ES2257553T3 - Ensayos de sensibilidad a farmacos virales. - Google Patents

Ensayos de sensibilidad a farmacos virales.

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ES2257553T3
ES2257553T3 ES02736442T ES02736442T ES2257553T3 ES 2257553 T3 ES2257553 T3 ES 2257553T3 ES 02736442 T ES02736442 T ES 02736442T ES 02736442 T ES02736442 T ES 02736442T ES 2257553 T3 ES2257553 T3 ES 2257553T3
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Anders Malmsten
Simon Gronowitz
Xingwu Shao
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Abstract

Un método para analizar la sensibilidad al fármaco fenotípica en un individuo mamífero infectado por virus con envuelta analizando en una polimerasa introducida en un virus con envuelta recuperado de una muestra biológica de dicho individuo, que comprende las etapas de: a) añadir un agente inactivante de enzima seleccionado a partir de agentes modificantes de cisteína, tales como 5, 5¿-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico), a la muestra para inactivar la actividad de la polimerasa distinta a la presente en el virión con envuelta, b) purificar y concentrar el virus con envuelta eliminando anticuerpos que bloquean la actividad de la enzima, inhibidores de la actividad de la enzima endógenos, fármacos antivirales y los agentes que inactivan a la enzima, c) lisar las partículas virales para liberar a la polimerasa, d) recuperar la polimerasa viral purificada y concentrada que es el resultado de b) y c) y determinar el perfil de sensibilidad al fármaco del individuo a partir de la enzima recuperada usando ensayos enzimáticos sensibles.

Description

Ensayos de sensibilidad a fármacos virales.
La presente invención se refiere a ensayos de sensibilidad a fármacos virales, en particular, a un método para analizar la sensibilidad al fármaco fenotípica en un individuo mamífero tratado con fármaco infectado por virus con envuelta, tal como infectado por retrovirus, por ejemplo infectado por el virus de la inmunodeficiencia humano (VIH-1), analizando en una enzima introducida en un virus con envuelta recuperado a partir de una muestra biológica de dicho individuo.
Antecedentes
La sensibilidad a VIH-fármaco está asociada con la respuesta virológica a nuevos tratamientos. En la actualidad están disponibles ensayos de resistencia a fármacos estandarizados, y los datos de las pruebas clínicas sugieren que el uso de los ensayos de sensibilidad a fármacos puede estar asociado a un mejor resultado virológico. Sin embargo, la sensibilidad a fármacos es compleja en términos de funcionamiento, interpretación y aplicación clínica.
Los ensayos fenotípicos miden la capacidad de un aislado de VIH de crecer en presencia de fármacos y se realizan usando ensayos en los que se evalua el grado de inhibición de la replicación del virus a diferentes concentraciones de fármaco. Los resultados se usan para calcular la concentración inhibitoria al 50% o 90% de un fármaco para un aislado. Un problema potencial con el ensayo del fenotipo clásico es el efecto de la deriva genética en la población del virus durante el aislamiento del virus. En el peor caso el clon del virus aislado es el que más se ajusta a crecer en condiciones in vitro, no el más abundante en el paciente.
La medida de la sensibilidad al fármaco fenotípica puede hacerse en la actualidad mediante ensayos automatizados basados en la tecnología del ADN recombinante. Estos enfoques implican la amplificación del ARN del plasma que codifica para la proteasa de VIH y la transcriptasa inversa (RT) y la generación de un virus recombinante con los otros genes a partir de un constructo de laboratorio (virus de casete) [1]. Los ensayos de genotipo miden la presencia de ciertas mutaciones en los genes reconocidos por fármacos antirretrovirales. Mientras que la resistencia fenotípica mide la sensibilidad al fármaco del virus, el genotipado detecta las mutaciones que confieren la resistencia fenotípica. La amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de las secuencias del VIH-1 del plasma que contiene de 500 a 1000 copias de ARN por ml es la etapa inicial tanto en estos ensayos como en los ensayos fenotípicos de virus recombinante. Dependiendo de las mutaciones evaluadas y la realización del laboratorio, la prueba, los ensayos del genotipo pueden diferenciar a un mutante en un nivel del 10 al 50% en una mezcla de virus. La complejidad de los datos generados de la secuenciación ha conducido a dificultades en la interpretación de los resultados. Pueden variar las interpretaciones en cuanto al nivel de resistencia fenotípica conferida por un modelo mutacional específico. Según son generados nuevos datos, hay un riesgo de proporcionar interpretaciones inadecuadas o hasta incorrectas [2]. El mecanismo de reacción para todos los fármacos antirretrovirales usados hasta ahora está en la interferencia con la reacción enzimática de la proteasa o de la RT viral. Dependiendo de la capacidad de los ensayos enzimáticos y de las técnicas de aislamiento de virus usadas, las pruebas de sensibilidad al fármaco teóricamente pueden hacerse en sobrenadantes a partir de la propagación del cultivo de virus, el aislamiento del virus primario o las preparaciones del virus recuperadas directamente de los pacientes.
Los ensayos de sensibilidad al fármaco en RT a partir del aislamiento del virus primario ofrece dos ventajas comparado con los análisis de inhibición de replicación de virus tradicional. El tiempo para la propagación del virus se reduce y, lo que es más importante, ocurrirá menos selección sobre la población del virus. La situación ideal debe finalmente caracterizar la enzima que ha sido extraída directamente del virus que está en la circulación de la sangre del paciente. La ventaja de tal enfoque es que la muestra reflejará la población de virus presente en el paciente en el tiempo en el que la muestra de sangre fue tomada. Esto hasta ahora no ha sido factible en la práctica, pero el concepto ha sido explorado por ensayos de resistencia con el ensayo de Amp RT basado en la PCR [3].
La RT del VIH-1 así como otras transcriptasas inversas realizan tres reacciones enzimáticas diferentes: polimerización del ADN dependiente del ARN, polimerización del ADN dependiente del ADN, y degradación del ARN en el híbrido ADN-ARN (RNasa H). La RT de VIH, codificada por el gen pol, es un heterodímero que consiste en una subunidad p66 y una p51. Tanto la polimerización de ADN dependiente de ARN como la polimerización de ADN dependiente de ADN son realizadas por el mismo sitio activo localizado en la subunidad p66. El p51 es producido por la eliminación del fragmento del extremo C del p66 correspondiente al dominio de RNasa H [4]. Todos los inhibidores de RT actualmente aprobados para uso clínico inhiben la actividad de la polimerasa de la enzima. El mecanismo de reacción de estos fármacos ha sido definido principalmente de acuerdo con su acción sobre la reacción de polimerización de ADN dependiente de ARN. El efecto sobre la reacción de polimerización de ADN dependiente de ADN está relativamente menos estudiado.
El ensayo de actividad de RT convencional se realiza utilizando una construcción de plantilla-iniciador artificial y trifosfato de desoxinucleótido marcado como sustrato nucleótido. El par plantilla/iniciador poli(rA) / oligo(dT) es la combinación más eficiente y más usada para la determinación del VIH así como para otras RT retrovirales. Una desventaja de este tipo de ensayo que afecta a las pruebas de sensibilidad al fármaco, es que sólo pueden ser analizados los análogos no nucleósidos o los análogos que pueden basarse en el par con rA. Los análogos a otras bases de nucleótidos requerirán un ensayo basado en una plantilla de polímero variable.
Todos los fármacos antirretrovirales aprobados hasta ahora interfieren con la reacción enzimática de la proteasa viral o de la RT. Hay además fármacos candidatos en el proyecto que afectan a la función de la integrasa retroviral.
Los inhibidores de RT son análogos nucleósidos o análogos no nucleósidos. Los inhibidores no nucleósidos se unen a una bolsa hidrófoba en la enzima RT cerca de, pero no contiguo, al sitio activo. La replicación del VIH-1 es inhibida alostéricamente desplazando los restos catalíticos de aspartato en relación con el sitio de unión de la polimerasa. La resistencia por lo general surge rápidamente cuando los no nucleósidos son administrados como monoterapia o en presencia de una supresión del virus incompleta. Actualmente sólo tres inhibidores no nucleósidos: Nevirapina, Efavirenz y Delavirdina están aprobados para uso clínico por la FDA.
Los inhibidores nucleósidos usados en la actualidad terminan la elongación de la cadena de ADN dado que carecen de un grupo 3'-hidroxilo. La terapia prolongada con inhibidores nucleósidos conduce comúnmente al desarrollo de virus resistentes. Este procedimiento está asociado con el aspecto gradual de mutaciones en el gen pol del virus, conduciendo cada una a sustituciones de aminoácidos definidas [5]. Los efectos de estas sustituciones a niveles enzimáticos son complicados e incluye la potenciación de una función editora del ADN primitivo. Esta reacción es dependiente del nucleótido y produce el polifosfato de dinucleosido y un extremo 3' del ADN extensible [6].
La terapia con VIH en la actualidad está basada en una terapia multifármaco. Los regímenes están basados en combinaciones de los tres tipos de fármacos disponibles: análogos nucleósidos, análogos no nucleósidos e inhibidores de proteasa. La estrategia es reducir al mínimo la probabilidad de que un virus mutante sobreviva. Las directrices que afrontan la insuficiente terapia virológica hoy día recomiendan cambiar completamente a un nuevo lote de fármacos. Esto es frustrante dado que muchas personas seropositivas del VIH no tienen tres o más fármacos no probados para escoger. Además esto también puede ser una decisión inútil al eliminar un fármaco que de hecho todavía es eficaz. Con un mejor análisis de resistencia al fármaco podría ser posible seleccionar el fármaco ineficaz o los fármacos en una combinación dada.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento para realizar ensayos de resistencia a fármaco fenotípicos sobre la enzima que es recuperada directamente de las muestras de plasma del paciente. Está basado en una combinación de técnicas para recuperar enzimas virales esencialmente libres de sus homólogos celulares seguido de su medida usando ensayos enzimáticos sensibles. La técnica de aislamiento de la enzima descrita puede ser usada para cualquier enzima introducida en un virus con envuelta, pero su uso está sólo en la presente memoria descriptiva explorado por la utilización de RT derivada de plasma para ensayos de resistencia de fármaco.
Así, un aspecto de la invención se refiere a un método para analizar la sensibilidad al fármaco fenotípica en un individuo mamífero infectado por virus con envuelta analizando en una polimerasa introducida en un virus con envuelta recuperado de una muestra biológica de dicho individuo, que comprende las etapas de:
a)
añadir un agente inactivante de enzima seleccionado a partir de agentes modificantes de cisteína, tales como 5,5’-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico), a la muestra para inactivar la actividad de la polimerasa distinta a la presente en el virión con envuelta,
b)
purificar y concentrar el virus con envuelta eliminando anticuerpos que bloquean la actividad de la enzima, inhibidores de la actividad de la enzima endógenos, fármacos antivirales y los agentes que inactivan a la enzima,
c)
lisar las partículas virales para liberar a la enzima,
d)
recuperar la enzima viral purificada y concentrada que es el resultado de b) y c) y determinar el perfil de sensibilidad al fármaco del individuo a partir de la enzima recuperada usando ensayos enzimáticos sensibles.
En una realización de la invención el individuo mamífero es un ser humano.
En una realización preferida en este momento la muestra biológica es una muestra de sangre, tal como una muestra de plasma.
En otra realización preferida el virus con envuelta es un retrovirus, tal como un virus de la inmunodeficiencia humano (VIH). La enzima es, en el último caso mencionado, preferiblemente una transcriptasa inversa de VIH (RT).
El perfil de sensibilidad al fármaco de un individuo obtenido con el método de la invención puede ser usado para seleccionar la terapia de tratamiento de fármaco para el individuo. En la práctica, el individuo mamífero infectado por el virus con envuelta será sometido a ensayos del perfil de sensibilidad al fármaco en varios puntos de tiempo para controlar el desarrollo de la infección y el tratamiento del fármaco viral en dicho individuo.
La invención también se refiere a un paquete comercial para analizar la sensibilidad al fármaco fenotípica en un individuo mamífero infectado por virus con envuelta de acuerdo con la invención, que comprende un agente inactivante de enzima para inactivar la actividad de polimerasa, un ensayo enzimático sensible, y al menos un fármaco de referencia. Puede contener opcionalmente instrucciones escritas o un soporte de información.
La invención será ilustrada a continuación según la siguiente descripción no restrictiva de realizaciones y dibujos de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la correlación entre el ARN recuperado de RT de VIH-1 y el viral medido con PCR de ARN.
La figura 2 ejemplifica la relación entre la cantidad de RT usada en los ensayos de sensibilidad al fármaco y los valores de IC_{50} encontrados. Símbolos: (\lozenge) RT tipo salvaje Efavirenz, (\blacklozenge)RT L100I Efavirenz, (\circ) RT tipo salvaje AZT-TP, (\bullet) RT T215Y AZT-TP.
Descripción de las realizaciones
El procedimiento usado consiste en cuatro etapas diferentes. I) Inactivación de la actividad de la polimerasa huésped que está presente en la muestra sin afectar a las enzimas virales presentes en el virión con envuelta. II) Eliminación del agente inactivante de enzima, anticuerpos que bloquean la actividad enzimática, inhibidores de la actividad enzimática endógenos y fármacos antivirales. III) Recuperar la enzima viral concentrada y purificada. IV) Determinación del perfil de sensibilidad al fármaco de la enzima recuperada.
Etapas I-III
Protocolo para el aislamiento de RT viral a partir del material que contiene anticuerpos que bloquean RT, basado en la destrucción de enzimas celulares solubles seguido del aislamiento de RT viral a partir de mini-columnas
1) Etiquetar los tubos de plástico de 4,5 ml que se usen. Colocarlos en una caja de Nalgene. Añadir 1 ml de la muestra (por ejemplo, plasma en EDTA de individuos infectados por VIH) a cada tubo etiquetado. Añadir 100 \mul de una solución 66 mM de 5,5’-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico) en agua tamponada, agitar e incubar las muestras durante una hora a temperatura ambiente.
La actividad de las enzimas en plasma libres es destruida durante este procedimiento mientras que las enzimas contenidas dentro de los viriones permanecen intactas. Los viriones entonces pueden ser purificados del 5,5’-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico), de los anticuerpos que bloquean la actividad enzimática y de otras sustancias que puedan interferir con la cuantificación de RT viral según diversos procedimientos de separación. El protocolo de debajo se basa en el uso del gel Fractogel® EMD TMAE Hicap.
2) Suspender el gel de separación con cuidado y transferir 1500 \mul de la mezcla de gel a cada tubo de pretratamiento de la muestra.
3) Incubar las muestras con la mezcla de gel durante 90 minutos a temperatura ambiente con los tubos tumbados horizontalmente en un agitador orbital.
4) Etiquetar la cantidad deseada de las mini-columnas de plástico de 10 ml para identificar las muestras que se analicen. Montar las columnas en un dispositivo de lavado de columnas, es decir, un sistema de extracción a vacío en fase sólida Visiprep de Supelco. Transferir los contenidos en los tubos de unión a sus columnas correspondientes. Antes de transferir agitar el tubo brevemente para distribuir uniformemente el gel.
5) Cuando todas las columnas estén llenas, aplicar el vacío y aspirar los geles secos. Apagar el vacío y comenzar el lavado llenando cada columna con 9 ml de tampón A. Cuando todas las columnas hayan sido llenadas, aplicar el vacío y aspirar los geles secos.
6) Repetir la etapa 5 tres veces más, dando un total de cuatro lavados. Aspirar los geles secos después de cada lavado. Después de aspirar los geles secos después del cuarto lavado, apagar el vacío y proceder a la etapa 7. La etapa de lavado elimina los anticuerpos que bloquean la RT no unida y 5,5’-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico) del siste-
ma.
7) Añadir a todos los geles secos 9 ml de tampón acondicionador (B). Después de un minuto aplicar el vacío y aspirar los geles secos.
8) Repetir la etapa 7. Antes de apagar el vacío comprobar que todo el tampón de acondicionamiento (B) ha sido eliminado de todos los geles.
9) Despegar la parte superior del dispositivo de lavado de columna. Montar el sostenedor de tubo con los tubos etiquetados en un recipiente limpio. Reajustar la parte superior del dispositivo. Controlar que los tubitos de cada columna bajan en sus tubos correspondientes.
10) Añadir 600 \mul de tampón de lisis (C) a cada columna. Dejar el tampón reposar en la columna durante cinco minutos. Entonces aplicar el vacío despacio y aspirar los geles secos. Esto dará en cada tubo aproximadamente 600 \mul de lisado de virus del gel unido.
La actividad de RT recuperada en los lisados de la etapa 10 está esencialmente libre de anticuerpos que bloquean a RT, fármacos y actividad de la polimerasa celular, y puede ser cuantificada con un ensayo de actividad sensible de RT, es decir, el Cavidi HS-kit Lenti RT, que está basado en el método descrito por Ekstrand et al. [7]. 25 \mul del lisado obtenido de acuerdo con el protocolo actual son suficientes para la determinación de la actividad de RT en la muestra. La muestra de 575 \mul restante debe congelarse a -70ºC o por debajo para su uso posterior en el ensayo de sensibilidad al fármaco.
Nota: las enzimas RT que no son sensibles a agentes que modifican la cisteína, por ejemplo RT del VIH-1 del tipo salvaje, opcionalmente pueden analizarse en presencia de 5,5’-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico) hasta 5 mM. Enzimas sensibles tales como RT de MULV y RT de ciertas cepas de VIH-1 resistentes a terapia (que contienen por ejemplo la mutación Y 181C) por otra parte requieren la adición de un agente reductor de sulfhidrilo, es decir, cisteína o cisteamina en el tampón de lisis.
Etapa IV
Protocolo para la determinación de la sensibilidad al fármaco de la actividad de RT en los lisados
Una modificación del ensayo de RT colorimétrico (Cavidi® HS-kit Lenti RT), disponible de Cavidi Tech, Uppsala, Suecia fue usada para la determinación del nivel de actividad de RT en las preparaciones de virus estudiadas. En breve, poli(rA) unido covalentemente en los pocillos de una placa de microtítulo de 96 pocillos sirve como plantilla para la incorporación de 5-bromo-desoxiuridina 5'-trifosfato (BrdUTP) durante la etapa de transcripción inversa a 33ºC. La cantidad de monofosfato de bromodesoxiuridina (BrdUMP) incorporada en el ADN, es detectada con un anticuerpo Anti-BrdU monoclonal conjugado con fosfatasa alcalina (Ap). Un sustrato de Ap, el fosfato de 4-metilumbeliferilo, se usa finalmente para detección fluorimétrica. La cantidad de RT aislada usada en las determinaciones de IC_{50} era para los análogos nucleósidos estandarizados a una actividad correspondiente a 5 fg (4,3 x 10^{-20} moles) se refiere a RT de VIH-1 por pocillo, mientras que fueron usados 1,7 fg (1,5 x 10^{-20} moles) de RT para los análogos no nucleósidos. Los lisados fueron diluidos en "lisados de prueba", es decir, lisados obtenidos de la separación de prueba de suero de becerro fetal.
Los estudios de inhibición de RT fueron realizados en dos versiones diferentes modificadas del ensayo de RT de HS Lenti.
Los análogos no nucleósidos fueron diluidos en serie en etapas cinco veces en la mezcla de reacción de RT y fueron transferidas alícuotas de 25 \mul a cada pocillo en la placa de microtítulo, fueron mezclados con 125 \mul de la mezcla de reacción de RT y la reacción enzimática fue iniciada por la adición de 25 \mul de dilución de lisado. La concentración del sustrato del nucleótido final (BrdUTP) fue 16 \muM y la cantidad de iniciador (odT_{22}) fue 12 ng por pocillo. Los análogos de dT fueron diluidos en serie en etapas cinco veces en la mezcla de reacción de la terminación de cadena y fueron transferidas alícuotas de 25 \mul a cada pocillo en la placa de microtítulo, fueron mezclados con 125 \mul de la mezcla de reacción de la terminación de cadena de RT y la reacción enzimática fue iniciada por la adición de 25 \mul de dilución de lisado. La concentración del sustrato nucleótido final (BrdUTP) fue 1,5 \muM y la cantidad del iniciador (odT_{22}) fue de 12 ng por pocillo. Tanto para los inhibidores de RT nucleósidos como no nuclosidos la reacción de RT se dejó proceder de la noche a la mañana (16-24 horas a 33ºC.). A partir de entonces la reacción fue terminada por un lavado de la placa. El valor de IC_{50} fue definido como la concentración de fármaco que proporciona una inhibición del 50% de la actividad de RT estudiada.
Materiales
Gel de separación: por ejemplo, Fractogel® EMD TMAE o Fractogel® EMD TMAE Hicap en (ácido 2-(N-morfolin)etanosulfónico) (MES) 314 mM pH 5,1, yoduro de potasio 413 mM y heparina 0,5 mg/ml.
Mini-columnas, por ejemplo, Biorad Poly-prep® (7311553)
Dispositivo de lavado de mini-columnas, es decir, sistema de extracción a vacío en fase sólida Visiprep de Supelco. Tubos de plástico, por ejemplo, tubos criogénicos Nunc de 4,5 ml.
Placas de microtítulo con prA inmovilizado, es decir, Nalge Nunc NucleoLinck®.
Agente que modifica la cisteína, por ejemplo 5,5’-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico) 66 mM en agua tamponada con Tris(hidroximetil)aminometano 0,87 M (pH 8,3).
Agente reductor de sulfhidrilo suave, por ejemplo cisteamina 33 mM en agua.
Fármacos antivirales
Fueron comprados en Moravek Biochemicals, California 3'-azido-2', 3'-deoxitimidina trifosfato (AZT-TP) y (2',3'-didehidro-3'-deoxitimidina trifosfato (d4T-TP). Nevirapina (11-ciclopropil-5,11-dihidro-4-metil-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-f][1,4]diazepin-6-ona) (NVP), Delaviridina, 1-(5-metanosulfonamido-1H-indol-2-il-carbonil)-4-[3-(1-
metiletil-amino)piridinil]piperazina monometano sulfonato (DLV) y Efavirenz, (-)6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona) (EFV) fueron comprados en Apoteksbolaget, Uppsala, Suecia.
Muestras de plasma de individuos infectados por el VIH
Muestras de plasma de pacientes sin tratamiento previo o de pacientes tratados con terapia combinatoria ordinaria fueron seleccionadas retrospectivamente. Las muestras codificadas fueron suministradas congeladas como dos paneles diferentes, representando a pacientes con resistencia a NNRTI y a T-análogos respectivamente. La cantidad de ARN de VIH-1 en cada muestra fue medida por PCR de ARN de VIH-1 estándar (Cobas, Roche Diagnostica) y el genotipo viral presente fue analizado con el kit de genotipado de VIH-1 de TRUGENE®. (Visible Genetics).
Enzimas de RT recombinantes
Fueron producidas formas mutantes resistentes a NNRTI de RT (L100I, K103N, L100I/K103N, Y181C). Como plantilla para las mutaciones fue usado el vector de expresión pETRT, que fue construido a partir de aislado del BH10. Las mutaciones fueron generadas usando kits de mutagénesis dirigida comerciales, QuikChange (Stratagene). Las mutaciones fueron verificadas por análisis de secuencia de ADN. Las formas transformadas y nativas de RT fueron aisladas como se describe antes [8].
Las RT recombinantes con mutaciones específicas de AZT fueron producidas introduciendo la mutación en la región de codificación de RT de un fragmento de enzima de restricción HXB2-D EcoRI-N del de tipo salvaje clonado en el vector de expresión pKK233-2 (Amersham Biotech). Las mutaciones fueron generadas usando kits de mutagénesis dirigida comerciales, QuikChange (Stratagene). Los vectores de expresión clonados mutados fueron transformados en la cepa XL1-Blue de E. coli y los genotipos fueron verificados por análisis de secuencia de ADN.
Tampones usados
A) Tampón de lavado: MES 20 mM pH 5,4, acetato de potasio 500 mM (KAc)
B) Tampón de acondicionamiento. Un tampón compatible con el ensayo de RT, por ejemplo, (N-(2-Hidroxietilpiperazin-N'-(ácido 2-etanosulfónico) (Hepes) 50 mM pH 7,6, KAc 25 mM, cloruro de magnesio (MgCl_{2}) 20 mM, ácido etilenglicol-bis(\beta-aminoetil-éter) N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) 0,2 mM, espermina 2 mM y albúmina de suero bovino inactivada con calor (BSA) 0,5 mg/ml.
C) Tampón de lisis: Un tampón compatible con el ensayo de RT incluyendo un detergente, por ejemplo polioxietileno 4 lauril-éter (Brij 30) del 1,25%, odT22 a 13 ng/ml y los mismos componentes que en el tampón de acondicionamiento (B). Un agente reductor de sulfhidrilo, es decir, cisteamina 0,2 mM es añadido opcionalmente cuando se tratan virus con RT que son sensibles a la oxidación/modificación de SH.
D) Mezcla de reacción de RT, por ejemplo Hepes 10 mM pH 7,6, BrdUTP19 \muM, 80 ng/ml de odT22, MgCl_{2} 4 mM, 0,5 g/l de sulfato de dextrano, espermina 2 mM, Triton-X 100 del 0,5% (v/v), EGTA 0,2 mM y 0,5 mg/ml de BSA.
E) Mezcla de reacción de terminación de cadena: Hepes 10 mM pH 7,0, BrdUTP 1,75 \muM, 80 ng/ml de odT22, MgCl_{2} 10 mM, ATP 7 mM, 0,05 g/l de sulfato de dextrano, espermina 2 mM, Triton-X 100 del 0,5% (v/v), EGTA 0,2 mM y 0,5 mg/ml de BSA.
Ejemplos
Ejemplo 1
Correlación entre ARN recuperado de RT de VIH-1 y viral medido con PCR de ARN
Muestras de 1 ml de plasma en EDTA de individuos infectados con VIH fueron tratadas de acuerdo con el "Protocolo para el aislamiento de RT viral a partir del material que contiene anticuerpos que bloquean a RT, basado en la destrucción de enzimas solubles celulares seguido del aislamiento de RT viral de mini-columnas" y la cantidad de actividad de RT recuperada de cada muestra fue determinada en un ensayo de RT de una noche usando RT de Cavidi® HS-kit Lenti. Las actividades de RT obtenidas fueron calculadas de nuevo en fg de RT de VIH-1/ml de plasma de acuerdo con una curva estándar interna. La cantidad de ARN de VIH-1 en cada muestra fue medida por PCR de ARN de VIH-1 estándar (Roche Amplicor). El gráfico es restringido a muestras con valores de PCR > 500 copias/ml. Una estrecha correlación fue encontrada entre la cantidad de RT de plasma recuperado y la cantidad de ARN de VIH medida con PCR (r=0,93, n=33, p <<0,001). Véase la figura 1.
Del ejemplo puede ser concluido que el procesamiento de 1 ml de plasma de un individuo con 50000 copias de ARN de VIH por ml de plasma causará un rendimiento de aproximadamente 200 fg de actividad de RT. Usando 1,7 fg de RT por ensayo esta cantidad corresponde a 118 análisis, que pueden ser usados para la determinación del perfil de sensibilidad al fármaco de la RT aislada.
Ejemplo 2
Influencia de la cantidad de RT usada en los análisis de sensibilidad al fármaco
Los efectos de NNRTI, AZT-TP y d4T-TP sobre la RT de VIH-1 recombinante indicada fueron determinados de acuerdo con el "Protocolo para la determinación de sensibilidad al fármaco de la actividad de RT en los lisados" utilizando las concentraciones de RT indicadas. La figura 2 ejemplifica la relación entre la cantidad de RT usada en los ensayos de sensibilidad al fármaco y los valores de IC_{50} encontrados. Los valores de IC_{50} para NNRTI como Efavirenz no estaban todos bajo la inflluencia de variaciones en la cantidad de RT dentro del intervalo investigado. Entre los NRTI estudiados el AZT-TP exhibe la variación más grande en relación con la cantidad de RT incluida en el ensayo. Esta variación era máxima para la RT del tipo salvaje y el IC_{50} aumentó de 0,13 a 0,22 \muM al aumentar la cantidad de RT de 2 a 162 fg/pocillo (figura 2).
La cantidad de actividad de RT disponible en las muestras de plasma pone los límites de los ensayos corrientes. Se requiere una señal al menos cinco veces el valor de base para obtener valores de IC_{50} reproducibles para los fármacos analizados. La baja variabilidad de los valores de IC_{50} al aumentar las cantidades de RT que se añaden al ensayo hacen la determinación de sensibilidad al fármaco factible sin una estandarización previa de la cantidad de RT usada en cada ensayo.
Ejemplo 3
Comparación de los efectos de inhibidores no nucleósidos sobre la RT de VIH-1 recombinante con mutaciones definidas
Los efectos de tres inhibidores no nucleósidos sobre la RT de VIH-1 recombinante indicada fueron determinados de acuerdo con el "Protocolo para la determinación de la sensibilidad al fármaco de la actividad de RT en los lisados". La cantidad de cada RT fue estandarizada para corresponder a la actividad de 1,7 fg/pocillo de nuestra RT de referencia. La duración de la reacción de RT fue 19 horas y las actividades obtenidas fueron calculadas de nuevo en % de la actividad con la misma RT incubada en ausencia de inhibidor.
Los datos de fenotipo fueron extraídos de la bibliografía (Noticias de antivirales internacionales y la base de datos http://stanford.edu/hiv) (Tabla 1).
Había en general una gran correlación entre los valores de IC_{50} del ensayo de inhibición de RT y los datos de fenotipo de acuerdo con la bibliografía. Era siempre posible distinguir las RT del virus alta o medianamente resistente (Tabla 1).
Ejemplo 4
Comparación del efecto de dT análogos sobre la RT de VIH-1 recombinante con mutaciones definidas
Los efectos de AZT-TP y d4T sobre la RT de VIH-1 recombinante indicada fueron determinados de acuerdo con el "Protocolo para la determinación de la sensibilidad al fármaco de la actividad de RT en los lisados". La cantidad de cada RT fue estandarizada para corresponder a la actividad de 5 fg/pocillo de nuestra RT de referencia. La duración de la reacción de RT fue de 19 horas y las actividades obtenidas fueron calculadas de nuevo en % de la actividad con la misma RT incubada en ausencia de inhibidor.
Los datos del fenotipo fueron extraídos de la bibliografía (noticias de antivirales internacionales y la base de datos http://stanford.edu/hiv) (Tabla 2).
La mezcla de reacción de la terminación de cadena usada para la determinación de la sensibilidad a fármacos T-análogos debe ser capaz de favorecer una reacción de fosforolisis dependiente de energía. Lamentablemente, una reacción de fosforolisis eficiente está reflejada puntualmente por una disminución en la velocidad de polimerización y como consecuencia también en una disminución en la sensibilidad de la detección. Por lo tanto, este ensayo requiere más actividad de RT, comparado con el ensayo correspondiente para los NNRTI. Otra consecuencia es que la desviación entre las RT resistente y sensible es más pequeña que en el ensayo de NNRTI. Sin embargo, había en general una gran correlación entre los valores de IC_{50} del ensayo de inhibición de RT y los datos del fenotipo de acuerdo con la bibliografía. Era siempre posible distinguir las RT del virus alta o medianamente resistente. (Tabla 2).
Ejemplo 5 Determinación de la sensibilidad a NNRTI utilizando RT derivadas de plasma
Muestras de un ml de plasma de 17 individuos infectados por VIH de Estocolmo, Suecia fueron tratadas de acuerdo con el "Protocolo para el aislamiento de RT viral a partir del material que contiene anticuerpos que bloquean a RT, basado en la destrucción de enzimas solubles celulares seguido del aislamiento de RT viral de mini-columnas". 15 de estos contuvieron bastante RT para permitir hacer ensayos de sensibilidad al fármaco. El valor de PCR para estas muestras fue de 17000 copias/ml o más grande. Cada RT de plasma y dos enzimas control fueron titulados en una serie de diluciones sucesivas de Nevirapina, Efavirenz, y Delavirdina de acuerdo con el "Protocolo para la determinación de sensibilidad al fármaco de la actividad RT en los lisados".
Utilizando una actividad correspondiente a 1,7 fg/pocillo de RT de VIH-1 de RT de referencia de cada extracto de RT, los inventores encontraron que 7 de las 15 muestras contenían RT que eran altamente resistentes a los tres NNRTI (Tabla 3). Todas tenían la sustitución K103N o en un caso (muestra 656) la combinación de las sustituciones A98G y Y181C en sus genes de RT. Ocho muestras eran sensibles a los tres NNRTI. Seis de las cuales no tenían ninguna mutación relevante en sus genes de RT mientras que las dos restantes tenían las mutaciones V179I o V179T/A/I, que se sabe que no afectan a la sensibilidad frente a NNRTI.
Ejemplo 6
Determinación de la sensibilidad a AZT-TP y d4T-TP utilizando RT derivadas de plasma
Muestras de un ml de plasma de 27 individuos infectados de VIH de Estocolmo, Suecia fueron tratadas de acuerdo con el "Protocolo para el aislamiento de RT viral a partir del material que contiene anticuerpos que bloquean a RT, basado en la destrucción de enzimas solubles celulares seguido del aislamiento de RT viral de mini-columnas". Sólo 13 de éstas contenían bastante RT para permitir análisis de sensibilidad al fármaco. El valor de PCR para estas muestras fue de 43000 copias/ml o más grande. Cada RT de plasma y dos enzimas control fueron titulados en una serie de diluciones sucesivas de AZT-TP y d4T-TP de acuerdo con el "Protocolo para la determinación de sensibilidad al fármaco de la actividad de RT en los lisados". Véase la Tabla 4.
Utilizando una actividad correspondiente a 5 fg/pocillo de RT de VIH-1 de RT de referencia de cada extracto de RT y la mezcla de reacción de la terminación de cadena los inventores encontraron que los valores de IC_{50} para ambos fármacos aumentaron en paralelo con la acumulación de mutaciones que se conocían que estaban implicadas en la resistencia a NRTI (Tabla 4). Las mutaciones D69N o Ml 84V solas, como se esperaba, no causaron aumento de los valores de IC_{50}. Las RT contenidas en la muestra 656 y 1320 que, a pesar de la presencia de varias sustituciones de aminoácido conocidas por afectar a la resistencia de NRTI, exhibieron valores de IC_{50} intermedios tanto para AZTT-TP como para d4T-TP. Estos aíslados fueron encontrados que también contenían las sustituciones Y181C o Ml 84V que se sabe que causan re-sensibilización en fármacos T-análogos. Dos RT en el panel actual exhibieron valores de IC_{50} que fueron elevados al menos 20 veces comparado con la RT control tipo salvaje (Tabla 4). Una de éstas tenía una serie de inserciones de aminoácidos (aa) representativos para el complejo Q151M [8] y la otra contenía la sustitución K70R clásica y además una sustitución L210S. Usando los valores de IC_{50} 1 \muM y 0,1 \muM según cortan los valores para AZT-TP y d4T-TP respectivamente, los extractos pueden ser clasificados como que contienen 9 RT sensibles y 4 resistentes, lo que está en concordancia con los resultados del ensayo de genotipo.
Referencias
1. Petropoulos C J, Parkin N T, Limoli K L, Lie Y S, Wrin T, Huang W, Tian H, Smith D, Winslow G A, Capon D J, Whitcomb J M. "A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1". Antimicrob Agents Chemother. 2000 April; 44(4):920-8.
2. The Euroguidelines Group for HIV resistance. "Clinical and laboratory guidelines for the use of HIV-1 drug resistance testing as part of treatment management: recommendations for the European setting". AIDS. 2001 Feb. 16;15(3):309-20.
3. Vazquez-Rosales G, Garcia Lerma J G, Yamamoto S, Switzer W M, Havlir D, Folks T M, Richman D D, Heneine W. "Rapid screening of phenotypic resistance to nevirapine by direct analysis of HIV type 1 reverse transcriptase activity in plasma". AIDS Res Hum Retroviruses. 1999 Sep. 1;15(13):1191-200.
4. Goff, S. P. (1990) "Retrovirus reverse transcriptase: Synthesis, Structure, and Function". Review. J Acquir Imm Defic Syndr 3: 817-831.
5. Vandamme A M, Van Vaerenbergh K, De Clercq E. "Anti-human immunodeficiency virus drug combination strategies". Antivir Chem Chemother. 1998 May; 9(3):187-203.
6. Meyer P R, Matsuura S E, Mian A M, So A G, Scott W A. Related Articles. "A mechanism of AZT resistance: an increase in nucleotide-dependent primer unblocking by mutant HIV-1 reverse transcriptase". Mol Cell. 1999 July; 4(1):35-43.
7. Ekstrand D H, Awad R J, Källander C F, Gronowitz J S. "A sensitive assay for the quantification of reverse transcriptase activity based on the use of carrier-bound template and non-radioactive-product detection, with special reference to human-immunodeficiency-virus isolation". Biotechnol Appl Biochem. 1996 April; 23 (Pt 2):95-105.
8. Lindberg J; Sigurethsson S, Löbwgren S, O Andersson H, Sahlberg C, Noreen R, Fridborg K, Zhang H, Unge T. "Structural basis for the inhibitory efficacy of efavirenz (DMP-266), MSC194 and PNU142721 towards the HV-1 RT K103N mutant". Eur J Biochem. 2002 March; 269(6):1670-1677.
9. Shirasaka, T., Kavlick, M. F., Ueno, T., Gao, W.-Y., Kojima, E., Alcaide, M. L., Chokekijchai, S., Roy, B. M., Arnold, E., Yarchoan, R., and Mitsuya, H. "Emergence of human immunodeficiency virus type 1 variants with resistance to multiple dideoxynucleosides in patients receiving therapy with dideoxynucleosides". Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92:2398-2402.
10. Larder B A. "3'-Azido-3'-deoxythymidine resistance suppressed by a mutation conferring human immunodeficiency virus type 1 resistance to normucleoside reverse transcriptase inhibitors". Antimicrob Agents Chemother. 1992 December; 36(12):2664-9.
11. Larder B A. "Interactions between drug resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase". J Gen Virol. 1994 May; 75 (Pt 5):951-7.
12. Boucher C A, Cammack N, Schipper P, Schuurman R, Rouse P, Wainberg M A; Cameron J M. "High-level resistance to (-) enantiomeric 2'-deoxy-3'-thiacytidine in vitro is due to one amino acid substitution in the catalytic site of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase". Antimicrob Agents Chemother. 1993 October; 37(10):2231-4.
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1
2
TABLA 3 Efecto de NNRTI sobre RT de VIH recuperada a partir de plasma de paciente
3
4

Claims (8)

1. Un método para analizar la sensibilidad al fármaco fenotípica en un individuo mamífero infectado por virus con envuelta analizando en una polimerasa introducida en un virus con envuelta recuperado de una muestra biológica de dicho individuo, que comprende las etapas de:
a)
añadir un agente inactivante de enzima seleccionado a partir de agentes modificantes de cisteína, tales como 5,5’-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico), a la muestra para inactivar la actividad de la polimerasa distinta a la presente en el virión con envuelta,
b)
purificar y concentrar el virus con envuelta eliminando anticuerpos que bloquean la actividad de la enzima, inhibidores de la actividad de la enzima endógenos, fármacos antivirales y los agentes que inactivan a la enzima,
c)
lisar las partículas virales para liberar a la polimerasa,
d)
recuperar la polimerasa viral purificada y concentrada que es el resultado de b) y c) y determinar el perfil de sensibilidad al fármaco del individuo a partir de la enzima recuperada usando ensayos enzimáticos sensibles.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el individuo mamífero es un ser humano.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la muestra biológica es una muestra de sangre.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la muestra de sangre es una muestra de plasma.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el virus con envuelta es un retrovirus.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el retrovirus es el virus de inmunodeficiencia humano (VIH), y la enzima es una transcriptasa inversa de (RT) VIH.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el perfil de sensibilidad al fármaco del individuo se usa para seleccionar la terapia del tratamiento de fármaco para el individuo.
8. Un paquete comercial para analizar la sensibilidad al fármaco fenotípica en un individuo mamífero infectado por virus con envuelta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7,
que comprende un agente inactivante de enzima seleccionada a partir de agentes modificantes de cisteína para inactivar la actividad de polimerasa, un ensayo enzimático sensible, y al menos un fármaco de referencia.
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BR112019027993A2 (pt) * 2017-07-04 2020-07-07 Cavidi Ab métodos para avaliar a susceptibilidade de um vírus ao tratamento com um fármaco inibidor de uma enzima do vírus do tipo selvagem, para avaliar se um paciente tratado para uma infecção viral tem necessidade de alterar a terapia farmacológica com um fármaco inibidor da enzima viral e para determinar a carga de um vírus em uma amostra do paciente e a dita resistência do vírus ao tratamento com um fármaco inibidor de uma enzima do vírus do tipo selvagem, e, sistema
CN108896759B (zh) * 2018-06-27 2020-05-19 南京医科大学 受试物致敏性检测方法及其试剂盒

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4707439A (en) * 1984-10-26 1987-11-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Screening test for reverse-transcriptase containing virus such as non-A, non-B hepatitis, NANBH
US6268123B1 (en) * 1993-06-01 2001-07-31 Retro-Tech Gmbh Direct and biochemically functional detection process of retrovirus in biological samples
DE19608687A1 (de) * 1996-03-06 1997-09-11 Retro Tech Gmbh Verfahren und Test-Kit für den nichtradioaktiven, enzymatischen Nachweis von Reverser Transkriptase
SE9902410D0 (sv) * 1999-06-24 1999-06-24 Cavidi Tech Ab Reverse transcriptase assay kit, use thereof and method for analysis of RT activity in biological samples
SE0001132D0 (sv) * 2000-03-29 2000-03-29 Cavidi Tech Ab Method of concentrating and recovering a viral enzyme activity from biological samples

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