PL209210B1 - Sposób hodowli komórek macierzystych wyprowadzonych z rosnącego poroża jeleniowatych - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób hodowli komórek macierzystych wyprowadzonych z rosnącego poroża jeleniowatych, zwłaszcza jelenia szlachetnego, w celu przygotowania przeszczepu służącego do regeneracji tkanki chrzestnej i kostnej.

W europejskim kręgu kulturowym, piękno twarzy wymaga zachowania symetrii poszczególnych jej elementów. Całkowity lub częściowy brak oraz wrodzone i nabyte zniekształcenia małżowiny usznej i nosa stanowić więc mogą poważny defekt kosmetyczny. W przypadku tych zniekształceń leczniczym postępowaniem z wyboru są skomplikowane, często wieloetapowe zabiegi chirurgiczne, z uż yciem dostę pnych organicznych wszczepów. Poszukiwania idealnego materiał u do rekonstrukcji rusztowania chrzestnego małżowin usznych i nosa mają ponad 100-letnią historię i są wciąż intensywnie prowadzone. Własna żebrowa chrząstka gospodarza była i jest najczęściej używana jako materiał rekonstrukcyjny w chirurgii twarzowej. Niefortunnie czas potrzebny do pozyskania chrząstki utrudnia zabieg, naraża pacjenta na pooperacyjny dyskomfort, przedłuża rekonwalescencję i zwiększa prawdopodobieństwo pojawienia się późniejszych komplikacji w miejscu pobrania materiału. Ponadto u dzieci ilość moż liwej do pozyskania chrzą stki ż ebrowej jest często zbyt mał a dla odtworzenia rusztowania małżowiny usznej lub nosa, a u dorosłych może być ona skostniała i nieprzydatna do formowania. Tych niedogodności pozwala uniknąć zastosowanie chrząstki allogennej - zgodnej gatunkowo, jako postępowanie z wyboru u każdego pacjenta, u którego nie jest dostępna wystarczająca ilość chrząstki własnej. Dla osłabienia odpowiedzi immunologicznej biorcy stosowane są wówczas różne metody jej przygotowania. Do popularnych sposobów należą kilkutygodniowe przechowywanie chrząstki w mertiolacie, wielokrotne płukanie w skoncentrowanym roztworze soli (NaCl) lub sterylizacja naświetlaniem promieniami gamma. Nie wykazująca aktywności metabolicznej chrząstka, pozostaje wówczas jedynie rusztowaniem dla otaczających tkanek i ulega powolnej resorpcji. Za kolejny etap w poszukiwaniu najodpowiedniejszego materiału organicznego do rekonstrukcji mogą być uważ ane badania Vacantiego i wsp. rozpoczęte w latach 90 XX wieku. W pionierskich eksperymentach użyto wówczas syntetycznej, biokompatybilnej, biodegradalnej, porowatej siatki polimerowej, którą impregnowano izolowanymi ludzkimi chondrocytami. Ilość chondrocytów możliwych do uzyskania poprzez namnażanie ich poza ustrojem jest jednak ograniczona, a ma ona bezpośredni związek z wydajnością procesu regeneracji. Technologia jest bardzo kosztowna, uciążliwa, wymagająca specjalistycznej aparatury. Wiele wszczepów traci leż stopniowo pierwotny kształt.

W ostatnich latach, coraz bardziej prawdopodobną staje się perspektywa, że zróżnicowane typy komórek, wywodzące się z komórek macierzystych, będą mogły służyć leczeniu wielu chorób u człowieka. Początek XXI wieku to okres dynamicznego rozwoju badań nad ich wykorzystaniem do regeneracji i odbudowy wszystkich rodzajów tkanek, w tym tkanki łącznej. Komórki macierzyste tak in vivo jak i in vitro cechują się bardzo duż ym potencjałem proliferacyjnym, a moż liwość ich przeszczepiania to szansa na istotny postęp w transplantologii. W przypadku większości tkanek wyjątkowo trudne jest jednak pozyskiwanie ukierunkowanych linii komórkowych. Z pobieraniem ludzkich komórek macierzystych wiążą się też często problemy etyczne oraz zagrożenie transferem chorób wirusowych i nowotworowych. Alternatywą dla komórek ludzkich mogłyby być zmodyfikowane komórki obcogatunkowe. Poszukując ich źródła zwrócono uwagę na ewentualność wykorzystania poroża jeleniowatych, charakteryzującego się szczególnym, nigdzie indziej nie spotykanym procesem odnowy i wzrostu.

Wyjątkowo dynamiczny wzrost poroża - w okresie trzech miesięcy dwucentymetrowe przyrosty dzienne - powoduje, że u ssaków jest ono jednym z najszybciej rosnących organów. Komórki regenerowanego corocznie poroża u jeleni, które są zaliczane do dorosłych somatycznych komórek macierzystych, mają bardzo duży potencjał proliferacyjny. Powstaje z nich ograniczona liczba typów komórek zróżnicowanych, uczestniczących między innymi w regeneracji uszkodzonej chrząstki i kości. Ponieważ komórki porożogenne są komórkami nisko zróżnicowanymi, powodującymi słabą indukcję odpowiedzi immunologicznej, to szansa przyjęcia się ich przeszczepów ksenogenicznych, to jest obcogatunkowych, może być duża.

Wynalazek dotyczy sposobu hodowli komórek macierzystych wyprowadzonych z rosnącego poroża jeleniowatych, zwłaszcza jelenia szlachetnego, w oparciu o hodowlę pierwotną, bezpośrednio z niej lub z komórek uprzednio zamroż onych.

Istota wynalazku polega na tym, że hodowlę pierwotną zakłada się z pobranych jałowo fragmentów wzrastającego poroża jelenia, które się rozdrabnia, wyizolowuje komórki i hoduje, stosując jako płyn wzrostowy medium hodowlane MEM z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej oraz roztworu glutaminy

PL 209 210 B1 i dobranych antybiotyków prowadząc ją w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 37°C. Po wyprowadzeniu piątego pasażu komórki zamraża się lub nadal prowadzi się hodowlę w warunkach wyżej opisanych, na identycznym podłożu hodowlanym, a po uzyskaniu odpowiedniej liczby komórek, co najmniej 2 x 10⁶ odkleja się je za pomocą trypsyny z 0,02% kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i odwirowuje w peł nym medium hodowlanym. Uzyskany osad zawiesza się w czystym medium MEM i przygotowuje fragmenty rusztowania, do którego wykorzystuje się kawałki Spongostanu, o wymaganych do uzupełnienia ubytku chrząstki lub kości wymiarach. Umieszcza się go w jałowych ampułkach, dodaje zawiesinę komórek w ilości, co najmniej 2 x 10⁶/1 ml płynu. Komórki osadza się na rusztowaniu ze Spongostanu poprzez wirowanie, a następnie zlewa supernatant.

Podczas badań poszukiwano odpowiedzi na pytanie czy użyte obcogatunkowe komórki hodowlane przetrwają i podejmą swoje funkcje życiowe w obrębie obcej tkanki. W tym celu podjęto próbę wykorzystania ksenogenicznego przeszczepu komórek macierzystych z rosnącego poroża jelenia szlachetnego do regeneracji ubytku chrząstki małżowiny usznej królika. Do przeszczepów użyto komórek z hodowli uzyskanej sposobem zgodnym z wynalazkiem, na rusztowaniu dla przeszczepów, którym był Spongostan firmy Johnson & Johnson, Poland. Do doświadczenia użyto 12 królików, 6 jako grupa eksperymentalna (E) i 6 - jako grupa kontrolna (C), ośmiomiesięcznych samic, rasy białej kalifornijskiej, o ciężarze około 3,5 - 4,0 kg. W połowie wysokości małżowiny usznej, na jej zewnętrznej powierzchni, standardowo przygotowano pole operacyjne. Powierzchnia skóry była golona i oczyszczana. Około 1 cm od wolnego brzegu małżowiny, na jej powierzchni grzbietowej, odpreparowywano uszypułowany przyśrodkowo płat skórno-ochrzęstnowy, o wymiarach 1 x 1 cm. Następnie wypreparowywano i usuwano fragment obnażonej chrząstki o wymiarach 0.5 x 0.5 cm. Drobne, krwawiące naczynia zamykano elektro-koagulacją. U 6-ciu królików z grupy E, każdorazowo prawostronnie, w przygotowanym łożu, to jest w kieszeni ochrzęstnowej, umieszczano dopasowany do wymiarów ubytku chrząstki płatek Spongostanu nasączony zawiesiną komórkową. W identyczny sposób 6-ciu królikom z grupy C wszczepiano Spongostan nasączony solą fizjologiczną. Na miejsca wszczepów nakładano płaty skórno-ochrzęstnowe. Rany zamykano jednowarstwowo nićmi chirurgicznymi. Następnie przemywano je wodą utlenioną i pozostawiano odkryte, bez zakładania opatrunków. Zabiegi przeprowadzano w osłonie antybiotykowej, podając wszystkim królikom domięśniowo penicylinę 50 000 U.I./ kg. Kierując się obserwacjami klinicznymi, zarówno w grupie E i C, po 4 i 9 tygodniach od dnia zabiegu, z miejsc operowanych pobierano przyżyciowo materiał doświadczalny, którym były wycinki obejmujące całą grubość małżowiny, zawierające zarówno wszczep jak i pozostawioną chrząstkę własną zwierzęcia. Pozyskany materiał utrwalono do badań immunohistochemicznych oraz w mikroskopie elektronowym.

Do badań immunocytochemicznych pobrany materiał został utrwalony w 4% roztworze zbuforowanej formaliny, odwodu i zatopiony w bloczkach parafinowych. Skrawki do badań mikroskopowych barwiono hematoksyliną i eozyną (M + E) oraz toluidyną (T). Na skrawkach parafinowych wykonano reakcje immunocytochemiczne przy użyciu przeciwciał anty-CX-CR4, anty-c-kit i anty-Thy-1, wykrywających charakterystyczne białka dla komórek macierzystych.

Do badań w mikroskopie elektronowym materiał utrwalono 2,5% aldehydem glutarowym na buforze cocodylowym (0,1 M, pH 7,4 ), a następnie odwadniano go i zatapiano w Eponie 812.

Badania elektroforetyczne białek surowicy krwi wykonano w czwartym tygodniu po zabiegu, pobierając od każdego królika z grupy doświadczalnej i z grupy kontrolnej, po 2 ml krwi z żyły usznej brzeżnej. Krew inkubowano w sposób standardowy w temperaturze 37°C przez 0,5 godziny, a następnie wirowano przez 5 minut dla uzyskania surowicy. Elektroforetyczny rozdział surowicy przeprowadzono na zbuforowanym żelu agarozowym, elektroforezą wysokonapięciową poziomą. Odczytu dokonywano densytometrem przy długości fali 600 nm, otrzymując poszczególne frakcje białek oraz określano stosunek albumin do globulin. Uzyskane wyniki badań elektroforetycznych poddano analizie statystycznej z użyciem testu t-Studenta. Za istotne statystycznie przejęto różnice, gdzie p < 0,05. Przy wykonaniu obliczeń wykorzystano program Statistica ver. 7.0 (Stat Soft, Kraków, Poland).

Podczas obserwacji klinicznych, przeprowadzanych jednocześnie po wszczepach doświadczalnych i kontrolnych, obserwowano i porównywano przebieg procesu gojenia. Wszystkie 12 zwierząt zniosło zastosowane procedury chirurgiczne dobrze. Rany pooperacyjne uległy prawidłowemu wygojeniu przez rychłozrost. Szwy usuwano w 8 dobie po zabiegu. W miejscach gdzie śródochrzęstnowo lokowano zawieszone na Spongostanie somatyczne komórki macierzyste obserwowano ich udział w procesach regeneracyjnych, bez odczynu zapalnego i reakcji odrzutu przeszczepu. Wynikiem intensywnie zachodzącego procesu regeneracji był wyraźny przyrost grubości chrząstki w czasie pierw4

PL 209 210 B1 szych 3 tygodni doświadczenia. Proces ten ulegał następnie stopniowemu spowolnieniu. W 7 tygodniu doświadczenia, pokryte niezmienioną skórą, nowo powstałe rusztowanie małżowiny usznej o lekko nierównej powierzchni, było grubsze o około 15% od otaczającej je chrząstki własnej zwierzęcia. Przez kolejne 2 tygodnie nie obserwowano już przyrostu grubości małżowiny. Wszczepiany królikom z grupy kontrolnej Spongostan, nasą czony roztworem soli fizjologicznej, ulegał wchłonięciu bez objawów martwicy i odczynu zapalnego, a obszary gdzie usunięto chrząstkę pozostawały wklęsłe. Po 9 tygodniach miejsca te były nadal znacznie cieńsze, pokryte obustronnie niezmienioną skórą. Nie zaobserwowano tu żadnych procesów regeneracyjnych, a jedynie proces bliznowacenia.

Na podstawie badań można stwierdzić co następuje.

W 4 tygodniu, na obwodzie obszaru regeneracji obserwuje się dużą ilość proliferuj ą cych, pasmowato ułożonych, niezróżnicowanych komórek. W pewnych obszarach pojawiają się między nimi małe naczynia krwionośne. W centrum przeszczepu ułożenie komórek staje się rzadsze, a między nimi pojawiają się włókna kolagenowe. Początkowo mają one regularny pasmowaty przebieg, a następnie ich układ staje się chaotyczny, często wzajemnie przeplatają się. Między włóknami kolagenowymi lokalizują się liczne fibroblasty, fibrocyty w mniejszej ilości chondrocyty, a także czasami miejscowe skupiska limfocytów i granulocytów kwasochłonnych. Centrum obszaru regeneracji zajmuje istota podstawowa organizująca się i ulegająca przebudowie z licznymi typowymi komórkami tkanki łącznej takimi jak fibroblasty, chondroblasty, osteoblasty oraz liczne struktury zagęszczonej macierzy. Morfologicznie struktury te podobne są do beleczek chrzęstno-kostnych i kostnych, w obrębie których w tak zwanych zatokach erozyjnych obecne są aktywne osteoklasty. Po 9 tygodniach, w miejscach regeneracji obserwuje się zmniejszoną liczbę komórek i wzrost ilości włókien kolagenowych. W bardziej zmineralizowanej istocie podstawowej obecne są liczne zwapnienia i pojedyncze ogniska kostnienia.

Przeprowadzone reakcje immunocytochemiczne pozwoliły zlokalizować komórki wykazujące obecność charakterystycznych dla komórek macierzystych białek Thy-1, CX-CR4 w obrębie obszaru wszczepu. Wyznakowane komórki znajdowały się obok i w obrębie naczyń krwionośnych oraz w strefie intensywnie proliferujących, niezróżnicowanych komórek na granicy wszczepu i chrząstki małżowiny usznej, a także w miejscach przebudowy beleczek chrzęstno kostnych.

Na podstawie mikroskopii elektronowej można stwierdzić co następuje.

Na większości oglądanych elektronogramów z miejsc regeneracji, zarówno w 4 jak i w 9 tygodniu doświadczenia obserwuje się stosunkowo liczne komórki, oraz dużą ilość włókien kolagenowych. Większość z obserwowanych komórek to fibroblasty, chondroblasty i osteoblasty. Po upływie 3 tygodni regeneracji cytoplazma ich zawiera duże ilości szorstkiej siateczki śródplazmatycznej o często rozdętych kanałach, liczne mitochondria z obecnością homogennej macierzy i niewyraźnym konturze grzebieni mitochondrialnych oraz wodniczki i wakuole. Jądra tych komórek zawierają duże ilości luźnej chromatyny. Obserwuje się także niewielkie obłonione fragmenty cytoplazmy, które odrywają się od komórek i stają się częścią substancji międzykomórkowej, uczestniczącej w jej mineralizacji. W 9 tygodniu doświadczenia liczba komórek jest mniejsza a wzrasta ilość kolagenu. W wielu komórkach zarówno błona komórkowa jak i otoczka jądrowa wykazują inwaginacje, a chromatyna jądrowa ulega kondensacji. Liczne komórki ulegają apoptozie i w nich występują charakterystyczne dla komórek apoptotycznych jądra komórkowe, w których chromatyna jądrowa jest skondesowana, a cytoplazma ich ulega fragmentacji. Po upływie 3 tygodni przyrost grubości chrząstki ulegał wyraźnemu spowolnieniu, natomiast po 9 tygodniach doświadczenia ubytek rusztowania chrzestnego małżowiny był już całkowicie odbudowany. Na elektronogramach obserwowano tu liczne komórki apoptotyczne. Aktywne procesy apoptotyczne są odpowiedzialne za morfogenezę rosnącego poroża. Są też jednym z mechanizmów mających wpływ na regulację procesu regeneracji, miedzy innymi ograniczając nadmierny rozrost komórkowy. Podobne procesy regulacyjne mają miejsce podczas rozwoju szkieletowego, wzrastania kości i ich przebudowie

Natomiast w wyniku elektroforetycznego rozdziału surowicy otrzymano frakcje białek takich jak albuminy, globuliny α1, α2, β1, β2 i gammaglobuliny. Pojedyncze frakcje określono w wartościach względnych i bezwzględnych oraz określono stosunek albumin do globulin. Elektroforetyczny rozdział białek surowicy obrazuje zachowanie się szerokiego spektrum frakcji, do których zaliczamy białka ostrej fazy i immunoglobuliny. Albuminy są tu frakcją reagującą ujemnie, a białka zawarte we frakcjach α1, α2, β1, β2 globulin reagują w różnym stopniu i z różną dynamiką dodatnio. Rolę urazu operacyjnego i naruszenia ciągłości tkanek jako czynnika indukującego odpowiedź ostrej fazy można było, naszym zdaniem pominąć, bowiem wszystkie zwierzęta z grup E i C przebyły identyczną technicznie procedurę chirurgiczną. Przy porównaniu proteinogramów grupy eksperymentalnej i kontrolnej u zwierząt,

PL 209 210 B1 którym wszczepiono komórki porożogenne zaobserwowano jedynie nieznaczne, na granicy istotności statystycznej, podwyższenie frakcji β2 globulin. Korelowało to z obserwowanym równocześnie w badaniach mikroskopowych słabym odczynem zapalnym na obcogatunkowe komórki. Umiarkowana angiogeneza i masywna synteza kolagenu, przy braku nacieku neutrofilowego uruchamiającego procesy proteolityczne, przemawia za odtwórczym działaniem komórek porożogennych. Odpowiedź immunologiczna u operowanych zwierząt była tym samym słabo wyrażona i nie towarzyszyła jej reakcja odrzucenia przeszczepu.

W poniższej tabeli został przedstawiony elektroforetyczny rozdział białek surowicy krwi królików z grupy kontrolnej i eksperymentalnej.

	Grupa C N 6	Grupa E N 6
Białko całkowite		g/l	60,9 ± 14,7	57,4 ± 11,3
Albuminy		g/l	41,7 ± 3,6	37,6 ± 7,2
		%	67,2 ± 4,83	65,8 ± 4,68
	Alfa 1	g/l	2,8 ± 1,6	1,7 ± 0,8
		%	4,22 ± 2,05	2,98 ± 1,27
	Alfa 2	g/l	3,8 ± 1,2	2,6 ± 0,7
		%	5,95 ± 1,36	5,28 ± 1,06
Globuliny	Beta 1	g/l	5,3 ± 1,4	4,9 ± 1,7
%	8,57 ± 2,07	11,01 ± 4,6
	Beta 2	g/l	2,03 ± 0,75	2,4 ± 0,62
		%	3,3 7± 1,26	4,18 ± 1,16
	Gamma	g/l	6,35 ± 1,73	7,03 ± 1,89
		%	10,38 ± 2,83	12,42 ± 2,79
Albuminy/Globuliny			2,04 ± 0,61	1,97 ± 0,42

Na podstawie wyników przeprowadzonych badań można wnosić, że realne jest uzyskanie wszczepów z komórek macierzystych wyprowadzonych sposobem według wynalazku w celu odbudowy tkanki chrzęstnej i kostnej u innych gatunków niż jeleniowate. Komórki porożogenne nie zostały odrzucone przez reprezentatywną grupę obcogatunkową zwierząt, jakimi są króliki, a przeciwnie brały one udział w regeneracji tkanki chrzestnej wraz z udziałem tolerujących ich obecność tkanek gospodarza. Pozwala to wnioskować, że istnieje realna perspektywa stosowania tak otrzymanych komórek macierzystych również u ludzi. Wytworzone sposobem według wynalazku wszczepy pozwalają na uniknięcie szeregu trudności regeneracji tkanki łącznej u ludzi znanymi sposobami, niosącymi niebezpieczeństwo transferu chorób wirusowych, nowotworowych czy genetycznych, a także, co jest niezwykle istotne, pozbycie się problemów etycznych związanych z pozyskiwaniem ludzkich komórek macierzystych do tego celu.

Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładzie wykonania.

P r z y k ł a d. Fragment tkanki rosnącego poroża w postaci krążka o średnicy 1,5 cm i grubości 0,2 mm pobiera się w sposób sterylny podczas narkozy zwierzęcia. Pobrany fragment tkanki dzieli się na cztery części. Jedną część przeznaczoną do hodowli komórkowej umieszcza się w probówce, zanurzając ją w 10 ml medium hodowlanego - MEM firmy Cambrex z dodatkiem penicyliny 100 U.l./ml i streptomycyny 0,1 mg/ml. W warunkach laboratoryjnych wycinek kilka razy pł ucze się medium z dodatkiem wymienionych antybiotyków. Następnie metodą mechaniczną rozdrabnia się go na małe fragmenty wielkości 0,5 - 1 mm. Z tak rozdrobnionego fragmentu poroża wyizolowuje się proliferujące komórki wykorzystując zjawisko ich samoczynnej migracji. Po izolacji komórki zawiesza się w pełnym medium, hodowlanym, w ilości co najmniej 20% objętości komory hodowlanej, z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej, penicyliny 100 U.I./ml, streptomycyny 0,1 mg/ml, L-Glutaminy 1 mM/ml i przenosi

PL 209 210 B1 do butelek hodowlanych o powierzchni 25 cm². Hodowlę prowadzi się w inkubatorze Kendro, w standardowych warunkach, to jest w temperaturze +37°C, w atmosferze z dodatkiem 5% CO2. Po uzyskaniu pełnego monolayeru, komórki odkleja się od podłoża butelek hodowlanych przy użyciu enzymu 0,05% trypsyny z 0,02% kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i przenosi się do kolejnych butelek hodowlanych. Z tak otrzymanej linii pierwotnej, poprzez kolejne pasaże wyprowadza się linię ciągłą, a po uzyskaniu piątego pasażu komórki zamraża się z dodatkiem 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowuje w ciekłym azocie w temperaturze -176°C.

W celu przygotowania komórek do wszczepu odmraż a się pasaż piąty, poddając komórki dalszej hodowli, stosując identyczne pełne medium hodowlane. Po uzyskaniu odpowiedniej ilości komórek 5 x 10⁶ odkleja się je od podłoża butelek hodowlanych za pomocą trypsyny i EDTA, następnie odwirowuje w pełnym medium hodowlanym, wykorzystując fakt, że surowica zawarta w medium inaktywuje działanie enzymu trypsyny, a otrzymany osad zawiesza się w czystym medium MEM bez surowicy,

L-Glutaminy, i antybiotyków. Komórki liczy się w komorze Biirkera i sporządza zawiesinę 2 x 10⁶ komórek do jednego wszczepu, przygotowując je do osadzenia na rusztowaniu. Do tego celu wykorzystuje się fragmenty Spongostanu, to jest gąbki żelatynowej firmy Johnson & Johnson, stosowanej w chirurgii np. przy tamowaniu krwawień, a tu jako nośnik do hodowli adherentnych komórek. Umieszcza się je w jałowych ampułkach plastikowych, dodaje zawiesinę komórek w ilości 2 x 10⁶ komórek/1 ml czystego płynu MEM bez dodatków, następnie odwirowuje go, a komórki w tym czasie osiadają na Spongostanie. Wirowanie prowadzi się w wirówce firmy Hereus przez 10 minut przy około 700 obr/min. Odwirowany płyn - supernatant - zlewa się, otrzymując gotowe do wszczepu komórki zawieszone na Spongostanie.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób hodowli komórek macierzystych wyprowadzonych z rosnącego poroża jeleniowatych, zwłaszcza jelenia szlachetnego, w oparciu o hodowlę pierwotną, prowadząc ją w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 37°C, bezpośrednio z niej lub z komórek uprzednio zamrożonych, znamienny tym, że hodowlę pierwotną zakłada się z pobranych jałowo fragmentów wzrastającego poroża jelenia, które się rozdrabnia, wyizolowuje komórki i hoduje, stosując jako płyn wzrostowy medium hodowlane MEM z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej oraz roztworu glutaminy i dobranych antybiotyków, a po wyprowadzeniu piątego pasażu komórki zamraża się lub nadal prowadzi się hodowlę w warunkach wyżej opisanych, na identycznym podłożu hodowlanym i po uzyskaniu liczby komórek co najmniej 2 x 10⁶, odkleja się je za pomocą trypsyny z 0,02% kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA), odwirowuje w pełnym medium hodowlanym, natomiast otrzymany osad zawiesza się w czystym medium MEM i przygotowuje fragmenty rusztowania, do którego wykorzystuje się kawałki Spongostanu, o wymaganych do uzupełnienia ubytku chrząstki lub kości wymiarach, po czym umieszcza się je w jałowych ampułkach, dodaje zawiesinę komórek w ilości, co najmniej 2 x 10⁶/1 ml płynu, zaś komórki osadza się na rusztowaniu ze Spongostanu poprzez wirowanie, a następnie zlewa supernatant.