PL209210B1

PL209210B1 - The manner of culture of mother cells obtained from growing antler

Info

Publication number: PL209210B1
Application number: PL382287A
Authority: PL
Inventors: Marek Cegielski; Marek Bochnia; Wojciech Dziewiszek
Original assignee: Akademia Medyczna Im Piastow Śląskich We Wrocławiu
Priority date: 2007-04-25
Filing date: 2007-04-25
Publication date: 2011-08-31
Also published as: PL382287A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób hodowli komórek macierzystych wyprowadzonych z rosnącego poroża jeleniowatych, zwłaszcza jelenia szlachetnego, w celu przygotowania przeszczepu służącego do regeneracji tkanki chrzestnej i kostnej.The present invention relates to a method of culturing stem cells derived from growing antlers of deer, especially red deer, in order to prepare a graft for the regeneration of cartilage and bone tissue.

W europejskim kręgu kulturowym, piękno twarzy wymaga zachowania symetrii poszczególnych jej elementów. Całkowity lub częściowy brak oraz wrodzone i nabyte zniekształcenia małżowiny usznej i nosa stanowić więc mogą poważny defekt kosmetyczny. W przypadku tych zniekształceń leczniczym postępowaniem z wyboru są skomplikowane, często wieloetapowe zabiegi chirurgiczne, z uż yciem dostę pnych organicznych wszczepów. Poszukiwania idealnego materiał u do rekonstrukcji rusztowania chrzestnego małżowin usznych i nosa mają ponad 100-letnią historię i są wciąż intensywnie prowadzone. Własna żebrowa chrząstka gospodarza była i jest najczęściej używana jako materiał rekonstrukcyjny w chirurgii twarzowej. Niefortunnie czas potrzebny do pozyskania chrząstki utrudnia zabieg, naraża pacjenta na pooperacyjny dyskomfort, przedłuża rekonwalescencję i zwiększa prawdopodobieństwo pojawienia się późniejszych komplikacji w miejscu pobrania materiału. Ponadto u dzieci ilość moż liwej do pozyskania chrzą stki ż ebrowej jest często zbyt mał a dla odtworzenia rusztowania małżowiny usznej lub nosa, a u dorosłych może być ona skostniała i nieprzydatna do formowania. Tych niedogodności pozwala uniknąć zastosowanie chrząstki allogennej - zgodnej gatunkowo, jako postępowanie z wyboru u każdego pacjenta, u którego nie jest dostępna wystarczająca ilość chrząstki własnej. Dla osłabienia odpowiedzi immunologicznej biorcy stosowane są wówczas różne metody jej przygotowania. Do popularnych sposobów należą kilkutygodniowe przechowywanie chrząstki w mertiolacie, wielokrotne płukanie w skoncentrowanym roztworze soli (NaCl) lub sterylizacja naświetlaniem promieniami gamma. Nie wykazująca aktywności metabolicznej chrząstka, pozostaje wówczas jedynie rusztowaniem dla otaczających tkanek i ulega powolnej resorpcji. Za kolejny etap w poszukiwaniu najodpowiedniejszego materiału organicznego do rekonstrukcji mogą być uważ ane badania Vacantiego i wsp. rozpoczęte w latach 90 XX wieku. W pionierskich eksperymentach użyto wówczas syntetycznej, biokompatybilnej, biodegradalnej, porowatej siatki polimerowej, którą impregnowano izolowanymi ludzkimi chondrocytami. Ilość chondrocytów możliwych do uzyskania poprzez namnażanie ich poza ustrojem jest jednak ograniczona, a ma ona bezpośredni związek z wydajnością procesu regeneracji. Technologia jest bardzo kosztowna, uciążliwa, wymagająca specjalistycznej aparatury. Wiele wszczepów traci leż stopniowo pierwotny kształt.In the European cultural circle, facial beauty requires the symmetry of its individual elements. Therefore, complete or partial absence as well as congenital and acquired deformities of the auricle and nose may constitute a serious cosmetic defect. In the case of these deformities, the therapeutic treatment of choice is complex, often multi-stage surgical procedures using available organic implants. The search for the perfect material for the reconstruction of the godfather of the auricles and the nose has over 100 years of history and is still intensively conducted. The host's own rib cartilage has been and is most often used as a reconstructive material in facial surgery. Unfortunately, the time needed to obtain the cartilage makes the procedure difficult, exposes the patient to postoperative discomfort, prolongs convalescence and increases the likelihood of later complications at the site of collection of the material. Furthermore, in children the amount of rib cage that can be recovered is often too small to recreate the scaffold of the auricle or nose, and in adults it may be ossified and unsuitable for molding. These inconveniences can be avoided by the use of allogeneic cartilage - compatible with species, as the treatment of choice for every patient who does not have enough own cartilage. In order to weaken the recipient's immune response, various methods of its preparation are then used. Popular methods include storing the cartilage in merthiolate for several weeks, repeated rinsing in concentrated salt solution (NaCl) or sterilization with gamma irradiation. Cartilage, which does not exhibit metabolic activity, then remains only a scaffold for the surrounding tissues and is slowly resorbed. The research by Vacanti et al., Started in the 1990s, may be considered the next stage in the search for the most suitable organic material for reconstruction. In pioneering experiments, a synthetic, biocompatible, biodegradable, porous polymer mesh was used, which was impregnated with isolated human chondrocytes. However, the number of chondrocytes obtainable by growing them outside the body is limited, and it is directly related to the efficiency of the regeneration process. The technology is very expensive, cumbersome, and requires specialized equipment. Many implants gradually lose their original shape.

W ostatnich latach, coraz bardziej prawdopodobną staje się perspektywa, że zróżnicowane typy komórek, wywodzące się z komórek macierzystych, będą mogły służyć leczeniu wielu chorób u człowieka. Początek XXI wieku to okres dynamicznego rozwoju badań nad ich wykorzystaniem do regeneracji i odbudowy wszystkich rodzajów tkanek, w tym tkanki łącznej. Komórki macierzyste tak in vivo jak i in vitro cechują się bardzo duż ym potencjałem proliferacyjnym, a moż liwość ich przeszczepiania to szansa na istotny postęp w transplantologii. W przypadku większości tkanek wyjątkowo trudne jest jednak pozyskiwanie ukierunkowanych linii komórkowych. Z pobieraniem ludzkich komórek macierzystych wiążą się też często problemy etyczne oraz zagrożenie transferem chorób wirusowych i nowotworowych. Alternatywą dla komórek ludzkich mogłyby być zmodyfikowane komórki obcogatunkowe. Poszukując ich źródła zwrócono uwagę na ewentualność wykorzystania poroża jeleniowatych, charakteryzującego się szczególnym, nigdzie indziej nie spotykanym procesem odnowy i wzrostu.In recent years, it has become more and more likely that different types of cells, derived from stem cells, will be able to treat many human diseases. The beginning of the 21st century is a period of dynamic development of research on their use for the regeneration and reconstruction of all types of tissues, including connective tissue. Stem cells, both in vivo and in vitro, are characterized by a very high proliferative potential, and the possibility of their transplantation is an opportunity for significant progress in transplantology. However, for most tissues, it is extremely difficult to obtain targeted cell lines. The collection of human stem cells is also often associated with ethical problems and the risk of transferring viral and neoplastic diseases. An alternative to human cells could be modified xenograft cells. Searching for their source, attention was drawn to the possible use of deer antlers, which are characterized by a specific, nowhere else, process of renewal and growth.

Wyjątkowo dynamiczny wzrost poroża - w okresie trzech miesięcy dwucentymetrowe przyrosty dzienne - powoduje, że u ssaków jest ono jednym z najszybciej rosnących organów. Komórki regenerowanego corocznie poroża u jeleni, które są zaliczane do dorosłych somatycznych komórek macierzystych, mają bardzo duży potencjał proliferacyjny. Powstaje z nich ograniczona liczba typów komórek zróżnicowanych, uczestniczących między innymi w regeneracji uszkodzonej chrząstki i kości. Ponieważ komórki porożogenne są komórkami nisko zróżnicowanymi, powodującymi słabą indukcję odpowiedzi immunologicznej, to szansa przyjęcia się ich przeszczepów ksenogenicznych, to jest obcogatunkowych, może być duża.Extremely dynamic growth of antlers - two-centimeter daily increments over a period of three months - makes it one of the fastest growing organs in mammals. Cells of deer, regenerated annually, antlers, which are classified as adult somatic stem cells, have a very high proliferative potential. They produce a limited number of differentiated cell types, which are involved, among others, in the regeneration of damaged cartilage and bone. Since antiplerotic cells are poorly differentiated cells that induce poor immune response induction, the chance of their xenograft, i.e. xenograft, transplantation may be high.

Wynalazek dotyczy sposobu hodowli komórek macierzystych wyprowadzonych z rosnącego poroża jeleniowatych, zwłaszcza jelenia szlachetnego, w oparciu o hodowlę pierwotną, bezpośrednio z niej lub z komórek uprzednio zamroż onych.The invention relates to a method of culturing stem cells derived from growing antlers of deer, especially red deer, based on primary culture, either directly from it or from cells previously frozen.

Istota wynalazku polega na tym, że hodowlę pierwotną zakłada się z pobranych jałowo fragmentów wzrastającego poroża jelenia, które się rozdrabnia, wyizolowuje komórki i hoduje, stosując jako płyn wzrostowy medium hodowlane MEM z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej oraz roztworu glutaminyThe essence of the invention is based on the fact that the primary culture is established from sterile collected fragments of growing deer antlers, which are crushed, cells are isolated and cultured, using the MEM culture medium with the addition of 10% fetal bovine serum and glutamine solution as a growth fluid.

PL 209 210 B1 i dobranych antybiotyków prowadząc ją w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 37°C. Po wyprowadzeniu piątego pasażu komórki zamraża się lub nadal prowadzi się hodowlę w warunkach wyżej opisanych, na identycznym podłożu hodowlanym, a po uzyskaniu odpowiedniej liczby komórek, co najmniej 2 x 10⁶odkleja się je za pomocą trypsyny z 0,02% kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i odwirowuje w peł nym medium hodowlanym. Uzyskany osad zawiesza się w czystym medium MEM i przygotowuje fragmenty rusztowania, do którego wykorzystuje się kawałki Spongostanu, o wymaganych do uzupełnienia ubytku chrząstki lub kości wymiarach. Umieszcza się go w jałowych ampułkach, dodaje zawiesinę komórek w ilości, co najmniej 2 x 10⁶/1 ml płynu. Komórki osadza się na rusztowaniu ze Spongostanu poprzez wirowanie, a następnie zlewa supernatant.And selected antibiotics, carried out in an atmosphere of 5% CO2 and a temperature of 37 ° C. After the fifth passage has been established, the cells are either frozen or grown under the conditions described above on an identical culture medium, and after obtaining the appropriate number of cells, at least 2 x 10 ⁶ , they are detached with trypsin with 0.02% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). ) and centrifuged in complete culture medium. The obtained pellet is suspended in clean MEM medium and fragments of the scaffold are prepared, for which the pieces of Spongostan are used, with the dimensions required to fill the defect of cartilage or bone. It is placed in a sterile vial, a suspension of cells in an amount of at least 2 x 10 ^6/1 ml of liquid. The cells are deposited onto the Spongostan scaffold by centrifugation, and then decanting the supernatant.

Podczas badań poszukiwano odpowiedzi na pytanie czy użyte obcogatunkowe komórki hodowlane przetrwają i podejmą swoje funkcje życiowe w obrębie obcej tkanki. W tym celu podjęto próbę wykorzystania ksenogenicznego przeszczepu komórek macierzystych z rosnącego poroża jelenia szlachetnego do regeneracji ubytku chrząstki małżowiny usznej królika. Do przeszczepów użyto komórek z hodowli uzyskanej sposobem zgodnym z wynalazkiem, na rusztowaniu dla przeszczepów, którym był Spongostan firmy Johnson & Johnson, Poland. Do doświadczenia użyto 12 królików, 6 jako grupa eksperymentalna (E) i 6 - jako grupa kontrolna (C), ośmiomiesięcznych samic, rasy białej kalifornijskiej, o ciężarze około 3,5 - 4,0 kg. W połowie wysokości małżowiny usznej, na jej zewnętrznej powierzchni, standardowo przygotowano pole operacyjne. Powierzchnia skóry była golona i oczyszczana. Około 1 cm od wolnego brzegu małżowiny, na jej powierzchni grzbietowej, odpreparowywano uszypułowany przyśrodkowo płat skórno-ochrzęstnowy, o wymiarach 1 x 1 cm. Następnie wypreparowywano i usuwano fragment obnażonej chrząstki o wymiarach 0.5 x 0.5 cm. Drobne, krwawiące naczynia zamykano elektro-koagulacją. U 6-ciu królików z grupy E, każdorazowo prawostronnie, w przygotowanym łożu, to jest w kieszeni ochrzęstnowej, umieszczano dopasowany do wymiarów ubytku chrząstki płatek Spongostanu nasączony zawiesiną komórkową. W identyczny sposób 6-ciu królikom z grupy C wszczepiano Spongostan nasączony solą fizjologiczną. Na miejsca wszczepów nakładano płaty skórno-ochrzęstnowe. Rany zamykano jednowarstwowo nićmi chirurgicznymi. Następnie przemywano je wodą utlenioną i pozostawiano odkryte, bez zakładania opatrunków. Zabiegi przeprowadzano w osłonie antybiotykowej, podając wszystkim królikom domięśniowo penicylinę 50 000 U.I./ kg. Kierując się obserwacjami klinicznymi, zarówno w grupie E i C, po 4 i 9 tygodniach od dnia zabiegu, z miejsc operowanych pobierano przyżyciowo materiał doświadczalny, którym były wycinki obejmujące całą grubość małżowiny, zawierające zarówno wszczep jak i pozostawioną chrząstkę własną zwierzęcia. Pozyskany materiał utrwalono do badań immunohistochemicznych oraz w mikroskopie elektronowym.During the research, an answer was sought to the question whether the used xenograft cultured cells would survive and take up their life functions within foreign tissue. For this purpose, an attempt was made to use xenograft stem cells from the growing antlers of red deer to regenerate the cartilage defect in the rabbit's ear. For transplantation, cells from a culture obtained according to the invention were used on a scaffold for transplants, which was the Spongostan of Johnson & Johnson, Poland. 12 rabbits were used for the experiment, 6 as experimental group (E) and 6 as control (C), eight-month-old Californian white female rabbits weighing approximately 3.5-4.0 kg. Halfway up the auricle, on its outer surface, an operating field is prepared as standard. The skin surface was shaved and cleaned. Approximately 1 cm from the free edge of the auricle, on its dorsal surface, a medially pedunculated dermal-chondral flap, measuring 1 x 1 cm, was dissected. Then a 0.5 x 0.5 cm fragment of the exposed cartilage was dissected and removed. Small, bleeding vessels were closed with electro-coagulation. In 6 rabbits from group E, a Spongostan flap soaked with the cell suspension was placed on the right side of the prepared bed, i.e. in the peridural pocket, adjusted to the dimensions of the cartilage defect. In an identical manner, 6 rabbits from group C were implanted with Spongostan soaked in physiological saline. Dermal-chondral flaps were applied to the implant sites. Wounds were closed in one layer with surgical threads. They were then rinsed with hydrogen peroxide and left uncovered without applying any dressings. The procedures were performed in an antibiotic cover, with penicillin 50,000 IU / kg administered intramuscularly to all rabbits. Following clinical observations, both in groups E and C, at 4 and 9 weeks from the day of surgery, experimental material was collected from the operated sites, which were sections covering the entire thickness of the auricle, containing both the implant and the animal's own cartilage. The obtained material was fixed for immunohistochemical studies and in an electron microscope.

Do badań immunocytochemicznych pobrany materiał został utrwalony w 4% roztworze zbuforowanej formaliny, odwodu i zatopiony w bloczkach parafinowych. Skrawki do badań mikroskopowych barwiono hematoksyliną i eozyną (M + E) oraz toluidyną (T). Na skrawkach parafinowych wykonano reakcje immunocytochemiczne przy użyciu przeciwciał anty-CX-CR4, anty-c-kit i anty-Thy-1, wykrywających charakterystyczne białka dla komórek macierzystych.For immunocytochemical tests, the collected material was fixed in a 4% buffered formalin solution, abdomen and embedded in paraffin blocks. Sections for microscopic examination were stained with hematoxylin and eosin (M + E) and toluidine (T). Immunocytochemical reactions were performed on paraffin sections using anti-CX-CR4, anti-c-kit and anti-Thy-1 antibodies, detecting proteins characteristic of stem cells.

Do badań w mikroskopie elektronowym materiał utrwalono 2,5% aldehydem glutarowym na buforze cocodylowym (0,1 M, pH 7,4 ), a następnie odwadniano go i zatapiano w Eponie 812.For electron microscopy studies, the material was fixed with 2.5% glutaraldehyde on a cocodyl buffer (0.1 M, pH 7.4), and then it was dehydrated and embedded in an Epona 812.

Badania elektroforetyczne białek surowicy krwi wykonano w czwartym tygodniu po zabiegu, pobierając od każdego królika z grupy doświadczalnej i z grupy kontrolnej, po 2 ml krwi z żyły usznej brzeżnej. Krew inkubowano w sposób standardowy w temperaturze 37°C przez 0,5 godziny, a następnie wirowano przez 5 minut dla uzyskania surowicy. Elektroforetyczny rozdział surowicy przeprowadzono na zbuforowanym żelu agarozowym, elektroforezą wysokonapięciową poziomą. Odczytu dokonywano densytometrem przy długości fali 600 nm, otrzymując poszczególne frakcje białek oraz określano stosunek albumin do globulin. Uzyskane wyniki badań elektroforetycznych poddano analizie statystycznej z użyciem testu t-Studenta. Za istotne statystycznie przejęto różnice, gdzie p < 0,05. Przy wykonaniu obliczeń wykorzystano program Statistica ver. 7.0 (Stat Soft, Kraków, Poland).The electrophoretic tests of blood serum proteins were performed in the fourth week after the procedure, collecting 2 ml of blood from the marginal ear vein from each rabbit from the experimental group and from the control group. Blood was incubated in the standard manner at 37 ° C for 0.5 hours and then centrifuged for 5 minutes to obtain serum. Serum electrophoresis was performed on a buffered agarose gel by high voltage horizontal electrophoresis. The readings were made with a densitometer at a wavelength of 600 nm, obtaining individual protein fractions and the ratio of albumin to globulin was determined. The obtained results of electrophoretic tests were statistically analyzed using the Student's t-test. The differences where p <0.05 were taken as statistically significant. The calculations were performed with the use of the Statistica ver. 7.0 (Stat Soft, Kraków, Poland).

Podczas obserwacji klinicznych, przeprowadzanych jednocześnie po wszczepach doświadczalnych i kontrolnych, obserwowano i porównywano przebieg procesu gojenia. Wszystkie 12 zwierząt zniosło zastosowane procedury chirurgiczne dobrze. Rany pooperacyjne uległy prawidłowemu wygojeniu przez rychłozrost. Szwy usuwano w 8 dobie po zabiegu. W miejscach gdzie śródochrzęstnowo lokowano zawieszone na Spongostanie somatyczne komórki macierzyste obserwowano ich udział w procesach regeneracyjnych, bez odczynu zapalnego i reakcji odrzutu przeszczepu. Wynikiem intensywnie zachodzącego procesu regeneracji był wyraźny przyrost grubości chrząstki w czasie pierw4During clinical observations, carried out simultaneously after the experimental and control implants, the healing process was observed and compared. All 12 animals endured the applied surgical procedures well. Postoperative wounds healed properly by rapid growth. The sutures were removed 8 days after surgery. In places where somatic stem cells suspended on Spongostan were located introchondrially, their participation in regenerative processes was observed, without inflammation and graft rejection. The result of the intensive regeneration process was a clear increase in the thickness of the cartilage during the first period

PL 209 210 B1 szych 3 tygodni doświadczenia. Proces ten ulegał następnie stopniowemu spowolnieniu. W 7 tygodniu doświadczenia, pokryte niezmienioną skórą, nowo powstałe rusztowanie małżowiny usznej o lekko nierównej powierzchni, było grubsze o około 15% od otaczającej je chrząstki własnej zwierzęcia. Przez kolejne 2 tygodnie nie obserwowano już przyrostu grubości małżowiny. Wszczepiany królikom z grupy kontrolnej Spongostan, nasą czony roztworem soli fizjologicznej, ulegał wchłonięciu bez objawów martwicy i odczynu zapalnego, a obszary gdzie usunięto chrząstkę pozostawały wklęsłe. Po 9 tygodniach miejsca te były nadal znacznie cieńsze, pokryte obustronnie niezmienioną skórą. Nie zaobserwowano tu żadnych procesów regeneracyjnych, a jedynie proces bliznowacenia.Of the first 3 weeks of experiment. This process then gradually slowed down. In the 7th week of the experiment, the newly formed scaffold of the auricle with a slightly uneven surface, covered with unchanged skin, was about 15% thicker than the surrounding cartilage of the animal's own. For the next 2 weeks, no increase in the thickness of the auricle was observed. The Spongostan rabbits from the control group, soaked with saline solution, were absorbed without signs of necrosis or inflammation, and the areas where the cartilage was removed remained concave. After 9 weeks, these areas were still much thinner, covered with unchanged skin on both sides. No regenerative processes have been observed here, only the scarring process.

Na podstawie badań można stwierdzić co następuje.Based on the research, the following can be stated.

W 4 tygodniu, na obwodzie obszaru regeneracji obserwuje się dużą ilość proliferuj ą cych, pasmowato ułożonych, niezróżnicowanych komórek. W pewnych obszarach pojawiają się między nimi małe naczynia krwionośne. W centrum przeszczepu ułożenie komórek staje się rzadsze, a między nimi pojawiają się włókna kolagenowe. Początkowo mają one regularny pasmowaty przebieg, a następnie ich układ staje się chaotyczny, często wzajemnie przeplatają się. Między włóknami kolagenowymi lokalizują się liczne fibroblasty, fibrocyty w mniejszej ilości chondrocyty, a także czasami miejscowe skupiska limfocytów i granulocytów kwasochłonnych. Centrum obszaru regeneracji zajmuje istota podstawowa organizująca się i ulegająca przebudowie z licznymi typowymi komórkami tkanki łącznej takimi jak fibroblasty, chondroblasty, osteoblasty oraz liczne struktury zagęszczonej macierzy. Morfologicznie struktury te podobne są do beleczek chrzęstno-kostnych i kostnych, w obrębie których w tak zwanych zatokach erozyjnych obecne są aktywne osteoklasty. Po 9 tygodniach, w miejscach regeneracji obserwuje się zmniejszoną liczbę komórek i wzrost ilości włókien kolagenowych. W bardziej zmineralizowanej istocie podstawowej obecne są liczne zwapnienia i pojedyncze ogniska kostnienia.At week 4, a large number of proliferating, streaky, undifferentiated cells are observed around the periphery of the regeneration area. In some areas, small blood vessels appear between them. In the center of the transplant, the arrangement of cells becomes less frequent, and collagen fibers appear between them. Initially, they follow a regular streaked course, and then their arrangement becomes chaotic, often intertwined. Numerous fibroblasts are located between the collagen fibers, fibrocytes with a smaller number of chondrocytes, and sometimes local clusters of lymphocytes and eosinophils. The center of the regeneration area is occupied by a basic entity that organizes and remodels with numerous typical connective tissue cells such as fibroblasts, chondroblasts, osteoblasts and numerous dense matrix structures. Morphologically, these structures are similar to cartilage-bone and bone trabeculae in which active osteoclasts are present in the so-called erosive sinuses. After 9 weeks, a decreased cell number and an increase in collagen fibers are observed at the regeneration sites. In a more mineralized basal matter, numerous calcifications and individual foci of ossification are present.

Przeprowadzone reakcje immunocytochemiczne pozwoliły zlokalizować komórki wykazujące obecność charakterystycznych dla komórek macierzystych białek Thy-1, CX-CR4 w obrębie obszaru wszczepu. Wyznakowane komórki znajdowały się obok i w obrębie naczyń krwionośnych oraz w strefie intensywnie proliferujących, niezróżnicowanych komórek na granicy wszczepu i chrząstki małżowiny usznej, a także w miejscach przebudowy beleczek chrzęstno kostnych.The performed immunocytochemical reactions allowed to locate cells showing the presence of the Thy-1 and CX-CR4 proteins characteristic for stem cells within the area of the implant. The labeled cells were located next to and within the blood vessels and in the zone of intensively proliferating, undifferentiated cells on the border of the implant and the auricle cartilage, as well as in the reconstruction sites of the osteochondral trabeculae.

Na podstawie mikroskopii elektronowej można stwierdzić co następuje.Based on electron microscopy, the following can be stated.

Na większości oglądanych elektronogramów z miejsc regeneracji, zarówno w 4 jak i w 9 tygodniu doświadczenia obserwuje się stosunkowo liczne komórki, oraz dużą ilość włókien kolagenowych. Większość z obserwowanych komórek to fibroblasty, chondroblasty i osteoblasty. Po upływie 3 tygodni regeneracji cytoplazma ich zawiera duże ilości szorstkiej siateczki śródplazmatycznej o często rozdętych kanałach, liczne mitochondria z obecnością homogennej macierzy i niewyraźnym konturze grzebieni mitochondrialnych oraz wodniczki i wakuole. Jądra tych komórek zawierają duże ilości luźnej chromatyny. Obserwuje się także niewielkie obłonione fragmenty cytoplazmy, które odrywają się od komórek i stają się częścią substancji międzykomórkowej, uczestniczącej w jej mineralizacji. W 9 tygodniu doświadczenia liczba komórek jest mniejsza a wzrasta ilość kolagenu. W wielu komórkach zarówno błona komórkowa jak i otoczka jądrowa wykazują inwaginacje, a chromatyna jądrowa ulega kondensacji. Liczne komórki ulegają apoptozie i w nich występują charakterystyczne dla komórek apoptotycznych jądra komórkowe, w których chromatyna jądrowa jest skondesowana, a cytoplazma ich ulega fragmentacji. Po upływie 3 tygodni przyrost grubości chrząstki ulegał wyraźnemu spowolnieniu, natomiast po 9 tygodniach doświadczenia ubytek rusztowania chrzestnego małżowiny był już całkowicie odbudowany. Na elektronogramach obserwowano tu liczne komórki apoptotyczne. Aktywne procesy apoptotyczne są odpowiedzialne za morfogenezę rosnącego poroża. Są też jednym z mechanizmów mających wpływ na regulację procesu regeneracji, miedzy innymi ograniczając nadmierny rozrost komórkowy. Podobne procesy regulacyjne mają miejsce podczas rozwoju szkieletowego, wzrastania kości i ich przebudowieIn most of the electronograms from the regeneration sites, both in the 4th and 9th week of the experiment, relatively numerous cells and a large number of collagen fibers were observed. Most of the cells observed are fibroblasts, chondroblasts and osteoblasts. After 3 weeks of regeneration, their cytoplasm contains large amounts of a rough endoplasmic reticulum with often distended channels, numerous mitochondria with the presence of a homogeneous matrix and indistinct contours of mitochondrial crests, as well as aquatic warblers and vacuoles. The nuclei of these cells contain large amounts of loose chromatin. There are also small, obstructed fragments of the cytoplasm that detach from the cells and become part of the intercellular substance involved in its mineralization. In the 9th week of the experiment, the number of cells is smaller and the amount of collagen increases. In many cells, both the cell membrane and the nuclear envelope show invagination and nuclear chromatin condenses. Many cells undergo apoptosis and contain nuclei, characteristic of apoptotic cells, in which nuclear chromatin is condensed and their cytoplasm is fragmented. After 3 weeks, the increase in the thickness of the cartilage slowed down significantly, while after 9 weeks of the experiment, the defect of the auricle's godfather was completely rebuilt. Numerous apoptotic cells were observed on the electronograms. Active apoptotic processes are responsible for the morphogenesis of the growing antlers. They are also one of the mechanisms influencing the regulation of the regeneration process, including limiting excessive cell growth. Similar regulatory processes take place during skeletal development, bone growth, and bone remodeling

Natomiast w wyniku elektroforetycznego rozdziału surowicy otrzymano frakcje białek takich jak albuminy, globuliny α1, α2, β1, β2 i gammaglobuliny. Pojedyncze frakcje określono w wartościach względnych i bezwzględnych oraz określono stosunek albumin do globulin. Elektroforetyczny rozdział białek surowicy obrazuje zachowanie się szerokiego spektrum frakcji, do których zaliczamy białka ostrej fazy i immunoglobuliny. Albuminy są tu frakcją reagującą ujemnie, a białka zawarte we frakcjach α1, α2, β1, β2 globulin reagują w różnym stopniu i z różną dynamiką dodatnio. Rolę urazu operacyjnego i naruszenia ciągłości tkanek jako czynnika indukującego odpowiedź ostrej fazy można było, naszym zdaniem pominąć, bowiem wszystkie zwierzęta z grup E i C przebyły identyczną technicznie procedurę chirurgiczną. Przy porównaniu proteinogramów grupy eksperymentalnej i kontrolnej u zwierząt,However, as a result of electrophoretic separation of serum, protein fractions such as albumin, α1, α2, β1, β2 globulins and gamma globulins were obtained. Single fractions were determined in relative and absolute values, and the albumin to globulin ratio was determined. The electrophoretic separation of serum proteins illustrates the behavior of a broad spectrum of fractions, including acute phase proteins and immunoglobulins. Albumin is a negatively reacting fraction, and proteins contained in the α1, α2, β1, β2 globulin fractions react to a different degree and positively with different dynamics. In our opinion, the role of the surgical trauma and the violation of tissue continuity as an inducing factor of the acute phase response could be omitted, as all animals from groups E and C underwent a technically identical surgical procedure. When comparing the proteinograms of the experimental and control groups in animals,

PL 209 210 B1 którym wszczepiono komórki porożogenne zaobserwowano jedynie nieznaczne, na granicy istotności statystycznej, podwyższenie frakcji β2 globulin. Korelowało to z obserwowanym równocześnie w badaniach mikroskopowych słabym odczynem zapalnym na obcogatunkowe komórki. Umiarkowana angiogeneza i masywna synteza kolagenu, przy braku nacieku neutrofilowego uruchamiającego procesy proteolityczne, przemawia za odtwórczym działaniem komórek porożogennych. Odpowiedź immunologiczna u operowanych zwierząt była tym samym słabo wyrażona i nie towarzyszyła jej reakcja odrzucenia przeszczepu.Only a slight, at the border of statistical significance, increase in the fraction of β2 globulins was observed in the presence of antiperspirant cells. This correlated with the weak inflammatory reaction to xenograft cells observed simultaneously in microscopic studies. Moderate angiogenesis and massive collagen synthesis, in the absence of neutrophilic infiltration triggering proteolytic processes, support the regenerative effect of antlerogenic cells. The immune response in the operated animals was therefore poorly expressed and was not accompanied by a graft rejection reaction.

W poniższej tabeli został przedstawiony elektroforetyczny rozdział białek surowicy krwi królików z grupy kontrolnej i eksperymentalnej.The table below presents the electrophoretic separation of serum proteins from the control and experimental rabbits.

Grupa C N 6 Group C. N 6 Grupa E N 6 Group E N 6 Białko całkowite Total protein g/l g / l 60,9 ± 14,7 60.9 ± 14.7 57,4 ± 11,3 57.4 11.3 Albuminy Albumin g/l g / l 41,7 ± 3,6 41.7 ± 3.6 37,6 ± 7,2 37.6 ± 7.2 % % 67,2 ± 4,83 67.2 ± 4.83 65,8 ± 4,68 65.8 ± 4.68 Alfa 1 Alpha 1 g/l g / l 2,8 ± 1,6 2.8 ± 1.6 1,7 ± 0,8 1.7 ± 0.8 % % 4,22 ± 2,05 4.22 ± 2.05 2,98 ± 1,27 2.98 ± 1.27 Alfa 2 Alpha 2 g/l g / l 3,8 ± 1,2 3.8 ± 1.2 2,6 ± 0,7 2.6 ± 0.7 % % 5,95 ± 1,36 5.95 1.36 5,28 ± 1,06 5.28 ± 1.06 Globuliny Globulins Beta 1 Beta 1 g/l g / l 5,3 ± 1,4 5.3 ± 1.4 4,9 ± 1,7 4.9 ± 1.7 % % 8,57 ± 2,07 8.57 ± 2.07 11,01 ± 4,6 11.01 ± 4.6 Beta 2 Beta 2 g/l g / l 2,03 ± 0,75 2.03 ± 0.75 2,4 ± 0,62 2.4 ± 0.62 % % 3,3 7± 1,26 3.3 7 ± 1.26 4,18 ± 1,16 4.18 ± 1.16 Gamma Gamma g/l g / l 6,35 ± 1,73 6.35 ± 1.73 7,03 ± 1,89 7.03 ± 1.89 % % 10,38 ± 2,83 10.38 ± 2.83 12,42 ± 2,79 12.42 ± 2.79 Albuminy/Globuliny Albumin / Globulins 2,04 ± 0,61 2.04 ± 0.61 1,97 ± 0,42 1.97 ± 0.42

Na podstawie wyników przeprowadzonych badań można wnosić, że realne jest uzyskanie wszczepów z komórek macierzystych wyprowadzonych sposobem według wynalazku w celu odbudowy tkanki chrzęstnej i kostnej u innych gatunków niż jeleniowate. Komórki porożogenne nie zostały odrzucone przez reprezentatywną grupę obcogatunkową zwierząt, jakimi są króliki, a przeciwnie brały one udział w regeneracji tkanki chrzestnej wraz z udziałem tolerujących ich obecność tkanek gospodarza. Pozwala to wnioskować, że istnieje realna perspektywa stosowania tak otrzymanych komórek macierzystych również u ludzi. Wytworzone sposobem według wynalazku wszczepy pozwalają na uniknięcie szeregu trudności regeneracji tkanki łącznej u ludzi znanymi sposobami, niosącymi niebezpieczeństwo transferu chorób wirusowych, nowotworowych czy genetycznych, a także, co jest niezwykle istotne, pozbycie się problemów etycznych związanych z pozyskiwaniem ludzkich komórek macierzystych do tego celu.Based on the results of the research carried out, it can be concluded that it is possible to obtain stem cell implants derived from the method according to the invention in order to rebuild cartilage and bone tissue in species other than deer. Antiperspirant cells were not rejected by a representative group of animals, such as rabbits, and, on the contrary, they participated in the regeneration of cartilage with the participation of host tissues tolerating their presence. This allows the conclusion that there is a real prospect of using the stem cells thus obtained also in humans. The implants produced by the method according to the invention allow to avoid a number of difficulties in the regeneration of connective tissue in humans by known methods, which carry the risk of transferring viral, cancer or genetic diseases, and, which is extremely important, to get rid of the ethical problems associated with obtaining human stem cells for this purpose.

Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładzie wykonania.The subject of the invention is presented in an exemplary embodiment.

P r z y k ł a d. Fragment tkanki rosnącego poroża w postaci krążka o średnicy 1,5 cm i grubości 0,2 mm pobiera się w sposób sterylny podczas narkozy zwierzęcia. Pobrany fragment tkanki dzieli się na cztery części. Jedną część przeznaczoną do hodowli komórkowej umieszcza się w probówce, zanurzając ją w 10 ml medium hodowlanego - MEM firmy Cambrex z dodatkiem penicyliny 100 U.l./ml i streptomycyny 0,1 mg/ml. W warunkach laboratoryjnych wycinek kilka razy pł ucze się medium z dodatkiem wymienionych antybiotyków. Następnie metodą mechaniczną rozdrabnia się go na małe fragmenty wielkości 0,5 - 1 mm. Z tak rozdrobnionego fragmentu poroża wyizolowuje się proliferujące komórki wykorzystując zjawisko ich samoczynnej migracji. Po izolacji komórki zawiesza się w pełnym medium, hodowlanym, w ilości co najmniej 20% objętości komory hodowlanej, z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej, penicyliny 100 U.I./ml, streptomycyny 0,1 mg/ml, L-Glutaminy 1 mM/ml i przenosiExample: A piece of tissue of the growing antler in the form of a disc 1.5 cm in diameter and 0.2 mm thick is collected in a sterile manner while the animal is anesthetized. The collected tissue fragment is divided into four parts. One part intended for cell culture is placed in a test tube by immersing it in 10 ml of the culture medium - MEM by Cambrex with the addition of penicillin 100 U.l / ml and streptomycin 0.1 mg / ml. In laboratory conditions, the sample is learned several times with the medium with the addition of the above-mentioned antibiotics. Then, it is mechanically crushed into small pieces of 0.5-1 mm. From such a fragmented antler fragment, proliferating cells are isolated using the phenomenon of their spontaneous migration. After isolation, cells are suspended in complete culture medium in an amount of at least 20% of the culture chamber volume, with the addition of 10% fetal bovine serum, penicillin 100 UI / ml, streptomycin 0.1 mg / ml, L-Glutamine 1 mM / ml and it carries

PL 209 210 B1 do butelek hodowlanych o powierzchni 25 cm². Hodowlę prowadzi się w inkubatorze Kendro, w standardowych warunkach, to jest w temperaturze +37°C, w atmosferze z dodatkiem 5% CO2. Po uzyskaniu pełnego monolayeru, komórki odkleja się od podłoża butelek hodowlanych przy użyciu enzymu 0,05% trypsyny z 0,02% kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i przenosi się do kolejnych butelek hodowlanych. Z tak otrzymanej linii pierwotnej, poprzez kolejne pasaże wyprowadza się linię ciągłą, a po uzyskaniu piątego pasażu komórki zamraża się z dodatkiem 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowuje w ciekłym azocie w temperaturze -176°C.PL 209 210 B1 for breeding bottles with an area of 25 cm ² . The cultivation is carried out in a Kendro incubator under standard conditions, i.e. at a temperature of + 37 ° C, in an atmosphere with 5% CO2. After the monolayer is complete, the cells are detached from the substrate of the culture bottles using the enzyme 0.05% trypsin with 0.02% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and transferred to subsequent culture bottles. From the primary line thus obtained, a solid line is drawn through successive passages, and after the fifth passage has been obtained, the cells are frozen with 10% dimethylsulfoxide (DMSO) and stored in liquid nitrogen at -176 ° C.

W celu przygotowania komórek do wszczepu odmraż a się pasaż piąty, poddając komórki dalszej hodowli, stosując identyczne pełne medium hodowlane. Po uzyskaniu odpowiedniej ilości komórek 5 x 10⁶ odkleja się je od podłoża butelek hodowlanych za pomocą trypsyny i EDTA, następnie odwirowuje w pełnym medium hodowlanym, wykorzystując fakt, że surowica zawarta w medium inaktywuje działanie enzymu trypsyny, a otrzymany osad zawiesza się w czystym medium MEM bez surowicy,To prepare the cells for implantation, the fifth passage is thawed by exposing the cells to further culture using the identical complete culture medium. After obtaining the appropriate number of 5 x 10 ⁶ cells, they are detached from the base of the culture bottles using trypsin and EDTA, then centrifuged in the complete culture medium, using the fact that the serum contained in the medium inactivates the action of the trypsin enzyme, and the obtained pellet is suspended in a clean medium MEM without serum

L-Glutaminy, i antybiotyków. Komórki liczy się w komorze Biirkera i sporządza zawiesinę 2 x 10⁶ komórek do jednego wszczepu, przygotowując je do osadzenia na rusztowaniu. Do tego celu wykorzystuje się fragmenty Spongostanu, to jest gąbki żelatynowej firmy Johnson & Johnson, stosowanej w chirurgii np. przy tamowaniu krwawień, a tu jako nośnik do hodowli adherentnych komórek. Umieszcza się je w jałowych ampułkach plastikowych, dodaje zawiesinę komórek w ilości 2 x 10⁶ komórek/1 ml czystego płynu MEM bez dodatków, następnie odwirowuje go, a komórki w tym czasie osiadają na Spongostanie. Wirowanie prowadzi się w wirówce firmy Hereus przez 10 minut przy około 700 obr/min. Odwirowany płyn - supernatant - zlewa się, otrzymując gotowe do wszczepu komórki zawieszone na Spongostanie.L-Glutamine, and antibiotics. The cells are counted in a Biirker chamber and 2 x 10 ⁶ cells are suspended into one implant, preparing them for scaffolding. For this purpose, fragments of Spongostan, i.e. a Johnson & Johnson gelatin sponge are used, used in surgery, e.g. in staunching bleeding, and here as a carrier for the cultivation of adherent cells. They are placed in sterile plastic ampoules, a cell suspension is added in the amount of 2 x 10 ⁶ cells / 1 ml of pure MEM fluid without additives, then it is centrifuged, and the cells at this time settle on Spongostan. Centrifugation is carried out in a Hereus centrifuge for 10 minutes at approximately 700 rpm. The centrifuged fluid - the supernatant - is decanted to obtain implant-ready cells suspended on Spongostan.

Claims

Patent claim

A method of culturing stem cells derived from growing antlers of deer, especially red deer, based on a primary culture, carried out in an atmosphere of 5% CO2 and a temperature of 37 ° C, directly from it or from cells previously frozen, characterized in that the primary culture is assumed from sterile collected fragments of growing deer antlers, which are crushed, cells are isolated and cultured, using MEM culture medium with the addition of 10% fetal bovine serum, glutamine solution and selected antibiotics as the growth fluid, and after the fifth passage, the cells are frozen or continued cultivation under the conditions described above, on an identical culture medium and after obtaining the number of cells at least 2 x 10 ⁶ , they are detached with trypsin with 0.02% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), centrifuged in complete culture medium, while the obtained pellet is suspended in a clean MEM medium and prepares fragments of the scaffolding to which the It uses pieces of Spongostanu as required to replenish cartilage or bone dimensions, and placed in a sterile vial, a suspension of cells in an amount of at least 2 x 10 ^6/1 ml of fluid and the cells deposited on the scaffold with Spongostanu by centrifugation, and then decant the supernatant.