 przez dodanie 100 gl 2N H2SO4. Wartości absorbancji odczytywano przy 490 nm z użyciem czytnika płytek Bio-Rad model 3550
5.2.2. Wyniki
Wyniki każdego odczytu w 490 nm są podane w jednostkach pomocniczych (A.U.) na ml. Osiąga się to przez porównanie każdej próbki z próbką standardową wytworzoną z różnych rozcieńczeń próbki zbiorczej zebranej z grupy A, po 28 dniach (zwierzęta, którym wstrzyknięto samą owoalbuminę). Jak widać wyraźnie pod tym względem, próbka zbiorcza rozcieńczona 50-krotnie ma stężenie wynoszące 1000 A.U./ml. Poszczególne wyniki koryguje się następnie pod względem odpowiadającego czynnika rozcieńczenia (50-, 200- lub 800-krotnie) i są ukazane w fig. 81, 82 i 83. Puste kółka odpowiadają średniej wartości po 14 dniach, podczas gdy czarne kółka odpowiadają średniej wartości po 28 dniach; Ova stanowi skrót od owoalbuminy.
Te wyniki wskazują, że koniugat OM-137-FV-owoalbumina jest szczególnie efektywnym immunogenem w badanym modelu, ponieważ zwiększa istotnie miano specyficznego przeciwciała wobec owoalbuminy u myszy po drugim wstrzyknięciu, bez względu na podklasę analizowanej immunoglobuliny (IgG1, IgG2a i IgM). W szczególności, następuje uderzające zwiększenie IgG2a anty-owoalbumina (fig. 84), które sugeruje, że przeważa reakcja immunologiczna TH1.
Nie kowalentna mieszanina owoalbumina + OM-197-MP powoduje wzrost odpowiedzi wobec IgG2a niż ta, która jest widoczna dla koniugatu.
P r z y k ł a d 5.3.
H1N1 Grupa immunizacji hemaglutyniną: Określanie specyficznych przeciwciał wzbudzonych u myszy w następstwie 1 i 2 wstrzyknięć podskórnych
5.3.1. Schemat doświadczenia
Badanie to przeznaczone jest do porównania odpowiedzi serologicznej indukowanej przez wstrzyknięcie mieszaniny adiuwant + antygen (OM-197 + H1N1) z wywołaną przez koniugat na bazie tego samego antygenu (OM-197-FV-H1N1). W tym celu, 30 myszy BALB/c (samice, 8 tygodniowe na początku traktowania) dzieli się na 3 grupy, w następujący sposób:
Grupy Adiuwant-antygen H1N1 2,5 gg/zwierzę/ wstrzyknięcie Adiuwant (niezwiązany) 50 gg/zwierzę/wstrzyknięcie Wstrzyknięta objętość gl
A H1N1 100
B H1N1 OM-197-MP(50Mg) 100
C OM-197-FV-H1N1 - 100
5.3.2. Wytwarzanie roztworów do wstrzyknięć • Grupa A: Sporządza się roztwór macierzysty H1N1 (hemaglutyniną A/Beijing 262/95, Solvay Duphar, Weesp, NL) o stężeniu wynoszącym 25 gg/ml w H2O.
• Grupa B: Roztwór macierzysty H1N1 + OM-197-MP zawiera 25 gg/ml H1N1 i 500 gg/ml OM-197-MP w H2O.
• Grupa C: Roztwór macierzysty OM-197-FV-H1N1 (H1N1 kowalentnie związana z OM-197FV) ma stężenie wynoszące 25 gg/ml w H2O).
Każdy roztwór macierzysty inkubuje się przez 15 minut w temperaturze 37°C następnie i dodaje 135 gl (14%) NaCl do 2 ml każdego roztworu. Całą mieszaninę wiruje się przez 3 minuty.
5.2.3. Program wstrzyknięć i test immunoglobuliny anty-H1N1:
Wstrzyknięcia wykonuje się w dniu 0 i 14. Roztwory podaje się podskórnie (50 gl w 2 różne miejsca, całość 100 gl na zwierzę). Pobieranie próbek wykonuje się w dniu 14 (nakłucie obok oczodołu).
Przeciwciała IgM specyficznie skierowane wobec H1N1 testowano podwójnie testem ELISA. W skrócie, płytki do mikromianowania (NUNC Immunoplate, Roskilde, DK) inkubowano (powleczenie przez noc) w temperaturze 4°C ze 100 gl H1N1 (0,5 gg) w buforze wodorowęglanowym (pH 9,6). Po przemyciu 0,5% Tween-20 15 (Merck Hohenbrunn, D), surowice rozcieńczano 50-, 200- i 800-krotnie (roztwór do rozcieńczania: roztwór soli buforowanej fosforanem (PBS) + 1% albumina surowicy bydlęcej (BSA, Sigma, St. Louis, MO, USA) + 0,02% Tween-20)). Do studzienek dodawano 100 gl każdego rozcieńczenia próbki surowicy. Inkubacja trwała 45 minut w temperaturze 37°C.
PL 208 584 B1
Po drugim etapie mycia, IgM specyficznie skierowane na H1N1, inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C razem z 100 pl przeciwciał anty-IgM koniugat(anty-mysie szczurze przeciwciało)-biotyna (Pharmingen, San Diego, CA, USA), rozcieńczone uprzednio w buforze Tween (rozcieńczenie 500-krotne). Po etapie dodatkowego mycia, konieczny był 3-ci etap inkubacji (30 minut w temperaturze 37°C) z rozcieńczonym 1:100 roztworem koniugatu streptoawidynaperoksydaza (Dako, Glostrup, DK).
Po etapie mycia, dodaje się 100 pl roztworu 3',3',5',5'-tetrametylobenzydyny (TMB, Sigma, St. Louis, MO, USA), aby wykryć sprzężone z peroksydazą wtórne przeciwciała IgM. Po 20 minutowym okresie inkubacji w temperaturze pokojowej, reakcję zatrzymano przez dodanie 100 pl 2N H2SO4. Wartości absorbancji odczytywano przy 490 nm z użyciem czytnika płytek Bio-Rad model 3550.
5.3.4. Wyniki
Wyniki każdego odczytu w 490 nm są podane w jednostkach pomocniczych (A.U.) na ml. Uzyskuje się to przez porównanie każdej próbki ze standardem wytworzonym z różnych rozcieńczeń próbki zbiorczej zebranej od grupy A (zwierzęta, którym wstrzyknięto samą H1N1) po 28 dniach. Jak sugeruje określenie, próbka zbiorcza rozcieńczona 50-krotnie ma stężenie wynoszące 1000 A.U./ml. Poszczególne wyniki są następnie korygowane pod względem odpowiadającego czynnika rozcieńczenia (50, 200, lub 800-krotnie) i są ukazane w fig. 84: czarne kółka odpowiadają średniej wartości w 28 dniu.
Myszy immunizowane koniugatem OM-197-FV-H1N1 wykazują miano przeciwciała IgM anty-H1N1 wyższe niż kontrola obejmująca albo sam antygen H1N1, albo mieszanina OM-197-MP + H1N1.
P r z y k ł a d 5.4.
Ocena właściwości adiuwanta OM-294-MP-AC w mysim modelu immunizacji przez podskórne podawanie antygenu Leishmania LmCPb.
5.4.1. Szkic doświadczenia
Myszom CBA podano przez ogon pojedyncze podskórne wstrzyknięcie (100 pl) antygenu LmCPb pasożyta Leishmania (3 pg n mysz) + adiuwant. Utworzono dwie grupy po 6 myszy każda i otrzymały one następujące traktowanie: sam antygen (grupa kontrolna) i antygen + 50 pg OM197-MP-AC odpowiednio.
Jedenaście dni po wstrzyknięciu, komórki pachwinowego i okołoaortowego gruczołu limfatycznego (2 grupy po 3 myszy każda) hodowano potrójnie w obecności oczyszczonego antygenu LmCPb lub całego ekstraktu pasożyta (amastygota). W dniu 4, próbkę supernatantu odciąga się i przechowuje w temperaturze -20°C do testu IL-4 i yIFN. Ostatecznie, do hodowli dodaje się trytowaną tymidynę (TdR 3H) w celu pomiaru reakcji proliferacji.
Test cytokiny przeprowadza się z użyciem sandwiczowego testu ELISA (zestawy OptEIA™ dla γ IFN i IL-4, BD, PharMingen, Basel, Szwajcaria) i określa się odpowiedź proliferacji, mierząc wychwyt tymidyny (TdR 3H). Wychwyt TdR 3H, podany w cpm jako wartość średniej arytmetycznej ± odchylenie standardowe (8 zbiorów od 3 myszy każdy) i stężenie IL-4 podane w pg/ml, są przytaczane indywidualnie dla każdego zbioru od 3 myszy, średnia arytmetyczna dwóch pomiarów (test cytokiny).
Antygen: Sporządza się roztwór macierzysty LmCPb o stężeniu wynoszącym 150 pg/ml w PBS.
Adiuwanty: Sporządza się roztwór macierzysty OM-294-MP-AC o stężeniu wynoszącym 0,9 mg/ml w wodzie do wstrzyknięć, z dodatkiem 0,1% trietanolaminy.
Mieszanina antygen-adiuwant: Preparat adiuwanta (4 objętości), który wyregulowano do odpowiedniego stężenia końcowego w jałowym PBS, miesza się tuż przed wstrzyknięciem z roztworem macierzystym antygenu (1 objętość).
5.4.2. Wyniki
U myszy CBA immunizowanych antygenem LmCPb Leishmania, pojedyncza dawka 50 pg OM-197-MP-AC wystarcza do indukcji zwiększenia (2 do 6-krotnie) proliferacji komórkowej w gruczole limfatycznym, jak zmierzono in vitro w odpowiedzi na oczyszczony antygen (w zakresie 0,6 do 15 pg/ml) lub cały ekstrakt pasożyta w stadium amastygoty (w zakresie 2 do 50 x 106/ml). Te wyniki przytacza się w tablicy 1. Ponadto, traktowanie myszy OM-197-MC-AC ujawnia znaczne ilości IL-4 w płynie supernatantu hodowli komórkowych gruczołów limfatycznych sprowokowanych antygenem pasożyta (patrz tablica 2) podczas gdy wytwarzanie γ IFN nie zostało wykryte (< 100 pg/ml).
PL 208 584 B1
T a b l i c a 1 Odpowiedź proliferacji in vitro limfocytów gruczołów limfatycznych u myszy CBA immunizowanych LmCPb: Wpływ adiuwanta OM-197-MP-AC samego lub w połączeniu z CpG-DNA
Prowokacja in vitro Wychwyt trytowanej tymidyny (CPM)
Bez adiuwanta OM-197-MP-AC
Brak prowokacji 0,7 ± 0,2 0,7 ± 0,1
LmCPb (Mg/ml) 15 2,8 ± 0,8 7,0 ± 0,7
5 1,6 ± 0,4 3,0 ± 1,1
1,7 1,1 ± 0,3 1,9 ± 0,5
0,6 0,9 ± 0,2 1,3 ± 0,5
Amastygoty 50 5,1 ± 1,4 32,6 ± 5,2
(x10-6/ml) 17 2,8 ± 1,0 12,6 ± 2,5
6 1,1 ± 0,6 5,3 ± 1,5
2 0,9 ± 0,4 1,6 ± 0,3
Con A ^g/ml) 124,3 ± 48,9 208,5 ± 56,0
Wartości przytaczane w tej tablicy stanowią średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe pomiarów wychwytu, prowadzonych na dwóch zbiorach z gruczołów limfatycznych (3 myszy na zbiór; potrójne hodowle każdego zbioru)
T a b l i c a 2 Wytwarzanie IL-4 in vitro przez limfocyty myszy CBA sprowokowanej LmCPb: Wpływ adiuwanta OM-197-MP-AC samego lub w połączeniu z CpG-DNA
Prowokacja in vitro Wytwarzanie IL-4 (pg/ml)
bez adiuwanta OM-197-MP-AC
Brak prowokacji a <8 <8
b <8 <8
LmCPb ^g/ml) 15 a <8 12
b <8 13
Amastygoty (x10-6/ml) 50 17 a <8 55
b <8 70
a <8 29
b <8 28
Con A (Mg/ml) 5 a 117 103
b 168 102
Wartości przytaczane w tej tablicy stanowią średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe 2 pomiarów cytokiny prowadzonych na dwóch zbiorach płynów supernatantów komórek gruczołów limfatycznych (a i b; 3 myszy na zbiór) hodowanych potrójnie.
Wniosek.
Adiuwant OM-294-MP-AC wzmacnia specyficzną odpowiedź T in vitro u myszy CBA, które immunizowano LmCPb (powszechna proteaza w stadium amastygotycznym pasożyta Leishmania) jak przetestowano przez proliferację limfocytów in vitro. Ponadto, adiuwant ten pobudza rozwój limfocytów anty-LmCPb, które wydzielają znaczne ilości IL-4.
P r z y k ł a d 5.5.
Ocena właściwości związków pochodnych acylo-dipeptydu zawierających pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego albo sprzężone albo w domieszce z syntetycznymi peptydami otrzymanymi z białka otaczającego sporozoit Plasmodium yoelii (PyCS- 252-260) w mysim modelu immunizacji.
Celem tego doświadczenia była ocena zdolności związków pochodnych acylo-dipeptydu zawierających pomocniczą sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego po szczepieniu lub w domieszce z syntetycznym peptydem PyCS 252-260 pochodzącą od białka otaczającego sporozoit Plasmodium
PL 208 584 B1 yoelii, w celu indukcji humoralnej lub komórkowej odpowiedzi immunologicznej skierowanej specyficznie przeciwko temu peptydowi.
5.5.1. Procedura doświadczalna
Tworzenie antygenów z adiuwantami: Syntetyczny peptyd PyCS 252- 260 odpowiadający epitopowi komórki T białka otaczającego sporozoit Plasmodium yoelii, ma następującą sekwencję SYVPSAEQI (Tablica 1). Peptyd 2 MR99B (SERSYVPSAEQI) otrzymano przez dodanie aminokwasów SER do końca N-terminalnego, a peptyd 1 MR99A (KGGKGGKSERSYVPSAEQI) otrzymano przez dodanie aminokwasów lizyna-glicyna-glicyna do końca N-terminalnego poprzednio opisanego peptydu MR99B.
Peptydy otrzymano przez syntezę w fazie stałej (F-moc, zgodnie z metodą syntezy Merrifield i Atherton (Atherton i inni, M Bioorg Chem., 8:350-351, 1979) przy użyciu odczynników i rozpuszczalników nabytych od Bachem Feinchemikallien (Buddendorf, Szwajcaria), Novabiochem (Laufelfingen, Szwajcaria) i Fluka (Buchs, Szwajcaria). Peptydy oczyszczono przez odwrotno-fazową HPLC.
Koniugaty mono- i polipeptydu ze związkami podobnymi do acylodipeptydu niosącymi pomocniczą sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, peptydami (OM-197-MC-FV)4 otrzymano jak opisano powyżej w przykładzie 3.6. (OM-197-MC-FV) i przykładzie 3.5. (OM-197-MC-FV-peptyd 2). Ostateczne jałowe roztwory koniugatów z peptydami liofilizowano.
Program immunizacji myszy: Dawka antygenu odpowiada 20 gg peptydu 2 na mysz i na wstrzyknięcie (Tablica 2). Przed wstrzyknięciem, liofilizowane preparaty rozpuszcza się w 0,9% NaCl, wiruje przez 3 minuty i poddaje działaniu dźwięków przez 10 minut w temperaturze 50°C. Preparaty obejmujące IFA wytwarza się przez mieszanie jednej objętości antygenu (14,5 gg peptydu PyCS 252-260 plus 50 gg P30 (uniwersalny epitop komórki T) w PBS) i jednej objętości adiuwanta.
4-tygodniowe myszy BALB/c (Harlan, Zeist, NL) otrzymały wstrzyknięcie podskórne w koniec ogona. Preparaty wstrzykuje się igłą numer 23 stosując końcową objętość wynoszącą 50 gl. Zwierzęta otrzymały drugie wstrzyknięcie antygenu na początku 5-tego tygodnia, a trzecie wstrzyknięcie w ciągu 9-tego tygodnia.
T a b l i c a 1. Antygeny
Peptydy syntetyczne Sekwencje Masa cząsteczkowa Dawka/wstrzyknięcie (gg)
Peptide 1 KGGKGGKSERSYVPSAEQI 1978,2 29,0
Peptide 2 SERSYVPSAEQI 1365,5 20,0
PyC252-260 SYVPSAEQI 993,1 14,5
T a b l i c a 2. Grupy doświadczalne, program immunizacji i pobierania próbek Immunizacje peptydem
Grupy Adiuwanty Antygen Liczba myszy
1 IFA - 7
PyC252-269
2 IFA 7
+ P30 7
3 OM-197 Peptyd 1 7
4 OM-197 Peptyd 2 7
5 OM-197-Peptyd1 7
6 OM-197-Peptyd1 7
7 OM-197-Peptydl 7
8 OM-197 - 7
U U U
0 5 7 9 tygodnie
11
4 4
Ocena Odpowiedź przeciwciała (ELISA) CTL response (ELISPOT)
PL 208 584 B1
Narząd limfoidalny i pobieranie próbek krwi:
Pobieranie próbek surowicy: Pobieranie próbek krwi przeprowadza się na wszystkich myszach w 7 i 11 tygodniu. Krew odstawia się na 6 minut w temperaturze 37°C, następnie utrzymuje przez noc w temperaturze 4°C. Następnie surowicę zamraża się w temperaturze -80°C do czasu testu przeciwciała.
Odzysk gruczołów limfatycznych pachwinowych: Zabija się dwoje zwierząt należących do każdej grupy, odpowiednio w 7 i 11 tygodniu. Pachwinowe gruczoły limfatyczne i śledzionę usuwa się chirurgicznie i komórki hoduje w celu przetestowania aktywności CTL przez ELISPOT (odpowiedź γ IFN).
Określenie miana przeciwciał anty-peptyd 1:
Test przeciwciał wzbudzonych specyficznie przeciwko peptydowi 1 (KGGKGGKSERSYVPSAEQI), przeprowadza się przez ELISA. Wiązanie antygenu wykonuje się w 96-studzienkowych płytkach do mikromianowania (Maxisorp F96, Nunc, DK) prowadząc inkubację przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze 4°C przy czym każda studzienka zawierała 0,05 ml PBS (roztwór soli buforowanej fosforanem) zawierającej 0,001 mg/ml peptydu 1. Płytki przemywa się PBS-0,05% Tween 20 (Sigma, St-Louis, MO, U.S.A.) (PBS-T) i blokowanie płytki wykonuje się z użyciem 5% odtłuszczonego mleka w PBS-T przez 1 godzinę, w temperaturze pokojowej. Poszczególne próbki surowicy (A, B, C, D, E, F, G) myszy, pobrane w tygodniu 9 i 11, seryjnie rozcieńcza się buforem do rozcieńczania (PBS zawierający 2,5% odtłuszczonego mleka w proszku i 0,05% Tween 20), następnie przenosi do płytki do mikromianowania i odstawia na 1 godzinę, w temperaturze pokojowej (RT). Płytki następnie przemywa się PBS i następnie do tych płytek rozdziela się rozcieńczony roztwór zawierający kozie poliklonalne przeciwciało anty-mysiej immunoglobulinie sprzężone fosfatazą alkaliczną (Sigma, St. Louis, MO, USA) i inkubuje przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki przemywa się PBS i ujawnia specyficzne przeciwciała dzięki barwnej reakcji poprzez dodanie substratu fosfatazy alkalicznej, p-nitrofenylofosforanu (Sigma, St. Louis, MO, USA). Odczytuje się absorbancję płytki do mikromianowania z czytnika przy 405 nm (czytnik Dynatech 25000 ELISA, Ashford, Middlesex, UK), każdą próbkę surowicy mierzy się podwójnie. Wyniki średnie wszystkich pomiarów w stosunku do myszy w każdej grupie. Miano przeciwciała jest podane przez najwyższe rozcieńczenie dające istotnie dodatnią odpowiedź, czyli OD większą w stosunku do poziomu hałasu tła ± 3 SD.
Test ELISPOT γ-IFN:
Przeciwciała specyficznie skierowane wobec mysiego γ-interferon u (O1E703B2) są wiązane przez wykonanie inkubacji przez noc w temperaturze 4°C w wilgotnej komorze, dodając roztwór przeciwciała w ilości 50 gg/ml w płytce do mikromianowania ELISPOT z dolną studzienką zakrytą nitrocelulozą (Millipore, Molsheim, France). Etap blokowania wykonuje się przez dodanie pożywki DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) zawierającej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS, Fakola, Szwajcaria) i pozostawieniu na 2 godziny w temperaturze 37°C. Komórki otrzymane z narządów limfoidalnych (pachwinowe gruczoły limfatyczne i śledziona) hoduje się w płytkach do mikromianowania przy gęstości wynoszącej 200 000 lub 400 000 komórek/studzienkę, następnie współhoduje przez 24 godziny w temperaturze 37°C z 100 000 komórkami prezentującymi antygen (które aktywowano peptydem PyCS 252-260 w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, i napromieniowuje (10 Krad) oraz przemywa 3 razy) lub w obecności Concanavalin A jako kontroli. Po inkubacji, komórki usuwa się i po etapie przemycia, dodaje się kompleks wtórne przeciwciało-biotyna przeciwko mysiemu γ IFN (ANI, 2 gg/ml w PBS z 1% BSA) i inkubuje przez 2 godziny. Dodaje się koniugat streptoawidyna-fosfataza alkaliczna (Boehringer Mannheim, Mannheim, GFR) rozcieńczony 1000-krotnie i inkubuje przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, i potem wykonuje 3 mycia PBS zawierającym 0,05% Tween 20, po czym 3 mycia PBS. Obecność kompleksów immunologicznych anty-γ IFN wykazuje się przez dodanie substratu BCIP/NBT (Sigma, St. Louis, MO, USA). Tę reakcję zatrzymuje się przez przemycie wodą z kranu. Następnie plamy, które są dodatnie pod względem γ IFN zlicza się w automatycznym czytniku model Biosys GmbH (Karben, Niemcy). Specyficzna liczba plam oznacza różnicę między plamami zliczonymi w obecności komórek aktywowanych peptydem i plamami zliczonymi przy braku peptydu. Wyniki są podane jako średnia wartość pomiarów zapisanych dla myszy w każdej grupie. Są one wyrażone w postaci liczby plam na milion hodowanych komórek.
Wyniki
Odpowiedź przeciwciała jest opisana w fig. 85 (2 tygodnie po 2-gim wstrzyknięciu) i w fig. 86 (2 tygodnie po 3-cim wstrzyknięciu). Po 2 wstrzyknięciach immunizacyjnych, obserwuje się dodatnie odpowiedzi u 5 z 7 zwierząt na grupę 5 (zwierzęta poprzednio immunizowane peptydem 1 sprzężo94
PL 208 584 B1 nym z 4 jednostkami związku podobnego do acylo-dipeptydu przez pomocniczą sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego). W tej grupie, procent myszy odpowiadających zwiększa się po 3-cim wstrzyknięciu, ponieważ myszy B i D wykazują średnie, lecz istotne miano przeciwciał. Grupa 3 immunizowana samym peptydem w domieszce z samym adiuwantem, nie wykazuje żadnego istotnego miana przeciwciał. Powstanie odpowiedzi obserwuje się po 3 wstrzyknięciach immunizujących w grupie 7 (pojedynczy koniugat peptyd 2 uzupełniony wolnym adiuwantem OM-197). Inne grupy, którym podawano krótki peptyd lub nie podawano peptydu, nie wykazywały żadnej odpowiedzi przeciwciała.
Na koniec, poczwórny koniugat OM-197-peptyd 2 jest zdolny do indukowania niskiego do średniego miana odpowiedzi przeciwciała u wszystkich immunizowanych myszy.
Test aktywności komórkowej opiera się o częstość wydzielania ylFN przez CTL, specyficznie skierowanego wobec epitopu PyCS 252-260. Wyniki są zapisane w tablicy 3. Kontrolę dodatnią reprezentuje grupa 2, a kontrolę ujemną reprezentuje sam adiuwant (grupy 1 i 8). Kontrola stymulacji komórkowej w oparciu o Concanavalin A jest dodatnia dla wszystkich myszy.
Grupy 5 (poczwórny koniugat) i 7 (pojedynczy koniugat + adiuwant) wykazują dodatnie odpowiedzi CTL.
Na koniec, peptyd sprzężony z 4 cząsteczkami związku podobnego do acylo-dipeptydu (OM-197-peptyd 1) jest skuteczny, podczas gdy pojedynczy koniugat (OM-197-peptyd 2) nie indukuje odpowiedzi CTL. Dla kontrastu, pojedynczy koniugat uzupełniony wolnym OM-197 indukują odpowiedź CTL, podczas gdy nie wywołuje on odpowiedzi przeciwciała, który to fakt jest prawdopodobnie spowodowany małym rozmiarem peptydu 2 (12 aminokwasów).
T a b l i c a 3: Odpowiedź CTL wobec peptydu PvCS 252 - 260
Liczba CTL na milion komórek śledziony
Grupa Adiuwant . . . Antygen Po 2-gim wstrzyknięciu Po 3-cim wstrzyknięciu
1 IFA (niekompletny adiuwant Freund'a) 0,0 ± 0,0 0,2 ± 0,2
2 IFA+PyCS 252-260 + P30 36,9 ± 2,7 4,4 ± 6,2
3 OM-197 + Peptyd 1 0,0 + 0,0 0,7 + 1,0
4 OM-197 + Peptyd 2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0
5 OM-197-Peptyd 1 11,3 ± 12,4 36,9 ± 25,6
6 OM-197-Peptyd 2 0,0 ± 0,0 0,6 ± 0,9
7 OM-197 + OM-197-Peptyd 2 28,8 ± 7,1 20,0 ± 14,1
8 OM-197 0,0 ± 0,0 0,6 ± 0,9
P r z y k ł a d 5.6.
Ocena pirogenności związków pochodnych acylo-dipeptydu na modelu króliczym
Celem tego doświadczenia jest określenie najwyższego stężenia związku podobnego do acylo
-dipeptydu niosącego wszczepioną pomocniczą sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, które nie indukuje gorączki u królików, którym podawano wstrzyknięcie dożylne związku.
Procedura:
białych królików New Zealand rozdziela się w następujące grupy:
Grupa 1: 1,0 mg/kg Grupa 2: 0,1 mg/kg Grupa 3: 0,01 mg/kg Grupa 4: 0,001 mg/kg Grupa 5: woda do wstrzyknięć
W dniu testu, króliki utrzymuje się ciasno i waży w skrzynkach przeznaczonych do tego celu. Do odbytu wprowadza się termometry godzinę po wprowadzeniu termometru, przez 90 minut zapisuje się temperatury (wstępne wstrzyknięcie) i oblicza się średnią wartość.
Następnie każdemu królikowi podaje się dożylnie wstrzyknięcie produktu lub kontroli (jałowa woda w 0,9% NaCl) przez boczną (boczną) żyłę uszną. Temperaturę mierzy się co 30 minut przez
PL 208 584 B1 godziny. Oblicza się i opisuje różnicę między średnią temperaturą wstępnego wstrzyknięcia i maksymalną temperaturą.
Biorąc 3 króliki na grupę, testowane produkty uważa się za nie pirogenne, jeśli suma 3 odpowiedzi nie przekracza 1,15°C, lub już pirogenne jeśli wymieniona suma przekracza 2,65°C. Jeśli otrzymany wynik leży pomiędzy, test jest powtarzany dla 3 dodatkowych królików.
Wyniki
Wyniki testu pirogenności prowadzonego na związkach OM-197-MC-MP i OM-197-MC-MP przytacza się w niniejszym:
Dawka OM-197-MC-MP Średnia odpowiedź w °C (poszczególne wartości) Wyniki
1 mg/Kg 3,40 (1,50, 0,60, 1,30) pirogenny
0,1 mg/Kg 2,00 (1,45, 0,05, 0,50) nie pirogenny (zapisana 1 wysoka wartość)
0,01 mg/Kg 0,65 (0,00, 0,45, 0,20) nie pirogenny
0,001 mg/Kg 0,35 (0,10, 0,05, 0,20) nie pirogenny
kontrola 0,20 (0,20, 0,00, 0,00) nie pirogenny
Dawka OM-197-MC-MP Średnia odpowiedź w °C (poszczególne wartości) Wyniki
1 mg/Kg 3,25 (1,25, 1,45, 0,55) pirogenny
0,1 mg/Kg 2,85 (1,10, 1,20, 0,55) pirogenny
0,01 mg/Kg 0,35 (0,20, 0,15, 0,00) nie pirogenny
0,001 mg/Kg 0,25 (0,00, 0,10, 0,15) nie pirogenny
kontrola 0,40 (0,25, 0,05, 0,10) nie pirogenny
Związki według wynalazku nie są pirogenne poniżej 0,1 mg/kg.
P r z y k ł a d d o d a t k o w y 5.6
Ocena pirogeniczności acylowanych pseudodipeptydów w modelu królika.
Celem tego eksperymentu jest określenie najwyższego stężenia acylowanego pseudodipeptydu niosącego wszczepione pomocnicze odgałęzienie, który nie indukuje gorączki u królika przy wstrzykiwaniu dożylnym.
Protokół:
królików (nowozelandzkie białe króliki) podzielono na następujące grupy:
Grupa 1: 0,9 mg/kg
Grupa 2: 0,09 mg/kg
Grupa 3: 0,009 mg/kg
Grupa 4: 0,0009 mg/kg
Grupa 5: woda do iniekcji
W dniu testu króliki zważono i unieruchomiono w pudełkach przewidzianych w tym celu. Sondy temperaturowe wprowadza się do ich odbytów.
W 1 godzinę po wprowadzeniu sond (przed iniekcją) temperatury rejestruje się przez 90 minut i określa się średnią.
Każdy królik otrzymuje następnie dożylną iniekcję produktu lub kontroli (sterylna woda z 0,9% NaCl) przez brzeżną (boczną) żyłę uszną. Temperaturę mierzy się co 30 minut przez 3 godziny. Różnica pomiędzy przediniekcyjną średnią i maksymalną temperaturą jest obliczana i zapisywana.
Dla 3 królików na grupę test uważa się za niepirogenny, jeśli suma 3 reakcji nie przekracza 1,15°C, a pirogenny, jeśli suma przekracza 2,65°C. Jeśli otrzymana wartość znajduje się pomiędzy nimi, test powtarza się z ponad 3 królikami.
PL 208 584 B1
Wynik:
Test pirogeniczności związku OM-197-MP-AC:
Dawka OM-197-MP-AC Suma reakcji w °C / (pojedyncza wartość) Wyniki
0,9 mg/kg 0,95 /(0,75; 0,20; 0,00) niepirogenny
0,09 mg/kg 0,70/ (0,40; 0,00; 0,30) niepirogenny
0,009 mg/kg 1,85/ (1,00; 0,65; 0,20) niepirogenny (nierozstrzygające)
0,0009 mg/kg 0,80/ (0,45; 0,15; 0,20) niepirogenny
Kontrola 0,55/ (0,35; 0,10; 0,10) niepirogenny
Związek według wynalazku nie jest pirogenny przy najwyższej testowanej dawce 0,9 mg/kg. Pośrednia dawka 0,009 mg/kg nie była powtarzana, ponieważ 2 wyższe dawki nie były pirogenne. Niska pirogenność związków według wynalazku potwierdza dane endotoksyczności in vitro określone przez LAL.

Claims (42)

1. Nowe pochodne N-acylo-dipeptydu zawierające grupę kwasową w stanie obojętnym lub naładowanym w części swego jednego końca i pomocniczą funkcjonalną rozdzielającą sekwencję łańcucha bocznego w części swego drugiego końca, związki o ogólnym wzorze I:
x- (CH2)m-CH- (CH2)n-CO-Y- (CH2)p-CH- (CH2)q-Z
I I
NHRi NHR2 (I) w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego, prostołańcuchowego lub rozgałęzionego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony albo zawiera jeden lub więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i (C1-24)alkilotio, indeksy dolne m, n oznaczają liczby całkowite w zakresie od 0 do 10, indeksy dolne p, q oznaczają liczby całkowite w zakresie od 1 do 10,
Y oznacza O lub NH,
X i Z oznacza pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego lub grupę kwasową albo w stanie obojętnym albo naładowanym wybrane spośród następujących grup obejmujących:
- karboksyl
- karboksy[(C1-5)alkoksy]
- karboksy[(C1-5)alkilotio]
- fosfono[(C1-5)alkoksy
- fosfono[(C1-5)alkilotio]
- dihydroksyfosforyloksy[(C1-5)alkoksy]
- dihydroksyfosforyloksy[(C1-5)alkilotio]
- dihydroksyfosforyloksy
- hydroksysulfonyloksy
- hydroksysulfonylo[(C1-5)alkoksy]
- hydroksysulfonylo[(C1-5)alkilotio]
- hydroksysulfonyloksy[(C1-5)alkoksy]
- hydroksysulfonyloksy[(C1-5)alkilotio]
- [karboksy(C1-5)alkilo]aminokarbonyl
- [dikarboksy(C1-5)alkilo]aminokarbonyl
- [amonio(C1-5)alkilo]aminokarbonyl
- {karboksy[amino(C1-5)alkilo}aminokarbonyl grupa pomocnicza oznaczona przez X lub Z, ma ogólny wzór (II):
A-(CO)r-(CH2)s-W (II) gdzie A oznacza albo O, S albo NH
PL 208 584 B1 indeks r oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 0 do 1; indeks s oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10;
W jest wybrany spośród grup obejmujących: formyl, acetyl, cyjano, chlorowco, amino, bromo, lub jodoacetamido, acyloamido, diacyloimido, sulfhydryl, alkilotio, hydroksyl, 1,2-dihydroksyetyl, alkoksy, acyloksy, winyl, etynyl, wolny karboksyl, zestryfikowany karboksyl lub w postaci mieszanego bezwodnika, amidu lub hydrazydku, azydek, tiocyjano, oraz ich enancjomery i diastereoizomery.
2. Związki według zastrz. 1, o ogólnym wzorze (I), w którym grupa pomocnicza oznaczona przez X lub Z, ma wzór (II):
A-(CO)r-(CH2)s-W (II) gdzie A oznacza O, S albo NH indeks r oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 0 do 1; indeks s oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10;
W jest wybrany spośród następujących grup obejmujących: formyl, acetyl, cyjano, chlorowco, amino, bromo, lub jodoacetamido, acyloamido, diacyloimido, sulfhydryl, alkilotio, hydroksyl, 1,2-dihydroksyetyl, alkoksy, acyloksy, winyl, etynyl, wolny karboksyl, zestryfikowany karboksyl lub w postaci mieszanego bezwodnika, amidu lub hydrazydku, azydek, tiocyjano.
3. Nowe pochodne N-acylodipeptydu zawierające grupę kwasową w stanie albo obojętnym albo naładowanym, na swoim jednym końcu i zawierających pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego na drugim, o ogólnym wzorze I:
X- (CH2)m-CH- (CH2)n-CO-Y- (CH2)p-CH- (CH2)q-Z
NHRi NHR2 (I) w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego prostołańcuchowego lub rozgałęzionego kwasu karboksylowego, mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden albo więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i (C1-24)alkilotio grup;
indeksy dolne m, n oznaczają liczby w zakresie od 0 do 10, indeksy dolne p, q oznaczają liczby w zakresie od 1 do 10,
X i Z każdy oznacza grupę kwasową albo w stanie obojętnym albo naładowanym lub pomocniczą funkcjonalną rozdzielającą sekwencję łańcucha bocznego, pod warunkiem, że co najmniej jeden z podstawników X lub Z oznacza pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego;
Y oznacza O lub NH, grupę kwasową X lub Z./ korzystnie wybiera się spośród następujących grup obejmujących:
- karboksyl
- karboksy[(C1-5)alkoksy]
- karboksy[(C1-5)alkilotio]
- fosfono[(C1-5)alkoksy]
- fosfono[(C1-5)alkilotio]
- dihydroksyfosforyloksy[(C1-5)alkoksy]
- dihydroksyfosforyloksy
- hydroksysulfonyloksy
- hydroksysulfonylo[(C1-5)alkoksy]
- hydroksysulfonylo[(C1-5)alkilotio]
- hydroksysulfonyloksy[(C1-5)alkoksy]
- hydroksysulfonyloksy[(C1-5)alkilotio] i grupa pomocnicza oznaczona przez X lub Z jaki opisano powyżej, wyłączywszy rodnik dihydroksyetylowy.
4. Związki według zastrz. 1 albo 2, o ogólnym wzorze (I), w którym, jeśli podstawniki X lub Z oznaczają grupę kwasową w stanie obojętnym, wymieniony związek oznacza wolny związek karboksylowy, sulfonowy, fosfoniowy lub fosforowy wymienionego kwasu.
5. Związki według zastrz. 1 albo 2, o ogólnym wzorze (I), w którym, jeśli podstawniki X lub Z oznaczają grupę kwasową w stanie naładowanym, wymieniony związek oznacza postać soli karboksy98
PL 208 584 B1 lowej, sulfonowej, fosfoniowej lub fosforowej, mianowicie przez dodanie zasady mineralnej lub organicznej, korzystnie przeznaczonej do zastosowania terapeutycznego.
6. Związki według zastrz. wybranego od 1 do 4, o ogólnym wzorze (I), w którym jeśli podstawniki X lub Z oznaczają grupę pomocniczą o wzorze (III):
O-CO-(CH2)s-W (III) indeks dolny s oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10, w szczególności równą 4, 5 lub 6;
W ma znaczenie wybrane spośród grup obejmujących: formyl, amino, hydroksyl, 1,2-dihydroksyetyl, karboksyl.
7. Związki według zastrz. wybranego od 1 do 5, o wzorze
X- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2)p-CH- (CH2)q-Z
NHRi NHR2 (IV) w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego, prostołańcuchowego lub rozgałęzionego kwasu karboksylowego, mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i grupy (C1-24)alkilotio, indeksy dolne m i n oznaczają liczby w zakresie od 0-10; indeksy dolne p i q oznaczają liczby w zakresie od 1 -10, i w którym jeden z podstawników X lub Z oznacza karboksyl lub grupę dihydroksyf osf oryloksy lub grupę karboksy[(C1-5)alkoksy], lub grupę karboksy[(C1-5)alkilotio], lub karboksy[(C1-5)alkilo]aminokarbonylową, lub [dikarboksy(C1-5)alkilo]aminokarbonylową, lub grupę {karboksy[amino(C1-5)alkilo}aminokarbonylową, i w którym drugi podstawnik oznacza grupę acyloksy wybraną spośród jednej z grup 6-aminoheksanoiloksy, 6-oksoheksanoiloksy, 6-hydroksyheksanoiloksy, 6,7-dihydroksyheptanoiloksy, lub 3-karboksypropanoiloksy, oraz ich enancjomery i diastereoizomery.
8. Związki według zastrz. wybranego od 1 do 7, wybrane z grupy utworzonej przez a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid kwasu N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowego, oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6,7-dihydroksyheptanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekan-1, 10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-oksoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną (Przykład 2.2);
kwas -N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid 5-O-(6,7-dihydroksyheptanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid 5-O-(6-oksoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid 5-O-(6-hydroksyheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
-(3RS,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1, 10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-aminoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
(3R,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-aminoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
(3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-aminoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-hydroksyheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
PL 208 584 B1
-2-[(R)-3-hydroksytetradekanoloamino]-5-(6-oksoheksylo)amino}pentylo-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-(dihydroksyfosforyloksy)butanian oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
(2R,8R)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoloamino]-3-okso-4-aza-8-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-nonan-1,9-diol, eter 1-O-karboksymetylowo-9-O-(6-oksohaksanianowy) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
-(2S,8R)-1-(karboksymetylo)-tio-2-[(R)-3-tetradodekanoiloksytetradekanoloamino]-3-okso-4-aza-8-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]nonan-9-ol 9-O-(7-aminoheptanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
-(2R,8R)-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoloamino]-3-okso-4-aza-8-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]nonan-1,9-ol 1-O-(2,2-dikarboksyetylo)eter 9-O-(6-heksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]1,10-diol, 1-diwodorofosforan 10-(6-bromoacetamidoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
(3RS,9R)-3-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]dekan-1,10-diol, 1-diwodorofosforan 10-(6-oksoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-sukcynyloamidoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-glicynyloksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-sukcynyloksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1-karboksy-5-aminopentylo]amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1-karboksy-5-aminopentylo]amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino] pentylo}amid e-N-[(1S)-1,2-dikarboksyetylo]amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1,2-dikarboksyetylo]amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-acetylo-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-(2-dekanoiloksyoktanoilo)-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną.
9. Związki według zastrz. wybranego od 1 do 7, o ogólnym wzorze I, wybrane z grupy obejmującej:
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
100
PL 208 584 B1
-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6,7-dihydroksyheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-oksoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetra dekanoiloamino]pentylo}amid 5-O-(6,7-dihydroksyheptanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-hydroksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid 5-O-(6-oksoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
związki -(3RS,9R), (3R,9R) i (3S,9R)-3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-(6-aminoheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
związki -3-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]dekan-1,10-diol 1-diwodorofosforan 10-5 (6-hydroksyheksanian) oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- {2-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-5-(6-oksoheksylo)amino}pentyl 2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-(dihydroksyfosforyloksy)-butanian oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-sukcynyloksy-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-((1S)-1-karboksy-5-amino]pentylo]amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczną;
- kwas N-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoilo]-D-asparaginowy, a-N-{(4R)-5-(6-aminoheksanoiloksy)-4-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]pentylo}amid e-N-[(1S)-1,2-dikarboksyetylo]amid oraz jego sole addycyjne z zasadą mineralną lub organiczne.
10. Sposób otrzymywania pochodnych N-acylo-dipeptydu określonych tak jak w zastrzeżeniu 1, zawierających grupę kwasową w stanie albo obojętnym albo naładowanym na swoim jednym końcu i zawierających pomocniczą funkcjonalną rozdzielającą sekwencję łańcucha bocznego na drugim końcu, o ogólnym wzorze I, znamienny tym, że obejmuje blokowanie aminowych grup funkcyjnych w pozycji (q+1) i YH w ω pozycji ω-funkcjonalnie podstawionego aminokwasu, za pomocą ortogonalnych środków blokujących, poprzez reakcję wciąż wolnej karboksylowej grupy funkcyjnej z czynnikiem redukującym, do uzyskania odpowiedniego alkoholu, uwolnienie aminowej grupy funkcyjnej w pozycji (q+1) i acylowaniu jej za pomocą pochodnej funkcjonalnej kwasu karboksylowwgo o wzorze R2OH w którym R2 jest taki jak wymieniono powyżej, a następnie uwolnienie terminalnego alkoholu lub aminowej grupy funkcyjnej, otrzymując aminoalkohol o ogólnym wzorze V,
Y- (CH2)P-CH- (CH2)q-OH
NHR2 (V) w którym Y oznacza HO lub korzystnie NH2,
R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników jakie określono powyżej;
każdy p i q oznaczają liczbę w zakresie od 1 do 10, który to aminoalkohol poddaje się kondensacji w obecności peptydowego czynnika kondensującego w obojętnym rozpuszczalniku, razem z ω-funkcjonalną pochodną związku aminokwasowego o ogólnym wzorze VI
PL 208 584 B1
101
X- (CH2)m-CH- (CH2)n-COOH
NHR2 (VI) w którym R1 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników jakie wymieniono powyżej, m i n oznaczają liczby całkowite w zakresie od 0 do 10, oraz X oznacza grupę kwasową jaką określono powyżej, która może występować w postaci estru, uzyskując pochodną dipeptydu o ogólnym wzorze VII,
X- (CH2)m-CH- (CH2)n-CO-Y- (CH2)p-CH- (CH2)q-OH
NHRi NHR2 (VII) w którym podstawniki R1 i R2 i indeksy dolne m, n, p i q są takie jak wymieniono powyżej, wolna końcowa alkoholowa grupa funkcyjna, która może być, jeśli trzeba, podstawiona przez alkil lub acyl lub inaczej przez alkilowy lub acylowy albo inny odczynnik podstawiający o ogólnym wzorze VIII,
A-(CO)r(CH2)s-W (VIII) przy czym A oznacza grupę opuszczającą, funkcyjną grupę OH, SH lub NH2; indeks dolny r jest równy 1, lub 0;
indeks dolny s ewentualnie jest zawarty między 1 i 10, korzystnie od 2 do 6;
W jest wybrany spośród następujących grup obejmujących rodniki; -formyl, -acetyl, -cyjano,
-chlorowco, -amino, -bromo- lub jodoacetamid, -acyloamid, -diacyloimid, -sulfohydryl, -alkytio, -hydroksyl, -1,2-dihydroksyetyl, -acyloksy, -winyl, etynyl, wolny lub zestryfikowany karboksyl lub w postaci mieszanego bezwodnika, amid lub hydrazydek, -azydek, -tiocyjano lub ich prekursory, w obecności czynnika sprzęgającego, i poddając produkt katalitycznemu uwodornieniu lub hydrolizie kwasowej w celu odbezpieczania, do otrzymania pochodnej o ogólnym wzorze I:
X- (CH2) π,-CH- (CH2) n-CO-Y- (CH2) p-CH- (CH2) q-Z
NH NH
I I
Ri R2 (I) w którym podstawniki i indeksy dolne X, Y, Z, R1, R2, n, m, p i q mają takie same znaczenia jak podano w zastrz. 1.
11. Sposób otrzymywania pochodnych acylo-dipeptydu o ogólnym wzorze IV, oraz ich enancjomery i diastereoizomery, x- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2)p-CH- (CH2) -Z
NHRi NHR2 (IV) gdzie we wzorze IV, każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego, prostołańcuchowego lub rozgałęzionego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i (C1-24)alkilotio;
indeksy m, p i q oznaczają liczby w zakresie od 1 do 10; indeks dolny n oznacza liczbę w zakresie od 0 do 10;
w którym każdy X i Z oznacza grupę kwasową lub pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, znamienny tym, że obejmuje blokowanie aminowych grup funkcyjnych w pozycjach (q+1) i ω kwasu diaminowego o wzorze H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH przez odczynniki blokujące, które
102
PL 208 584 B1 łatwo ulegają odpowiednio, rozkładowi kwasowemu i wodorolizie, reakcji wciąż wolnej karboksylowej grupy funkcyjnej z czynnikiem redukującym, uzyskując odpowiadający alkohol, uwolnieniu aminowej grupy funkcyjnej w pozycji (q+1), a następnie acylowaniu jej za pomocą pochodnej funkcjonalnej kwasu karboksylowego o wzorze R2OH, w którym R2 jest taki jak określono powyżej, następnie uwolnieniu końcowej aminowej grupy funkcyjnej przez wodorolizę, otrzymując aminoalkohol o ogólnym wzorze IX
H2N- (CH2)p-CH- (CH2)q-OH nhr2 (ix) w którym R2 oznacza grupę acylow ą pochodzą c ą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników jakie wymieniono powyżej;
p i q oznaczają liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10;
który to aminoalkohol poddaje się kondensacji w obecności peptydowego czynnika kondensującego w obojętnym rozpuszczalniku, razem z funkcjonalną pochodną ω-karboksyaminokwasu o ogólnym wzorze VI:
X- (CH2)m-CH- (CH2)n~COOH
NHRi (VI) w którym R1 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników;
m oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10; n oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 0 do 10; a X oznacza grupę dialkiloksy- lub diaryloksyfosforyloksy o wzorze (R0)2P-0
Φ
O uzyskując pochodną dipeptydu o ogólnym wzorze X (RO)2PO- (CH2)m-CH- (CH2)n-CONH- (CH2)p-CH- (CH2)q-OH ; I I
O NHRi NHR2 (X) w którym podstawniki R1, R2, oraz indeksy dolne m, n, p i q są takie jak określono powyżej, a R oznacza grupę, która łatwo ulega wodorolizie, wolna końcowa alkoholowa grupa funkcyjna, która może być, jeśli trzeba, podstawiona przez alkil lub acyl lub inaczej przez alkilowy lub acylowy albo inny odczynnik podstawiający o ogólnym wzorze VIII
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII) gdzie A oznacza grupę opuszczającą, grupę funkcyjną OH, SH lub NH2; indeks dolny r oznacza liczbę całkowitą równą 1 lub 0;
indeks dolny s oznacza liczbę w zakresie od 2 do 6; ewentualnie w zakresie od 1 do 10;
W korzystnie jest wybrany spośród grup obejmujących -formyl, -acetyl, -cyjano, -chlorowco,
-amino, -bromo, -jodoacetamid, -acylamid, -diacyloimido, -sulfhydryl, -alkilotio, -hydroksyl, 1,2-dihydroksyetyl, -acyloksy, -winyl, -etynyl, wolny lub zestryfikowany karboksyl lub w postaci mieszanego bezwodnika, amid lub hydrazydek, azydek, -tiocyjano lub ich prekursory, w obecności czynnika sprzęgającego, i poddając go katalitycznemu uwodornieniu lub kwasowej hydrolizie w celu odbezpieczania, do otrzymania pochodnej o ogólnym wzorze XI
PL 208 584 B1
103 w którym podstawniki W, R1, R2 i indeksy dolne m, n, p, q, r, s mają takie same znaczenia jak powyżej,
12. Sposób otrzymywania pochodnych dipeptydu, według zastrz. 11, o ogólnym wzorze XII, oraz ich enancjomery i diastereoizomery:
X- (CH2)m-CH- (CH2)n-CO-O- (CH2)p-CH- (CH2)q-Z I I
NHRi NHR2 (XII) w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego, prostołańcuchowego lub rozgałęzionego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub niesie jeden lub więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i (C1-24) alkilotio;
indeksy dolne m, p i q oznaczają liczby w zakresie 1-10; indeks dolny n oznacza liczbę w zakresie od 0 do 10;
w którym każdy X i Z oznacza grupę kwasową lub pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, znamienny tym, że obejmuje blokowanie aminowych grup funkcyjnych w pozycjach (q+1) i ω kwasu diaminowego o wzorze H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH przez odczynniki blokujące, które łatwo ulegają odpowiednio, rozkładowi kwasowemu i wodorolizie, reakcji wciąż wolnej karboksylowej grupy funkcyjnej z czynnikiem redukującym, uzyskując odpowiadający alkohol, uwolnieniu aminowej grupy funkcyjnej w pozycji (q+1), a następnie acylowaniu jej za pomocą pochodnej funkcjonalnej kwasu karboksylowego o wzorze R2OH, w którym R2 jest taki jak określono powyżej, następnie uwolnieniu końcowej aminowej grupy funkcyjnej przez wodorolizę i potem podstawienie alkilowe czynnikiem podstawienia alkilowego, otrzymując aminoalkohol o ogólnym wzorze XIII,
W- (CH2) SNH- (CH2) P-CH- (CH2) q-0H
NHR2 (XIII) w którym R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników jakie wymieniono powyżej;
p i q oznaczają liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10; indeks dolny s oznacza liczbę od 1 do 10, korzystnie między 2 i 7;
który to aminoalkohol poddaje się kondensacji w obecności czynnika kondensującego w obojętnym rozpuszczalniku, razem z pochodną ω-hydroksyaminokwasu o ogólnym wzorze VI:
X- (CH2) m-CH- (CH2) n-COOH
NHRi (VI) w którym R1 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników;
m oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10; n oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 0 do 10;
X oznacza grupę dialkiloksy- lub diaryloksy- fosforyloksy o wzorze
104
PL 208 584 B1 (RO)2P-0
Φ
O uzyskując pochodną dipeptydu o ogólnym wzorze XIV;
(RO) 2PO- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-O- (CH2)q-CH- (CH2)p-NH- (CH2) s- W
Φ I I
O NHRi NHR2 (XIV) w którym podstawniki R1, R2, i indeksy dolne m, n, p, q i s są takie jak określono powyżej, i R oznacza grupę, która łatwo ulega wodorolizie, a następnie otrzymany produkt poddaje się katalitycznemu uwodornieniu lub kwasowej hydrolizie w celu odbezpieczania, do otrzymania pochodnej o ogólnym wzorze XV:
(HO)2PO- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-O- (CH2) q-CH- (CH2) p-NH- (CH2) S-W
Φ I I
O NHRi NHR2 (XV) w którym podstawniki W, R1, R2 i indeksy dolne m, n, p, q, r i s są takie jak wymieniono powyżej;
W jest wybrane spośród grup obejmujących formyl, acetyl, cyjano, chlorowco, bromo lub jodoacetamido, acylamido, diacyloimido, acyloksy, winyl, etynyl, wolny lub zestryfikowany karboksyl lub mający postać mieszanego bezwodnika, amid lub hydrazydek, azydek, tiocyjano, lub ich prekursory.
13. Sposób według zastrz. 11 otrzymywania pochodnych karboksydipeptydu o ogólnym wzorze IV, oraz ich enancjomery i diastereoizomery:
X- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2)p-CH- (CH2) -Z
NHRi NHR2 (IV) w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego, prostołańcuchowego lub rozgałęzionego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i (C1-24)alkilotio;
indeksy dolne m, p i q oznaczają liczby od 1 do 10; indeks dolny n oznacza liczbę w zakresie od 0 do 10;
i w którym każdy X i Z oznacza grupę kwasową lub pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, znamienny tym, że obejmuje blokowanie aminowych grup funkcyjnych w pozycjach (q+1) i ω kwasu diaminowego o wzorze H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH przez odczynniki blokujące, które łatwo ulegają odpowiednio rozkładowi kwasowemu i wodorolizie, reakcji wciąż wolnej karboksylowej grupy funkcyjnej czynnikiem redukującym, uzyskując odpowiadający alkohol, uwolnieniu aminowej grupy funkcyjnej w pozycji (q+1), a następnie acylowaniu jej za pomocą pochodnej funkcjonalnej kwasu karboksylowego o wzorze R2OH, w którym R2 jest taki jak określono powyżej, następnie uwolnieniu końcowej aminowej grupy funkcyjnej przez wodorolizę, otrzymując aminoalkohol o wzorze IX,
H2N- (CH2)p-CH- (CH2) q—OH
NHR2 (IX) w którym R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników jakie wymieniono powyżej, p i q oznaczają liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10;
który to aminoalkohol poddaje się kondensacji w obecności peptydowego czynnika kondensującego w obojętnym rozpuszczalniku, razem z funkcjonalną pochodną ω-karboksyaminokwasu o ogólnym wzorze VI:
PL 208 584 B1
105
X- (CH2)m-CH- (CH2) „-COOH
NHRi (VI) w którym R1 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników, m oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 10, n oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 0 do 10, a X oznacza grupę RO-COtworząc pochodną dipeptydu o ogólnym wzorze XVI,
RO-CO- (CH2) m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2) p-CH- (CH2) q-OH
NHRi NHR2 (XVI) w którym podstawniki R1, R2 i indeksy dolne m, n, p i q mają takie same znaczenia jak powyżej, i R oznacza grupę która łatwo ulega wodorolizie, taka jak grupa benzylowa, wolna końcowa alkoholowa grupa funkcyjna, która może być, jeśli trzeba, podstawiona przez alkil lub acyl lub inaczej przez alkilowy lub acylowy albo inny odczynnik podstawiający o ogólnym wzorze VIII,
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII) gdzie A oznacza grupę opuszczającą, grupę funkcyjną OH, SH lub NH2, indeks dolny r oznacza liczbę korzystnie równą 1, ewentualnie równą 0, indeks dolny s oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 2 do 6, ewentualnie w zakresie od 1 do 10,
W korzystnie wybiera się spośród grup obejmujących formyl, acetyl, cyjano, chlorowco, amino, bromo lub jodoacetamido, acylamido, diacyloimido, sulfhydryl, alkilotio, hydroksyl, 1,2-dihydroksyetyl, acyloksy, winyl, etynyl, wolny lub zestryfikowany karboksyl lub w postaci pewnej innej pochodnej, w obecności czynnika sprzęgającego, i poddając go katalitycznemu uwodornieniu lub kwasowej hydrolizie w celu odbezpieczania, do otrzymania pochodnej o ogólnym wzorze XI, (HO) 2PO- (CH2) m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2) p-CH- (CH2) q-O- (CO) r (CH2) S-W
I I
O NH NH
I I
Ri R2 (XI) w którym podstawniki W, R1, R2 i indeksy dolne m, n, p, q, r i s są takie jak wymieniono powyżej.
14. Sposób otrzymywania pochodnych dipeptydu, według zastrz. 11, o ogólnym wzorze IV, oraz ich enancjomery i diastereoizomery:
X- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2)p-CH- (CH2) -Z
NHRi NHR2 (IV) w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego, prostołańcuchowego lub rozgałęzionego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksy, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i (C1-24) alkilotio, indeksy dolne m, p i q oznaczają liczby w zakresie od 1 do 10, indeks dolny n oznacza liczbę w zakresie od 0 do 10, w którym każdy X i Z oznacza grupę kwasową lub pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, znamienny tym, że polega na blokowaniu hydroksylowych grup funkcyjnych pochodnej dipeptydu, o ogólnym wzorze XVI
106
PL 208 584 B1
RO-CO- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2)p-CH- (CH2)q-OH
NHRi NHR2 (XVI) w którym podstawniki R1, R2 i indeksy dolne m, n, p i q mają takie same znaczenia jak powyżej, i R oznacza grupę, która łatwo ulega wodorolizie, z grupą zabezpieczającą, która łatwo ulega rozszczepieniu kwasowemu, uwolnieniu zestryfikowanej karboksylowej grupy funkcyjnej, reakcji ewentualnie aktywowanej karboksylowej grupy funkcyjnej z czynnikiem redukującym z uzyskaniem odpowiadającego alkoholu pierwszorzędowego, przekształceniu wymienionej alkoholowej grupy funkcyjnej w ester fosforowy przez traktowanie jej czynnikiem fosforylującym, uwolnieniu zabezpieczonej hydroksylowej grupy funkcyjnej przez traktowanie kwasem, a potem poddanie jej reakcji acylowania, alkilowania lub innego podstawienia, za pomocą odczynnika o ogólnym wzorze VIII:
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII) gdzie A oznacza grupę opuszczającą, grupę funkcyjną OH, SH lub NH2, indeks dolny r oznacza liczbę równą 1 lub 0, indeks dolny s oznacza liczbę w zakresie od 1 do 10, korzystnie od 2 do 6,
W wybrany jest spośród grup obejmujących formyl, acetyl, cyjano, chlorowco, amino, bromo lub jodoacetamido, acylamido, diacyloimido, sulfhydryl, alkilotio, hydroksyl, 1,2-dihydroksyetyl, acyloksy, winyl, etynyl, wolny lub zestryfikowany karboksyl lub jego inną pochodną, w obecności czynnika sprzęgającego, i poddając go katalitycznemu uwodornieniu lub kwasowej hydrolizie w celu odbezpieczania, do otrzymania pochodnej o ogólnym wzorze XI;
(HO) 2PO- (CH2) m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2) p-CH- (CH2) q-O- (CO) r (CH2) S-W
Φ I I
O NH NH
I I
Ri R2 (XI) w którym podstawniki W, R1, R2 i indeksy dolne m, n, p, q, r i s mają znaczenia takie jak podano w zastrzeżeniu 1.
15. Sposób otrzymywania pochodnych fosfodipeptydu według zastrz. 11, o ogólnym wzorze IV, oraz ich enancjomery i diastereoizomery
X- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2)p-CH- (CH2)q-Z
NHRi NHR2 (IV) w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego, prostołańcuchowego lub rozgałęzionego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i (C1-24)alkilotio, indeksy dolne m, p i q oznaczają liczby w zakresie od 1 do 10, indeks dolny n oznacza liczbę w zakresie od 0 do 10, i w którym każdy X i Z oznacza grupę kwasową lub pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego, znamienny tym, że obejmuje odbezpieczenie zestryfikowanej 10 karboksylowej grupy funkcyjnej pochodnej dipeptydu o wzorze XVI,
RO-CO- (CH2) m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2) p-CH- (CH2) q-OH
NHRi NHR2 (XVI) w którym podstawniki R1, R2 i indeksy dolne m, n, p i q mają takie same znaczenia jak powyżej, i R oznacza grupę, która łatwo ulega wodorolizie,
PL 208 584 B1
107 następnie poddanie otrzymanego kwasu reakcji sprzęgania peptydu z częściowo zabezpieczonym aminokwasem lub diaminoalkanem takim jak 3-benzyloksykarbonyloamino-1-aminopropan, dibenzylo-L-asparaginian lub ε-N-benzyloksykarbonylo-L-lizyna, w obecności czynnika sprzęgającego peptyd, i potem poddając, jeśli trzeba, produkt reakcji sprzęgania reakcji podstawienia acylem-, alkilem- lub innym, za pomocą odczynnika o ogólnym wzorze VIII,
A-(CO)r(CH2)s-W (VIII) gdzie A może oznaczać grupę opuszczającą, grupę funkcyjną OH, SH lub NH2, indeks dolny r oznacza liczbę całkowitą równą 1 lub 0, indeks dolny s oznacza liczbę całkowitą w zakresie ogólnie od 1 do 10, korzystnie od 2 do 6,
W ma znaczenie wybrane spośród grup obejmujących formyl, acetyl, cyjano, chlorowco, amino, bromo lub jodoacetamido, acylamido, -diacyloimido, -sulfhydryl, alkilotio, hydroksyl, 1,2-dihydroksyetyl-, acyloksy, winyl, etynyl, wolny lub zestryfikowany lub inaczej derywatyzowany karboksyl, w obecności czynnika aktywującego, i odbezpieczenie otrzymanego produktu, przez wodorolizę, do otrzymania związku o ogólnym wzorze XVIII
R3-NH-CO- (CH2) m-CH- (CH2) „-CO-NH- (CH2) p-CH- (CH2) q-O- (CO) r- (CH2) S-W
NH NH
Ri R2 (XVIII) w którym podstawniki W, R1, R2 i indeksy dolne m, n, p, q, r i s są takie jak wymieniono powyżej, a grupa R3 oznacza aminoalkil, karboksyalkil, dikarboksyalkil lub aminokarboksyalkil.
16. Sposób według zastrz. 10, w którym blokowanie aminowej grupy funkcyjnej w pozycji ω łańcucha pochodnej ornityny lub lizyny uzyskuje się przez N-benzyloksykarbonylowanie, po początkowej reakcji kwasowej grupy funkcyjnej z solą miedzi, w środowisku alkalicznym, reakcji tego karboksylanu miedzi z chloromrówczanem benzylu i uwolnieniu karboksylowej grupy funkcyjnej przez chelatowanie miedzi w środowisku kwasowym, po czym α-N-t-butoksykarbonylowaniu, otrzymując pochodną a-N-t-butoksykarbonylową i ω-N-benzyloksykarbonylową.
17. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że redukcję wolnej karboksylowej grupy funkcyjnej uzyskuje się za pomocą kompleksu borowodorodimetylosiarkowego lub przez reakcję pochodnej karboksylowej z mrówczanem alkilu, tworząc mieszany bezwodnik, który jest następnie redukowany borowodorkiem metalu alkalicznego lub ziem alkalicznych, uzyskując odpowiadającą pochodną hydroksylową, mającą grupę funkcyjną pierwszorzędowego alkoholu.
18. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że usuwanie grupy benzyloksykarbonylowej uzyskuje się przez wodorolizę w rozpuszczalniku typu alkoholu zawierającym trietyloaminę.
19. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że wolną aminę sprzęga się z kwasem a-acylamino-rn-fosforylokarboksylowym w obecności odczynnika sprzęgania peptydu, mianowicie IDQ, uzyskując zabezpieczony związek podobny do fosforylodipeptydu.
20. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że związek podobny do dipeptydu ulega podstawieniu acylowemu przy alkoholowej grupie funkcyjnej, za pomocą ω-funkcjonalnie podstawionego kwasu, w obecności czynnika estryfikującego, mianowicie EDCl, uzyskując ester alkenylowy.
21. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że alkenylowa grupa funkcyjna estru alkenylowego ulega reakcji dihydroksylowania przy sąsiadującej grupie diolowej, którą następnie poddaje się, po odbezpieczeniu grup funkcjonalnych pochodnej dipeptydu, reakcji utleniania nadjodowego, z uzyskaniem związku mającego aldehydową grupę funkcyjną.
22. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że związek podobny do dipeptydu ulega podstawieniu acylowemu przy alkoholowej grupie funkcyjnej, za pomocą kwasu ω-aminoalkanowego.
23. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że prowadzi się pełną reakcję odbezpieczenia przez wodorolizę, w obecności katalizatora, do otrzymania pochodnej dipeptydu, zawierającej pomocniczą aminoalkilową sekwencję rozdzielającą łańcuch boczny.
24. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że środkiem kwasowym stosowanym w reakcji sprzęgania, jest pochodna kwasu asparaginowego lub kwasu glutaminowego, otrzymana przez acylowanie aminowej grupy funkcyjnej estru β-benzylowego aminokwasu za pomocą pochodnej kwasu tłuszczowego, w obecności czynnika acylującego, aby odzyskać ester β-benzylowy kwasu N-acyloasparaginowego lub glutaminowego.
108
PL 208 584 B1
25. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że pochodną kwasu N-acyloasparaginowego lub glutaminowego sprzęga się z α-N-acyloaminoalkoholem pochodzącym od ornityny lub lizyny, po czym otrzymaną pochodną dipeptydu poddaje się reakcji wodorolizy w obecności katalizatora, otrzymując pochodną dipeptydu zawierającą karboksylową grupę funkcyjną.
26. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że hydroksylową grupę funkcyjną pochodnej dipeptydu acyluje się za pomocą pochodnej kwasu ω-alkenylo i grupa alkenylowa ulega reakcji dihydroksylowania, po czym odbezpiecza i poddaje reakcji utleniania nadjodowego, otrzymując związek o ogólnym wzorze XVII.
27. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że hydroksylową grupę funkcyjną pochodnej dipeptydu acyluje się za pomocą kwasu ω-aminoalkanowego i produkt poddaje się reakcjom odbezpieczenia, otrzymując związek o ogólnym wzorze XVII.
28. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że aminoalkohol otrzymany przez redukcję ornityny lub lizyny poddaje się podstawieniu alkilowemu przez ω-alkenylo triflan, który sprzęga się z kwasem α-acylamino ω-fosforylokarboksylowym w obecności czynnika acylującego takiego jak EDCl, po czym poddaje grupę alkenylową reakcji dihydroksylowania w obecności tetratlenku osmu, usuwa grupę zabezpieczającą, i utlenia sąsiednią diolową grupę funkcyjną nadjodanem sodu, uzyskując związek mający aldehydową grupę funkcyjną.
29. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że N-zabezpieczoną pochodną seryny poddaje się reakcję podstawienia O-alkilowego, usuwa się grupę zabezpieczającą aminowej grupy funkcyjnej przez rozkład kwasowy, aminową grupę funkcyjną acyluje się ponownie z użyciem związku kwasu 3-hydroksytłuszczowego w obecności czynnika acylującego, uzyskując pochodną N-acyl O-alkiloseryny, którą sprzęga się z aminoalkoholem w obecności czynnika sprzęgającego peptyd, po czym acyluje wolną grupę funkcyjną OH kwasem alkanowym ω-funkcjonalnie derywatyzowanym, otrzymując związek o ogólnym wzorze I, w którym X oznacza grupę karboksyalkiloksy.
30. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że wyjściowym aminokwasem jest cysteina lub homocysteina, którą poddaje się podstawieniu alkilowemu przez bromooctan p-metoksybenzylu, a następnie acyluje przez wiązanie z atomem azotu z pochodną kwasu 3-hydroksytłuszczowego, tak otrzymaną pochodną podstawioną przez S-alkilo-N-acylo sprzęga się z 5-amino-2-[3-hydroksytetradekanoiloamino]pentan-1-olem, w obecności czynnika sprzęgającego peptyd, uzyskując produkt kondensacji, którego wolną grupę funkcyjną pierwszorzędowego alkoholu acyluje się kwasem alkanowym ω-funkcjonalnie derywatyzowanym, i otrzymany produkt poddaje, jeśli trzeba, reakcji odbezpieczenia, otrzymując związek o ogólnym wzorze I, w którym X oznacza grupę karboksyalkilotio.
31. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że pochodną p-metoksybenzyloksykarbonyloseryny poddaje się podstawieniu O-alkilowemu za pomocą dibenzylometyleno malonianu w środowisku alkalicznym, uwalnia się aminową grupę funkcyjną przez traktowanie kwasem i wolną aminową grupę funkcyjną acyluje następnie kwasem 3-hydroksytłuszczowym w obecności czynnika acylującego, po czym tak otrzymaną sprzęga pochodną N-acylo-O-alkilową z aminoalkoholem w obecności czynnika sprzęgającego peptyd, tworząc pochodną dipeptydu, który następnie acyluje się przy jego wolnej grupie funkcyjnej OH, przy użyciu ω-alkenylo- lub amino-pochodnej kwasu alkanowego, pochodną alkenylową poddaje się dihydroksylowaniu, następnie reakcji odbezpieczania przez wodorolizę, po czym reakcji utleniania nadjodowego, uzyskując związek o ogólnym wzorze I, w którym X oznacza grupę dikarboksyalkiloksy.
32. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że ester benzylowy O-fosforylohomoseryny jako związek wyjściowy podaje się reakcji N-acylowania kwasem 3-benzyloksytetradekanowym, otrzymany ester benzylowy podaje się selektywnej wodorolizie, sprzęga wymieniony kwas z pochodną α-N-dodekanoiloksytetradekanową ornityny, w obecności czynnika sprzęgającego peptyd, uzyskując pochodną dipeptydu, który jest acylowany przy wolnej hydroksylowej grupie funkcyjnej za pomocą ω-alkenylo- lub aminofunkcjonalnie podstawionego kwasu alkanowego, w obecności karbodiimidu, i poddaje produkt reakcji, w przypadku pochodnej alkenylowej, reakcji dihydroksylowania i reakcji odbezpieczania przez wodorolizę w obecności katalizatora, po czym utlenianiu nadjodowym, otrzymując związek o ogólnym wzorze I, w którym R1 oznacza grupę hydroksyalkanoilową i R2 oznacza grupę acyloksyalkanoilową.
33. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że związek pośredni w postaci pochodna dipeptydu, pochodzący od kwasu asparaginowego lub glutaminowego, poddaje się reakcji blokowania przy wolnej hydroksylowej grupie funkcyjnej za pomocą grupy łatwo ulegającej acydolizie, jak grupa benzylowa, fenylowa, lub karboksylowa, następnie zestryfikowaną karboksylową grupę funkcyjną odPL 208 584 B1
109 bezpiecza się przez wodorolizę, którą to grupę następnie się redukuje, korzystnie po aktywowaniu do mieszanego bezwodnika, czynnikiem redukującym takim jak borowodorek metalu alkalicznego, otrzymaną hydroksylową grupę funkcyjną poddaje się reakcji fosforylowania, a następnie hydroksylową grupę zabezpieczającą hydrolizuje się w środowisku kwaśnym i tak regenerowaną hydroksylową grupę funkcyjną poddaje się reakcji acylowania ω-funkcjonalnie podstawionym kwasem karboksylowym, po czym poddaje ją reakcji dihydroksylowania i reakcji odbezpieczania przez wodorolizę w obecności katalizatora i reakcji utleniania nadjodowego, zapewniając związek o ogólnym wzorze XI niosącym aldehydową grupę funkcyjną.
34. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że pochodną dipeptydu w postaci związku pośredniego pochodzącego od kwasu asparaginowego lub glutaminowego poddaje się reakcji odbezpieczenia przy zestryfikowanej karboksylowej grupie funkcyjnej, wymienioną karboksylową grupę funkcyjną sprzęga się z częściowo zabezpieczonym aminoalkanem lub aminokwasem, w obecności czynnika sprzęgającego, następnie produkt reakcji sprzęgania poddaje się albo reakcji odbezpieczenia, mianowicie przez wodorolizę, albo reakcji acylowania z ω-funkcjonalnie podstawionym kwasem alkanowym i produkt poddaje się kolejno, jeśli stosuje się pochodną alkenylową, reakcji dihydroksylowania i reakcji odbezpieczania, mianowicie przez wodorolizę, i na koniec reakcji utleniania nadjodowego, otrzymując związek o ogólnym wzorze I lub ogólnym wzorze XVII.
35. Enancjomery i diastereoizomery związków o ogólnym wzorze I określonych w zastrz. 1, o ogólnym wzorze IV określonych w zastrz. 7, o ogólnym wzorze XI określonych w zastrz. 11, o ogólnym wzorze XII określonych w zastrz. 12, o ogólnym wzorze XVI określonych w zastrz. 13, lub o ogólnym wzorze XVIII określonych w zastrz. 15.
36. Związki N-acylopeptydowe, które obejmują;
- związki o ogólnym wzorze IV:
X- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2)p-CH- (CH2)q-Z
NHRi NHR2 (IV) w którym każdy R1 i R2 oznacza grupę acylową pochodzącą od nasyconego lub nienasyconego, prostołańcuchowego lub rozgałęzionego kwasu karboksylowego mającego od 2 do 24 atomów węgla, który jest niepodstawiony lub zawiera jeden lub więcej podstawników wybranych z grupy obejmującej hydroksyl, alkil, alkoksy, acyloksy, amino, acylamino, acylotio i (C1-24) alkilotio, indeksy dolne m, p i q oznaczają liczby od 1 do 10, indeks dolny n oznacza liczbę w zakresie od 0 do 10, i w którym każdy X i Z oznacza grupę kwasową lub pomocniczą funkcjonalną sekwencję rozdzielającą łańcucha bocznego,
- związki o ogólnym wzorze XVI:
RO-CO- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2)p-CH- (CH2)q-OH
NHRi NHR2 (XVI) w którym podstawniki R1, R2 i indeksy dolne m, n, p i q mają takie same znaczenia jak powyżej, i R oznacza grupę, która łatwo ulega wodorolizie,
- związki o ogólnym wzorze XVII:
HO-CO- (CH2)m-CH- (CH2) n-CO-NH- (CH2) p-CH- (CH2) q-O- (CO) r- (CH2) SW
NH NH
Ri R2 (XVII) w którym A oznacza atom tlenu, podstawniki W, R1, R2, i indeksy dolne m, n, p, q, r i s są takie jak wymieniono powyżej, przy czym wymienione związki występują w postaci czystych enancjomerów lub w postaci mieszaniny stereoizomerów.
110
PL 208 584 B1
37. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca składnik aktywny w połączeniu lub w domieszce z farmaceutycznie dopuszczalnym obojętnym, nietoksycznym nośnikiem lub zaróbką, znamienna tym, że jako składnik aktywny zawiera co najmniej jeden związek o ogólnym wzorze I określony w zastrz. 1, albo w postaci mieszaniny racemicznej lub postaci aktywnej optycznie, w postaci czystych diastereoizomerów lub ich mieszaniny, w stanie obojętnym lub naładowanym.
38. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 37, znamienna tym, że zawiera jako składnik aktywny, co najmniej jedną sól związku o ogólnym wzorze I, razem z zasadą organiczną lub mineralną przeznaczoną do zastosowania terapeutycznego.
39. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 37, znamienna tym, że zawiera związek o ogólnym wzorze I, albo czystych diastereoizomery lub ich mieszaniny, w połączeniu lub w domieszce z farmaceutycznym nośnikiem lub zaróbką.
40. Kompozycja według zastrz. 37, znamienna tym, że zawiera związek określony w zastrz. 1, szczepiony na antygenie lub na nośniku farmaceutycznym.
41. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1, szczepionego na antygenie, do wytwarzania kompozycji określonej w zastrz. 37, przeznaczonej do terapii w chorobach immunologicznych.
42. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1, szczepionego na nośniku farmaceutycznym, do wytwarzania kompozycji określonej w zastrz. 37, przeznaczonej do terapii w chorobach immunologicznych.
PL356405A 1999-12-22 2000-12-21 Nowe pochodne N-acylo-dipeptydu o ogólnym wzorze 1, sposoby ich wytwarzania, kompozycje farmaceutyczne zawierające takie związki, enancjomery tych związków, oraz zastosowanie tych związków PL208584B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB1999/002038 WO2001046127A1 (fr) 1999-12-22 1999-12-22 Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise
PCT/FR2000/003650 WO2001046126A1 (fr) 1999-12-22 2000-12-21 Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL356405A1 PL356405A1 (pl) 2004-06-28
PL208584B1 true PL208584B1 (pl) 2011-05-31

Family

ID=11004948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL356405A PL208584B1 (pl) 1999-12-22 2000-12-21 Nowe pochodne N-acylo-dipeptydu o ogólnym wzorze 1, sposoby ich wytwarzania, kompozycje farmaceutyczne zawierające takie związki, enancjomery tych związków, oraz zastosowanie tych związków

Country Status (16)

Country Link
US (3) US7799762B2 (pl)
EP (1) EP1242365A1 (pl)
JP (1) JP4902924B2 (pl)
CN (2) CN1434795B (pl)
AR (1) AR035024A1 (pl)
AU (3) AU1581400A (pl)
BR (1) BR0016696A (pl)
CA (1) CA2395197C (pl)
CZ (1) CZ20022194A3 (pl)
HU (1) HUP0204531A3 (pl)
LV (1) LV12886B (pl)
PL (1) PL208584B1 (pl)
RU (1) RU2275378C2 (pl)
SK (1) SK287514B6 (pl)
TW (1) TWI237022B (pl)
WO (2) WO2001046127A1 (pl)

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7915238B2 (en) 1999-02-01 2011-03-29 Eisai R & D Management Co., Ltd. Immunomodulatory compounds and methods of use thereof
US20040006242A1 (en) 1999-02-01 2004-01-08 Hawkins Lynn D. Immunomodulatory compounds and method of use thereof
US6835721B2 (en) 1999-02-01 2004-12-28 Eisai Co., Ltd. Immunomodulatory compounds and methods of use thereof
WO2001046127A1 (fr) * 1999-12-22 2001-06-28 Om Pharma Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise
EP2269638A3 (en) 2004-05-28 2012-06-13 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine compositions comprising virosomes and a saponin adjuvant
RU2396960C2 (ru) * 2004-07-23 2010-08-20 Ом Фарма Комбинированная противоопухолевая терапия и фармацевтические композиции для нее
WO2006095270A1 (en) * 2005-03-10 2006-09-14 Om Pharma Combination anticancer therapy or om-174 and pharmaceutical compositions therefor
US20060210590A1 (en) 2005-02-03 2006-09-21 Alk-Abello A/S Minor allergen control to increase safety of immunotherapy
GB0503337D0 (en) 2005-02-17 2005-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Compositions
AR054020A1 (es) 2005-03-23 2007-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Nuevo uso
CN103285392A (zh) 2005-04-26 2013-09-11 卫材R&D管理株式会社 用于癌症免疫疗法的组合物和其用途
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
KR101515078B1 (ko) 2005-12-22 2015-04-24 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
WO2007102081A2 (en) * 2006-03-09 2007-09-13 Om Pharma Immunomodulatory compounds and treatment of diseases related to an overproduction of inflammatory cytokines
EP2476433A1 (en) 2006-03-30 2012-07-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
PT2422810E (pt) 2006-07-17 2014-12-03 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacina da gripe
US9364525B2 (en) 2006-07-18 2016-06-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccines for malaria
US8323664B2 (en) 2006-07-25 2012-12-04 The Secretary Of State For Defence Live vaccine strains of Francisella
PL2137210T3 (pl) 2007-03-02 2017-06-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nowy sposób i kompozycje
PE20090146A1 (es) 2007-04-20 2009-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica contra el virus influenza
CA2690708A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
WO2009117035A1 (en) 2007-12-19 2009-09-24 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Soluble forms of hendra and nipah virus f glycoprotein and uses thereof
JP5711972B2 (ja) 2007-12-24 2015-05-07 アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック 組換えｒｓｖ抗原
ES2553113T3 (es) 2008-04-16 2015-12-04 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacuna
WO2010079081A1 (en) 2009-01-07 2010-07-15 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Methods for recovering a virus or a viral antigen produced by cell culture
GB0901411D0 (en) 2009-01-29 2009-03-11 Secr Defence Treatment
GB0901423D0 (en) 2009-01-29 2009-03-11 Secr Defence Treatment
US20110293660A1 (en) 2009-02-06 2011-12-01 Bruno Rene Andre Novel method
PE20110992A1 (es) 2009-02-17 2012-02-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica que comprende un antigeno del virus del dengue
GB0906234D0 (en) 2009-04-14 2009-05-20 Secr Defence Vaccine
EP2445527A2 (en) 2009-06-24 2012-05-02 ID Biomedical Corporation of Quebec Vaccine
HUE028085T2 (en) 2009-06-24 2016-11-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Recombinant RSV antigens
CA2768186A1 (en) 2009-07-15 2011-01-20 Novartis Ag Rsv f protein compositions and methods for making same
GB0913680D0 (en) 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
JP5774010B2 (ja) 2009-09-25 2015-09-02 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム インフルエンザウイルスのための免疫拡散アッセイ
GB0919117D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
CA2797059A1 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel method
GB201009273D0 (en) 2010-06-03 2010-07-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel vaccine
EP2627352B1 (en) 2010-10-15 2017-05-10 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Cytomegalovirus gb antigen
CA2835644C (en) 2011-05-13 2021-06-15 Novartis Ag Pre-fusion rsv f antigens
CN103533953A (zh) 2011-05-17 2014-01-22 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 针对肺炎链球菌的疫苗
US20130144540A1 (en) * 2011-12-06 2013-06-06 Palo Alto Research Center Incorporated Constrained de novo sequencing of peptides
WO2013139744A1 (en) 2012-03-18 2013-09-26 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Method of vaccination against human papillomavirus
US20140037680A1 (en) 2012-08-06 2014-02-06 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Novel method
AU2013301312A1 (en) 2012-08-06 2015-03-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Method for eliciting in infants an immune response against RSV and B. pertussis
EP2970398B1 (en) 2013-03-13 2024-05-08 The United States of America, as Represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Prefusion rsv f proteins and their use
BE1022174B1 (fr) 2013-03-15 2016-02-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccin
ES3020582T3 (en) 2013-07-26 2025-05-23 Inst Nat Sante Rech Med Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of bacterial infections
MX2016001695A (es) 2013-08-05 2016-05-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Composiciones inmunogenas de combinacion.
JP6851827B2 (ja) 2013-08-30 2021-03-31 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 細胞培養中でのウイルスの大規模製造
CN104436157A (zh) 2013-09-23 2015-03-25 恩金生物有限公司 流感疫苗和治疗
US10821175B2 (en) 2014-02-25 2020-11-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems
WO2015165480A1 (en) 2014-04-30 2015-11-05 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus vaccine compositions and method of producing the same
MX384992B (es) 2014-06-13 2025-03-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Combinaciones inmunógenas.
AU2015384786B2 (en) 2015-03-03 2020-08-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Display platform from bacterial spore coat proteins
WO2016180852A1 (en) 2015-05-12 2016-11-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for preparing antigen-specific t cells from an umbilical cord blood sample
WO2016207408A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Institute For Research In Biomedicine Novel vaccines in prevention and treatment of malaria
GB201614799D0 (en) 2016-09-01 2016-10-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compositions
US11084850B2 (en) 2016-12-16 2021-08-10 The Pirbright Institute Recombinant prefusion RSV F proteins and uses thereof
WO2018193063A2 (en) 2017-04-19 2018-10-25 Institute For Research In Biomedicine Novel malaria vaccines and antibodies binding to plasmodium sporozoites
EP3581201A1 (en) 2018-06-15 2019-12-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof
WO2021014385A1 (en) 2019-07-24 2021-01-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified human cytomegalovirus proteins
JP2023553854A (ja) 2020-12-02 2023-12-26 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ドナー鎖補完性ｆｉｍｈ
WO2022162012A2 (en) 2021-01-26 2022-08-04 Eth Zurich Antibodies broadly targeting coronaviruses and uses thereof
WO2022161598A1 (en) 2021-01-26 2022-08-04 Eth Zurich Antibodies broadly targeting coronaviruses and uses thereof
CN118510790A (zh) 2021-12-13 2024-08-16 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 噬菌体λ-疫苗系统
WO2023144665A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified human cytomegalovirus proteins

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2460290A1 (fr) * 1979-06-29 1981-01-23 Rhone Poulenc Ind Nouveaux tetra- ou pentapeptides, leur preparation et les medicaments qui les contiennent
DE4119856A1 (de) * 1991-06-17 1992-12-24 Hoechst Ag N-acyl-s-(2-hydroxyalkyl)-cysteine, deren herstellung sowie deren verwendung als zwischenprodukte zur herstellung von synthetischen immunadjuvantien und synthetischen impfstoffen
DE4123365A1 (de) 1991-07-15 1993-01-21 Sandoz Ag Acylaminopentansaeurederivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE4123366A1 (de) 1991-07-15 1993-01-21 Sandoz Ag Acylpentanoylamidoglycinderivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
JPH06206893A (ja) * 1992-09-07 1994-07-26 Suntory Ltd 新規なジサッカライド誘導体
FR2701948B1 (fr) * 1993-02-22 1996-07-26 Exsymol Sa Produit de couplage de l'histamine ou l'histamine méthyl-substituée et d'un acide aminé, procédé de préparation et applications thérapeutiques, cosmétologiques et agroalimentaires.
EP0668289A4 (en) * 1993-09-07 1998-10-21 Suntory Ltd NEW DISACCHARIDE DERIVATIVE.
ES2194666T3 (es) * 1993-09-10 2003-12-01 Petrovax Inc Portador inmunoestimulante para vacunas.
PL181241B1 (pl) * 1993-11-17 2001-06-29 Deutsche Om Arzneimittel Gmbh Disacharydy beta(1 6)glukozoaminowe, sposób wytwarzania disacharydu beta(1 6) glukozoaminowego, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i środek immunomodulujący i/lub przeciwnowotworowy oraz szczepionka
RU2141483C1 (ru) * 1997-07-04 1999-11-20 Небольсин Владимир Евгеньевич Производные пептидов или их фармацевтически приемлемые соли, способ их получения, применение и фармацевтическая композиция
GB9727123D0 (en) 1997-12-22 1998-02-25 Int Centre Genetic Eng & Bio Synthesis of diamines
CN1168702C (zh) * 1998-06-30 2004-09-29 Om药业 酰基-二肽类化合物,其制备方法以及含有前述化合物的药物组合物
WO2001046127A1 (fr) * 1999-12-22 2001-06-28 Om Pharma Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise

Also Published As

Publication number Publication date
RU2275378C2 (ru) 2006-04-27
AU1581400A (en) 2001-07-03
SK9202002A3 (en) 2003-04-01
CN101164543B (zh) 2012-03-21
TWI237022B (en) 2005-08-01
US20030203852A1 (en) 2003-10-30
SK287514B6 (sk) 2010-12-07
AU2006202085B2 (en) 2012-01-19
AU2006202085C1 (en) 2012-07-05
CN1434795A (zh) 2003-08-06
CA2395197C (fr) 2013-03-26
CN101164543A (zh) 2008-04-23
PL356405A1 (pl) 2004-06-28
JP2003518086A (ja) 2003-06-03
CA2395197A1 (fr) 2001-06-28
CZ20022194A3 (cs) 2002-11-13
JP4902924B2 (ja) 2012-03-21
HUP0204531A3 (en) 2004-12-28
US20050192232A1 (en) 2005-09-01
LV12886B (en) 2003-03-20
US7799762B2 (en) 2010-09-21
HUP0204531A2 (hu) 2003-06-28
BR0016696A (pt) 2004-06-22
EP1242365A1 (fr) 2002-09-25
AU2857201A (en) 2001-07-03
WO2001046126A1 (fr) 2001-06-28
WO2001046127A1 (fr) 2001-06-28
US20100215685A1 (en) 2010-08-26
US8173133B2 (en) 2012-05-08
AU2006202085A1 (en) 2006-06-15
RU2002119418A (ru) 2004-01-10
AR035024A1 (es) 2004-04-14
CN1434795B (zh) 2012-11-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL208584B1 (pl) Nowe pochodne N-acylo-dipeptydu o ogólnym wzorze 1, sposoby ich wytwarzania, kompozycje farmaceutyczne zawierające takie związki, enancjomery tych związków, oraz zastosowanie tych związków
KR100711561B1 (ko) 면역학적 보조제 화합물
AU761396B2 (en) Novel acyl pseudodipeptides, preparation method and pharmaceutical compositions containing same
JP2003518086A5 (pl)
WO2003011223A2 (en) Immunomodulatory compounds and methods of use thereof
US20130022628A1 (en) Acyl pseudopeptides which carry a functionalized auxiliary arm
KR100898844B1 (ko) 작용기화된 보조 아암을 가진 아실 슈도디펩티드
HK1119399A (en) Acyl pseudodipeptides which carry a functionalised auxiliary arm
AU2008202882A1 (en) Immunological adjuvant compound
HK1070372B (en) Immunological adjuvant compounds

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20131221