PL181241B1

PL181241B1 - Disacharydy beta(1 6)glukozoaminowe, sposób wytwarzania disacharydu beta(1 6) glukozoaminowego, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i środek immunomodulujący i/lub przeciwnowotworowy oraz szczepionka

Info

Publication number: PL181241B1
Application number: PL94314494A
Authority: PL
Inventors: John G. Davies; Jacques Bauer; Pierre Hirt; Adrian Schulthess
Original assignee: Deutsche Om Arzneimittel Gmbh; Om Lab Sa
Priority date: 1993-11-17
Filing date: 1994-11-17
Publication date: 2001-06-29
Also published as: PT729473E; PL314494A1; JP3967769B2; CZ141896A3; AU700485B2; EP0729473A1; SK61396A3; AU1219495A; RU2154068C2; ES2149340T3; CN1055093C; DE69425671T2; DE69425671D1; SK281944B6; CZ290331B6; ATE195740T1; BR9408071A; JPH09505071A; HUT74738A; KR100355470B1

Abstract

1 . Disachar ydy ß (1 —6) glukozoaminowe o wzorze 1 ogólnym 1, w którym. R1 oznacza grupe hydroksylowa, grupe dihydro- ksyfosfonoiloksylowa lub jej postacie naladowane, grupe (C1 -C5 )acyloksylowa, grupe (C1 -C5 )alkoksy- lowa, albo grupe o symbolu X; R2 i R2 ' niezaleznie oznaczaja grupe acylowa lub grupe o symbolu Y, z tym, ze co najmniej jeden z sym- boli R2 lub R2 ' oznacza grupe o symbolu Y; R3 i R3 ' niezaleznie oznaczaja wodór, grupe (C1 -C3 )alkilowa lub grupe (C1 -C3 )acylowa; R 4 oznacza wodór, grupe (C1 -C3 )alkilowa lub grupe (C1 -C3 )acylowa; R 4' oznacza wodór, grupe (C1 -C5 )acylowa, grupe (C1 -C5 )alkilowa lub grupe fosfonowa albo jej postacie naladowane; R6 ' oznacza wodór, grupe hydroksylowa, grupe dihydroksyfosfonoiloksylowa lub jej postacie nalado- wane albo grupe o symbolu Z; WZÓR 1 PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zatem także sposób wytwarzania disacharydu β(1-+6) glukozoaminowego o wzorze ogólnym 1, w którym:

Rj oznacza grupę hydroksylową grupę dihydroksyfosfonoiloksylową lub jej postacie naładowane, grupę (CpCsjacyloksylową grupę (CpCjjalkoksylową albo grupę o symboluX;

R₂ i R₂ niezależnie oznaczają grupę acylowąlub grupę o symbolu Y, z tym, że co najmniej jeden z symboli R₂ lub R₂' oznacza grupę o symbolu Y;

R₃ i R₃' niezależnie oznaczają wodór, grupę (C₁-C₃)alkilowąlub grupę (Cj-C₃)acylową;

R₄ oznacza wodór, grupę (C_rC₃)alkilowąlub grupę (CpC^acylową

R₄ oznacza wodór, grupę (C_rC₅)acylową grupę (C_rC₅)alkilową lub grupę fosfonową albo jej postacie naładowane;

R₆' oznacza wodór, grupę hydroksylową, grupę dihydroksyfosfonoiloksyIową lub jej postacie naładowane albo grupę o symbolu Z;

przy czym grupa o symbolu X j est wybrana z grupy obejmuj ącej grupę karboksy (C_rC₅)alkiloksylową grupę o wzorze -O-CH-KCH^COOH] [(CH^COOH], w którym m = 0-5 i n = 0-5; oraz postacie naładowane grupy o symbolu X;

grupa o symbolu Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę acyloksyacylową i grupę (CpC^jalkiloksyacylową grupa o symbolu Z jest wybrana z grupy obejmującej ketodeoksyoktonian (kwas 3-deoksy-D-manno-2-oktulozonowy, KDO), ugrupowanie o wzorze (KDO)n, w którym η = 1 do 10, polisacharydowy łańcuch boczny, składnik rdzeniowy, polegający na tym, że:

i) otrzymuje się substancję wyjściowązawierającąugrupowanie lipidu A pochodzącego z drobnoustrojów zawierających lipopolisacharyd, i ii) poddaje się wspomnianą substancję wyjściową obróbce alkalicznej zapewniającej O-deacylację ugrupowania lipidu A w pozycji 3 i w pozycji 3'.

Korzystnie stosuje się substancję wyjściową wybraną z grupy obejmującej drobnoustroje zawierające lipopolisacharyd, bakterie Gram-ujemne, frakcje tych drobnoustrojów i bakterii Gram-ujemnych zawierającą strukturę powierzchniową albo lipopolisacharyd pochodzący z tych drobnoustrojów i bakterii Gram-ujemnych, a zwłaszcza stosuje się lipid A pochodzący z bakterii Gram-ujemnych.

Korzystnie przed obróbką alkaliczną lub po niej, dokonuje się obróbki kwaśnej w celu usunięcia ugrupowania rdzeniowego i polisacharydowego łańcucha bocznego.

Usunięciu ulegającukrowe, związane z atomem tlenu grupy acylowe i/lub połączone z atomem tlenu grupy oksyacylowe.

Jeżeli jest to celowe, poddaną obróbce alkalicznej substancję wyjściową można poddać dalszej obróbce w celu usunięcia składnika polisacharydowego i rdzeniowego (co polega na potraktowaniu kwasami), oraz w celu zmiany, lub wymiany, podstawników w pozycji 1,2,3, 4,2', 3', 4'i 6'.

Jednakże, disacharydy glukozoaminowe według wynalazku można otrzymać także na drodze syntezy, wychodząc z odpowiedniego disacharydu glukozoaminowego, z wprowadzeniem przedmiotowych podstawników w pozycji 2 i/lub 2'.

Selektywnej deacylacji w pozycji 3 i wpozycji 3' dokonuje się na drodze obróbki alkalicznej. Warunki przeprowadzania tej obróbki alkalicznej dobiera się w ten sposób, aby w obu glukozoaminach nastąpiła deacylacja wpozycji 3-hydroksy. Obróbkę alkalicznąprzeprowadzić można przy użyciu wodorotlenków, węglanów i fosforanów, takich jak wodorotlenek sodowy lub węglan potasowy. Przykładowymi organicznymi środkami alkalicznymi są alkiloaminy, takie jak diety loamina i trietyłoamina. Obróbki alkalicznej dokonuje się, normalnie, w środowisku wodnym lub organicznym. Wartość pH mieści się typowo w zakresie 10-14, na przykład w zakresie 11 -13, a praktycznie wynosi, na przykład, 12,2. Obróbkę alkaliczną normalnie prowadzi się w temperaturze w zakresie od temperatury otoczenia do temperatury 70°C, wtakiej jak temperatura 37°C. Czas trwania obróbki zależy od rodzaju użytej substancji wyjściowej. W przypadku posłużenia się w tym celu drobnoustrojami, długość tego okresu waha się w granicach od 1 godziny do 10 dni, na przykład od 8 godzin do 5 dni, ale normalnie mieści się ona w zakresie 8-40 godzin. Natomiast w przypadku użycia w omawianym przeznaczeniu lipopolisacharydó w lub lipidu A, okres ten może wynosić od 0,2 do 10 godzin, na przykład od 1 do 5 godzin. W praktyce, wynosi on od około 1,5 godziny do około 3 godzin.

181 241

W przypadku, gdy substancja wyjściowa zawiera w pozycji 6' składnik rdzeniowy, którego należy się pozbyć, substancję tę poddaje się obróbce kwaśnej, w zamiarze jego usunięcia. Taką obróbkę kwaśną można przeprowadzić albo przed powyżej wspomnianą obróbką alkaliczną, albo po jej wykonaniu. Obróbki kwaśnej dokonuje się przy pH 1-5, korzystnie przy pH w zakresie od 2,5 - 4,5, normalnie przy pH powyżej 3 i poniżej 4,5, na przykład przy pH 3,5. Przy pH 1, lub niższym, dochodzi do odfosforylowania disacharydu glukozoaminowego, w wyniku czego otrzymuje się związek monofosforylowany. Do kwasów, których użyć można w tym przypadku należą kwasy mineralne i organiczne, takie jak kwas chlorowodorowy i kwas octowy lodowaty. Czas obróbki kwaśnej wynosi od około 30 minut do około 5 godzin, na przykład od 1 do 2 godzin Podczas obróbki kwaśnej temperatura podnosi się do około 70-100°C, na przykład do 80 -100°C, w praktyce 95°. Następnie temperatura obniża się do temperatury otoczenia.

Disacharydy glukozoaminowe według wynalazku można także otrzymywać stosując jako związek wyjściowy odpowiedni dimer od-, mono- lub difosfororylowanej glukozoaminy, z przyłączeniem grupy acyloksyacylowej, grupy acyloaminoacylowej i/lub grupy acylotioacylowej, tak do pozycji 2 jak do pozycji 2'.

Po dokonaniu częściowego odacylowania tych disacharydów glukozoaminowych według wynalazku i rozdzieleniu utworzonych produktów, otrzymuje się disacharydy glukozoaminowe zawierające w pozycji 2 i w pozycji 2' grupy acylowe o łańcuchach rozgałęzionych.

Disacharydy glukozoaminowe według wynalazku można stosować w postaci kompozycji farmaceutycznej lub leku i używać jako środków immunomodulujących, w celu hamowania, stymulowania lub wywoływania toleryzacji wytwarzania reaktywnych azotowych związków pośrednich, takich j ak tlenek azotu (NO) i cytokin reaguj ących, z uwzględnieniem częstotliwości stosowania i dawkowania, jako środków przeciwnowotworowych, na przykład służących reaktywacji komórek T, a składzie szczepionek, jako konkurentów dla miejsc wiążących endotoksyny oraz jako modulatorów interleukin. Dzięki nadzwyczaj małej endotoksyczności, disacharydy te nie wywierajążadnego, albo zasadniczo żadnego, działania ubocznego.

Dzięki nadzwyczaj niskiemu poziomowi endotoksyczności w połączeniu z ujawnionąpowyżej aktywnością biologiczną, omawiane disacharydy według wynalazku tworzą składnik czynny kompozycji farmaceutycznej.

Takiej kompozycji farmaceutycznej, oraz disacharydów jako takich, można używać jako środków immunomodulujących, środków przeciwnowotworowych i jako składników szczepionek.

Przedmiotem wynalazku jest zatem także kompozycja farmaceutyczna i środek immunomodulujący i/lub przeciwnowotworowy, zawierająca substancję czynną i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik, charakteryzuje się tym, że jako składnik czynny zawiera disacharyd β(1—>6) glukozoaminowy o wzorze ogólnym 1, w którym:

R! oznacza grupę hydroksylową, grupę dihydroksyfosfonoiloksylową lub jej postacie naładowane, grupę (C₁-C₅)acyloksylową, grupę (C_rC₅)alkoksylową, albo grupę o symboluX;

R₂ i R₂' niezależnie oznaczają grupę acy Iową lub grupę o symbolu Y, z tym, że co najmniej jeden z symboli R₂ lub R₂ oznacza grupę o symbolu Y;

R₃ i R₃' niezależnie oznaczają wodór, grupę (Cj-C₃)alkilowąlub grupę (Cj-C₃)acylową;

R₄ oznacza wodór, grupę (C_rC₃)alkilowąlub grupę (C_rC₃)acyIową;

R₄' oznacza wodór, grupę (Ć_rC₅)acylową, grupę (Cj-Cjjalkilową lub grupę fosfonową albo jej postacie naładowane;

R₆' oznacza wodór, grupę hydroksylową, grupę dihydroksyfosfonoiloksylową lub jej postacie naładowane albo grupę o symbolu Z;

przy czym grupa o symbolu X jest wybrana z grupy obejmującej grupę karboksy(C₁-C₅)alkiloksylową, grupę o wzorze -O-CH-[(CH^_mCOOH] [(CH^nCOOH], w którym m=0-5 i n=0-5; oraz postacie naładowane grupy o symbolu X;

grupa o symbolu Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę acyloksyacylową i grupę (C_rC₂₄)alkiloksyacylową;

181 241 grupa o symbolu Z jest wybrana z grupy obejmującej ketodeoksyoktonian (kwas 3 -deoksy-D-manno-2-oktulozonowy, KDO), ugrupowanie o wzorze (KDO)n, w którym η = 1 do 10, polisacharydowy łańcuch boczny, składnik rdzeniowy.

Przedmiotem wynalazku jest zatem także szczepionka, zawierająca substancję czynną i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik i substancje pomocnicze, charakteryzująca się tym, że jako składnik czynny zawiera disacharyd β(1 —>6) glukozoaminowy o wzorze ogólnym 1, w którym:

Rj oznacza grupę hydroksylową, grupę dihydroksyfosfonoiloksylową lub jej postacie naładowane, grupę (C_rC₅)acyloksylową, grupę (C_rC₅)alkoksylową, albo grupę o symboluX;

R₂ i R₂' niezależnie oznaczają grupę acylowąlub grupę o symbolu Y, z tym, że co najmniej jeden z symboli R₂ lub R₂ oznacza grupę o symbolu Y;

R₃ i R₃' niezależnie oznaczają wodór, grupę (C_rC₃)alkilowąlub grupę (C₁-C₃)acylową;

R₄ oznacza wodór, grupę (Cj-C₃)alkilowąlub grupę (Ci-C₃)acylową;

R₄' oznacza wodór, grupę (C₁-C₅)acylową, grupę (C]-C₅)alkilową lub grupę fosfonową albo jej postacie naładowane;

R/ oznacza wodór, grupę hydroksylową, grupę dihydroksyfosfonoiloksylową łub jej postacie naładowane albo grupę o symbolu Z;

przy czym grupa o symboluXjest wybrana z grupy obejmującej grupę karboksyfCj-C₅)alkiloksylową, grupę o wzorze -O-CH-[(CH₂)_mCOOH] [(CH2)_nCOOH], w którym m=0-5 i n=0-5; oraz postacie naładowane grupy o symbolu X;

grupa o symbolu Z jest wybrana z grupy obejmującej ketodeoksyoktonian (kwas 3-deoksy-D-manno-2-oktulozonowy, KDO), ugrupowanie o wzorze (KDO)n, w którym η = 1 do 10, polisacharydowy łańcuch boczny, składnik rdzeniowy.

Disacharydy według niniejszego wynalazku można podawać układowo lub miejscowo, stosując wstrzyknięcia dożylne, podskórne, dootrzewnowe, domięśniowe itp. Wielkość dawkowania będzie się zmieniać w zależności od rodzaju zwierzęcia i stanu zdrowia człowieka poddawanego leczeniu, jego wieku, masy ciała, objawów leczonej choroby, pożądanych efektów terapeutycznych, drogi podawania, czasu leczenia itp. Zadowalające wyniki uzyskuje się przy poziome dawkowania wynoszącym od 0,001 do 500 mg/kg masy ciała, przy podawaniu w jednej, lub większej ilości dawek dziennie, lub przy stosowaniu postaci o przedłużonym uwalnianiu leku.

Kompozycja farmaceutyczna może zawierać farmaceutycznie dozwolony nośnik lub rozcieńczalnik, na przykład w przypadku postaci przeznaczonej do podawania w inny sposób niż drogą doustną, stanowiąc roztwór wodny lub niewodny, zawiesinę lub emulsję. Tego rodzaju wodne roztwory lub zawiesiny mogą zawierać wodę destylowaną lub fizjologiczny roztwór soli. Roztwory nie wodne mogą zawierać glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne, takie jak oliwa, oraz alkohole. Kompozycja może zawierać inne dodatki, takie jak środki konserwujące, środki zwilżające, emulgatory, środki dyspergujące itp.

Dla pełniejszego zrozumienia niniejszego wynalazku można odnieść się do następujących przykładów, zamieszczonych jedynie w celu jego objaśnienia i bez zamiaru ograniczenia zakresu niniejszego wynalazku w jakikolwiek sposób.

Przykład 1

Przeprowadzono hodowlę Escherichia coli 1-1147 (szczep zdeponowany w CNCM w dniu 3 października pod numerem I-1147) w podłożu hodowlanym, którego skład uj awniony jest w tabeli 1.

181 241

Tabela 1

Skład podłoża hodowlanego (roztwór wodny) dla E. coli 1-1147

Substancja	Hość/litr
Inozyna	0,200 g
Monohydrat kwasu cytrynowego	0,300 g
Kwas glutaminowy	1,300 g
Chlorek amonowy	1,050 g
Siarczan magnezowy · 7 H₂O	ι,πο g
Fosforan diwodoropotasowy (KH₂PO₄)	1,360 g
Arginina	0,300 g
Uracyl	0,100 g
Chlorek wapniowy	0,017 g
Chlorek sodowy	2,000 g
Oligometale (roztwór podstawowy x 1000)	1 ml
L-Leucyna	10,0 g
L-lizyna · HC1	10,0 g
L-Seryna	10,0 g
L-Metionina	10,0 g
L-Walina	10,0 g
L-Alanina	10,0 g
L-Asparagina	10,0 g
Glukoza (roztwór podstawowy 500 g/litr)	5 ml

Roztwór podstawowy oligometali: 2,5 g FeCl₂ · 4 H₂0,0,25 g CoCl₂ · 6 H₂O, 0,25 g NaΜοΟ₄·7 H₂0,0,25 g MnSO₄ -4 H₂0,0,25 g ZnSO₄ -7 H₂0,0,25 g NiSO₄ -7 H₂0,0,05 g H₃BO₄, 0,05 g CuSO₄. Dodaje się 1,0 litra H₂O, miesza i dodaje 1,1 ml 85% H₂SO₄.

Doprowadzono pH podłoża hodowlanego do pożądanej wartości przy użyciu 5 N NaOH, 5% amoniaku łub 25% HC1. W warunkach napowietrzania i mieszania (500 obr/min) hodowlę Escherichia coli 1-1147 prowadzono w temperaturze 37°C, przy pH 6,9.

Następnie zawartość fermentora zinaktywowano przez poddanie jej obróbce cieplnej (105°C, w ciągu 2 minut).

Zinaktywowaną zawartość fermentora poddano ultrafiltracji (odcięcie 1000 kD) i zatrzymane bakterie przemyto 0,6 % wodnym roztworem NaCl. Przemytą zawiesinę bakteryjną zatężono metodą ultrafiltracji. Otrzymano 764 g (w przeliczeniu na suchą wagę) biomasy.

Biomasę tę rozcieńczono do gęstości 7,0 g/litr i poddano obróbce alkalicznej, polegającej na dodaniu 345 ml 10,77 N NaOH i inkubowaniu całości w temperaturze 37°C w ciągu 40 godzin (pH 12,2).

Ekstrakt alkaliczny poddano pierwszej ultrafiltracji (odcięcie 1000 kD), a następnie produkt, który przeniknął, drugiej ultrafiltracji (odcięcie 10 kD). Produkt zatrzymany po tej drugiej ultrafiltracji poddano obróbce kwaśnej.

Produkt zatrzymany rozcieńczono 7,01 wody i zakwaszono przy użyciu 370 ml kwasu octowego lodowatego (końcowa wartość pH 3,52). Następnie otrzymanąmieszaninę, przy mieszaniu ogrzewano w temperaturze 95°C w ciągu 120 minut, po czym utworzoną zawiesiną o odczynie kwaśnym ochłodzono do temperatury 25°C. Wytrącony osad wydzielono za pomacą wirowania (4000 x g, w ciągu 50 minut). Osad zawieszono w 3,7 litra wody i poddano ekstrakcji przy użyciu

181 241

4,3 litra 2-propanolu i po upływie 60 minut w temperaturze 25°C dodano 252 ml trietyloaminy (pH 9,0), po czym mieszanie kontynuowano w ciągu 24 godzin.

Supematant oddzielono za pomocą odwirowania (4000 x g, 25°C, w ciągu 50 minut), a osad poddano dwukrotnie powtórnej ekstrakcji przy użyciu 90% 2-propanolu. Supematanty połączono ze sobąi poddano chromatografii z odwróconymi fazami (Waters nr 10001, Preparative C₁₈, 125 A).

Alternatywnie, ekstrakt po obróbce kwaśnej poddano ultrafiltracji i produkt zatrzymany (>1000 kD) zatężono, po czym poddano dializie wobec 5 obj ętości wody. Produkt poddany dializie rozcieńczono 9 objętościami 2-propanolu i doprowadzono do pH 9 przy użyciu trietyloaminy (TEA). Ekstrakcję prowadzono, przy mieszaniu, w ciągu 2 godzin. Supematant oddzielono sposobem powyżej opisanym, a osad poddano ponownej ekstrakcji 2-propanolem. Supematanty połączono ze sobąi zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem (40°C, 16 hPa), a w końcu poddano chromatografii z odwróconymi fazami na kolumnie C_ł8 Prep Sep Pak (Waters nr 10001).

Każdy z dwóch supematantów rozcieńczono dwoma objętościami wody i zmieszano z 5 mM fosforanem tetrabutyloamoniowym (TBAP), po czym wprowadzono na kolumnę 50g C₁₈ Prep Sep Pak do chromatografii z odwróconymi fazami (Waters nr 10001, Preparative C, ₈,125 A), wstępnie kondycjonowaną250 ml układu CH₃CN : H₂O 1 :1 (obj/obj) + 5 mM TBAP. Kolumnę przemyto układem 60% CH₃CN: H₂01:1 (obj/obj) + 5 mM TBAP i układem 40% 2-propanol: H₂O 9 :1 (obj/obj) + 5 mM TBAP. Elucja disacharydów według wynalazku następowała we frakcji 30% CH₃CN: H₂01:1 (obj/obj) + 5 mM TBAP oraz 70% 2-propanol: H₂O 9:1 (obj/obj) + 5 mM TBAP).

Frakcję zawierającą disacharyd otrzymaną w wyniku chromatografii z odwróconymi fazami rozcieńczono wodą w stosunku 1:1 (obj/obj)+25 mMTBAP i wprowadzono na kolumnę do preparatywnej HPLC (Millipore-Waters Bondapak C18 300 A15 M, 300 mm x 47 mm φ). Elucja disacharydu według wynalazku następowała we frakcji 67% 2-propanoł: H₂O 9 : 1 (obj/obj) + 25 mM TBAP) oraz 33% CH₃CN: H₂O 1:1 (obj/obj) + 25 mM TBAP. Frakcja ta zawierała 55 mg disacharydu A według wynalazku.

Odsalanie disacharydu

Sól usunięto z porcji frakcji zawierającej disacharyd A w sposób następujący. Kolumnę Sep Pak Vac C₁₈ Plus (krzemionka C₁₈,0,6 ml), Waters nr 20515) poddano kondycjonowaniu za pomocą wstrzyknięcia, kolejno, 5 ml układu CHC1₃-CH₃OH 2 :1 (obj/obj), 5 ml CH₃CN i 5 ml układu CH₃CN : H₂O 1 : 1 (obj/obj). Próbkę wprowadzono na kolumnę po rozcieńczeniu frakcj i HPLC przy użyciu 3 obj ętości H₂O, w wyniku czego otrzymano łącznie 6 ml rozcieńczonej próbki. Następnie usunięto TBAP przy użyciu 10 ml układu CH₃CN: H₂O (obj/obj) +10 mM HC1, a potem 10 ml CH₃CN. Następnie wyodrębniono czysty disacharyd A przy użyciu 5 ml układu CHC1₃-CH₃OH 2 : 1 (obj/obj).

Frakcję wysuszono za pomocą odparowania pod zmniejszonym ciśnieniem (16 hPa) w temperaturze 3 5°C. Odsolony disacharyd A rozpuszczono w układzie H₂O: TEA 1000:1 (obj/obj) przeznaczając go do wykorzystania w testach biologicznych i biochemicznych, lub w układzie chloroform: metanol 2:1 (obj/obj), z przeznaczeniem do wykorzystania w oznaczeniu FAB-MS.

Otrzymywanie disacharydu w postaci soli sodowe]

Kolumnę 10 g C₁₈ Prep Sep Pak do chromatografii z odwróconymi fazami (Waters nr 10001, Preparative C₁₈, 125 A) poddano wstępnemu kondycjonowaniu przy użyciu, kolejno, 50 ml CH₃CN i 50 ml układu CH₃CN : H₂O 1 :1 (obj/obj).

Próbkę (frakcję HPLC) wprowadzono do kolumny po rozcieńczeniu 1 objętościąH₂O. Po zajściu adsorbcji kolumnę przemyto 100 ml układu CH₃CN: H₂O 1:1 (obj/obj) + 5 mM TBAP. Następnie usunięto disacharyd przy użyciu 50 ml układu 2-propanol: H₂O 9:1 (obj/obj)+5 mM TBAP.

Otrzymaną w wyniku tego frakcję poddano oczyszczaniu sposobem następującym. Kolumnę 20 ml Q-Sepharose fast flow (Pharmacia 17-0510-01) poddano kondycjonowaniuprzy użyciu, kolejno, 30 ml 1 MNaOH z następującym po tym przemyciem H₂O w celu zobojętnienia, a w dalszym ciągu 30 ml 1 M HC1, z następującym po tym przemyciu H₂O w celu zobojętnienia.

181 241

Próbkę wprowadzono bezpośrednio na kolumnę i po przeprowadzeniu adsorpcji usunięto substancje nie zaadsorbowane przy użyciu 200 ml H₂O i 100 ml układu 2-propanol: H₂O 9 :1 (obj/obj). Disacharyd wyeluowano przy użyciu 100 ml układu 0,9% (NaCl: izopropanol 1 : 1 (obj/obj)).

Końcowe oczyszczanie przeprowadzono w sposób następujący. Kolumnę 10 g C₁₈ Prep Sep Pak do chromatografii z odwróconymi fazami poddano wstępnemu kondycjonowaniu przy użyciu, kolejno, 50 ml CH₃CN, 50 ml układu CHC1₃: CH₃OH 2:1 (obj/obj), 50 ml CH₃CN i 50mlukładu50%CH₃CN :H₂O1:1 (obj/obj). Próbkę wprowadzono na kolumnę po rozcieńczeniu 1 objętością H₂O. Po przeprowadzeniu adsorpcji, kolumnę przemyto kolejno 200 ml H₂O, 200 ml układu 2-propanol: H₂O 9 : 1 (obj/obj) i 50 ml CH₃CN. Disacharyd eluowano 50 ml układu CHC1₃: CH₃OH 2 :1 (obj/obj). Odebraną frakcję wysuszono za pomocą odparowania pod zmniejszonym ciśnieniem (16 hPa),w temperaturze 35°C.

Sól sodowa była dobrze rozpuszczalna w wodzie (aż do 100 mg/ml).

Przykład 2

Przeprowadzono hodowlę Haemophilus influenzae [szczep nabyty w National Collection of Type Cultures (ATCC 9795)] w podłożu hodowlanym, którego skład ujawnionyjestwtabeli 2.

Tabela 2

Skład kompozycji zasadniczego podłoża hodowlanego dla Haemophilus influenzae

Substancja	Ilość/litr
Chlorek sodowy	2g
Monowodorofosforan sodowy	2g
Octan sodowy	0,5 g
Tiamina	0,003 g
Kwas nikotynowy	0,003 g
70% roztwór mleczanu sodowego	2 ml
60% roztwór mleczanu amonowego	2 ml
Ekstrakt mięsny	7,5 g
Pepton	15 g
Pepton sojowy	lg
Trypton	3g
Ekstrakt drozdżowy	7,5 g
Glukoza	3g

Podłoże hodowlane uzupełniono heminą, użytą w ilości 10 mg/litr i N ADH, użytym w ilości 4 mg/litr. pH doprowadzono do 7,0 ± 0,3 przy użyciu 5 N NaOH lub 25% HC1. Po rozpoczęciu fazy stacjonarnej hodowlę przerwano i zawartość fermentora zinaktywowano przez poddanie jej obróbce cieplnej (100^óC ciągu 100 sekund). Zinaktywowanąhodowlę poddano wirowaniu i wydzieloną biomasę rozcieńczono 0,6% wodnym roztworem NaCl (w przybliżeniu 60 g/litr). Obróbkę alkaliczną przeprowadzono za pomocą dodania 10 N NaOH do końcowego stężenia NaOH wynoszącego 0,2 N. Obróbkę tę prowadzono, przy mieszaniu, w temperaturze 37°C, w ciągu 5 dni.

Poddany obróbce alkalicznej lizat poddano bezpośrednio obróbce kwaśnej po zakwaszeniu do pH 3,5 przy użyciu kwasu octowego lodowatego. Mieszaninę ogrzewano do temperatury 95°C w ciągu 120 minut, a następnie ochłodzono do temperatury pokojowej.

Utworzony osad odwirowano (10000 x g, 30 minut, w temperaturze 4°C) i supematant odrzucono.

181 241

Osad zawieszono w układzie CH₃CN : H₂O 1:1 (obj/obj), po czympH doprowadzono do 9 przy użyciu TE A. Po odwirowaniu (15000 x g, 10 minut), supematant doprowadzono do stężenia 5 mM TBAP. Supematant wprowadzono do kolumny Sep Pak Vak C₁₈ (10 g krzemionki C₁₈, 35 ml, Waters nr 43345) poddanej kondycjonowaniu przy użyciu 50 ml CH₃CN : H₂O 1 : 1 (obj/obj). Frakcję zawierającą disacharyd B według wynalazku eluowano 50 ml układu 2-propanol : H₂O 9 : 1 (obj/obj) + 5 mM TBAP.

Frakcję tę zatężono za pomocą odparowania (temperatura 35°C, 16 hPa) do objętości około 2 ml. Frakcje poddano wirowaniu (15000 x g, 5 minut) i supematant wprowadzono na kolumnę C₁₈ do półpreparatywnej HPLC (Macherey-Nagel nr 715806, 250 mm x 10 mm φ, Nucleosil 300-7C18). Frakcja zawierająca disacharyd B według wynalazku eluowała się we frakcji 28% CH₃CN: H₂O 1:1 (obj/obj) + 25 mM TBAP oraz 72% 2-propanol: H₂O 9:1 (obj/obj) + 25 mM TBAP.

Disacharyd o wzorze B odsolono sposobem podobnym do sposobu użytego w przykładzie 1.

Przykład 3

Lipopolisacharyd z Escherichia coli 0111: B4 (Sigma, nr wyrobu L3024) poddano obróbce alkalicznej w 0,2 M NaOH, w temperaturze 37°C, w ciągu 1,5 godziny.

Utworzony roztwór zobojętniono przy użyciu 1 M kwasu fosforowego.

400 μΐ roztworu podanego obróbce alkalicznej LPS zatężono za pomocą ultrafiltracji (Millipore Ultrafree-MC, UFC3 LGC 00, odcięcie 10 kD).

Produkt zatrzymany (> 10 kD) rozcieńczono w 400 pi H₂O i poddano obróbce kwaśnej polegającej na dodaniu kwasu octowego lodowatego do osiągnięcia stężonego kwasu octowego wynoszącego 0,2 M, a następnie ogrzewaniu zakwaszonego tak roztworu w temperaturze 95°C w ciągu 120 minut. Po ochłodzeniu do temperatury 25°C, utworzony osad osadzono za pomocą wirowania (15000 x g, 10 minut) i supematant odrzucono. Następnie osad rozpuszczono w 20 μΐ układu H₂O TE A 1000 :1 (obj/obj) i otrzymany tak roztwór wprowadzono na kolumnę C₁₈ do analitycznej E1PLC (Supelco nr 58985, Supelcosil LC-18,3 pm, 150 mm x 4,6 mm φ). Elucja frakcja disacharydu według wynalazku następowała we frakcji 42% CH₃CN : H₂O 1 :1 (obj/obj) + 5 mM TBAP oraz 58% 2-propanol: H₂O 9 :1 (obj/obj) + 5 mM TBAP.

Przykład 4

Sporządzono roztwór lipidu A z Escherichia coli F-583 (Sigma, nr wyrobu L5399) w układzie H₂O :TEA 1000:1 (obj/obj), o stężeniu2 mg/ml, po czym roztwór ten poddano obróbce alkalicznej przy użyciu 0,2 MNaOH, wtemperaturze 37°C, wciągu 2,5 godziny. Otrzymany roztwór zobojętniono przy użyciu 1 M kwasu fosforowego. Zobojętniony roztwór wprowadzono na kolumnę do analitycznej HPLC (Supelco nr 58958, Supelcosil LC-18,3 pm, 150 mm x 4,6 mm φ). Elucja disacharydu według wynalazku dokonywała się we frakcji 42% CH₂CN : H₂O 1 : 1 (obj/obj) + 5 mM TBAP oraz 58% 2-propanol: H₂O 9 : 1 (obj/obj) + 5 mM TBAP.

Przykład 5

Do diwodorofosforanu 2-amino-2-deoksy-6-O-(2-amino-2-deoksy-4-O-fosfono-p-D-glukopiranozylo)-a-D-glukopiranozylu [Horst i in., Eur. J. Biochem., 214,695 - 701 (1993)] dodaje się, w środowisku metanolu, dokładnie 4,0 równoważnika molowego metanolami sodowego, a następnie 2,2 równoważnika molowego bezwodnika kwasu (R)-3-dodekanoiloksytetradekanowego [otrzymanego na drodze reakcji kwasu (R)-3-dodekanoiloksytetradekanowego z 0,5 równoważnika molowego DDC w środowisku bezwodnego dichlorometanu; patrz: Charon i in., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1.2291 - 2295 (1984)]. Po upływie 12 godzin w temperaturze pokojowej dodaje się 2 objętości (w stosunku do objętości metanolu) wody i otrzymaną mieszaninę poddaje ekstrakcji eterem dietylowym (w celu usunięcia kwasu 3-dodekanoiloksytetradekanowego. Fazę wodnązatęża się i surowy disacharyd C według wynalazku poddaje się HPLC z odwróconymi fazami. Otrzymany produkt rozpuszcza się w układzie H₂O: TEA1000:1 (obj/obj), po czym dodaje się fosforan tetrabutyloamoniowy (TBAP) do końcowego stężenia 5 mM. Następnie, otrzymany roztwór wprowadza się na kolumnę do preparatywnej HPLC (Millipore-Waters Bondapak C18 300 A15 M, 300 mm x 47 mm φ). Disacharyd o wzorze C eluuje się gradientem złożonym z układów: CH₃CN: H₂01:1 (obj/obj)+25 mM TBAP (rozpuszczalnik A) i 2-propanol: H₂0 9:1 (obj/obj) + 25 mM TBAP (rozpuszczalnik B) [50% A: 50% B do 0% A: 100% B, przy 1%/min, przepływ 80 ml/min]. Odsolenie uzyskuje się w sposób następujący. Frakcję HPLC zawieraj ącą disacharyd o wzorze C rozcieńcza się wodą, a następnie wprowadza na kolumnę C₁₈-Sep Pak Vac Plus (Waters) [żel krzemionkowy C_ł8 do chromatografii z odwróconymi fazami, wstępnie kondycjonowany kolejno układem CHC1₃ : CH₃OH 2 :1 (obj/obj), CH₃CN, CH₃CN : H₂O 1 : 1 (obj/obj)]. TBAP usuwa się za pomocą przemycia kolejno układem CH₃CN : H₂O 1 : 1 (obj/obj), 10 mM HC1 i CH₃CN. Czysty disacharyd eluuje się układem CHC1₃: CH₃OH 2 : 1 (obj/obj).

Przykład 6

Do fazy wodnej zawierającej disacharyd o wzorze C otrzymanej w przykładzie 5 (przed oczyszczeniem) dodaj e się dokładnie 1 równoważnik molowy wodorotlenku sodowego w postaci roztworu wodnego; stężenie zapewniające początkową wartość pH 12,5). Po upływie 24 godzin pH mieszaniny doprowadza się do wartości w zakresie 6,5 - 7 i wprowadzana kolumnę do preparatywnej HPLC (Millipore-Waters Bondapack C18 300 A, 15 M, 300 mm x 47 mm φ). Disacharydy o wzorach A i D eluuje się gradientem złożonym z układów: CH₃CN : H₂O 1 : 1 (obj/obj) + 25 mM TBAP (rozpuszczalnik A) i 2-propanol: H₂O 9 :1 (obj/obj) + 25 mM TBAP (rozpuszczalnik B) [75% A: 25% B do 0% A: 100% B, przy 1% min, przepływ 80 ml/min). Frakcje HPLC zawierające disacharydy o wzorach A i D odsala się sposobem opisanym odnośnie do disacharydu o wzorze C w przykładzie 5.

Przykład porównawczy (nie według wynalazku).

Sporządzono roztwór lipidu A z Escherichia coli F-583 (Sigma, nr wyrobu L5399) w układzie H₂O : trietyloamina 1000 :1 (obj/obj), o stężeniu 10 mg/ml i poddano go następnie obróbce alkalicznej przy użyciu 0,2 M NaOH, w temperaturze 37°C, w ciągu 20 minut. Czas ten okazał się wystarczający do 3-0-deacetylacji lipidu A [Myers i in., Cellular and Molecular Aspects of Endotoxin Reactions, str. 145 -156 (1990), Elsevier Science Publishers].

Roztwór zobojętniano kwasem ortofosforowym. Do badań biologicznych kierowano go po rozcieńczeniu układem 0,1% TEA/0,9% NaCl i stosowano z pominięciem dalszego oczyszczania.

W przypadku próbki przeznaczonej do oznaczania FAB-MS, lipid A otrzymany w wyniku obróbki alkalicznej poddawano oczyszczaniu metodą HPLC z odwróconymi fazami (Supelco nr 58985, SupelcosilLC18,3 μχη, 15 mm x 4,6 mm φ). Główny pik, eluujący się w układzie 18% CH₃CN: H₂01:1 (obj/obj)+5 mM TBAP i w układzie 82% 2-propanol: H₂O 9:1 (obj/obj)+5 mM TBAP odsolono w warunkach opisanych w przykładzie 1. Analiza FAB-MS: jon cząsteczkowy o 1570,1 jednostki masy (obliczono : 1569,1 jednostki masy).

Fizykochemiczne właściwości disacharydów według wynalazku

Zbadano właściwości fizykochemiczne disacharydów o wzorach A i B, wytworzonych w przykładach 1 i 2.

Oznaczenia glukozoaminy dokonywano po hydrolizie kwasowej (4 M HC1, 16 godzin, 100°C, atmosfera argonu) i przeprowadzeniu w pochodną przy użyciu izotiocyjanianu fenylu, z następującą po tym analizą ilościową wykonaną metodą HPLC [patrz : K.R. Anumula i in., Analytical Biochemistry, tom 179, str. 113 - 122 (1991)].

Kwasy tłuszczowe ogólne oznaczano po przeprowadzeniu hydrolizy kwasowej (4 M HC1, 4 godziny, 100°C) za pomocąmetylowania z udziałem BF₃ w obecności metanolu, z ilościowym oznaczeniem metodą chromatografii gazowej (kolumna OV-1, Hewlett Packard) (patrz: L. Miller, Gas-Liquid Chromatography of Cellular Fatty Acids as a Bacterial Indetification Aid, Gas Chromatography Application Notę, str. 228 - 237 (1984).

Kwasy tłuszczowe zawiązane estrowo oznaczano metodą chromatografii gazowej po obróbce z udziałemNaOCH₃ (patrz: E.T. Rietschel i in., European Journal of Biochemistry, tom 28, str. 166 -172 (1972)].

Fosforan oznaczano według metody Amesa [patrz: B.N. Ames, Methods in Enzymology, tom. 8, str. 115 - 118 (1966)].

Kwas 3-deoksy-D-manno-2-oktuIozonowy (KDO) oznaczano z zastosowaniem metody podanej przez Y.D. Karkhanisa i in. [Analytical Biochemistry, tom 58, str. 595 - 601 (1978)].

Roztwór disacharydu o wzorze A zawierał 2,1 pmola/ml fosforanu, 1,9 pmola/ml glukozoaminy, 1,0 pmola/ml C_]20/ml kwasu tłuszczowego i 2,2 pmola/ml 3OH-C_{14 0} kwasu tłuszczowego. Po uwolnieniu reszt związanych estrowo kwasów tłuszczowych wykryto jedynie C₁₂₀ kwas tłuszczowy, co pokazuje, że reszty 3OH-C₁₄₀ kwasu tłuszczowego były związane wiązaniami amidowymi. KDO nie wykryto (< 1 mola/10 moli disacharydu A).

Zgodnie z tym, disacharyd zawiera (na 1 mol) 2 mole fosforanu, 2 mole glukozoaminy, 2 mole 3OH-C₁₄₀ kwasu tłuszczowego i 1 mol C₁₂.₀ kwasu tłuszczowego.

Spektrometria mas z bombardowaniem szybkimi atomami (FAB-MS), ujemna wartość modalna próbki w układzie CHC1₃: CH₃OH1:1 (obj/obj), stężenie 1 mg/ml. Do tworzenia widma używano zestawu spektrometru VG ZAB-2SE (Yac^ = 8 kV) przy 30 kV i prądzie emisyjnym 1 pA. Spektrometr wzorcowano przy użyciu jodku cezu. Widmo FAB-MS pokazano na fig. 1. Disacharyd o wzorze A wykazuje pik cząsteczkowy przy 1133,55 jednostki masy (masa obliczona 1133,3). Obecność innych pików sugeruje fragmentację produktu zachodzącą w trakcie przeprowadzania analizy. Występowanie piku 1053,5 wskazuje na utratę grupy fosforanowej, a piku 951,3 na utratę C₁₂ kwasu tłuszczowego.

Widmo FAB-MS disacharydu B przedstawiono na fig. 2 i pokazuje ono pik cząsteczkowy przy 1161,8 jednostki masy (obliczono 1161,3). Pik przy 1183,8 jednostki masy oznacza dodanie sodu. Pik 951,6 wskazuje na utratę C₁₄ kwasu tłuszczowego. Pik przy 973,6 jednostki masy reprezentuje fragment piku 951,6 z jonem sodu.

Widmo 'H-NMR (Bruker 360 MHz) disacharydu o wzorze A (sól sodowa w D₂O) pokazano na fig. 3, a jego widmo ^l3C-NMR (Bruker 90 MHz) na fig. 4 i 5 (w rozszerzonej skali).

Wzory strukturalne następujących disacharydów P-D-glukozoamino-(l-6)-a-D-glukozoaminowych:

* disacharyd o wzorze A : diwodorofosforan 2-deoksy-6-O-[2-deoksy-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-O-fosfono-p-D-glukopiranozylo]-2-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-a-D-glukopiranozylu;

* disacharyd o wzorze B : diwodorofosforan 2-deoksy-6-O-[2-deoksy-2-[(R)-3-tetradekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-0-fosfono-P-D-glukopiranozylo]-2-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-a-D-glukopiranozylu;

* disacharyd o wzorze C : diwodorofosforan 2-deoksy-6-O-[2-deoksy-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-4-O-fosfono-p-D-glukopiranozylo]-2-[(R)-3-dodekanoiloksytetradekanoiloamino]-a-D-glukopiranozylu;

* disacharyd o wzorze D : diwodorofosforan 2-deoksy-6-O-[2-deoksy-2-[(R)-3-hydroksytetradekanoiloamino]-4-0-fosfono-|3-D-glukopiranozylo]-2-[(R)-3-dodekanoiłoksytetradekanoiloamino]-a-D-glukopiranozylu, przedstawiono na rysunku.

Endotoksyczność i aktywność biologiczna disacharydów według wynalazku

Oznaczono endotoksyczność i aktywność biologicznądisacharydu o wzorze A (przykład 1) i disacharydu o wzorze B (przykład 2) i dokonano porównania z analogicznymi właściwościami lipopolisacharydu pochodzącego z Escherichia coli 0111 :B₄ (Sigma, nr wyrobu L3024), lipidu A (Sigma, nr wyrobu L5399, stosowany jako substancja wyjściowa w przykładzie 4) i 3-O-deacylowanego lipidu A, wywodzącego się z lipidu A z Escherichia coli F583 (otrzymanego tak, jak to opisano w przykładzie porównawczym), ale z pominięciem oczyszczenia metodą HPLC.

1. Endotoksyczność.

Endotoksyczność oznaczano w teście z lizatem amebocytów skrzypłocza (LAL). Test ten oparty jest na obserwacji, że endotoksyny wywohijąkoagulację hemolimfy Limulus poliphemus.

W teście żelatynowania, kolejne rozcieńczenia związku poddawanego badaniu mieszano z LAL w stosunku 1:1 (obj/obj) [Haemachemlnc., czułość LAL 0,06 jednostki endotoksyny/ml), po czym otrzymaną mieszaninę inkubowano w ciągu godziny w temperaturze 37°C. Następnie śledzono i kontrolowano tworzenie się żelu przez pomiar gęstości optycznej przy 405 nm. Ostatnie rozcieńczenie, które wywoływało tworzenie się żelu ustalono przez odwrócenie mikropłytki

181 241 reakcyjnej. Aktywność endotoksyny w próbkach określono przez porównanie z rozcieńczeniami wzorca lipopolisacharydu (1 jednostka endotoksyny = 0,1 ng LPS).

Endotoksyczność oznaczano także w teście chromogennym, w którym mierzono aktywację proteazy w LAL przez LPS, przy użyciu chromogenu (Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA; Bio Whittaker Kit nr 50-650U). Powstawanie zabarwienia (w wyniku uwalniania pNA, to znaczy p-nitroaniliny), mierzono przy 405 nm.

Próbki inkubowano wstępnie w temperaturze 37°C w ciągu 10 minut, po czym wprowadzano zawierający chromogen LAL. Mierzono czas potrzebny do osiągnięcia gęstości optycznej 0,2 przy 405 nm. Aktywność endotoksyny obliczano w porównaniu z krzywą porównawczą otrzymaną dla wzorców LPS.

Otrzymane wyniki zamieszczono w tabeli 3, jak ilość ng LPS na 1 ng produktu.

Tabela 3

Aktywność endotoksyczna w LAL (ng/ng)

Rodzaj testu	E coli LPS*’	Lipid A	3-O-deacylowany lipid A	Disacharyd o wzorze A	Disacharyd o wzorze B	Monofosforylodisacharyd o wzorze A
Żelatynowanie	0,9 ± 0,4 (n = 6)	0,6 ± 0,3 (n — 3)	1,0 ±0,1 (n = 2)	0,003 ± 0,002 (n= 12)	0,004 ± 0,002 (n = 7)	0,0031 ±0,0013 (n= 10)
Tworzenie barwnika	0,70 (n=l)	0,7 ± 0,3 (n = 3)	1,70 ± 0,95 (n = 3)	0,0014 ±0,0013 (n = 9)	0,0008 ± 0,0006 (n = 7)	0,0016 ± 0,0009 (n=10)

’ Aktywność endotoksyczna LPS w LAL = 1 ng/ng, dane doświadczalne mieszczą się w zakresie 0,3 do 3 ng/ng

Tak więc, tabela 3 pokazuje, że disacharydy o wzorach A i B według wynalazku przejawiają najmniejszą endotoksyczność, zwłaszcza w stosunku do 3-O-deacylowanego lipidu A według US-A-4912094.

2. In vitro aktywność biologiczna wywołana w makrofagach myszy C57BL/6.

Szpik kostny pobrano z kości biodrowej, kości udowej i kości piszczelowej sześciotygodniowych myszy samców C57BL/6. Po zhomogenizowaniu zawiesiny szpiku w podłożu zmodyfikowanym metodą Dulbecco, a następnie odwirowaniu, osad zawieszono w podłożu zmodyfikowanym metodą Dulbecco i komórki hodowano w stężeniu 4 x 10⁵ komórek/ml w tym samym podłożu uzupełnionym 3 0% supematantem fibroblastów L-929 [zwykle stosowane źródło czynnika stymulującego kolonizację 1 (CSF-1)] oraz 20% surowicą końską.

Po upływie 7 dni dojrzałe makrofagi zebrano i zawieszono w pobliżu zmodyfikowanym metodą Dulbecco zawierającym 5% płodowej surowicy cielęcej, do stężenia 7 χ 10⁶ komórek/ml. Tę zawiesinę komórek zmieszano w stosunku 1:1 (obj/obj) z próbkami rozcieńczonymi w tym samym podłożu i użyto w testach biologicznych przeprowadzanych na mikropłytkach (70000 komórek/dołek) w następujących warunkach inkubacji: temperatura 37°C, czas 22 godziny, wilgotność 100%, CO₂ 8%.

Wytwarzanie tlenku azotu (NO)

Tlenek azotu (NO) jest wytwarzany przez makrofagi w odpowiedzi na zakażenie bakteryjne, a w szczególności na LPS. NO, jak się wydaje, ma właściwości cytostatyczne i cytotoksyczne. NO odznacza się nadzwyczajną reaktywnością i szybko ulega przekształceniu, na drodze utlenienia, do azotynu i azotanu.

Tworzenie się azotynumierzonowteścieGriessa (dodanie, w stosunku 1:1 (obj/obj), chlorowodorku N-(l-naftylo)-etylenodiaminy (1 g/litr w wodzie) i p-aminobenzenosulfonoamidu (10 g/litr w 5% H₃PO₄)]. Stężenie azotynu w supematantach aktywnych mikrofagów obliczano w porównaniu z wzorcami NaNO₂.

Otrzymane wyniki zamieszczono w tabeli 4.

Tabela 4

Wytwarzanie NO w supematantach makrofagów stymulowanych LPS i związkami pochodnymi

Związek	Największą aktywność ⁾	Najmniejszą aktywność	Aktywność 50% *>	Aktywność NO przy 50% w nmolach NOj/ml*	Liczba oznaczeń
LPS E coli	100	0,0004	0,01	7	n = 6
Lipid A	50	0,005	0,07	5	n = 7
3-O-deacylowany lipid A	50	0,005	0,16	5	n = 3
Disacharyd o wzorze A	50	0,016	0,16	5	n = 6
Disacharyd o wzorze B	16	0,0005	0,05	5	n= 1
Monofosforylodisacharyd o wzorze A	50	5	8	4	n= 1

·) ’*)

Stężenie związku wyrażone w pg/ml, odpowiadające wywołanej aktywności NO, Stężenie w NOi/ml ekstrapolowane z krzywej kolejnych rozcieńczeń.

LPS wywołuje wytwarzanie największej ilości NO. Lipid A, 3-O-deacylowany lipid A, disacharyd o wzorze A i disacharyd o wzorze B wywołują wytwarzanie NO na tym samym poziomie.

Tak więc, disacharydy o wzorach A i B wywołują wytwarzanie NO w makrofagach równie silnie jak lipid A i 3-deacylowany lipid A.

Wytwarzanie interleukiny-la (IL-la)

IL-Ια wytwarzana jest przez szereg różnych komórek, włączając w to makrofagi, w rezultacie stymulacji przez LPS. Niektóre publikowane stwierdzone przejawy aktywności IL-Ια dotyczą aktywowania komórek T, indukowania ekspresji receptora 11-2 i ekspresji genu cytokiny w komórkach T, kostymulacji proliferacji komórek B i wydzielania Ig, a także wzmożenia indukowanego IL-2 i IFN aktywowania cytotoksyczności, w której funkcję mediatora pełni NK, oraz indukowania syntezy białka w fazie ostrej i wywoływania gorączki.

Pomiarów stężenia IL-Ια w supematantach makrofagów dokonywano stosując test ELISA (kit GENZYME, Intertest la).

Otrzymane wyniki zestawiono w tabeli 5.

Tabela 5

Wytwarzanie IL-Ια w supematantach makrofagów stymulowane przez LPS i związki pochodne

Związek	Najwyższe przebadane stężenie	Stężenie 500 pg/ml	Najmniejsza wykryta aktywność
	stężenie (pg/ml)	IL-Ια (pg/ml)	IL-la (pg/ml)	stężenia (pg/ml)	EL-Ια (pg/ml)
Ślepa próba = TEA 0,1%	500	<15*’	<15*^}		<15*’
LPSE coli	1600	295 ±129	170¹	1,56	18±4
Lipid A	500	53 ±35	53 ±35	50	17±8
3-O-Deacylowany lipid A	500	56 ±19	56 ±19	160	21 ±6
Disacharyd o wzorze A	500	75 ±45	75 ±45	16	19 ± 11

Granica detekcji testu jest rzędu 15 pg/ml.

Stężenie IL-Ια ekstrapolowane z ktżywej kolejnych rozcieńczeń.

181 241

Ustalenie maksymalnego poziomu wytwarzania IL-la okazało się niemożliwe, a to z tego powodu, że wytwarzanie ciągle jeszcze się zwiększało, i to przy najwyższym stężeniu przyjętym w omawianym teście.

Wywoływanie wytwarzania IL-la przy stężeniu 500 pg/ml nie różni się w wyraźny sposób dla lipidu A, 3-O-deacylowanego lipidu A i disacharydu o wzorze A. Natomiast wytwarzanie lipidu A i disacharydu o wzorze A. Natomiast wytwarzanie IL- la powodowane przez LPS zaznacza się silniej.

Wytwarzanie IL-lapod wpływem disacharydu o wzorze A jest co najmniej tak intensywne, jak pod wpływem lipidu A i 3-O-deacylowanego lipidu A.

Wytwarzanie interleukiny-6 (IL-6)

IL-6 jest wytwarzana przez aktywowane monocyty lub makrofagi, limfocyty T i B. IL-6 wywołuje, między innymi, proliferację komórek różnych typów, zahamowanie wzrostu niektórych linii komórek czerniaka, różnicowanie się limfocytów B i stymulację wydzielania IgG, różnicowanie się cytotoksycznych komórek T oraz słabą aktywność przeciwwirusową

Stężenie IL-6 w supematantach makrofagów oznaczono z wykorzystaniem testu ELISA (Kit ENDOGEN, EM-IL-6).

Otrzymane wyniki zestawiono w tabeli 6.

Tabela 6

Wytwarzanie IL-6 w supematantach makrofagów stymulowane przez LPS i związki pochodne

Związek	Największa aktywność	Najmniejsza aktywność	Aktywność 50%
stężenie (pg/ml)	IL-6 (pg/ml)	stężenie (pg/ml)	IL-6 (pg/ml)	stężenie (pg/ml)	Ł-6 (pg/ml)
Próba ślepa = TEA 0,1%	500	1150 ±80	0	710 ±240	-	-
LPS E. coli	25	13860 ±2750	0,006	2400 ±960	0,3	6950
Lipid A	160 do 0,016⁷	3000 do2200*⁷	0,016	2460 ±50	ND**⁷	ND⁷
3-O-Deacylowany lipid A	160 do O,O16*⁷	2850 do 22OO*⁷	0,016	2410 ±160	ND”⁷	ND*’⁷
Disacharyd o wzorze A	50	5700 ±2650	0,016	850 ±350	1	2850

Wywołana aktywność jest względnie stała w przebadanym zakresie i nie wykazuje maksimum. *⁷ND = nie oznaczono.

Aktywność wywołana najmniejszym stężeniem badanego związku (0,016) ciągle jest większa od aktywności 50%.

Stymulacja wydzielania IL-6 przez disacharyd o wzorze A jest wyraźnie słabsza od analogicznego działaniaLPS. Jednakże, disacharyd o wzorze A działa indukująco, jeśli chodzi o wytwarzanie IL-6 w makrofagach, silniej niż lipid A i 3-O-deacylowany lipid A.

Wytwarzanie czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-a)

TNF-α wytwarzany jest głównie przez makrofagi i monocyty stymulowane przez LPS. Wśród różnych rodzajów aktywności TNF-α wymienić należy aktywność przeciwwirusową cytolizę i cytostazę pewnych typów komórek, wpływ na rozwój komórek niektórych linii, ekspresję antygenów, takąjak ekspresj a kompleksów zgodności tkankowej klasy I i Π, powodowanie martwicy wywołanego metylocholantrenem mięsaka, powodowanie aktywacji leukocytów cechujących się różnokształtnościąjąder komórkowych (PMN), aktywacji osteoklastów i resorpcji kości. TNF-α jest także zasadniczym mediatorem we wstrząsie toksycznym i w posocznicy.

Stężenie TNF-α w supematantach makrofagów oznaczono z wykorzystaniem testu ELISA (Kit GENZYME, Factor-test mTNF-α). Otrzymane wyniki wyszczególniono w tabeli 7.

Tabela 7

Wytwarzanie TNF-α w supematantach makrofagów stymulowane przez LPS i związki pochodne

Związek	Najwyższe przebadane stężenie	Stężenie 500 pg/ml	Najmniejsza wykryta aktywność
stężenie (pg/ml)	TNF-α (pg/ml)	TNFa (pg/ml)	stężenie (pg/ml)	TNF-α (pg/ml)
Próba ślepa = TEA 0,1%	500	138± 9	138 ±9	0	< 100 ’’
LPS E coli	100 do 6,25	257 do 284	130”’’	0,006	175 ± 55
Lipid A	500	223 ±64	223 ±64	0,016	118 ± 9
3-O-Deacylowany lipid A	500	311 ±72	311 ±72	0,016	155 ±6
Disacharyd o wzorze A	500	530 ±139	530±139	0,16	159 ±43

Granica detekcji testu jest rzędu 100 pg/m.

' Stężenie TNF-α jest względnie stałe w zakresie od 100 do 6,25 pg/ml LPS, i zmniejsza się w przypadku stężeń wyższych od 200 pg/ml.

' Stężenie TNF-α ekstrapolowane z krzywej kolejnych rozcieńczeń.

Ustalenie maksymalnego poziomu wytwarzania TNF-α okazało się niemożliwe, a to z tego powodu, że wytwarzanie to ciągle jeszcze zwiększało się, i to przy najwyższym przyjętym w teście stężeniu.

W przeciwieństwie do innych testów, wytwarzanie TNF-α wywoływane przez LPS miało mniejsze rozmiary niż w przypadku użycia disacharydu o wzorze A. Disacharyd o wzorze A indukował TNF-cc w takim samym stopniu, lub jeszcze silniej, niż czynił to lipid A albo 3-O-deacylowany lipid A.

Wytwarzanie prostaglandyny E2 (PGE2)

PGE1 i PGE2 są głównymi metabolitami kwasu arachidonowego, syntetyzowanymi przez makrofagi stymulowane LPS, TNF-α lub IL-1. PGE przejawiająaktywność immunomodulującą w stosunku do limfocytów T i B. Jak się wydaje, wywołująone stymulację subpopulacji limfocytów T pomocniczych Th2 i zahamowanie aktywności subpopulacji limfocytów T pomocniczych Thl, a także wywołują zmianę („przełączną”) izotop immunoglobulin.

Stężenie PGE2 w supematantach makrofagów mierzono stosując test RIA (Kit PAESEL + LOREI, 36-104-6001 Prostaglandin E2 3H-RIA Kit).

Otrzymane wyniki zestawiono w tabeli 8.

Tabela 8

Wytwarzanie PGE2 w supematantach makrofagów stymulowanych LPS i związkami pochodnymi

Związek	Najwyższe stężenie wywołujące aktywność	Najniższe stężenie wywołujące aktywność
stężenie (pg/ml)	PGE2 (pg/ml)	stężenie (pg/ml)	PGE2 (pg/ml)
Próba ślepa = TEA 0,1%	500	<80’’	-	<80*^>
LPS E. coli	1600	1120 ±135	6,25	153 ±29
Lipid A	500	<80^υ	-	<80^
3-O-Deacylowany lipid A	500	240 ±25	500	240 ±25
Disacharyd o wzorze A	500	540 ±65	16	80 ±41

Granica detekcji testu jest rzędu 80 pg/ml.

Ustalenie maksymalnego poziomu wytwarzania PGE2 okazało się niemożliwe, a to z tego powodu, że wytwarzanie to ciągle jeszcze wzrastało, i to przy najwyższym przyjętym w teście stężeniu. Stymulacja wytwarzania PGR2 przez disacharyd A jest wyraźnie słabsza niż ma to miejsce w przypadku LPS. Jednakże, disacharyd A był bardziej aktywny niż lipid A i 3-O-deacylowany lipid A. Lipid A nie wywoływał wytwarzania PGE2, a 3-O-deacylowany lipid A czynił to jedynie w przypadku najwyższego stężenia stosowanego w teście.

Wnioski

Disacharydy według wynalazku wykazują aktywność in vitro i wywołują wytwarzanie NO, IL- la, IL-6, THF-ai PGE2. Disacharydy według wynalazku są w rówynym stopniu, a nawet jeszcze bardziej aktywne niż lipid A i 3-O-deacylowany lipid A, ale przejawiają zasadniczo mniejsząendotoksyczność, jak to ustalono w teście LAL. Mniejsza aktywność lipidu A i 3-0deacylowanego lipidu A może wynikać z istniejących między nimi różnic pod względem czystości. Disacharydy o wzorach A i B zostały oczyszczone metodą HPLC, podczas gdy lipid A jest handlowym preparatem biologicznym (Sigma L-5399), a 3-O-deacylowany lipid A został wytworzony według US-A-4912054, przy użyciu jako substancji wyjściowej handlowego preparatu lipidu A. Jedynym produktem, który wykazał większą aktywność jest LPS, wywołujący, na ogół, silniej sząodpowiedź i potrzebujący niższego stężenia do indukowania wyraźnego sygnału.

3. Aktywność biologiczna in vivo.

Aktywność biologiczną in vivo disacharydu A badano pod względem działania przeciwnowotworowego w stosunku do raka rozsianego otrzewnej, wywołanego u szczurów BDIX. Komórki Pro b otrzymane według metody Martina [F. Martin i in., International Journal of Cancer, tom 32, str. 623 - 627 (1983)] wstrzyknięto szczurom dootrzewnowo, stosując je w ilości 10^ć komórek/szczura. Po upływie 10 dni, w krezce, w plamach mlecznych, pojawiły się liczne lite guzki i postępująco naciekały do jamy otrzewnej (patrz: P. Lagadec i in., Invasion and Metastasis, tom 7. str. 83 - 95 (1987)]. Po upływie 4-5 tygodni pojawiła się puchlina brzuszna krwawa i wszystkie szczury zdechły w ciągu 8-12 tygodni.

Immunoterapię rozpoczęto po upływie 14 dni od wstrzyknięcia nowotworowych komórek Pro b. Leczenie obejmowało dootrzewnowe wstrzyknięcia disacharydu o wzorze A w dawkach wynoszących 0,1,0,3 i 0,8 mg/kg masy ciała. Disacharyd o wzorze A rozpuszczono w wodnym roztworze zawierającym 0,9% NaCl i 0,1% trietyloaminy. Szczury dostawały po 5 wstrzyknięć, po jednym co 3,5 dnia. Grupa kontrolna otrzymywała we wstrzyknięciach roztwór wodny. Obie grupy obejmowały 10 szczurów.

Po upływie 6 dni od wstrzyknięcia komórek nowotworowych przeprowadzono autopsję. Rozmiary zrakowacenia otrzewnej oceniano bez wyboru i szczury sklasyfikowano szeregując je według zwiększającego się zrakowacenia.

Klasyfikacja zrakowacenia pod względem rozmiarów guzków była następująca:

klasa 0 : nie ma żadnych widzialnych guzków nowotworowych;

klasa 1 Jest kilka guzków o wielkości poniżej 0,2 cm;

klasa 2 : guzków jest zbyt wiele, aby dały się policzyć, wielkość aż do 0,5 cm;

klasa 3 : guzy o wielkości do 1 cm;

klasa 4 : jama otrzewnej całkowicie nacieczona nowotworem, wielkość kilka cm. Przeglądu otrzymanych wyników dokonano w tabeli 9.

Tabela 9

In vivo aktywność przeciwnowotworowa disacharydu o wzorze A w raku rozsianym otrzewnej

Disacharyd o wzorze A (dawka)	Liczba szczurów ze zrakowaceniem klasy:	Działanie związku (1)	Objętość puchliny (ml/szczura)	Działanie związku (2)
0	1	2	3	4	Zakres	Średnia
0 mg/kg	0	1	1	2	6		0-64	40 ±24
0,1 mg/kg	0	2	0	4	4	NS	0- 18	7±7	p< 0,001
0,3 mg/kg	2	3	2	2	1	p<0,01	0-20	2±6	p< 0,001
0,8 mg/kg	1	6	1	1	1	p<0,01	0-2	0± 1	p< 0,001

Istotność statystyczną aktywności przeciwnowotworowej obliczono z wykorzystaniem : (1) testu Kruskala-Wallisa oraz (2) analizy wariancyjnej.

W oczywisty sposób, disacharyd o wzorze A wywiera zależne od dawki działanie przeciwnowotworowe.

4. Toksyczność ostra.

Do żyły ogonowej myszy NMRI, samców i samic, w wieku 6-7 tygodni, wstrzyknięto disacharyd o wzorze A. Dawka w wysokości sięgającej 100 mg/kg masy ciała nie spowodowała żadnych padnięć.

Przykład 7

Jako substancji wyjściowej użyto lipopolisacharydu pochodzącego z Pseudomonas aeruginosa (Sigma, nr wyrobu L7018). Budowa lipidu A została już poznana [patrz: Kulshin i in., Eur. J. Biochem. 198, 697 - 704 (1991)]. W przeciwieństwie do lipidu A z E. coli, przeważający związek zawiera reszty acyloksyacylowe przy obu grupach aminowych szkieletu difosforanu diglukozoaminy. Poza tym, występuje tu także, wpozycji 3', kwas 3-hydroksy dekanowy, natomiast taka sama tłuszczowa reszta acylowa znajduje się tylko w pozycji 3 frakcji ubocznej.

Usunięcie tej tłuszczowej reszty acylowej występującej wpozycji 3' doprowadzi do otrzymania analogu disacharydu o wzorze C. Dalsza hydroliza prowadzi do utraty zestryfikowanej tłuszczowej reszty acylowej przy grupie acyloksy acylowej, albo w pozycji 2 albo w pozycji 2'. Struktury takie są analogami disacharydów o wzorach C i D.

Lipopolisacharyd z Ps. aeruginosa (SigmaL7018) rozpuszczono w 0,1M roztworze octanu sodowego, pH 4,0, w stężeniu 5 mg/ml, po czym ogrzewano, w ciągu 120 minut w temperaturze 100°C. Po ochłodzeniu, dodano 0,5 objętości 2-propanolu, a następnie fosforanu tetrabutyloamoniowego (TBAP), aż do uzyskania końcowego stężenia 25 mM. Następnie dodano trietyloaminę (TEA) do pH około 9,0 (papierek wskaźnikowy). Otrzymaną mieszaninę wprowadzono na kolumnę Cl 8 Sep-Pak (Waters) z zawracaniem (10 przepuszczeń). Sep-Pak przemyto lOml 5 mM roztworu TBAP w układzie acetonitryl: H₂01:1 (obj/obj), a następnie 10 ml acetonitrylu. Substancje zaadsorbowane wyeluowano 4 ml układu chloroform : metanol 2 : 1 (obj/obj).

Dwa główne piki, PsAl i PsA2 (fig. 6) poddano oczyszczaniu metodąHPLC i przeprowadzono analizę kwasów tłuszczowych. Skład kwasów tłuszczowych odpowiada cząsteczkom opisanym przez Kulshina iin. (tabela poniżej). PsAl jest mniej hydrofobowy niż PsA2, gdyżeluuje się z kolumny przy krótszym czasie retencji (RĄ Odpowiada to cząsteczce zawierającej dwie reszty kwasowe 2OH-C12:0. PsA2 zawiera tak 20H-C12:0 jak i C12:0.

181 241

Pik	Zidentyfikowany kwas tłuszczowy
PsAl	3OH-C10:0 2OH-C12:0 3OH-C12:0
PsA2	3OH-C10:0 C12:0 2OH-C12:0 3OH-C12:0

Rozpuszczalnik usunięto przy użyciu wyparki obrotowej, a pozostałość rozpuszczono w 0,2% roztworze TEA w wodzie.

Następnie, do roztworu lipidu A z Ps. aeruginosa wprowadzono wodorotlenek sodowy, do uzyskania stężenia 0,2 M, po czym roztwór inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 60 minut, a następnie zobojętniono 8,5% roztworem kwasu ortofosforowego. Otrzymany roztwór wprowadzono do układuHPLC z odwróconymi fazami (HP1050 z Supelco LC18,3 pm kolumna do chromatografii z odwróconymi fazami, z kolumną wstępną), zrównoważonego mieszaniną złożoną z 75% rozpuszczalnika A [(5 mM TBAP w układzie acetonitryl: woda 1 :1 (obj/obj)] i 25% rozpuszczalnika B [(5 mM TBAP w układzie 2-propanol: woda 9 :1 (obj/obj)], po czym przeprowadzono elucję w gradiencie 2% rozpuszczalnika B/min do 100% B. Piki wykrywano przy 210 nm. Główne piki zebrano (patrz fig. 7), a następnie rozcieńczono 2 objętościami wody i wprowadzono na ładunki Cl 8 Sep-Pak zrównoważone w rozpuszczalniku A. Następnie ładunki przemyto 10 ml 0,45% roztworu chlorku sodowego w układzie 2-propanol: H₂O 1:3 (obj/obj), 10 ml wody i 10 ml acetonitrylu. Substancje zaadsorbowane wyeluowano 4 ml układu chloroform : metanol 2:1 (obj/obj), po czym rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymane frakcje rozpuszczono w 100 μΐ wody.

Zawartość tłuszczowych grup acylowych w omawianych frakcjach poddano analizie metodą chromatografii gazowej, po dokonaniu hydrolizy z udziałem 4 M HC1, w temperaturze 100°C, w ciągu 4 godzin. Uwolnione kwasy tłuszczowe przekształcono w estry metylowe według metody Millera [L. Miller, Gas Chromatography, ApplicationNote 228-37 (Hewlett Packard) i poddano badaniu przy użyciu chromatografu gazowego Hewlett-Packard 5890, z kolumną topionej krzemionki (Supelco 2-4026) w odniesieniu do wzorców estrów metylowych kwasów tłuszczowych (Supelco).

Po przeprowadzeniu hydrolizy ekstraktu lipidu A, przy badaniu metodąHPLC z odwróconymi fazami, zaobserwowano liczne piki. Główne piki (PsAOHl, 2,4 i 6) z HPLC zebrano i kwasy tłuszczowe w każdej frakcji zidentyfikowano i przedstawiono poniżej.

Pik	Zidentyfikowany kwas tłuszczowy
PsAOHl	3OH-C12:0 2OH-C12:0
PsAOH2	3OH-C12:0 2OH-C12:0
PsAOH4	3OH-C12:0 C12:0
PsAOHÓ	3OH-C12:0 2OH-C12:0 C12:0

Wzory strukturalne tych disacharydów:

* PsAOHl : diwodorofosforan 2-deoksy-6-O-[2-deoksy-2-[(R)-3-[(S)-2-hydroksydodekanoiloksy]-dodekanoiloamino]-4-O-fosfono-P-D-glukopiranozylo]-2-[(R)-3-hydroksydodekanoiloamino]-a-D-glukopiranozylu; (wzór E) * PsAOH2 : diwodorofosforan 2-deoksy-6-O-[2-deoksy-2-[(R)-3-hydroksydodekanoiloamino]-4-O-fosfono-P-D-glukopiranozylo]-2-[(R)-3-[(S)-2-hydroksydodekanoiloksy]-dodekanoiIoamino]-a-D-glukopiranozylu; (wzór F) * PsAOH4: diwodorofosforan 2-deoksy-6-O-[2-deoksy-2-[(R)-3-dodekanoiloksydodekanoiloamino]-4-0-fosfono-P-D-gh±opiranozylo]-2-[(R)-3-hydroksydodekanodoamino]-a-D-glukopiranozylu; (wzór G) * PsAOHó: diwodorofosforan 2-deoksy-6-O-[2-deoksy-2-[(R)-3-dodekanoiloksydodekanoiloamino]-4-0-fosfono-p-D-glukopiranozylo]-2-[(R)-3-[(S)-2-hydroksydodckanoiloksy]-dodekanoiloamino]-o.-D-glukopiranozylu, (wzór H) przedstawiono na rysunku.

Frakcje poddano także analizie metodą spektrometrii masowej z jonizacją elektronową (ES-MS) przy ujemnej wartości nodalnej. Użyto aparatu VG Biotech BIO-Q z analizatorem o potrójnym kwadrupolu. Od 2 do 4 μΐ z każdej próbki rozcieńczono do 10 μΐ układem acetonitryl: woda: 25% roztworu amoniaku 50:50:1 (obj/obj). Następnie 10 μΐ wprowadzono bezpośrednio do źródła jonów spektrometru masowego. Do elucji użyto układu acetonitryl: woda: 25% roztwór amoniaku 50:50:1 (obj/obj), przy szybkości elucji wynoszącej 7 μΐ/min. Przy przeprowadzaniu analizy pod względem fragmentacji głównych jonów, jony macierzyste z pierwszego kwadrupola poddano pobudzonemu zderzeniami rozkładowi w drugim kwadrupolu, przy czym jako gazu kolizyjnego użyto argonu. Jony pochodne („filialne”) wykrywano w trzecim kwadrupolu.

Poniżej podano odnoszące się do masy wartości obliczone i otrzymane przy badaniu metodą ES-MS dla każdego piku.

Pik	Masa obliczona	Masa otrzymana
PsAOHl	1093,5	1093,4
PsAOH2	1093,5	1093,1
PsAOH4	1077,5	1077,0
PsAOHó	1275,8	1275,7

Stwierdzono bardzo dobrą zgodność wyników w każdym przypadku.

W przypadku PsAOHl i PsAOH2, masy są identyczne, co wskazuje na to, że są to dwie izoformy cząsteczki. Lipidy A znane sąz tego, że w pewnych warunkach przeprowadzania analizy metodą spektrometrii masowej ulegają fragmentacji [Kulshin, 1991; Cotter i in., Bioomed. Encl. Mas Spectrom., 14 591 - 598 (1987)]. Powstająjony stanowiące nieredukującą połowę cząsteczki, z dodaniem 102 jednostek masy. Tak więc, w przypadku dwóch spektrometrów masowych (MS) zestawionych w układzie posobnym (MS-MS), jon główny w pierwszym z nich może ulec podziałowi na fragmenty, i jony „filialne” zostają wykryte w drugim. Eliminuje to możliwość przypuszczenia, że zaobserwowane jony wtórne są zanieczyszczeniami: muszą one pochodzić od jonu pierwotnego i powstając na drodze jego fragmentacji. Wartości odnoszące się do masy jonów pochodnych każdej frakcji, spodziewanej i otrzymanej w wyniku analizy przeprowadzonej z zastosowaniem układu MS-MS przedstawiono poniżej.

Pik	Masa fragmentu obliczona	Masa fragmentu otrzymana
PsAOHl	558,5 lub 756,8	756,1
PsAOH2	558,5 lub 756,8	557,7
PsAOH4	558,5 lub 740,8	739,9
PsAOHó	558,5 lub 740,8	740,1

Wyniki tych obserwacj i pozwalaj ąna wyraźne zidentyfikowanie struktury disacharydów o wzorze E, F, G i H.

Dla wewnętrznego porównania, disacharyd o wzorze A poddano także badaniu metodą ES-MS. Masa fragmentu obliczona wynosiła 768,9, a znaleziona 768.

Aktywność biologiczną omawianych frakcji zbadano przez określenie działania stymulującego wytwarzanie azotynu w mysich makrofagach otrzewnowych, sposobem opisanym w powyższej części niniejszego opisu.

Ilość każdego analogu w roztworze podstawowym określono na podstawie wartości absorpcji w HPLC w odniesieniu do wartości dla disacharydu o wzorze A. Frakcje wykazują aktywność tego samego rzędu co disacharyd o wzorze A (fig. 8). Disacharyd o wzorze H, który zawiera dwie grupy acyloksyacylowe i nie ma żadnych innych tłuszczowych reszt acylowych, okazał się najbardziej aktywnym. Usytuowanie grupy acyloksyacylowej w pozycji 2, względem usytuowania w pozycji 2', wywiera tylko nieznaczny wpływ na aktywność.

W celu wyeliminowania możliwości, że aktywność zawdzięcza się obecności w próbkach zanieczyszczeń w postaci innych substancji, takich jak LPS, disacharydy o wzorach E, F, G i H poddano powtórnemu oczyszczaniu metodą HPLC z odwróconymi fazami, przy czym zbierano także frakcje odpowiadające regionom linii podstawowej HPLC tuż przed i tuż po danym piku i poddano je takiej samej obróbce, jaką stosowano w przypadku frakcji zawierających pik danej substancji. Zbadano aktywność frakcji szczytowych i wspomnianych frakcji linii podstawowej. Frakcje szczytowe, zawierające disacharydy o wzorach E, F, G i H, wykazały aktywność podobną do aktywności obserwowanej w pierwszym teście. Próby ślepe, odpowiadające regionom profilu HPLC znajdującym się tuż przed i tuż po piku danego analogu lipidu A, okazały się nieaktywne. Tak więc, stymulacja wytwarzania azotynu jest w specyficzny sposób związana z analogami lipidu A.

Endotoksyczność disacharydów o wzorach E, F i G określono w teście chromogennym LAL (patrz niżej). Jednakże, zamiast używania albuminy surowicy bydlęcej w stężeniu 1 g/ml, stosowano w tym przypadku stężenie 0,1 mg/ml. Wyniki otrzymane z dwóch eksperymentów (n = 4 lub 6) przedstawiono poniżej.

Próbka	Aktywność enotoksyczna w teście LAL (mg/mg)
LPS z E. coli	0,58	± 0,14
Lipid A z E. coli	0,32	± 0,06
Disacharyd o wzorze E	0,000005	± 0,000002
Disacharyd o wzorze F	0,0000025	± 0,000026
Disacharyd o wzorze G	0,00006	± 0,00003
Disacharyd o wzorze A	0,000003	± 0,000002

181 241

R₂ ^z

WZÓR 1

181 241

WZÓRB

181 241

WZÓR C

Ο

WZÓR D

181 241

WZÓR E (PsAOHl)

181 241

WZÓR F (PsA0H2)

WZÓR G (PsAH04)

WZÓR H (PsAOH6)

181 241

Fig. i

181 241

250HRH χΙ 8gd=l 20-ΖΛΥ-33 13-34^:30:43 ZM F0Μ=Ί52 1=3.3v Ha=2552 TJ08 flcnl^-SCM SysTGHCG MR: 3593303 il-SCilHi 15220/1030 Gil [0 22 G PI= 8° CaU HOSS’ 351.6

Fig. 2 seercTT

Ο9ΙΖ.θΞΪ.

90S»8^rl >4206'1

7ΖΤΏ7Τ rdrrm

46£S0·ε otses-ε >4S4I r 9£812 f

9ΐ6έε + ge»6r + 08660'» eeiis »

05069 +

EE4S9 + 20649'r

»£ŹS9'S

9O999‘g

Hdd

.00 5.50 5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00

PPM

Fig. 3

181 241

Fig. 4

Fig. 5

181 241

Fig. 6

181 241

Fig, 7

181 241

PsAOH-1

PsAOH-2

-®“ PsAOH-4

0.00001 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10

OM-174

Product concentration in pg/ml

Stężenie produktu w pg/ml Fig. 8

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Disacharydy β(1 ->6) glukozoaminowe o wzorze ogólnym 1, w którym:

Rj oznacza grupę hydroksylową, grupę dihydroksyfosfonoiloksylową lub jej postacie naładowane, grupę (C_rC₅)acyloksylową, grupę (Ci-C₅)alkoksylową, albo grupę o symboluX;

R₂ i R₂ niezależnie oznaczajągrupę acylowąlub grupę o symbolu Y, z tym, że co najmniej jeden z symboli R₂ lub R₂' oznacza grupę o symbolu Y;

R₃ i R₃' niezależnie oznaczająwodór, grupę (C₁-C₃)alkilowąlub grupę (C]-C₃ jacy Iową;

R4 oznacza wodór, grupę (C₁-C₃)alkilowąlub grupę (Cj-C^acylową;

R4 oznacza wodór, grupę (C₁-C₅)acylową, grupę (Cj-Cjjalkilową lub grupę fosfonową albo jej postacie naładowane;

R₆' oznacza wodór, grupę hydroksylową, grupę dihydroksyfosfonoiloksylową lub jej postacie naładowane albo grupę o symbolu Z;

przy czym grupa o symbolu Xjest wybrana z grupy obejmującej grupę karboksy(Cj-C₅)alkiloksylową, grupę o wzorze -O-CH-KCH^COOH] [(CH^COOH], w którym m = 0-5 i n = 0-5; oraz postacie naładowane grupy o symbolu X;

grupa o symbolu Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę acyloksyacylową i grupę (C ] -C₂₄)alkiloksy acyl ową;

grupa o symbolu Z jest wybrana z grupy obejmującej ketodeoksyoktonian (kwas 3-deoksy-D-manno-2-oktulozonowy, KDO), ugrupowanie o wzorze (KDO)n, w którym η = 1 do 10, polisacharydowy łańcuch boczny, składnik rdzeniowy;

oraz ich sole.
2. Disacharyd według zastrz. 1, w którym grupa o symbolu Y stanowi grupę acyloksyacylową.
3. Disacharyd według zastrz. 2, w którym grupa o symbolu Y stanowi grupę 3-acyloksyacylową.
4. Disacharyd według zastrz. 1 albo 2, w którym grupa acylowa stanowi resztę kwasu tłuszczowego, resztę 3-hydroksykwasu tłuszczowego lub resztę 3-oksokwasu tłuszczowego.
5. Disacharyd według zastrz. 1 albo 2, w którym grupa acyloksyacylowa, stanowiąca grupę o symbolu Y zawiera ugrupowanie acylowe wybrane z grupy obejmującej resztę kwasu tłuszczowego, resztę 3-hydroksykwasu tłuszczowego lub resztę 3-oksokwasu tłuszczowego.
6. Disacharyd według zastrz. 6, w którym grupąo symbolu Y jest grupa acyloksyacylowa, stanowiąca połączoną z atomem azotu grupę 3-hydroksy(C₁-C₂₄)acylową, korzystnie tłuszczową grupę (C₈-C₁₈)acylową, związaną estrowo w pozycji 3-hydroksy z grupą (C₁-C₂₀)acylową, korzystnie z tłuszczową grupą (C₁₀-C₁₈)acylową.
7. Disacharyd według zastrz. 6, w którym grupa acyloksyacylowa stanowi połączoną z atomem azotu tłuszczową grupę 3-hydroksy-C₁₄-acylową, związaną estrowo w pozycji 3-hydroksy z C₁₂-kwasem tłuszczowym.
8. Disacharyd według zastrz. 6, w którym grupa acyloksylowa stanowi połączoną z atomem azotu tłuszczową grupę 3-hydroksy-C ₁₄-acylową, związaną estrowo w pozycji 3-hydroksy z C₁₄-kwasem tłuszczowym.
9. Disacharyd według zastrz. 1, w którym R₂ oznacza grupę o symbolu Y.
10. Disacharyd według zastrz. 1, w którym R₂ oznacza grupę o symbolu Y.

181 241
11. Disacharyd według zastrz. 5, w którym reszta 3-hydroksykwasu tłuszczowego stanowi 3-hydroksy(C₄-C24)kwas tłuszczowy, korzystnie 3-hydroksy(C₁₀-C_lg)kwas tłuszczowy.
12. Disacharyd według zastrz. 11, w którym reszta 3-hydroksykwasu tłuszczowego stanowi 3-hydroksy-C₁₄-kwas tłuszczowy.
13. Disacharyd według zastrz. 11 albo 12, w którym R₂ oznacza resztę 3-hydroksykwasu tłuszczowego.
14. Disacharyd według zastrz. 11 albo 12, w którym R₂ oznacza resztę 3-hydroksykwasu tłuszczowego.
15. Disacharyd według zastrz. 1, w którym R₂ i R₂' oba oznaczają grupę o symbolu Y.
16. Disacharyd według zastrz. 15, wktórymR₂iR₂ obaoznaczajągrupę acyloksyacylową stanowiącą połączoną z atomem azotu grupę 3-hydroksy(C₄-C2₄)acylową, korzystnie tłuszczową grupę (C_g-C_lg)acylową, związaną estrowo w pozycji 3-hydroksy z grupą (C₁-C₂₀)acylową, korzystnie z tłuszczową grupą (C₁₀-C₁₈)acylową.
17. Disacharyd według zastrz. 16, w którym R₂ oznacza połączoną z atomem azotu tłuszczową grupę 3-hydroksy-C₁₄-acylową, związaną estrowo w pozycji 3-hydroksy z C₁₄-kwasem tłuszczowym, i w którym R₂ oznacza połączoną z atomem azotu tłuszczową grupę 3-hydroksy-C₁₄-acylową> związaną estrowo w pozycji 3-hydroksy z C_ł2-kwasem tłuszczowym.
18. Disacharyd według zastrz. 1, w którym R_t oznacza grupę dihydroksyfosfonoiloksylową.
19. Disacharyd według zastrz. 1, w którym R4 oznacza wodór.
20. Disacharyd według zastrz. 1, w którym R_t znajduje się w konfiguracji a.
21. Disacharyd według zastrz. 1, w którym R₃ oznacza wodór.
22. Disacharyd według zastrz. 1, w którym R₃ oznacza wodór.
23. Disacharyd według zastrz. 1, w którym Rg oznacza grupę hydroksylową.
24. Disacharyd według zastrz. 1, w którym R/ oznacza grupę fosfonową.
25. Disacharyd według zastrz. 1, obecny w postaci soli zawierającej jeden, lub większą ilość kationów.
26. Disacharyd według zastrz. 25, w którym kationami sąjony metali alkalicznych.
27. Sposób wytwarzania disacharydu β(1—>6) glukozoaminowego o wzorze ogólnym 1, w którym:

Rj oznacza grupę hydroksylową, grupę dihydroksyfosfonoiloksylową lub jej postacie naładowane, grupę (Cj-Cjjacyloksylową grupę (C^Cjjalkoksylową albo grupę o symbolu X;

R₂ i R₂' niezależnie oznaczają grupę acylowąlub grupę o symbolu Y, z tym, że co najmniej jeden z symboli R₂ lub R₂ oznacza grupę o symbolu Y;

R₃ i R₃' niezależnie oznaczają wodór, grupę (Cj-C^alkilowąlub grupę (C_rC₃)acylową;

R4 oznacza wodór, grupę (C]-C₃)alkilowąlub grupę (C_rC₃)acylową;

R4 oznacza wodór, grupę (CpCjjacylową, grupę (C₁-C₅)alkilową lub grupę fosfonową albo jej postacie naładowane;

R/ oznacza wodór, grupę hydroksylową, grupę dihydroksyfosfonoiloksylową lub jej postacie naładowane albo grupę o symbolu Z;

przy czym grupa o symboluX jest wybrana z grupy obejmującej grupę karboksy(C₁-C₅)alkiloksylową, grupę o wzorze -O-CH-KCH^COOH] [(CH^COOH], w którym m=0-5 i n=0-5; oraz postacie naładowane grupy o symbolu X;

grupa o symbolu Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę acyloksyacylową i grupę (C_rC₂₄)alkiloksyacylową;

grupa o symbolu Z jest wybrana z grupy obejmującej ketodeoksyoktonian (kwas 3 -deoksy-D-manno-2-oktulozonowy, KDO), ugrupowanie o wzorze (KDO)n, w którym η = 1 do 10, polisacharydowy łańcuch boczny, składnik rdzeniowy, znamienny tym, że: i) otrzymuje się substancję wyjściową zawierającą ugrupowanie lipidu A pochodzącego z drobnoustrojów zawierających lipopolisacharyd, i ii) poddaje się wspomnianą substancję wyjściową obróbce alkalicznej zapewniającej O-deacylację ugrupowania lipidu A w pozycji 3 i w pozycji 3'.
28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że stosuje się substancję wyjściową wybraną z grupy obejmującej drobnoustroje zawierające lipopolisacharyd, bakterie Gram-ujemne, frakcję tych drobnoustrojów i bakterii Gram-ujemnych zawierającą strukturę powierzchniową albo lipopolisacharyd pochodzący z tych drobnoustrojów i bakterii Gram-ujemnych.
29. Sposób według zastrz. 27 albo 28, znamienny tym, że jako substancję wyjściową stosuje się lipid A pochodzący z bakterii Gram-ujemnych.
30. Sposób według zastrz. 27 albo 29, znamienny tym, że przed obróbkąalkaliczną lub po niej, dokonuje się obróbki kwaśnej w celu usunięcia ugrupowania rdzeniowego i polisacharydowego łańcucha bocznego.
31. Kompozycja farmaceutyczna i środek immunomodulujący i/lub przeciwno wotworowy, zawierająca substancję czynną i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik, znamienna tym, że jako składnik czynny zawiera disacharyd β(1 —>6) glukozoaminowy o wzorze ogólnym 1, w którym:

Ri oznacza grupę hydroksylową grupę dihydroksyfosfonoiloksylową lub jej postacie naładowane, grupę (Ci-C₅)acyloksylową grupę (C_rC₅)alkoksylową albo grupę o symbolu X;

R₂ i R₂ niezależnie oznaczają grupę acylowąlub grupę o symbolu Y, z tym, że co najmniej jeden z symboli R₂ lub R₂ oznacza grupę o symbolu Y;

R₃ i R₃' niezależnie oznaczają wodór, grupę (CpCyalkilowąlub grupę (C_rC₃)acylową

R4 oznacza wodór, grupę (C_rC₃)alkiIowąlub grupę (Cj-Cjjacylową

R₄' oznacza wodór, grupę (Ci-C₅)acylową grupę (Cj-Cjjalkilową lub grupę fosfonową albo jej postacie naładowane;

R₆' oznacza wodór, grupę hydroksylową grupę dihydroksyfosfonoiloksylową lub jej postacie naładowane albo grupę o symbolu Z;

prz y czym grupa o symbolu X jest wybrana z grupy obejmującej grupę karboksy(Ci-C₅)alkiloksylową grupę o wzorze -O-CH-[(CH₂)_mCOOH] [(CH^COOH], w którym m=0-5 i n=0-5; oraz postacie naładowane grupy o symbolu X;

grupa o symbolu Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę acyloksyacylową i grupę (Ci -C₂₄)alkiloksyacylową grupa o symbolu Z jest wybrana z grupy obejmującej ketodeoksyoktonian (kwas 3-deoksy-D-manno-2-oktulozonowy, KDO), ugrupowanie o wzorze (KDO)n, w którym η = 1 do 10, polisacharydowy łańcuch boczny, składnik rdzeniowy.
32. Szczepionką zawierająca substancję czynną i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik i substancje pomocnicze, znamienna tym, że jako składnik czynny zawiera disacharyd β( 1 —>6) glukozoaminowy o wzorze ogólnym 1, w którym:

Rj oznacza grupę hydroksylową grupę dihydroksyfosfonoiloksylową lub jej postacie naładowane, grupę (Ci-C₅)acyloksylową grupę (CpCjjalkoksylową albo grupę o symbolu X;

R₂ i R₂ niezależnie oznaczają grupę acylowąlub grupę o symbolu Y, z tym, że co najmniej jeden z symboli R₂ lub R₂ oznacza grupę o symbolu Y;

R₃ i R₃ niezależnie oznaczają wodór, grupę (C₁-C₃)alkilowąlub grupę (CpC^jacylową

R^ oznacza wodór, grupę (C₁-C₃)alkilowąlub grupę (C_rC₃)acylową;

Ri' oznacza wodór, grupę (Ći-C₅)acylową grupę (C_rC₅)alkilową lub grupę fosfonową albo jej postacie naładowane;

R₆' oznacza wodór, grupę hydroksylową grupę dihydroksyfosfonoiloksylową lub jej postacie naładowane albo grupę o symbolu Z;

prz y czym grupa o symbolu X jest wybrana z grupy obejmującej grupę karboksy(Ci-C₅)alkiloksylową grupę o wzorze -O-CH-KCH^mCOOH] [(CH^COOH], w którym m = 0-5 i n = 0-5; oraz postacie naładowane grupy o symbolu X;

grupa o symbolu Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę acyloksyacylową i grupę (C i -C₂₄)alkiloksy acylową grupa o symbolu Z jest wybrana z grupy obejmującej ketodeoksyoktonian (kwas 3-deoksy-D-manno-2-oktulozonowy, KDO), ugrupowanie o wzorze (KDO)_n, w którym η = 1 do 10, polisacharydowy łańcuch boczny, składnik rdzeniowy.

* * *

Przedmiotem niniejszego wynalazku są specyficzne disacharydy β(1—>6) glukozoaminowe, a w szczególności 2-N- i/lub 2'-N-acylowane disacharydy glukozoaminowe, w których co najmniej jedna z grup acylowych ma łańcuch rozgałęziony, oraz związki zawierające tego rodzaju disacharydy. Wynalazek niniejszy dotyczy również sposobów wytwarzania takich disacharydów z substancji wyjściowych zawierających ugrupowanie lipidu A lipopolisacharydów, które to substancje wyjściowe poddaje się specjalnej obróbce alkalicznej. Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznych zawierających te disacharydy jako składnik aktywny, a także szczepionek oraz disacharydów jako środka immunomodulującego i/lub przeciwnowotworowego.

Lipopolisacharydy sąendotoksynami drobnoustrojów, takich jak bakterie Gram-ujemne, i obejmująskładnik polisacharydowy oraz składnik lipidowy. Ten składnik lipidowy, nazywany także lipidem A, określa endotoksyczne właściwości lipopolisacharydów [E.Th. Rietschel i in., Immunobiology, tom 186, str. 169 -190 (1993)]. WUS-A-4912094 ujawniono zmodyfikowane lipopolisacharydy, które przejawiająograniczone właściwości endotoksyczne, przy zachowaniu właściwości antygenowych i immunostymulujących. Te zmodyfikowane lipopolisacharydy są związkami 3-O-deacylowanymi i można je przekształcić, na drodze hydrolizy kwasowej, w 3-deacylowane disacharydy. Wśród tych związków monofosforylo-3-O-deacylowany-disacharyd wykazuje mniejszą toksyczność niż difosforylo-3-O-deacylowany-disacharyd.

Wynalazek niniejszy dotyczy disacharydów zarówno 3-O-deacylowanych jak i 3'-O-deacylowanych, zawierających w pozycji 3-0 i/lub w pozycji 3'-0 połączonąz atomem O grupę alkilową lub acylową o krótkim łańcuchu, oraz zawierających co najmniej jedną, związaną z atomem azotu, w pozycji 2, w pozycji 2' albo i w pozycji 2 i w pozycji 2', grupę acylowąo łańcuchu rozgałęzionym. Związki te przejawiająjeszcze bardziej obniżonąendotoksyczność, z zachowaniem aktywności biologicznej (takiej jak immunomodulacja). Wykazująone także aktywność przeciwnowotworową.

Zaskakujące, przy tym, było odkrycie, że te specyficzne disacharydy glukozoaminowe łączą w sobie właściwość mniejszej endotoksyczności z utrzymaniem aktywności biologicznej, ponieważ, aczkolwiek syntetyczne 3-0- i 3'-O-deacylowane disacharydy glukozoaminowe, zawierające związaną z atomem azotu grupę acylową w pozycji 2 i w pozycji 2' [związek 307, H. Takada i in., CRC Critical Reviews in Microbiology, tom 16, str. 477 - 523 (1989)], oraz związek LA-19-PP, Rietschel i in., (1993)] przejawiały w testach in vitro pewną aktywność immunobiologiczną, to jednak aktywność ta była o wiele słabsza od aktywności porównawczych próbek bakteryjnego lipidu A. Brak im było również typowej aktywności endotoksycznej.

Wynalazek niniejszy dotyczy disacharydów β(1 —>6) glukozoaminowych o wzorze ogólnym 1, w którym:

Ri oznacza grupę hydroksylową, grupę dihydroksyfosfonoiloksylową lub jej formy naładowane, grupę (Cj-Ć₅)acyloksylową, grupę (C₁-C₅)alkoksylową, albo grupę o symbolu X;

R₂ i R₂ niezależnie oznaczają grupę acylowąlub grupę o symbolu Y, z tym, że co najmniej jeden z symboli R₂ lub R₂ oznacza grupę o symbolu Y;

R₃ i R₃' niezależnie oznaczają wodór, grupę (Ci-C₃)alkilowąlub grupę (C₁-C₃)acylow^

R4 oznacza wodór, grupę (C₁-C₃)alkilowąlub grupę (Cj-CJacylową;

R4 oznacza wodór, grupę (CpCJacylową grupę (C₁-C₅)alkilową lub grupę fosfonową albo jej postacie naładowane;

R₆' oznacza wodór, grupę hydroksylową, grupę dihydroksyfosfonoiloksylową lub jej postacie naładowane albo grupę o symbolu Z, przy czym:

grupa o symbolu X jest wybrana z grupy obejmującej grupę karboksy(C₁-C₅)alkoksylową grupę o wzorze

-CH-[(CH₂)_mCOOH] [(CH₂)_nCOOH], w którym m = 0-5 i n = 0-5; oraz postacie naładowane grupy o symbolu X;

grupa o symbolu Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę acyloksyacylową grupę (C i -C₂₄)alkoksyacylo wą grupa o symbolu Z jest wybrana z grupy obejmującej ketodeoksyoktonian (kwas 3-deoksy-D-manno-2-oktulozonowy, KDO), ugrupowanie o wzorze (KDO)n, w którym η = 1 do 10, polisacharydowy boczny łańcuch, składnik rdzeniowy; oraz ich soli.

Omawiane disacharydy glukozoaminowe wykazują o wiele mniejszą endotoksyczność, według oznaczenia w teście z lizatem amebocytu skrzypłoczy (LAL), niż lipopolisacharydy (LPS) pochodzące, na przykład, z E. coli, lipid A i zmodyfikowany lipid A według US-A-4912094. Dalej, disacharydy glukozoaminowe według wynalazku indukują wytwarzanie reaktywnych azotowych związków pośrednich, takich jak tlenek azotu (NO) i cytokin, takich jak interleukina 1 - oc (IL 2- oc), IL-6, czynnik martwicy nowotworu (TNF) i prostaglandyna (PGE).

Oprócz tego, omawiane disacharydy przejawiają aktywność przeciwnowotworową taką jak, na przykład, działanie skierowane przeciw rakowi rozsianemu otrzewnej.

Wreszcie, toksyczność ostra tych disacharydów jest nadzwyczaj mała. Nie stwierdzono żadnych przypadków śmiertelnych u myszy Swiss po podaniu im drogą dożylną dawki wynoszącej 100 mg disacharydu na kilogram masy ciała.

Disacharyd glukozoaminowy według wynalazku [dimer β(1—>6) glukozoaminy], charakteryzuje się tym, że każda glukozoamina zawiera w pozycji 3 i 3' grupę hydroksylową lub związaną z atomem tlenu grupę alkilową lub grupę acylowąo krótkim łańcuchu, nie wpływającą w zasadniczym stopniu na zmianę endotoksyczności i/lub aktywności biologicznej, a następnie, w pozycji 2 lub 2', co najmniej jedną, połączoną z atomem N grupę acylową o łańcuchu rozgałęzionym. Pozostała pozycja 2' lub 2 jest zacylowana przy atomie azotu. Przypuszczalnie obecność dwóch łańcuchów hydrofobowych w pozycjach 2 i H (przy czym co najmniej jeden z nich występuj e w postaci grupy acy lowej o łańcuchu rozgałęzionym) nadaje disacharydowi kombinowaną właściwość polegającą na nadzwyczaj małej endotoksyczności i zachowywaniu przy tym aktywności biologicznej.

Grupę acylową o łańcuchu rozgałęzionym, określaną w niniejszym opisie jako grupa o symbolu Y, wybiera się z grupy obejmującej grupę acyloksyacylowąi grupę (C₁-C₂₄)alkiloaminoacylową.

W przypadku grupy acyloksyacylowej, dwie grupy acylowe połączone są ze sobąpoprzez atom tlenu. Grupę (Ci-C₂₄)alkiloaminoacylową można otrzymać wychodząc z odpowiedniego tłuszczowego hydroksykwasu.

Korzystnie, grupa o symbolu Y stanowi związaną z atomem azotu grupę acylowąo łańcuchu rozgałęzionym w pozycji 3, takąjak grupa 3-acyloksyacylowa. To samo dotyczy wspomnianych powyżej równoważnych grup (C j - C₂₄)alkil oaminoacylowych.

Korzystnie, człony grupy o symbolu Y obejmująjedno lub dwa ugrupowania acylowe, korzystnie wybrane spośród reszt kwasów tłuszczowych, reszt tłuszczowych hydroksykwasów oraz reszt tłuszczowych oksokwasów. W przypadku, gdy grupą acyloksyacylowąjest, korzystnie, grupa 3-acyloksyacylowa, tego rodzaju ugrupowania acylowe obejmują resztę 3-hydroksykwasu tłuszczowego, w przypadku grupy związanej estrowo, resztę 3-oksokwasu tłuszczowego. Typowymi przykładami grupy acy loksy acy lowej są takie grupy jak tłuszczowa grupa 3-hydroksy(C₄-C₂₄)acylowa związana estrowo w pozycji 3-hydroksy z (C_rC₂₄)kwasem karboksylowym. Korzystnie, grupą acyloksyacylową jest tłuszczowa grupa 3-hydroksy-(C₈-C₁₈)acylowa, związana estrowo w pozycji 3-hydroksy z (C₁₀-C₁₈)kwasem tłuszczowym. Tego rodzaju grupy acyloksyacylowe są obecne w lipidzie A, składowej substancji bakterii Gram-ujemnych, takich jak Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Campylobacter jejuni, Rhodocyclus gelatinosus, Chromabacterium violaceum, Neisseria meningitidis i Salmonella minnesota.

181 241

W pierwszej grupie korzystnych disacharydów glukozoaminowych według wynalazku, grupę acyloksyacylowąstanowi połączona z atomem azotu tłuszczowa grupa 3-hydroksy-C₁₄-acylowa, związana estrowo w pozycji 3-hydroksy z C₁₂-kwasem tłuszczowym, ze wspomnianą grupą acyloksyacylową w pozycji 2'. W innym korzystnym disacharydzie glukozoaminowym według wynalazku, grupę acyloksyacylową stanowi związana z atomem azotu tłuszczowa grupa 3-hydroksy-C₁₄-acylową związana estrowo w pozycji 3-hydroksy z C₁₄-kwasem tłuszczowym, przy czym wspomniana grupa acyloksyacylową znajduje się korzystnie w pozycji 2'.

W innym korzystnym disacharydzie glukozoaminowym według wynalazku, grupę acyloksyacylową stanowi związana z atomem azotu tłuszczowa grupa 3-hydroksy-C₁₄-acylową związana estrowo w pozycji 3-hydroksy z C_I2-kwasem tłuszczowym, przy czym wspomniana grupa acyloksylowa znajduje się w pozycji 2. W innym korzystnym disacharydzie glukozoaminowym według wynalazku, grupę acyloksyacylową stanowi związana z atomem azotu tłuszczowa grupa 3-hydroksy-C_I4-acylową związana estrowo w pozycji 3-hydroksy z C_]2-kwasem tłuszczowym, przy czym wspomniana grupa acyloksyacylową występuje zarówno w pozycji 2 jak i w pozycji 2'.

W przypadku, gdy grupa o symbolu Y zawiera centrum chiralności, wynalazek obejmuje swym zakresem wszystkie enancjomery R i S, a także jakiekolwiek mieszaniny racemiczne.

Innym związanym z atomem azotu podstawnikiem może być grupa acylową albo także grupa acyloksyacylową. Tak więc, w przypadku drugiej grupy disacharydów według wynalazku, grupę acylową stanowi grupa 3-hydroksy(C₄-C2₄)kwas tłuszczowy, korzystnie 3-hydroksy(C₁₀-C_lg)kwas tłuszczowy. W korzystnych disacharydach według wynalazku, grupę acylową stanowi grupa 3-hydroksy-C₁₄-kwas tłuszczowy, obecna w pozycji 2 lub w pozycji 2'.

Jednakże, związanym z atomem azotu podstawnikiem może być także grupa acyloksyacylowa zdefiniowana w powyższej części niniejszego opisu i stanowiąca związaną z atomem azotu tłuszczową grupę 3-hydroksy(C₄-C2₄)acylową związanąestrowo w pozycji 3-hydroksy z kwasem (C^Cjojkarboksylowym, korzystnie połączona z atomem azotu tłuszczowa grupa 3-hydroksy(C₈-C₁₈)acylowa, związana estrowo w pozycji 3 z (C₁₀-C_lg)kwasem tłuszczowym. Korzystniejszym jest disacharyd, w którym R₂ oznacza związaną z atomem azotu grupę 3-hydroksy-C₁₄-kwas tłuszczowy-acyl, związanąestrowo w pozycji 3-hydroksy z C₁₂-kwasem tłuszczowym lub C_J6-kwasem tłuszczowym i w którym R₂' oznacza związaną z atomem azotu grupę 3-hydroksy-Ci₄-kwas tłuszczowy-acyl, związanąestrowo w pozycji 3-hydroksy z C₁₂-kwasem tłuszczowym lub C₁₄-kwasem tłuszczowym. Należy zauważyć, że w ugrupowaniu o symbolu Y grupy acylowe i/lub grupa acylowa i alkilową mogąbyć ze sobą powiązane.

W niniejszym opisie, termin,,reszta kwasu tłuszczowego” oznacza: zasadniczo hydrofobowy łańcuch złożony z 2 - 30 atomów węglą który może być łańcuchem prostym, rozgałęzionym, nasyconym, jedno- lub wielonienasyconym, zawierającym wprowadzony do niego jeden, lub więcej niż jeden heteroatom, taki jak azot, tlen lub siarką przy czym łańcuch ten może być podstawiony jednym, lub większą ilością podstawników, takich jak grupa hydroksylową grupa okso, grupa acyloksylową grupa alkoksylową grupa aminowa, grupa nitrowa, grupa cyjanową chlorowiec i grupa sulfhydrylową pod tym warunkiem, że podstawienie takie nie wpływą w zasadniczy sposób, szkodliwie na aktywność biologiczną wytwarzanego związku. Przykład podstawionej reszty kwasu tłuszczowego (obejmującej podstawnik połączony wiązaniem amidowym) ujawnili K. Onozuka i in., (Int. J. Immunopharmac., tom 15, str, 657 - 664 (1993)].

Podstawnikiem o symbolu R] może być grupa (CpCsjacyloksylowa lub grupa (CpCjjalkiloksylową podczas gdy podstawnikiem o symbolu R/ może być grupa (Cj-Cjjacylowa lub grupa (Cj-C₅)alkilową pod warunkiem, że nie wpływają one szkodliwie na właściwości disacharydu glukozoaminowego. Następnie, podstawnikiem o symbolu R_r może być grupa hydroksylową a podstawnikiem o symbolu R4 może być wodór. Korzystnie, Rj i R/ mogą niezależnie oznaczać grupę zawierającąfosfor. W szczególności, grupa taka obecna w pozycji 1 lub w pozycji 4' może wpływać na aktywność biologiczną na przykład na odmienne stymulowanie cytokin [patrz: H. Takada i S. Kotani, Bacterial Endotoxic Lipopolysaccharides, D.C. Morrison i J. Ryaą CRC Press, tom 1, str. 107-134, (1992) - zwłaszcza str. 123]. Korzystne disacharydy według wynalazku

181 241 zawierają grupę dihydroksyfosfonoiloksylową w pozycji 1 oraz grupę fosfonową w pozycji 4', przy czym grupa znajdująca się w pozycji 1 korzystnie występuje w konfiguracji a.

Podstawnikiem o symbolu R| może także być grupa o symbolu X. Grupa o symbolu X jest, na ogół, naładowana ujemnie w warunkach fizjologicznego pH. Grupą o symbolu X może być grupa karboksy(C_rC₅)alkiloksylowa. Grupę o symbolu X może także stanowić kwas dikarboksylowy o wzorze -O-CH-ftCH^COOH] [(CH^COOH], w którym m=0-10,an=0-10,tak jak m i n=0, m i η = 1 oraz m = 1 i n=3. Podstawnik w postaci kwasu dikarboksylowego w pozycji 12, w którym m i η = 1 został ujawniony przez Onozukę i in. (1993).

Podstawnikami o symbolach R₃ i R₃' może być grupa alkilowa lub acylowa o krótkim łańcuchu, nie wpływająca szkodliwie na endotoksyczność i/lub aktywność biologiczną disacharydów glukozoaminowych według wynalazku. Przykładami są w tym przypadku takie grupy jak grupa (C₁-C₃)alkilowa i grupa (Ci-C₃)acylowa. Korzystnie, oba podstawniki o symbolach R₃ i R₃' stanowią atomy wodoru, co oznacza, że pozycja 3 i pozycja 3' nie sązacylowane.

Podstawnikiem o symbolu R4 w pozycji 4 może być grupa (Cj-C₃)alkilowa lub grupa (CpC^acylowa, których znaczenie zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu. Disacharyd 4-O-acylowany może zsyntetyzować z wykorzystaniem metody ujawnionej przez S. Kusumoto i in. [ACS Symposium Senes, tom 231, str. 237 - 254 (1983)]. Jednakże, korzystnie w pozycji 4 znajduje się grupa hydroksylowa (R₄ = H).

Podstawnikiem o symbolu R/ może być wodór, grupa hydroksylowa, grupa dihydroksyfosfonoiloksylowa, oraz ich postacie naładowane.

W celu zwiększenia rozpuszczalności disacharydów glukozoaminowych według wynalazku w wodzie, można polepszyć charakter hydrofitowy podstawnika znajdującego się w pozycji 6', wykorzystując grupę o symbolu Z. Grupę o symbolu Z może stanowić kwas 3-deoksy-D-manno-2-oktulozonowy (KDO), albo kilka cząstek KDO, tak jak mato miejsce w rdzeniu wewnętrznym naturalnych polisacharydów, w bezpośrednim sąsiedztwie ze składnikiem w postaci lipidu A.

Grupą o symbolu Z może być także całkowity lub częściowy łańcuch polisacharydowy, taki jak łańcuch boczny wywodzący się z naturalnego lipopolisacharydu albo składnik rdzeniowy wywodzący się z naturalnych lipopolisacharydów.

Z jednej strony, rozpuszczalność disacharydów według wynalazku w wodzie określona jest przez obecność grupy naładowanej, hydrofitowym charakterem podstawnika w pozycji 6'. Z drugiej strony, rozpuszczalność tych związków w wodzie ulega zwiększeniu wtedy, gdy disacharyd glukozoaminowy występuje w postaci soli, takiej jak sól zawierająca jeden, lub większą ilość kationów metali i/lub jon amoniowy, tworzących parę, na przykład, z grupami dihydroksyfosfonoiloksylowymi, grupami karboksylanowymi i grupami fosfonowymi, jeżeli są one obecne.

Disacharydy glukozoaminowe według wynalazku można otrzymywać z substancji wyjściowej zawierającej ugrupowanie lipidu A lipopolisacharydów występujących w drobnoustrojach, tycich jak bakterie Gram-ujemne. Tego rodzaju lipopolisacharydy obecne są na przykład, wtej frakcji otrzymanej z drobnoustrojów, która zawiera struktury powierzchniowe i wywodzące się z nich lipopolisacharydy. Korzystnymi bakteriami Gram-ujemnymi stosowanymi jako źródło substancji wyjściowej, sąEscherichia coli i Haemophilus influenzae. Jednakże, jako substancji wyjściowej użyć można także dostępnego w handlu LPS lub lipidu A.

Wynalazek niniej szy dotyczy także sposobu wytwarzania tych disacharydów glukozoaminowych przy użyciu substancji wyjściowej pochodzenia biologicznego, to znaczy jakiejkolwiek substancji wyjściowej zawierającej ugrupowanie lipidu A polisacharydów z drobnoustrojów, takich jak bakterie Gram-ujemne.