PL209660B1 - Membrana poliolefinowa do immunoizolacji mikroorganizmów i sposób jej wytwarzania - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest membrana poliolefinowa i sposób modyfikowania mikroporowatych membran poliolefinowych do immunoizolacji bakterii.

Mikroporowate membrany poliolefinowe są znane od wielu lat i wykonywane różnymi metodami. Standardowa membrana polipropylenowa jest przygotowana przez podgrzanie około 30% wagowych polipropylenu i 70% wagowych oleju lub innej cieczy o wysokiej temperaturze wrzenia w odpowiednim czasie i temperaturze do uformowania jednorodnego roztworu, przez wytłaczanie lub wylewanie roztworu na schłodzoną powierzchnię. Według opisu zgłoszeniowego niemieckiego nr DE3026718 A1, gorący roztwór polimeru wytłacza się przez odpowiednio ukształtowaną dyszę do fajki przędzalniczej, w której znajduje się ciecz chł odzą ca. Nastę pnie z otrzymanych w ten sposób kapilar ekstrahuje się rozpuszczalnik. W opisie patentowym USA nr 3 801 404, opisano także sposób otrzymywania membran polipropylenowych, polegający na wytwarzaniu mikroporowatych filmów przez rozciąganie na zimno lub na gorąco folii polipropylenowej. Również w patencie europejskim nr EPO 1 0860 1 A2 opisano otrzymywanie płaskich błon polipropylenowych, a opis patentowy niemiecki nr DE 3205289 C2 ujawnia składy mieszanin rozpuszczalników polimeru. Inne dane na temat poliolefinowych włókien do plazmaforezy są trudno dostępne.

Immunoizolacja materiału biologicznego jest ważnym czynnikiem w oddzieleniu żywego przeszczepu od układu immunologicznego organizmu bez potrzeby stosowania immunosupresji. Układ materiału biologicznego, produkującego substancje biologicznie czynne, enkapsulowanego w membranie i wszczepionego biorcy, może spełniać rolę terapeutyczną.

Aby ocenić przydatność membrany do immunoizolacji mikroorganizmów poddawano ją badaniu in vitro i in vivo, sprawdzając jednocześnie jakość enkapsulacji. W tym celu membrana z enkapsulowanymi w niej mikroorganizmami była wszczepiana zwierzętom (myszom) na okres 1 tygodnia. Zastosowano bakterie E. Coli transfekowane genem białka fluoryzującego zielono GFP (green fluorescent protein) i jako wyznacznik ich żywotności badano w cytometrze przepływowym ekspresję tego genu dla enkapsulowanych w membranach E. coli in vitro i in vivo.

Podczas badań nad przydatnością różnego rodzaju membran do immunoizolacji materiału biologicznego, stwierdzono, że stwarzają one kłopoty z zamykaniem, przerastają tkanką łączną oraz są zbyt kruche. Badano między innymi membrany z polipropylenu nie modyfikowanego, polietylenu, mieszanin polietylen-polipropylen. Okazało się, że nadają się one do plazmaforezy, ale nie do immunoizolacji, obrastając po wszczepieniu komórkami gospodarza.

Nieoczekiwanie okazało się, że sposobem według wynalazku można otrzymać membrany modyfikowane, nie obrastające w przeszczepie, pozwalające na immunoizolację mikroorganizmów: nie ograniczające transportu substancji odżywczych przez membranę, pozwalające na ich normalne funkcjonowanie, zapobiegające wydostawaniu się mikroorganizmów na zewnątrz.

Membrana poliolefinowa, do immunoizolacji mikroorganizmów, według wynalazku charakteryzuje się tym, że na podłożu z materiału poliolefinowego ma naniesioną warstwę siloksanu zawierającego grupy fenylowe, korzystnie wybranym z grupy obejmującej alkilofenylosiloksany, zwłaszcza metylofenylosiloksany, korzystnie zawierające 20-80% grup fenylowych, o grubości od 1 μm do 100 μm, a następnie warstwę siloksanu nie zawierającego grup fenylowych, korzystnie wybranym z grupy obejmującej alkilosiloksany, zwłaszcza metylosiloksany, korzystnie zawierające 100% grup metylowych, o grubości od 1 μm do 100 μm.

Sposób wytwarzania mikroporowatych membran poliolefinowych do immunoizolacji mikroorganizmów, według wynalazku polega na tym, że w strukturę membrany poliolefinowej o wysokiej porowatości wprowadza się w znany sposób, roztwór siloksanu zawierającego grupy fenylowe, wybranego z grupy obejmującej alkilofenylosiloksany, zwłaszcza metylofenylosiloksany, korzystnie zawierające 20-80% grup fenylowych, o lepkości 1900-4300 cSt i o stężeniu 0,05-17,8% objętościowych, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym wybranym z grupy obejmującej węglowodory alifatyczne lub aromatyczne, w tym również halogenowe, alkohole, aldehydy, ketony, aminy i inne azotopochodne, ewentualnie w mieszaninie wymienionych rozpuszczalników, a następnie w strukturę membrany wprowadza się w znany sposób, korzystnie przez zamoczenie, roztwór siloksanu nie zawierającego grup fenylowych, wybranego z grupy obejmującej alkilosiloksany, zwłaszcza metylosiloksany, korzystnie zawierające 100% grup metylowych lub etylowych, o lepkości 1900-5000 cSt i o stężeniu 0,0517,8% objętościowych, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym wybranym z grupy obejmującej węglowodory alifatyczne lub aromatyczne, w tym również halogenowe, alkohole, aldehydy, ketony,

PL 209 660 B1 aminy i inne azotopochodne, ewentualnie w mieszaninie wymienionych rozpuszczalników, po czym z tak przygotowanej membrany usuwa się rozpuszczalnik w znany sposób.

W sposobie według wynalazku w strukturę membrany poliolefinowej o wysokiej porowatości wprowadza się roztwór siloksanu zawierającego grupy fenylowe, korzystnie, przez zamoczenie, moczenie lub przepłukiwanie strzykawką.

W sposobie według wynalazku, korzystnie wprowadza się roztwór siloksanu zawierającego grupy fenylowe w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie o stężeniu 0,1-12,2% objętościowych.

W sposobie według wynalazku, wprowadza się roztwór siloksanu zawierającego grupy fenylowe, korzystnie o lepkości 2500-4300 cSt.

W sposobie według wynalazku korzystnie poddaje się membranę kąpieli w roztworze siloksanu zawierającego grupy fenylowe pod ciśnieniem 0,02-0,08 MPa w temperaturze 12-50°C, w czasie 1 godziny, a przygotowane kapilary ewentualnie moczy si ę w roztworze alkoholu etylowego.

W sposobie wedł ug wynalazku, korzystnie wprowadza się roztwór siloksanu nie zawierają cego grup fenylowych w rozpuszczalniku organicznym o stężeniu 0,1-10% objętościowych.

W sposobie wedł ug wynalazku, wprowadza się roztwór siloksanu nie zawierają cego grup fenylowych, o lepkości zwłaszcza 2700-4800 cSt.

W sposobie według wynalazku korzystnie poddaje się membranę kąpieli w roztworze siloksanu nie zawierającego grup fenylowych pod ciśnieniem 0,02-0,08 MPa w temperaturze 12-50°C, w czasie 1 godziny, a przygotowane kapilary ewentualnie moczy si ę w roztworze alkoholu etylowego.

Sposób według wynalazku polega na utworzeniu membrany ciekłej na membranie poliolefinowej stanowiącej podłoże. Roztwór membrany ciekłej przygotowuje się przez rozpuszczenie siloksanu w rozpuszczalniku. Membranę poliolefinową poddaje się ką pieli w roztworze siloksanu w odpowiednio dobranych warunkach ciśnieniowych, w odpowiedniej temperaturze i czasie tak, aby faza membrany ciekłej została zaadsorbowana przez podłoże. Tak przygotowane kapilary moczy się jeszcze ewentualnie w roztworze alkoholu etylowego.

Badano przepuszczalność membran wytworzonych sposobem według wynalazku i stwierdzono, że pozwalają one na transport wszelkich substancji odżywczych, niezbędnych do życia opłaszczonemu materiałowi biologicznemu, jednocześnie nie pozwalając na wydostawanie się na zewnątrz mikroorganizmów. Badania jakości immunoizolacji bakterii E. coli pozwoliły stwierdzić, że wartości ekspresji białka fluoryzującego zielono (GFP), E. coli enkapsulowanych w kapilarach otrzymanych sposobem według wynalazku we wszczepie są porównywalne w całym czasie jego trwania oraz są porównywalne z wartością ekspresji GFP przed wszczepieniem (podobnie wartości ekspresji GFP E. coli enkapsulowanych w kapilarach hodowanych in vitro w środowisku hodowlanym), co świadczy o zapewnieniu funkcjonowania mikroorganizmów we wszczepie. Nie stwierdzono obecności bakterii we krwi obwodowej myszy po wszczepie, co potwierdza dobrą jakość enkapsulacji. Membrany nie ulegają pęknięciom po wszczepieniu w miejsca narażone na duże naprężenia, membrana jest łatwa do usunięcia z miejsca wszczepu, gdyż nie obrasta tkanką łączną .

Najkorzystniejsza wersja sposobu polega na tym, że kapilary starannie umyte i wysuszone zanurza się w pojemniku z roztworem siloksanu zawierającego grupy fenylowe o lepkości 1900-4300 cSt w rozpuszczalniku organicznym na okres 5-60 minut w komorze ciś nieniowej przy odpowiednim ciśnieniu i w temperaturze od 5-50°C. Roztwór siloksanu może wypełniać całkowicie pory membrany lub pokrywać tylko elementy struktury membrany, pozostawiając pory otwarte. Po wyjęciu kapilary poddaje się ją moczeniu w alkoholu etylowym, zależnie od sposobu, w jaki kapilary zostały umyte przed procesem silikonowania. Następnie, kapilary zanurza się w pojemniku z roztworem siloksanu nie zawierającego grup fenylowych o lepkości 1900-5000 cSt w rozpuszczalniku organicznym na okres 5-60 minut w komorze ciśnieniowej przy odpowiednim ciśnieniu i w temperaturze od 5-50°C. Olej silikonowy może wypełniać całkowicie pory membrany lub pokrywa elementy struktury membrany. Po wyjęciu kapilary poddaje się ją moczeniu w alkoholu etylowym, zależnie od sposobu, w jaki kapilary zostały umyte przed procesem silikonowania.

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku, nie ograniczające jego zakresu.

P r z y k ł a d I. Kapilary polipropylenowe, umyte i wysuszone, moczy się przez 35 minut w roztworze metylofenylosiloksanu, zawierającego 80% grup fenylowych o lepkości 2200 cSt w cykloheksanie o stężeniu 0,9% objętościowych, po czym wymoczone kapilary umieszcza się w nagrzewnicy termostatowej w 4°C na 30 minut. Następnie, kapilary poddaje się moczeniu w roztworze metylosiloksanu (100% grup metylowych) (siloksan OV1 firmy SERVA) o lepkości 4000 cSt w cykloheksanie

PL 209 660 B1 o stężeniu 10% obj., po czym wymoczone kapilary umieszcza się w nagrzewnicy termostatowej w 4°C na 30 minut, a następnie hydrofilizuje się alkoholem etylowym.

P r z y k ł a d II. Kapilary polipropylenowe, umyte i wysuszone, moczy się przez 35 minut w roztworze metylofenylosiloksanu, zawierają cego 80% grup fenylowych (siloksan OV17 firmy SERVA) o lepkości 3700 cSt w cykloheksanie o stężeniu 8% objętościowych, po czym kapilary suszy się w temperaturze pokojowej w nawiewie powietrza. Następnie, kapilary poddaje się moczeniu w roztworze metylosiloksanu (100% grup metylowych) (siloksan OV1 firmy SERVA) o lepkoś ci 4000 cSt w cykloheksanie o stężeniu 12% obj., po czym wymoczone kapilary umieszcza się w nagrzewnicy termostatowej w 4°C na 30 minut, a następnie hydrofilizuje się alkoholem etylowym.

P r z y k ł a d III. Kapilary polipropylenowe, umyte, poddaje się kąpieli w roztworze metylosiloksanu zawierającego 60% grup fenylowych, o lepkości 3000 cSt w 1,1,1'-trichloroetanie o stężeniu 5,5% objętościowych, po czym wymoczone kapilary umieszcza się w nagrzewnicy termostatowej w temperaturze pokojowej na 1 dobę . Następnie, kapilary poddaje się moczeniu w roztworze metylosiloksanu (100% grup metylowych) o lepkości 4000 cSt w cykloheksanie o stężeniu 12% objętościowych, po czym wymoczone kapilary suszy się w temperaturze pokojowej w nawiewie powietrza.

Claims (9)

1. Membrana poliolefinowa do immunoizolacji mikroorganizmów, znamienna tym, że na podłożu z materiału poliolefinowego ma naniesione kolejno: warstwę siloksanu zawierającego grupy fenylowe, wybranego z grupy obejmującej alkilofenylosiloksany, zwłaszcza metylofenylosiloksany korzystnie o grubości od 1 μm do 100 μm, a następnie warstwę siloksanu nie zawierającego grup fenylowych, wybranego z grupy obejmującej alkilosiloksany, zwłaszcza metylosiloksany, korzystnie o grubości od 1 μm do 100 μm.

2. Sposób modyfikowania mikroporowatych membran poliolefinowych do immunoizolacji bakterii, znamienny tym, że w strukturę membrany poliolefinowej o wysokiej porowatości wprowadza się w znany sposób, roztwór siloksanu zawierającego grupy fenylowe, wybranego z grupy obejmującej alkilofenylosiloksany, zwłaszcza metylofenylosiloksany korzystnie zawierające 20-80% grup fenylowych, o lepkości 1900-4300 cSt i o stężeniu 0,05-17,8% objętościowych, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym wybranym z grupy obejmującej węglowodory alifatyczne lub aromatyczne, w tym również halogenowe, alkohole, aldehydy, ketony, aminy i inne azotopochodne, ewentualnie w mieszaninie wymienionych rozpuszczalników, a następnie w strukturę membrany wprowadza się w znany sposób, korzystnie przez zamoczenie, roztwór siloksanu nie zawierającego grup fenylowych, wybranego z grupy obejmującej alkilosiloksany, zwłaszcza metylosiloksany, korzystnie zawierające 100% grup metylowych lub etylowych, o lepkości 19005000 cSt i o stężeniu 0,05-17,8% objętościowych, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym wybranym z grupy obejmującej węglowodory alifatyczne lub aromatyczne, w tym również halogenowe, alkohole, aldehydy, ketony, aminy i inne azotopochodne, ewentualnie w mieszaninie wymienionych rozpuszczalników, po czym z tak przygotowanej membrany usuwa się rozpuszczalnik w znany sposób.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w strukturę membrany poliolefinowej o wysokiej porowatości wprowadza się roztwór siloksanu zawierającego grupy fenylowe, korzystnie, przez zamoczenie, moczenie, przepłukiwanie strzykawką.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w strukturę membrany wprowadza się roztwór siloksanu zawierającego grupy fenylowe w rozpuszczalniku organicznym o stężeniu 0,1-12,2% objętościowych.

5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w strukturę membrany wprowadza się roztwór siloksanu zawierającego grupy fenylowe, o lepkości zwłaszcza 2500-4300 cSt.

6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w strukturę membrany wprowadza się roztwór siloksanu nie zawierającego grup fenylowych w rozpuszczalniku organicznym o stężeniu 0,1-10% objętościowych.

7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w strukturę membrany wprowadza się roztwór siloksanu nie zawierającego grup fenylowych, o lepkości 2700-4800 cSt.

PL 209 660 B1

8. Sposób według zastrz. 2 albo 3, albo 4 albo 5 albo 6 albo 7, znamienny tym, że membranę poddaje się kąpieli w roztworze siloksanu zawierającego grupy fenylowe pod ciśnieniem 0,02-0,08 MPa w temperaturze 12-50°C, w czasie 1 godziny, a przygotowane kapilary ewentualnie moczy się w roztworze alkoholu etylowego.

9. Sposób według zastrz. 2 albo 3, albo 4 albo 5 albo 6 albo 7, znamienny tym, że membranę poddaje się kąpieli w roztworze siloksanu nie zawierającego grup fenylowych pod ciśnieniem 0,020,08 MPa w temperaturze 12-50°C, w czasie 1 godziny, a przygotowane kapilary ewentualnie moczy się w roztworze alkoholu etylowego.