PL209075B1

PL209075B1 - Sposób testowania fenotypowej wrażliwości na lek oraz zestaw do określania fenotypowej wrażliwości na lek

Info

Publication number: PL209075B1
Application number: PL367829A
Authority: PL
Inventors: Clas Källander; Anders Malmsten; Simon Gronowitz; Xingwu Shao
Original assignee: Cavidi Tech Ab
Priority date: 2001-06-14
Filing date: 2002-06-14
Publication date: 2011-07-29
Also published as: EP1395676B1; AU2002309447B2; JP4455054B2; BR0210361A; PT1395676E; AP2003002923A0; BR0210361B1; ZA200309551B; PL367829A1; EA006161B1; AP1592A; EA200301244A1; DE60208788D1; JP2004530433A; BRPI0210361B8; CN1539022B; HK1065070A1; US20040170958A1; ATE316150T1; OA12620A

Abstract

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób testowania fenotypowej podatności na lek u ssaka zakażonego wirusem w otoczce przez wykonanie testu na enzymie znajdującym się w wirusie zaopatrzonym w otoczkę, takim jak wirus HIV, uzyskanym z próbki materiału biologicznego, takiego jak krew lub osocze, pobranego od tego osobnika. Sposób obejmuje etapy: a) dodania do próbki środka dezaktywującego enzymy w celu wyeliminowania aktywności polimeraz innych niż obecne w wirionie w otoczce b) usunięcia środka dezaktywującego enzymy, przeciwciał blokujących aktywność enzymów, inhibitorów aktywności enzymów endogennych i leków przeciwwirusowych c) dokonania lizy cząstki wirusa w celu uwolnienia enzymu d) odzyskania zatężonego, oczyszczonego enzymu wirusowego, takiego jak odwrotna transkryptaza (RT) HIV z etapu c) i oznaczenia profilu wrażliwości osobnika na lek na podstawie odzyskanego enzymu poprzez zastosowanie czułych testów enzymatycznych. Profil wrażliwości na lek można wykorzystać do doboru leczenia farmakologicznego. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także opakowanie handlowe.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób testowania fenotypowej wrażliwości na lek u ssaka zakażonego wirusem otoczkowym poprzez testowanie na polimerazie zawartej w wirusie otoczkowym uzyskanym z próbki biologicznej oraz zestaw do określania fenotypowej wrażliwości na lek u ssaka zakażonego wirusem otoczkowym.

Niniejszy wynalazek dotyczy testowania wrażliwości wirusów na leki, w szczególności sposobu testowania fenotypowej wrażliwości na leki u leczonego farmakologicznie ssaka zakażonego wirusem otoczkowym, takim jak retrowirus, na przykład ludzki wirus niedoboru odporności (HIV-1), przez testowanie na enzymie umieszczanym w wirusie otoczkowym, uzyskanym z próbki biologicznej pobranej od tego ssaka.

Stan techniki

Wrażliwość na leki przeciwko wirusowi HIV wiąże się z reakcją wirologiczną na nowe leki. Obecnie dostępne są standaryzowane testy oporności na leki, a dane z badań klinicznych sugerują, że stosowanie testowania wrażliwości na leki wiąże się z poprawą ocenianych wirologicznie wyników leczenia. Badanie oporności na leki jest jednak złożone pod względem wykonania, interpretacji i wykorzystania klinicznego.

Testy fenotypowe mierzą zdolność izolatu HIV do wzrostu w obecności leku - przeprowadza się je stosując testy oceniające stopień zahamowania replikacji wirusa przy różnym stężeniu leku. Z wyników oblicza się 50% lub 90% stężenie hamujące leku dla danego izolatu. Potencjalnym problemem przy stosowaniu klasycznych testów fenotypowych jest wpływ dryftu genetycznego w populacji wirusa w czasie izolowania wirusa. W najgorszym przypadku izolowany klon wirusa jest klonem wykazującym największą zdolność do wzrastania w warunkach in vitro, nie zaś klonem najobficiej występującym u pacjenta.

Pomiaru wrażliwości fenotypowej na lek można obecnie dokonywać przez wykonanie zautomatyzowanych testów opartych na technice rekombinacji DNA. W metodach tych wykorzystuje się powielanie RNA z osocza kodującego proteazę HIV i odwrotną transkryptazę (RT) oraz wytwarzanie wirusa rekombinowanego z innymi genami ze struktury laboratoryjnej (wirus kasetowy) [1]. Testy genotypowe mierzą częstość występowania pewnych mutacji w genach, na które ukierunkowane są leki przeciwretrowirusowe. Oporność fenotypowa oznacza wrażliwość wirusa na lek, natomiast genotypowanie wykrywa mutacje nadające oporność fenotypową. Wstępnym etapem obu tych testów i testów fenotypowych wirusów rekombinowanych jest powielanie metodą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) sekwencji HIV-1 z osocza, zawierających od 500 do 1000 kopii RNA na mililitr. W zależności od ocenianych mutacji i od laboratorium wykonującego test, testy genotypowe mogą rozróżniać mutant na poziomie od 10 do 50% w mieszaninie wirusów. Złożoność danych uzyskiwanych z sekwencjonowania prowadzi do trudności w interpretacji wyników. Interpretacja może się różnić w odniesieniu do poziomu oporności fenotypowej nadawanego przez dany wzorzec mutacji. W miarę generowania nowych danych istnieje ryzyko niewłaściwej lub nawet błędnej interpretacji [2]. Mechanizm reakcji dla wszystkich dotychczas stosowanych leków przeciwwirusowych zakłóca reakcję enzymatyczną proteazy wirusowej lub RT. W zależności od wydajności testów enzymatycznych i zastosowanych technik izolowania wirusa testowanie wrażliwości na leki można teoretycznie przeprowadzać na nadsączach z propagacji hodowli wirusa, na pierwotnych izolatach wirusa lub na preparatach wirusa uzyskiwanych bezpośrednio od pacjentów.

Badanie wrażliwości na leki na RT z pierwotnych izolatów wirusa zapewnia dwie korzyści w porównaniu z tradycyjnymi testami hamowania replikacji wirusa: krótszy jest czas propagacji wirusa i co ważniejsze mniejsza jest selekcja populacji wirusów. Idealna byłaby taka sytuacja, w której możliwa byłaby charakterystyka enzymów ekstrahowanych bezpośrednio z wirusa krążącego we krwi pacjenta. Korzyścią z zastosowania takiej metody byłoby to, że próbka odzwierciedlałaby populację wirusów obecną u pacjentów w momencie pobierania próbki krwi. Dotychczas nie było to w praktyce możliwe, jednak założenie to badano poprzez testowanie oporności za pomocą testu Amp RT opartego na PGR i [3].

RT HIV-1, podobnie jak inne podobne odwrotne transkryptazy, uczestniczy w trzech różnych reakcjach enzymatycznych: zależnej od RNA polimeryzacji DNA, zależnej od DNA polimeryzacji DNA i rozpadzie RNA w hybrydzie DNA-RNA (RNAza H). RT HIV, kodowana przez gen pol, jest heterodimerem złożonym z podjednostek p66 i p51. Zarówno za zależną od RNA polimeryzację DNA, jak i za zależną od DNA polimeryzację DNA odpowiada to samo miejsce aktywne, znajdujące się w podjednostce p66. p51 powstaje poprzez usunięcie cech C-końcowego fragmentu p66, odpowiadającego

PL 209 075 B1 domenie RNAzy H [4]. Wszystkie inhibitory RT obecnie zarejestrowane do zastosowania klinicznego hamują aktywność polimerazową enzymu. Mechanizm reakcji tych leków określa głównie ich wpływ na reakcję zależnej od RNA polimeryzacji DNA. Wpływ na reakcję zależnej od DNA polimeryzacji DNA jest względnie mniej poznany.

Konwencjonalny test aktywności RT wykonuje się stosując sztuczną strukturę matrycy i startera oraz wyznakowany trifosforan deoksynukleotydu jako substrat nukleotydowy. Para matryca/starter poli(rA)/oligo(dT) jest najskuteczniejszym i najszerzej stosowanym połączeniem służącym do oznaczania HIV, jak również innych transkryptaz retrowirusowych. Wadą tego typu testów w odniesieniu do testowania wrażliwości na leki jest to, że można badać tylko analogi nienukleozydowe lub analogi, które mogą tworzyć pary zasad z rA. Analogi do innych zasad nukleotydowych będą wymagać testu opartego na zmiennej matrycy polimerowej.

Wszystkie dotychczas zarejestrowane leki przeciwretrowirusowe zakłócają reakcję enzymatyczną proteazy wirusowej lub RT. Ponadto w ostatniej fazie badań przed rejestracją są leki wpływające na funkcję integrazy retrowirusowej.

Inhibitory RT są analogami nukleozydowymi lub analogami nienukleozydowymi. Inhibitory nienukleozydowe wiążą się z kieszonką hydrofobową w enzymie RT w pobliżu miejsca czynnego, jednak nie stanowią przedłużenia miejsca czynnego. Replikacja HIV-1 ulega zahamowaniu allosterycznemu poprzez przemieszczenie katalitycznych reszt asparaginianowych w stosunku do wiązania polimerazy. Oporność pojawia się zwykle szybko przy podawaniu środków nienukleozydowych w postaci monoterapii lub przy niedostatecznej supresji wirusów. Do tej pory FDA zarejestrowało do zastosowania klinicznego jedynie trzy inhibitory nienukleozydowe: Nevirapine, Efavirenz i Delaviridine.

Obecnie stosowane inhibitory nukleozydowe powodują terminację wydłużania łańcucha DNA, ponieważ brak w nich grupy 3'-hydroksylowej. Długotrwałe leczenie inhibitorami nukleozydowymi często prowadzi do powstania opornego wirusa. Procesowi temu towarzyszy stopniowe pojawianie się mutacji w genie pol wirusa; każda z tych mutacji prowadzi do określonych substytucji aminokwasowych [5]. Wpływ tych substytucji na poziomie enzymatycznym jest złożony i obejmuje wzmożenie prymitywnej funkcji redagowania DNA. Reakcja ta zależy od nukleotydów i powoduje wytworzenie polifosforanu dinukleozydowego i wydłużalnego 3'-końca DNA [6].

Leczenie HIV obecnie opiera się na terapii wielolekowej. Schematy leczenia oparte są na podawaniu połączeń wszystkich trzech dostępnych typów leków: analogów nukleozydowych, analogów nienukleozydowych i inhibitorów proteaz. Celem tej strategii jest zminimalizowanie prawdopodobieństwa przeżycia zmutowanego wirusa. W przypadku, gdy stwierdza się wirologicznie niepowodzenie dotychczasowej terapii, zaleca się obecnie przejście na całkowicie nowy zestaw leków. Jest to trudne, ponieważ wiele osób HIV-dodatnich stosowało już tak wiele leków, że nie jest możliwe znalezienie trzech lub więcej leków, których jeszcze nie przyjmowały. Ponadto decyzja o wycofaniu leku, który w rzeczywistoś ci nadal jest skuteczny, jest swego rodzaju marnotrawstwem. Poprawa testowania wrażliwości na leki umożliwiłaby usuwanie z danego połączenia leków jedynie leków nieskutecznych.

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób określania fenotypowej wrażliwości na lek u ssaka zakażonego wirusem otoczkowym poprzez testowanie na polimerazie zawartej w wirusie otoczkowym odzyskanym z próbki biologicznej od tego ssaka, polegający na tym, że obejmuje następujące etapy, w których:

a) do próbki dodaje się środek inaktywujący enzym wybrany spośród środków modyfikujących cysteinę, korzystnie kwas 5-5'-ditiobis-(2-nitrobenzoesowy), w celu inaktywacji aktywności polimerazy innej niż aktywność obecna w wirionie otoczkowym.

b) oczyszcza się i zatęża wirusa otoczkowego poprzez usuwanie środka inaktywującego enzym, przeciwciał blokujących aktywność enzymatyczną, endogennych inhibitorów aktywności enzymatycznej i leków przeciwwirusowych,

c) poddaje się lizie cząstkę wirusową w celu uwolnienia polimerazy,

d) odzyskuje się zatężoną oczyszczoną polimerazę wirusową otrzymaną w punkcie c) i oznacza się profil wrażliwości na lek danego osobnika z uzyskanej polimerazy poprzez pomiar jej aktywności w obecności seryjnie rozcieńczonych leków z zastosowaniem ilościowych testów enzymatycznych.

Korzystnie ssakiem jest człowiek.

Korzystnie jako próbkę biologiczną stosuje się próbkę krwi.

Korzystniej jako próbkę krwi stosuje się próbkę osocza. Jeszcze korzystniej jako wirusa otoczkowego stosuje się retrowirusa.

PL 209 075 B1

Najkorzystniej jako retrowirusa stosuje się ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), a jako enzym odwrotną transkryptazę (RT) HIV.

Przedmiotem wynalazku jest też zestaw do określania fenotypowej wrażliwości na lek u ssaka zakażonego wirusem otoczkowym jak określono powyżej charakteryzujące się tym, że zawiera środek inaktywujący enzym do inaktywacji aktywności polimerazy wybrany spośród środków modyfikujących cysteinę, korzystnie jak kwas 5-5'-ditiobis-(2-nitrobenzoesowy), ilościowy test aktywności polimerazy oraz co najmniej jeden lek przeciwwirusowy jako lek referencyjny.

Zgodnie z wynalazkiem opisano procedurę przeprowadzania testu fenotypowej oporności na lek na enzymie uzyskiwanym bezpośrednio z próbek osocza pacjenta. Procedura ta oparta jest na połączeniu sposobów uzyskiwania enzymów wirusowych w zasadzie wolnych od swych odpowiedników komórkowych i następnie na ich oznaczaniu czułymi testami enzymatycznymi.

Opisaną technikę izolowania enzymów można stosować dla dowolnego enzymu umieszczonego w wirusie otoczkowym, jednak jej zastosowanie opisane w niniejszym zgłoszeniu zbadano do tej pory jedynie poprzez wykorzystanie do testowania wrażliwości na leki odwrotnej transkryptazy, uzyskanej z osocza.

Zgodnie z wynalazkiem opisano zatem sposób testowania fenotypowej wrażliwości na leki u ssaka zakaż onego wirusem otoczkowym poprzez testowanie na enzymie wprowadzonym do wirusa otoczkowego uzyskanego z próbki biologicznej od tego ssaka, obejmujący następujące etapy:

a) dodawania środka inaktywującego enzym do próbki w celu inaktywacji aktywności polimerazowej innej niż aktywność obecna w wirionie otoczkowym,

b) usuwania środka inaktywującego enzym, przeciwciał blokujących aktywność enzymatyczną, endogennych inhibitorów aktywności enzymatycznej i leków przeciwwirusowych,

c) lizy cząstki wirusowej w celu uwolnienia enzymu,

d) uzyskiwania zatężonego oczyszczonego enzymu wirusowego z punktu c) i oznaczenie profilu wrażliwości na lek u danego pacjenta na podstawie uzyskanego enzymu z zastosowaniem czułych testów enzymatycznych.

W jednym z wykonań takiego sposobu ssakiem jest czł owiek.

W korzystnym wykonaniu próbką biologiczną jest próbka krwi, na przykł ad próbka osocza. W innym korzystnym wykonaniu wirusem otoczkowym jest retrowirus, taki jak ludzki wirus niedoboru odporności (HIV). W tym ostatnim przypadku enzymem jest, korzystnie, odwrotna transkryptaza (RT) HIV.

Profil wrażliwości na leki danego pacjenta, uzyskany z zastosowaniem sposobu według niniejszego wynalazku, można wykorzystać do dobrania terapii farmakologicznej dla tego pacjenta. W praktyce u ssaka zakażonego wirusem otoczkowym badanie profilu wrażliwoś ci na lek będzie prowadziło się w kilku punktach czasowych w celu monitorowania rozwoju zakażenia i leczenia lekami przeciwwirusowymi u tego pacjenta.

Zgodnie z wynalazkiem opisano również zestaw zawierający, pisemne lub zawarte na nośnikach danych instrukcje badania fenotypowej wrażliwości na lek u zakażonego wirusem otoczkowym ssaka sposobem według niniejszego wynalazku i środek inaktywujący enzym do inaktywacji aktywności polimerazy, czuły test enzymatyczny i co najmniej jeden lek referencyjny.

Wynalazek zilustrowano poniżej za pomocą następującego nieograniczającego opisu wykonań i rysunków wynalazku.

Treść cytowanych pozycji piśmiennictwa włącza się do niniejszego opisu przez odesłanie.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 przedstawia korelację między uzyskaną RT HIV-1 a RNA wirusowym, mierzoną przez PCR RNA.

Fig. 2 przedstawia związek między ilością RT zastosowanej w testach wrażliwości na leki a stwierdzonymi wartoś ciami IC50. Symbole: (◊) RT typu dzikiego, Efavirenz; (♦) RT L100, Efavirenz; (ο) RT typu dzikiego, AZT-TP; (•)RT T215Y, AZT-TP.

Opis wykonań

Zastosowana procedura składa się z czterech różnych etapów: I) Inaktywacji aktywności polimerazy gospodarza obecnej w próbce bez wpływu na enzymy wirusowe obecne w zamkniętym wirionie otoczkowym. II) Usunięcia środka inaktywującego enzym, przeciwciał blokujących aktywność enzymatyczną, endogennych inhibitorów aktywności enzymatycznej i leków przeciwwirusowych. III) Uzyskania zatężonego oczyszczonego enzymu wirusowego. IV) Oznaczenia profilu wrażliwości na leki uzyskanego enzymu.

PL 209 075 B1 (Etapy I-III) Protokół izolowania RT wirusowej z materiału zawierającego przeciwciała blokujące RT, oparty na niszczeniu rozpuszczalnych enzymów komórkowych i następnie izolowaniu RT wirusowej z minikolumn

1) Nanieść oznaczenia na przeznaczone do wykorzystania probówki plastykowe o pojemności 4,5 ml.

Umieścić je w pudle Nalgene. Dodać 1 ml próbki (na przykład osocza z EDTA od pacjentów zakażonych HIV) do każdej oznaczonej probówki. Dodać 100 μΐ 66 mM roztworu kwasu 5, 5'-ditiobis (2-nitrobenzoesowego) w zbuforowanej wodzie, zmieszać na worteksie i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

W tym procesie zniszczeniu ulega aktywność wolnych enzymów osoczowych, natomiast enzymy znajdujące się w wirionach pozostają nienaruszone. Następnie można oczyszczać wiriony z kwasu 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoesowego), przeciwciał blokujących aktywność enzymatyczną i innych substancji, które mogłyby zakłócać ilościowe oznaczenie RT wirusowej, kilkoma sposobami oddzielania. Poniższy protokół opiera się na zastosowaniu żelu Fractogel® EMD TMAE Hicap gel.

2) Zawiesić ostrożnie żel oddzielający i przenieść 1500 μl tej zawiesiny żelu do każdej probówki do obróbki wstępnej próbki.

3) Próbki inkubować z zawiesiną żelu przez 90 minut w temperaturze pokojowej; probówki powinny być umieszczone poziomo na wytrząsarce orbitalnej.

4) Oznaczyć pożądaną ilość 10 ml plastykowych minikolumn do identyfikacji analizowanych próbek. Zamontować kolumny w urządzeniu do płukania kolumn, na przykład w rozgałęzionym aparacie do próżniowej ekstrakcji na fazie stałej Supelco Vsiprep. Zawartość probówek przenieść do odpowiednich kolumn. Przed przeniesieniem probówkę krótko zmieszać na worteksie, celem równomiernego rozmieszczenia żelu.

5) Po napełnieniu wszystkich kolumn przyłożyć próżnię i odessać żele do sucha. Próżnię wyłączyć i rozpocząć płukanie, napełniając każdą kolumnę 9 ml buforu A. Po napełnieniu wszystkich kolumn przyłożyć próżnię i odessać żele do sucha.

6) Powtórzyć etap 5 jeszcze trzy razy, tak aby razem przeprowadzić cztery płukania. Odessać żele do sucha po każdym płukaniu. Po odessaniu żeli do sucha po czwartym płukaniu próżnię wyłączyć i przejść do etapu 7.

W etapie płukania z systemu usuwa się niezwiązane przeciwciała blokujące RT oraz kwas 5,5'- ditiobis-(2-nitrobenzoesowy).

7) Do wszystkich wysuszonych żeli dodać po 9 ml buforu kondycjonującego (B). Po jednej minucie przyłożyć próżnię i odessać żele do sucha.

8) Powtórzyć etap 7. Przed wyłączeniem próżni upewnić się, że ze wszystkich porcji żelu usunięta została całość buforu kondycjonującego (B).

9) Unieść górną część urządzenia do płukania kolumn. Do czystego pojemnika wprowadzić podstawkę na probówki z oznakowanymi probówkami. Z powrotem nałożyć górną część urządzenia. Upewnić się, że drobne przewody z każdej kolumny biegną do odpowiednich probówek.

10) Do każdej kolumny dodać 600 μl buforu do lizy (C). Pozostawić bufor w kolumnie przez 5 minut. Następnie powoli przyłożyć próżnię i odessać żele do sucha. W każdej tubie uzyskuje się w ten sposób około 600 μl lizatu wirusa z połączonego żelu.

Aktywność RT uzyskana w lizatach z etapu 10 jest w zasadzie wolna od przeciwciał blokujących RT, leków i aktywności polimerazy komórkowej i można ją oznaczać ilościowo czułym testem aktywności RT, tzn. Cavidi HS-kit Lenti RT, opartym na sposobie opisanym przez Ekstranda i wsp.

[7]. 25 μl lizatu uzyskanego sposobem według wynalazku wystarcza do oznaczenia aktywności RT w próbce. Pozostałą część próbki 575 μl należy zamrozić w temperaturze -70°C lub niższej do późniejszego zastosowania w teście wrażliwości na leki.

Uwaga: enzymy RT, które nie są wrażliwe na środki modyfikujące cysteinę, na przykład RT HIV-1 typu dzikiego, można ewentualnie testować w obecności do 5 mM kwasu 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoesowego). Z drugiej strony enzymy wrażliwe, takie jak RT MULV i RT z pewnych opornych na leki szczepów HIV-1 (zawierających na przykład mutację Y181C), wymagają dodania do buforu do lizy środka redukującego grupy sulfhydrylowe, na przykład cysteiny lub cysteaminy.

(Etap IV) Protokół oznaczania wrażliwości na leki aktywności RT w lizatach

Do oznaczenia poziomu aktywności RT w badanych preparatach wirusów wykorzystano modyfikację kolorymetrycznego testu RT (Cavidi® HS-kit Lenti RT), dostępnego w firmie Cavidi Tech, Uppsala, Szwecja. Pokrótce, poli(rA) kowalencyjnie związane ze studzienkami 96-studzienkowej płytki do mikromiareczkowania służy jako matryca do włączania 5'-trifosforanu 5-bromodeoksyurydyny

PL 209 075 B1 (BrdUTP) w etapie odwrotnej transkrypcji w temperaturze 33°C. Ilość monofosforanu bromodeoksyurydyny (BrdUMP), włączonego do DNA, wykrywa się fosfatazą alkaliczną (Ap) sprzężoną z przeciwciałem monoklonalnym anty-BrdU. Substrat Ap - fosforan 4-metyloumbeliferylu - ostatecznie wykorzystuje się do wykrywania fluorymetrycznego. Ilość RT z izolatu stosowanego do oznaczania IC50 dla analogów nukleozydowych standaryzowano do aktywności odpowiadającej 5 fg (4,3 x 10^-20 mol) referencyjnej RT HIV-1 na studzienkę, natomiast w przypadku analogów nienukleozydowych stosowano 1,7 fg (1,5 x 10^-20 mol) RT. Lizaty rozcieńczano w „lizatach pozorowanych, tzn. w lizatach wytworzonych z rozdzielania niezakaż onej pł odowej surowicy cielę cej.

Badania hamowania RT przeprowadzono w dwóch różnych zmodyfikowanych wersjach testu HS Lenti RT.

Analogi nienukleozydowe seryjnie rozcieńczano w 5 etapach w mieszaninie reakcyjnej RT i próbki, po 25 μ l, przenoszono do każ dej studzienki na pł ytce do mikromiareczkowania, gdzie mieszano je ze 125 μΐ mieszaniny reakcyjnej RT i zapoczątkowywano reakcję enzymatyczną poprzez dodanie 25 μl rozcieńczonego lizatu. Ostateczne stężenie substratu nukleotydowego (BrdUTP) wynosiło 16 μM, a ilość startera (odT₂₂) - 12 ng na studzienkę. Analogi dT seryjnie rozcieńczano w pięciu etapach w mieszaninie reakcyjnej do terminacji łańcucha i próbki po 25 μl przenoszono do każdej studzienki płytki do mikromiareczkowania, gdzie mieszano je ze 125 μl mieszaniny reakcyjnej do terminacji łańcucha RT i zapoczątkowywano reakcję enzymatyczną poprzez dodanie 25 μl rozcieńczonego lizatu. Ostateczne stężenie substratu nukleotydowego (BrdUTP) wynosiło 1,5 μM, natomiast ilość startera (odT22) - 12 ng na studzienkę. W przypadku inhibitorów RT, zarówno nukleozydowych jak i nienukleozydowych, reakcję RT pozostawiano na noc (16-24 godzin w temperaturze 33°C). Następnie reakcję kończono przez przepłukanie płytki. Wartość IC50 zdefiniowano jako stężenie leku powodujące 50% zahamowanie badanej aktywności RT.

Materia ły

Żel rozdzielający: na przykład Fractogel® EMD TMAE lub Fractogel® EMD TMAE Hicap w 314 mM kwasu (2-(N-morfolino)etanosulfonowego) (MES), pH 5,1, 413 mM jodku potasowego i heparynie 0,5 mg / ml.

Minikolumny, na przykład Biorad Poly-Prep® (7311553).

Urządzenie do płukania minikolumn, to znaczy rozgałęzione urządzenie do próżniowej ekstrakcji na fazie stałej Supelco Visiprep.

Probówki plastykowe, na przykład kriogeniczne 4,5 ml Nunc.

Płytki do mikromiareczkowania z unieruchomionym prA, to znaczy Nalge Nunc NucleoLinck®.

Środek modyfikujący cysteinę, na przykład 66 mM kwas 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoesowy), w wodzie zbuforowanej 0,87 M Tris(hydroksymetylo)aminometanu (pH 8,3).

Łagodny środek redukujący grupy sulfhydrylowe, na przykład 33 mM cysteamina w wodzie.

Leki przeciwwirusowe:

Trifosforan 3'-azydo-2',3'-deoksytymidyny (AZT-TP) i trifosforan (2',3'-didehydro-3'-deoksytymidyny (d4T-TP) nabyto w firmie Moravek Biochemicals, Kalifornia, Stany Zjednoczone. Nevirapine (11-cyclopropylo-5,11-dihydro-4 metylo-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'- f] [1,4]diazepinon-6) (NVP),

Delaviridine - sulfonianomonometan 1-(5' metanosulfonoamido-1H-indolilo-2-karbonylo)-4-[3-(1-metylo-etyloamino)pirydynylo]piperazyny (DLV) i Efavirenz - (-)6-chloro-4-cyklopropyloetynylo-4-trifluorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazynon-2) (EFV) nabyto w firmie Apoteksbolaget, Uppsala, Szwecja.

Próbki osocza od pacjentów zakażonych HIV

Próbki osocza od pacjentów uprzednio nieleczonych lub pacjentów otrzymujących standardową terapię łączoną dobierano retrospektywnie. Zakodowane próbki dostarczano w postaci zamrożonej jako dwa różne panele odpowiadające grupom pacjentów, odpowiednio, z opornością na NNRTI i T-analogi. Ilość RNA HIV-1 w każdej próbce oznaczano standardową PCR RNA HIV-1 (Cobas, Roche Diagnostica), a genotyp wirusa obecnego w próbce analizowano za pomocą zestawu do genotypowania TRUGENE™ HIV-1 Genotyping kit (Visible Genetics).

Rekombinowane enzymy RT:

Wytworzono zmutowane postacie RT oporne na NNRTI (L100I, K103N, L100I/K103N, Y181C). Jako matrycę do mutacji zastosowano wektor ekspresyjny pETRT, który skonstruowano z izolatu BH10. Mutacje wytworzono, stosując dostępne w handlu zestawy do mutagenezy ukierunkowanej - QuikChange (Stratagene). Mutacje potwierdzono analizą sekwencji DNA. Zmutowane i natywne postacie RT izolowano w sposób uprzednio opisany [8].

PL 209 075 B1

RT rekombinowane z mutacjami swoistymi dla AZT wytwarzano poprzez wprowadzanie mutacji do regionu kodującego RT fragmentu enzymu restrykcyjnego HXB2-D EcoRI - Ndel typu dzikiego klonowanego do wektora ekspresyjnego pKK233-2 (Amersham Biotech). Mutacje wytwarzano stosując dostępne w handlu zestawy do mutagenezy ukierunkowanej - QuickChange (Stratagene). Zmutowane klonowane wektory ekspresyjne transformowano do szczepu E. coli XL1-Blue, a genotypy weryfikowano przez analizę sekwencji DNA

Zastosowane bufory:

A) Bufor do płukania: 20 mM MES, pH 5,4, 500 mM octanu potasu (KAc).

B) Bufor kondycjonujący. Bufor wykazujący zgodność z testem RT, na przykład 50 mM kwasu (N-(2-hydroksyetylopiperazyno-N'-(2-etanosulfonowego) (HEPES), pH 7,6, KAc 25 mM, chlorek magnezu (MgCl₂) 20 mM, kwas etylenoglikolo-bis(eter e-aminoetylowy)N,N,N',N'-tetraoctowy (EGTA) 0,2 mM, spermina 2 mM i inaktywowana cieplnie albumina surowicy bydlęcej (BSA) 0,5 mg/ml.

C) Bufor do lizy: wykazujący zgodność z testem RT bufor, w skład którego wchodzi detergent, na przykład 1,25% eter polioksyetylenowo-4-laurylowy (Brij 30), 13 ng / ml odT22 i te same składniki, co obecne w buforze kondycjonujacym (B). Ewentualnie przy obróbce wirusów z RT wrażliwą na utlenianie/modyfikację grup SH dodaje się środek redukujący grupy sulfhydrylowe, to znaczy 0,2 mM cysteaminę.

D) Mieszanina reakcyjna RT, na przykład 10 mM HEPES, pH 7,6, 19 μΜ BrdUTP, 80 ng/ml odT₂₂, 4 mM MgCl2, 0,5 g/l siarczanu dekstranu, 2 mM sperminy, Triton-X 100 0,5%(obj.), EGTA 0,2 mM i BSA 0,5 mg/ml.

E) Mieszanina reakcyjna do terminacji łańcucha: HEPES 10 mM, pH 7,0, BrdUTP 1,75 μM, odT22 80 ng/ml, MgCl2 10 mM, ATP 7 mM siarczan dekstranu 0,05 g/l, spermina 2 mM, Triton-X 100 0,5%(obj.), EGTA 0,2 mM i BSA 0,5 mg/ml.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

Korelacja między uzyskaną RT HIV-1 a RNA wirusowym, miierzona przy użyciu PCR RNA ml próbek osocza EDTA od pacjentów zakażonych HIV poddawano obróbce zgodnie z „Protokołem izolowania RT wirusowej z materiału zawierającego przeciwciała blokujące RT, opartym na niszczeniu rozpuszczalnych enzymów komórkowych i następnie izolowaniu RT wirusowej z minikolumn, po czym oznaczano ilościowo aktywność RT uzyskanej z każdej próbki w teście RT, przeprowadzanym przez noc, z użyciem zestawu Cavidi® HS-kit Lenti RT. Uzyskaną aktywność RT przeliczano na fg RT HIV-1/ml osocza według wewnętrznej krzywej wzorcowej. Ilość RNA HIV-1 w każdej próbce oznaczano poprzez standardową PCR RNA HIV-1 (Roche Amplicor). Wykres ograniczano do próbek o wartościach PCR powyżej 500 kopii/ml. Stwierdzono silną korelację między ilością uzyskanej RT osocza a ilością RNA HIV oznaczoną za pomocą PCR (r=0,93, n=33, p<<0,001) - zob. fig. 1.

Na podstawie tego przykładu można wywnioskować, że obróbka 1 ml osocza od pacjenta, u którego obecnych jest 50000 kopii RNA HIV/ml osocza, da w wyniku uzyskanie około 200 fg aktywności RT. Przy zastosowaniu 1,7 fg RT na test ilość ta odpowiada 118 testom, które można wykonać celem oznaczenia profilu wrażliwości izolowanej RT na leki.

P r z y k ł a d 2

Wpływ ilości zastosowanej RT w testach wrażliwości na leki

Wpływ NNRTI, AZT-TP i d4T-TP na wskazane rekombinowane RT HIV-1 oznaczano zgodnie z „Protokołem oznaczania wrażliwości na leki aktywności RT w lizatach stosując wskazane stężenie RT. Fig. 2 ilustruje związek między ilością RT zastosowanej w testach wrażliwości na leki a stwierdzonymi wartościami IC50. IC50 dla NNRTI, takich jak Efavirenz, nie ulegały żadnym zmianom zależnym od ilości RT w badanym zakresie. Spośród badanych NNRTI AZT-TP wykazuje największą zmienność w odniesieniu do ilości RT użytej w teście. Zmienność ta była maksymalna dla RT typu dzikiego; IC50 zwiększała się z 0,13 do 0,22 μM przy zwiększaniu ilości RT z 2 do 162 fg/studzienkę (Fig. 2).

Ilościowa aktywność RT dostępna w próbkach osocza wyznacza granice opisanych tu testów. Do uzyskania powtarzalnych wartości IC50 dla badanych leków niezbędny jest sygnał przekraczający co najmniej 5-krotnie wartość tła. Mała zmienność wartości IC50 przy dodawaniu coraz większych ilości RT do testu sprawia, że oznaczanie wrażliwości na leki jest możliwe bez uprzedniej standaryzacji ilości RT stosowanych w poszczególnych testach.

PL 209 075 B1

P r z y k ł a d 3

Porównanie wpływu inhibitorów nienukleozydowych na rekomibinowaną RT HIV-1 z określonymi mutacjami

Wpływ trzech inhibitorów nienukleozydowych na wskazaną rekombinowaną RT HIV-1 określano według „Protokołu oznaczania wrażliwości na leki aktywności RT w lizatach. Ilość każdej RT standaryzowano, tak aby odpowiadała aktywności równe] 1,7 fg/studzienkę naszej RT referencyjnej. Czas trwania reakcji RT wynosił 19 godzin, a uzyskaną aktywność przeliczano na procent aktywności tej samej RT inkubowanej w nieobecności inhibitora.

Dane fenotypowe znaleziono w piśmiennictwie („International antiviral news i bazie danych na stronie http://stanford.edu/hiv) (tabela 1).

Ogólnie stwierdzono istnienie silnej korelacji między wartościami IC50 z testu hamowania RT a danymi fenotypowymi wedł ug piś miennictwa. Zawsze moż liwe był o dostrzeż enie RT pochodzą cych z wirusów wysoce opornych lub ś rednio opornych (Tabela 1).

P r z y k ł a d 4

Porównanie wpływu analogów dT na rekombinowaną RT HIV-1 z określonymi mutacjami

Wpływ AZT-TP i dT4 na wskazaną rekombinowaną RT HIV-1 oznaczano zgodnie z „Protokołem oznaczania wrażliwości na leki aktywności RT w lizatach. Ilość każdej RT standaryzowano tak, aby odpowiadała aktywności 5 fg/studzienkę naszej RT referencyjnej. Czas trwania reakcji RT wynosił 19 godzin, a uzyskaną aktywność przeliczano na procent aktywności tej samej RT inkubowanej w nieobecnoś ci inhibitora.

Dane fenotypowe znaleziono w piśmiennictwie („International antiviral news i bazie danych (http://stanford.edu/hiv) (tabela 2).

Mieszanina reakcyjna do terminacji łańcucha, stosowana do oznaczania wrażliwości leków T-analogowych, powinna być zdolna do podtrzymania zależnej od energii reakcji fosforolizy. Niestety, skuteczna reakcja fosforolizy szybko przekłada się na zmniejszenie prędkości polimeryzacji i w wyniku tego również na zmniejszenie wrażliwości wykrywania, tak więc test ten wymaga większej aktywności RT w porównaniu z odpowiednimi testami dla NNRTI. Inną konsekwencją jest to, że różnica między RT opornymi a wrażliwymi jest mniejsza niż w teście NNTRI. Istnieje jednak ogólnie silna korelacja między wartościami IC50 z testu hamowania RT a danymi fenotypowymi według piśmiennictwa. Zawsze możliwe było dostrzeżenie RT wirusów wysoce opornych lub średnio opornych (tabela 2).

P r z y k ł a d 5

Oznaczanie wrażliwości NNRTI z zastosowaniem RT pochodzących z osocza ml próbki osocza pobrane od 17 pacjentów zakaż onych HIV ze Sztokholmu (Szwecja) poddano obróbce zgodnie z „Protokołem izolowania RT wirusowej z materiału zawierającego przeciwciała blokujące RT, opartym na niszczeniu rozpuszczalnych enzymów komórkowych i następnie izolowaniu RT wirusowej z minikolumn. 15 z tych próbek zawierało RT w ilości dostatecznej do umożliwienia badania wrażliwości na leki. Wartość PCR dla tych próbek wynosiła 17000 kopii/ml lub wiece]. RT z każdej próbki osocza i dwa enzymy kontrolne miareczkowano z uzyskaniem zestawu seryjnych rozcieńczeń Nevirapine, Efavirenz i Delavirdine zgodnie z „Protokołem oznaczania wrażliwości na leki aktywności RT w lizatach.

Stosując aktywność odpowiadającą 1,7 fg/studzienkę referencyjnej RT HIV-1 dla każdego ekstraktu RT stwierdziliśmy, że 7 z 15 próbek zawierało RT wysoce oporne na wszystkie 3 NNRTI (Tabela 3). We wszystkich przypadkach w genach RT znajdowała się substytucja K103N, a w jednym przypadku (próbka 656) jednocześnie substytucja A98G i Y1B1C. 8 próbek wykazywało wrażliwość na wszystkie trzy NNRTI. 6 z nich nie miało żadnych istotnych mutacji w genach RT, natomiast w pozostałych dwóch występowała mutacja V179I lub V179T/A/I; o ile wiadomo, żadna z tych mutacji nie wpływa na wrażliwość na NNRTI.

P r z y k ł a d 6

Oznaczanie wrażliwości na AZT-TP i d4T-TP z zastosowaniem RT pochodzących z osocza ml próbki osocza pobrane od 27 pacjentów zakaż onych HIV ze Sztokholmu (Szwecja) poddano obróbce zgodnie z „Protokołem izolowania RT wirusowej z materiału zawierającego przeciwciała blokujące RT, opartym na niszczeniu rozpuszczalnych enzymów komórkowych i następnie izolowaniu RT wirusowej z minikolumn. Jedynie 13 z tych próbek zawierało RT w ilości dostatecznej do przeprowadzenia badania wrażliwości na leki. Wartość PCR dla tych próbek wynosiła 43000 kopii/ml lub więcej. RT każdej z próbek osocza i dwa enzymy kontrolne miareczkowano z uzyskaniem zestawu

PL 209 075 B1 seryjnych rozcieńczeń AZT-TP i d4T-TP zgodnie z „Protokołem oznaczania wrażliwości na leki aktywności RT w lizatach. Zob. tabela 4.

Stosując aktywność odpowiadającą 5 fg/studzienkę referencyjnej RT HIV-1 z każdego ekstraktu RT i mieszaninę reakcyjną do terminacji łańcucha stwierdziliśmy, że wartość IC50 dla obu leków zwiększała się równolegle do nagromadzenia mutacji, o których wiadomo, że biorą udział w oporności na NRTI (Tabela 4). Sama mutacja D69N ani sama mutacja M184V, jak oczekiwano, nie powodowała zwiększenia wartości IC50.Próbki 656 i 1320 zawierały RT, która mimo obecności kilku substytucji aminokwasowych, o których wiadomo, że wpływają na oporność na NRTI, wykazywała średnie wartości IC50, zarówno dla AZT-TP, jak i dla d4T-TP. Stwierdzono, że izolaty te zawiera]ą substytucję Y181C albo M184V, o których wiadomo, że powodują ponowne uwrażliwienie na leki T-analogowe. Dwie RT w obecnym panelu wykazywały wartości IC50 zwiększone co najmniej 20-krotnie w porównaniu z kontrolną RT typu dzikiego (tabela 4). Jedna z nich wykazywała zestaw insercji aminokwasów (aa) reprezentatywny dla kompleksu Q151M [8], a druga zawierała klasyczną substytucję K70R, i ponadto substytucję L210S. Stosując wartości IC₅₀ 1 μΜ i 0,1 μΜ jako wartości odcięcia odpowiednio dla AZT-TP i d4T-TP ekstrakty można klasyfikować jako zawierające 9 wrażliwych i 4 oporne RT, co pozostaje w zgodności z wynikami testu genotypowego.

Piśmiennictwo

1. Petropoulos CJ, Parkin NT, Limoli KL, Lie YS, Wrin T, Huang W, Tian H, Smith D, Winslow GA, Capon DJ, Whitcomb JM. A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1. Antimicrob Agents Chemother. 2000 Apr; 44(4):920-8.

2. The Euroguidelines Group for HIV resistance. Clinical and laboratory guidelines for the use of HIV-1 drug resistance testing as part of treatment management: recommendations for the European setting. AmS. 2001 Feb 16;15(3):309-20.

3. Vazquez-Rosales G, Garcia Lerma JG, Yamamoto S, Switzer WM, Havlir D, Folks TM, Richman DD, Heneine W. Rapid screening of phenotypic resistance to nevirapine by direct analysis of HIV type 1 reverse transcriptase activity in plasma. AIDS Res Hum Retroviruses. 1999 Sep 1;15 (13): 1191-200.

4. Goff, S.P. (1990) Retrovirus reverse transcriptase: Synthesis, Structure, and Function. Review. J Acquir Imm Defic Syndr 3: 817-831.

5. Vandamme AM, Van Vaerenbergh K, De Clercq E. Antihuman immunodeficiency virus drug combination strategies. Antivir Chem Chemother. 1998 May; 9 ( 3 ):187-203.

6. Meyer PR, Matsuura SE, Mian AM, So AG, Scott WA. Related Articles. A mechanism of AZT resistance: an increase in nucleotide-dependent primer unblocking by mutant HIV-1 reverse transcriptase. Mol Cell. 1999 Jul;4(1):35-43.

7. Ekstrand DH, Awad RJ, Kallander CF, Gronowitz JS. A sensitive assay for the guantification of reverse transcriptase activity based on the use of carrier-bound template and non-radioactiveproduct detection, with special reference to human immunodeficiency-virus isolation. Biotechnol Appl Biochem. 1996 Apr; 23 (Pt 2):95-105.

8. Lindberg J; Sigurethsson S, Lowgren S, O Andersson H, Sahlberg C, Noreen R, Fridborg K, Zhang H, Unge T. Structural basis for the inhibitory efficacy of efavirenz (DMP-266), MSC194 and PNU142721 towards the HIV-1 RT K103N mutant. Eur J Biochem. 2002, Mar; 269 (6):1670-1677

9. Shirasaka, T., Kavlick, M. F., Ueno, T., Gao, W.-Y., Kojima, E., Alcaide, M. L., Chokekijchai,

S., Roy, B. M., Arnold, E., Yarchoan, R. , Mitsuya, H. Emergence of human immunodeficiency virus type 1 variants with resistance to multiple dideoxynucleosides in patients receiving therapy with dideoxynucleosides. Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92: 2398-2402.

10. Larder BA. 3'-Azido-3'-deoxythymidine resistance suppressed by a mutation conferring human immunodeficiency virus type 1 resistance to nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors. Antimicrob Agents Chemother. 1992 Dec; 36 (12):2664-9.

11. Larder BA. Interactions between drug resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. J Gen Virol. 1994 May;75 (Pt 5):951-7.

12. Boucher CA, Cammack N, Schipper P, Schuurman R, Rouse P, Wainberg MA; Cameron JM. High-level resistance to (-) enantiomeric 2'-deoxy-3'-thiacytidine in vitro is due to one amino acid substitution in the catalytic site of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Antimicrob Agents Chemother. 1993 Oct; 37(10):2231-4

PL 209 075 B1 c—1 φ '—ι Φ Ό Φ Η

-Η ε

>Ί

Φ

Φ £

Ο •Η

Φ

Η

Ψ-Ι

Φ

Ό

Ν

Φ

Ν τ—I I > I—I X

Η

X

Φ' Φ Φ 5 Ο Φ • Η X ε

ο

X φ

Ρ

Φ υ

>1 φ

Ν ο

φ

I-1

X φ

φ φ

•Η

Φ 'ο ρ

ο

X

Ή

Ό

-Η

X

Φ

Ή

Φ £

>Ί γ-Ρ

X φ

Φ

- Ρ

Φ

Ρ ο

Cu

Wrażliwość odpowiedniego wirusa*	Efavirenz	CU	3	g:	z	P g:	Wr 1
Delaviridine	CU	2»		3	P (2	p hg
Nevirapine	z	2	3		Wr	p 3^
IC_5C wskazanego inhibitora w teście RT (μΜ)	Efavirenz	>4	>4	X A	0, 5	o o	C, 12
Delaviridine	lO cn	0 Λ	>100	3,0	0,5	ΙΌ
Nevirapine	32	>100	>100	O o V-1 Λ	0,2	X t-H
Modyfikacja w analizowanej RT	L100I	K103N	L100I/K103N	Y181C	BH10 typu dzikiego	HxB2 typu dzikiego

!l
Cu f 1 Φ υ φ^> ’ΠΊ Φ s φ
X	>5
φ	Ν Φ
υ	Ρ
g φ	Ο
φ	ο
3	Γ-1 Λ
Ρ»	-Ρ
Φ	φ
Ο	ο
Ρ	Ρ
Ν	Ν
φ	φ
’>Ί Φ	Ό
Ρ	'Φ
ο	0
Ρ	Φ
..X	Ρ
1 ο	Ο Cu
,-1	Ο
I C\J	Φ
—	X
Ό	Ο φ
'Φ	>Ί
ο Γ^-·
Ρ	II
ο Ou
φ	-

'φ	φ
•Ρ	-Ρ
c	ο
II	Ρ X
X	1 ο
	ο Γ—1
>1	1
φ	ο
•Η	V-1
ι-1 •Ν	-Ρ
φ	φ
Ρ	ο
φ	Ρ
Ρ 55	Ν φ 'U 'Φ
φ	Ο
3	φ
ο	Ρ
α	ο
Φί	a
-Ρ	ο
ο φ	φ
φ	-Ρ
Ρ	Φ
φ	Ό Φ
φ	Ρ
φ	'Φ
Q	Ο
-k	CP

wykonano

PL 209 075 B1

Ή £

ω *Γ'Ί υ

-ρ ρ

£ •Η £

>1 ρ

Ο • rd

Ρ •Η '4-4 ω

Ό

Ν ω

Ν τ—I I >

n

X

Η

0Τ

Ρ

Ο

Ρ

Ή

-Ω £

ο ω

ρ ρ

Η

Μ¹ •Η

CU

Η

I

Η

Γθ <

□

Χυ γΜ

Oj φ

Γ—I

CM Ρ

Ρ 3 Ό Ρ Ο Cu

Tabela

W

Ω

Ρ •Η <υ _ Ή

Ο	Ρ
CP ω	!
Ρ Ρ	Τ3
ο	Ρ
α.	<α
ο	'U
α>	'03
ΤΥ	Ο
υ	Ρ
03	Ρ
Ν	0
>.	Ω.
-Ρ	Ο
>. ω	03
Ρ
<υ	Ο
ω	ω
ω	>Ί
Ρ	3
ω Ή	II
Ρ ω	,
-Ρ	Ό
	'03
•Ρ	ο
I—I	Ρ
Ν	Ρ
03	ο
Ρ	Cb

ο τ f0 ω -η c c

Ό ο ω c Η ο -w α, ο a

rtf

Ό &j Ο

Ο 'U

Ct 'OT ο

Φ C ι—ι Η

U ο (Τ3 CL

4-> Ο

II OT

-Ρ ω ρ (X

II

φ	2
3
ο	» κ
	ΧΊ
κΎ	3
Ρ	•Ρ
ο	ι—\|
Ρ	Ν
0)	03	ο
ΜΡ	Ρ	Ρ
	3	03
<υ		Ρ
Ρ		Ο
03
Q	Ρ
+		3

PL 209 075 B1 ro

I-1

Φ

Ό (C

NNRTI na RT HIV uzyskaną z osocza pacjentów

| Mutacje na aminokwasie

|l81 |

o

1 179

>

*

| 108

>

1106

>

103

2

| 101

d

i—ł

t—ł

ł—l

ł—4

OO CTi

ω

o

> Q ° s O =L 1—i —

| 7,51

| 4,54

O <0 co

[8,22

[8,97

[9,54

[8,21

12,7

o o i—1 Λ

>100 |

>100

| ooi<

s > £ o cl, a. 1—i Cl] '—

0,09 j

r·'· ν—1 O

Γ0?21 1

[0,15 j

Γ-,—i o

[0,21 ]

CN ’χΓ O

Γ57 33 |

A

1 >⁴ 1

>⁴ 1

'tr A

A

>4

L·⁴

lT) cn

1,6

S CL s o > d ι-H 2 —

[0,65 j

T-i OO o

O co o

r- cn o

[0,97 |

2,16

[2,92 |

[3,14 |

O O t—1 Λ

o o τ—i Λ

o o t—1 Λ

[>100 I

00K

>100

>ioo 1

vr A

CN τ—i O

Fg RT/ml w osoczu

1056 |

83!

40 1

69 1

1032 |

kD τ—i

375 ......J

71 |

39 |

400 |

5533 |

| 517

on OO kO

1921

268 |

H ω 1-i o 4-¹ c o

CN 0Ί

V—1

Wartość PCR

542000

73000 |

17000 1

17000

465000 |

105000 I

245000

431000

O o o co ,—1

529000 I

>750000 I

71000

764000 |

>75000

353000

Kod pacjenta

3980

1 1177 I

1412

OO r- i—1

1885

1572

'TT CN 'tr τ—1

1639

cn

622

2098

2883

3807

656

1517

Rekombinowane

L100I

RT typu dzikiego

Heterogenność w sekwencji V179T/A/I.

Claims

1. Sposób określania fenotypowej wrażliwości na lek u ssaka zakażonego wirusem otoczkowym poprzez testowanie na polimerazie zawartej w wirusie otoczkowym odzyskanym z próbki biologicznej od tego ssaka, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy w których:

a) do próbki dodaje się środek inaktywujący enzym wybrany spośród środków modyfikujących cysteinę, korzystnie kwas 5-5'-ditiobis-(2-nitrobenzoesowy), w celu inaktywacji aktywności polimerazy innej niż aktywność obecna w wirionie otoczkowym,

c) poddaje się lizie cząstkę wirusową w celu uwolnienia polimerazy,

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ssakiem jest człowiek.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako próbkę biologiczną stosuje się próbkę krwi.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako próbkę krwi stosuje się próbkę osocza.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako wirusa otoczkowego stosuje się retrowirusa.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako retrowirusa stosuje się ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), a jako enzym odwrotną transkryptazę (RT) HIV.

7. Zestaw do określania fenotypowej wrażliwości na lek u ssaka zakażonego wirusem otoczkowym jak określono w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że zawiera środek inaktywujący enzym do inaktywacji aktywności polimerazy wybrany spośród środków modyfikujących cysteinę, korzystnie jak kwas 5-5'-ditiobis-(2-nitrobenzoesowy), ilościowy test aktywności polimerazy oraz co najmniej jeden lek przeciwwirusowy jako lek referencyjny.