PL209967B1

PL209967B1 - Polisacharyd z Echinacea angustifolia oraz sposób jego wytwarzania

Info

Publication number: PL209967B1
Application number: PL373112A
Authority: PL
Inventors: Andrea Giori; Alessandro Anelli; Paolo Morazzoni; Pierro Francesco Di
Original assignee: Indena Spa
Priority date: 2002-07-30
Filing date: 2003-06-26
Publication date: 2011-11-30
Also published as: AU2003246588A1; KR20050025967A; ATE335768T1; CA2494089C; PL373112A1; ES2270141T3; CA2494089A1; KR101124105B1; DE60307500T2; KR101124047B1; US6818761B2; NO333509B1; JP2005536588A; SI1560855T1; ITMI20021692A1; IL166554A0; KR20110018468A; WO2004014958A1; AU2003246588B2; CN1671745A

Description

Przedmiotem wynalazku jest polisacharyd z korzeni Echinacea angustifolia o masie cząsteczkowej 1,3 x 10⁵, składający się z ramnozy, arabinozy, galaktozy i kwasu galakturonowego w proporcji 0,5:2,5:1,75:10,25 oraz sposób wytwarzania tego polisacharydu.

Polisacharyd z Echinacea angustifolia (Jeżówka wąskolistna) może być stosowany do terapii schorzeń, w których potrzebne jest wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej.

Echinacea jest rośliną pochodzącą z Ameryki Północnej i Meksyku. Jej lecznicze właściwości były dobrze znane pierwotnym mieszkańcom Ameryki, którzy stosowali ją w leczeniu ran. Dzięki zdolności Echinacea do zwiększania odporności na infekcje, w ciągu pierwszych lat poprzedniego stulecia rozpowszechniło się jej zastosowanie w leczeniu zakażeń lokalnych i ogólnoustrojowych. Echinacea, a w szczególnoś ci Echinacea angustifolia, jest obecnie wysoce polecana w leczeniu objawów grypy, a w szczególnoś ci w leczeniu przezię bień , zakaż e ń grzybiczych oraz w gojeniu ran.

Wydaje się, że ogólny mechanizm działania wynika z niespecyficznej stymulacji układu immunologicznego oraz uwrażliwienia zarazków i patogenów na chemioterapeutyki i antybiotyki. Właściwości gojące przypisywane są zdolności do stabilizacji kwasów hialuronowych poprzez hamowanie hialuronidazy za pośrednictwem jednego ze składników czynnych, zawartych w roślinie, tj. echinakozydu oraz masywnej aktywacji makrofagów indukowanej przez polisacharydy. Dzięki temu, wszelkie ogniska zakażeń pozostają zlokalizowane oraz dochodzi do akumulacji mukopolisacharydów i materiału histoplastycznego, niezbędnych do procesów naprawczych.

Ponieważ znaczna część frakcji polisacharydów Echinacea składa się z inuliny, której nie można przypisać powyżej wymienionych właściwości, istnieje potrzeba identyfikacji aktywnego polisacharydu oraz dostarczenia efektywnego sposobu jego ekstrakcji i oczyszczania.

Przedmiotem wynalazku jest polisacharyd z korzeni Echinacea angustifolia o masie cząsteczkowej 1,3 x 10⁵, składający się z ramnozy, arabinozy, galaktozy i kwasu galakturonowego w proporcji 0,5:2,5:1,75:10,25.

Korzystnie polisacharyd zbudowany jest ze szkieletu, w którym części proste i rozgałęzione występują zamiennie, przy czym części proste składają się z częściowo acetylowanych (9%) i metylowanych (35%) reszt kwasu galakturonowego połączonych wiązaniem α-(1-4), a części rozgałęzione składają się zamiennie z kwasu galakturonowego i ramnozy, do których przyłączone są łańcuchy boczne zawierające arabinozę i galaktozę w proporcji 2,5:1,75.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania wyżej określonego polisacharydu, składający się z następujących etapów:

a) usunięcia składników nie-polisacharydowych wybranych spośród echinakozydu i jego analogów oraz alkilamidów z korzeni za pomocą ekstrakcji acetonem lub alkoholem, zawierającym od jednego do trzech atomów węgla,

b) wielokrotnej ekstrakcji frakcji polisacharydowej z korzeni otrzymanej w poprzednim etapie za pomocą 15% (objętościowo/objętościowo) etanolu w temperaturze 70°C,

c) wyodrębniania polisacharydu za pomocą chromatografii sączenia molekularnego lub chromatografii jonowymiennej frakcji polisacharydowej.

Korzystnie w etapie a) stosuje się rozpuszczalnik w połączeniu z wodą, korzystniej zawartość wody w rozpuszczalniku jest nie większa niż 40%, a najkorzystniej jako rozpuszczalnik stosuje się etanol o stężeniu od 80 do 95% (objętościowo/objętościowo).

Korzystnie temperatura ekstrakcji prowadzonej w etapie a) wynosi od 20°C do temperatury wrzenia rozpuszczalnika.

Korzystnie przed etapem chromatografii w punkcie c) frakcje polisacharydu z punktu b) poddaje się jednej lub większej liczbie procesów wstępnego oczyszczania.

Korzystnie wstępne oczyszczanie jest wybrane spośród:

c1) wytrącania i wyodrębniania frakcji wzbogaconej w polisacharydy poprzez rozpuszczenie w mieszaninie wody i 50-70% (obję toś ciowo/obję toś ciowo) acetonu lub wody i 50-70% (obję toś ciowo//objętościowo) alkoholu zawierającego od jednego do trzech atomów węgla, c2) usunięcia frakcji nierozpuszczalnych polisacharydów poprzez działanie za pomocą wody, c3) poddawania działaniu inulinazy, c4) ultrafiltracji z punktem odcięcia 10000 lub więcej.

Korzystnie wykonywane jest wstępne oczyszczanie c1) i c2).

PL 209 967 B1

Korzystnie wykonywane jest wstępne oczyszczanie c3), ewentualnie poprzedzone jednym lub dwoma oczyszczaniami c1) i c2).

Korzystnie wykonywane jest wstępne oczyszczanie c4) ewentualnie poprzedzone jednym lub dwoma oczyszczaniami c1) i c2).

Polisacharyd został scharakteryzowany za pomocą widm ¹H-HMR, ¹³C-NMR i profilu GCP, jak przedstawiono na Fig. 1-3.

Poniżej przedstawiono wynalazek bardziej szczegółowo.

Polisacharyd otrzymuje się z korzeni Echinacea angustifolia rosnącej dziko lub uprawianej.

Etap a) wykonuje się w celu usunięcia składników nie-polisacharydowych korzeni, głównie echinakozydu i jego analogów, jak również dużej grupy alkilamidów, które również stanowią charakterystyczne składniki Echinacea angustifolia (R. Bauer i wsp., Phytochemistry 28, 505, 1989; Planta Med. 55, 367, 1989). Korzenie poddaje się ekstrakcji za pomocą rozpuszczalnika wybranego spośród acetonu lub alkoholu o jednym do trzech atomów węgla, ewentualnie w połączeniu z wodą, w temperaturze od 20°C do temperatury wrzenia, korzystnie pod chłodnicą zwrotnicą. Zawartość wody w rozpuszczalniku nie może przekraczać 40% (objętościowo/objętościowo). Korzystnym, rozpuszczalnikiem jest etanol o stężeniu pomiędzy 80, a 95% (objętościowo/objętościowo).

Celem etapu b) jest ekstrakcja mieszaniny składników polisacharydowych z korzeni. Ekstrakcję prowadzi się za pomocą wody, acetonu lub alkoholu o jednym do trzech atomów węgla, w połączeniu z wodą , w temperaturze od 20°C do temperatury wrzenia rozpuszczalnika, korzystnie od 40 do 70°C. Gdy stosuje się mieszaninę rozpuszczalników, zawartość wody wynosi 60% lub więcej, korzystnie 85% (objętościowo/objętościowo). Zgodnie z korzystnym wykonaniem wynalazku, rozpuszczalnikiem jest 15% (objętościowo/objętościowo) etanol.

Etap c) zapewnia frakcjonowanie ekstraktu z etapu b) oraz oddzielenie polisacharydu od innych polarnych składników ekstraktu. Korzystnie etap ten polega na chromatografii sączenia molekularnego lub chromatografii jonowymiennej.

W pierwszym przypadku, polisacharyd oczyszczany jest na podstawie wymiarów molekularnych - polisacharyd ma masę odmienną od wszystkich innych skł adników. Odpowiednio usieciowana ż ywica może rozdzielać składniki chemiczne o różnych wymiarach. Przepuszczenie ekstraktu z etapu b) przez tego rodzaju żywicę (przykładowo Toyopearl HW-65S i Superdex® 200HR) umożliwia oczyszczenie polisacharydu według wynalazku.

Oczyszczanie polisacharydu poprzez chromatografię jonowymienną oparte jest na kwasowym charakterze polisacharydu, dzięki obecności karboksylowych grup funkcyjnych w jednostkach kwasu galakturonowego. Obróbka ekstraktu z etapu b) na żywicy anionowymiennej umożliwia zatrzymanie jedynie polisacharydu oraz wszelkich innych składników kwasowych (obecnych w niewielkich ilościach) oraz usunięcie wszelkich innych składników zasadowych lub neutralnych. Żywica przemywana jest solą fizjologiczną lub kwaśnym roztworem wodnym w celu odzyskania cząstek uwięzionych w żywicy. Następnie sole lub kwasy w oczyszczonym roztworze usuwane są za pomocą dializy ultrafiltracyjnej. Wybierany jest wystarczająco wysoki punkt odcięcia (na przykład 10000 lub 100000) celem dodatkowego usunięcia zanieczyszczeń kwasowych w ekstrakcie wyjściowym oraz tych zatrzymanych przez żywicę anionową.

Korzystnymi żywicami anionowymiennymi są żywice silnie jonowymienne, takie jak Diaion HPA 25 i Q Sepharose® Fast Flow.

Roztwór oczyszczonego polisacharydu otrzymany zgodnie z jednym z procesów chromatograficznych opisanych w etapie c) jest następnie zatężany i suszony próżniowo lub sublimacyjnie. Polisacharyd ma postać proszku w kolorze kości słoniowej.

Etap c) może obejmować również wstępne etapy oczyszczania, przydatne do ułatwiania prowadzenia chromatografii. Chociaż etapy te nie są niezbędne, to umożliwiają one usunięcie pierwszej porcji zanieczyszczeń z ekstraktu z etapu b) oraz zmniejszają ilość żywicy.

Wstępne oczyszczanie wybiera się spośród:

C1) zatężania ekstraktu z etapu b) pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie oczyszczania poprzez działanie mieszaniną wody i acetonu lub wody i alkoholu o jednym do trzech atomów węgla, korzystnie etanolu. Mieszanina będzie zawierała 50-70%, korzystnie 66,5% alkoholu lub acetonu. Zgodnie z korzystnym, wykonaniem wynalazku, pozostałość uzyskana po zatężeniu ekstraktu rozpuszczana jest w temperaturze pokojowej w trzech częściach wody oraz rozcieńczana 7 objętościami 95% etanolu, z mieszaniem. Wytrąconą frakcję zawierającą polisacharyd zbiera się poprzez filtrację,

PL 209 967 B1 przemywa etanolem o stężeniu od 50 do 70% (obj./obj.) oraz poddaje oczyszczaniu za pomocą chromatografii.

C2) poddawania frakcji polisacharydu z etapu b) lub wzbogaconej frakcji z etapu 1c) działaniu wody w temperaturze pokojowej. W ten sposób, polisacharyd według wynalazku, który jest wysoce rozpuszczalny w wodzie, jest oddzielany od innych mniej rozpuszczalnych polisacharydów. Ekstrakt otrzymywany w etapie b) (lub frakcja wzbogacona w polisacharydy z etapu 1c) jest zawieszany w wodzie w temperaturze pokojowej i mieszany, aby wspomóc rozpuszczenie. Nierozpuszczalna pozostałość jest oddzielana, a roztwór wodny jest poddawany chromatografii.

C3) trawienie enzymatyczne, użyteczne w hydrolizie inulinopodobnych oligosacharydów i polisacharydów, stanowiących jedno z głównych zanieczyszczeń ekstraktu z etapu b). Ekstrakt (lub jeden z częściowo oczyszczonych produktów z etapu c1) lub c2) jest poddawany trawieniu, w roztworze wodnym, za pomocą katalitycznej ilości inulinazy przez 10-24 godziny. Enzym ten jest następnie inaktywowany za pomocą ciepła lub trypsyny, a fragmenty węglowodanowe utworzone w trakcie hydrolizy są usuwane poprzez dializę (ultrafiltracja styczna z odcięciem wyższym niż 10000, korzystnie 100000). Otrzymana w ten sposób pozostałość jest następnie poddawana chromatografii.

C4) ultrafiltracja przy wysokim punkcie odcięcia (odcięcie powyżej 10000, korzystnie 100000) w celu usunięcia zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej. W tym przypadku, ekstrakt z etapu b) (lub jeden z częściowo oczyszczonych produktów z etapów c1) lub c2) jest rozpuszczany w wodzie, korzystnie w 10 lub 20 objętościach i poddawany dializie. Następnie pozostałość zawierająca polisacharyd według wynalazku jest poddawana chromatografii.

Polisacharyd według wynalazku wykazywał właściwości immunostymulacyjne u myszy, w szczególności stymulował aktywację limfocytów T oraz przeciwdziałał wpływowi cyklosporyny A, redukując w ten sposób śmiertelność wynikając ą z zakażenia Candida albicans. Polisacharyd według wynalazku może być tym. samym stosowany do wytwarzania leków, dodatków żywnościowych lub składników odżywczych podawanych w sytuacjach, w których pożądane jest zwiększenie obrony immunologicznej w organizmie.

Polisacharyd może być formułowany zgodnie z konwencjonalnymi technikami, przykładowo według technik opisanych w Remingotn's Pharmaceutical Sciences Handbook, wyd. XVII, Mack Pub. NY, USA.

Wynalazek zostanie dalej przedstawiony za pomocą przykładów.

Przykłady

We wszystkich następujących przykładach, określanie miana polisacharydu za pomocą HPLC jest wykonywane na kolumnie TosoHaas TSK-Gel G 5000 PWXL eluowanej wodą zawierającą 0,5% trietyloaminy w warunkach izokratycznych przy prędkości przepływu 0,5 ml/min. Podczas analizy trwającej 30 minut, kolumna jest utrzymywana w temperaturze 50°C. Wprowadzana objętość wynosi 50 μ|. Z kolumną sprzężony jest detektor ELSD (Evaporative Light Scattering Detector - detektor światła rozproszonego z odparowaniem) Sedex model 75 (S.E.D.E.R.E.), którego nebulizator jest utrzymywany w temperaturze 60°C pod ciśnieniem gazu 220000 Pa.

P r z y k ł a d 1

Ekstrakcja korzeni Echinacea angustifolia (etap a) i b)).

600 gram zmielonych korzeni Echinacea angustifolia poddaje się ekstrakcji pod chłodnicą zwrotną przez 4 godziny za pomocą 2,5 l 90% (objętościowo/objętościowo) etanolu. Zbiera się produkt perkolacji, a następnie wykonuje się kolejne siedem ekstrakcji za pomocą tego samego rozpuszczalnika (etap a). Powstający ekstrakt usuwa się. Następnie korzenie poddaje się ekstrakcji siedem razy w temperaturze 70°C za pomocą 15% (objętościowo/objętościowo) etanolu, każda ekstrakcja trwa cztery godziny. Połączone perkolaty filtruje się i zatęża pod próżnią otrzymując 170 g brązowego produktu (całkowity ekstrakt polisacharydów, etap b)).

P r z y k ł a d 2

Odzyskiwanie polisacharydu poprzez wstępne oczyszczanie za pomocą rozpuszczalników i chromatografii anionowymiennej.

170 g całkowitego ekstraktu polisacharydów z etapu b) przykładu 1 rozpuszcza się w 570 ml wody, a następnie dodaje się 1,13 l etanolu. Mieszaninę miesza się przez około godzinę, osad dekantuje się przez około 20 minut, filtruje, przemywa za pomocą 850 ml 66,5% (objętościowo/objętościowo) etanolu oraz suszy pod próżnią w 55°C przez 48 godzin, otrzymując 140 g substancji stałej w kolorze orzechowym. Substancję stałą zawiesza się w 2,1 l wody i powstającą zawiesinę pozostawia się

PL 209 967 B1 do mieszania przez 20 minut, a następnie oddziela się od nierozpuszczalnej pozostałości (którą wyrzuca się).

Roztwór wodny wzbogacony w polisacharydy według wynalazku, prowadzi do otrzymania 38,7 g suchej pozostałości. Roztwór nanosi się na kolumnę chromatograficzną zawierającą 0,9 l żywicy Diaion HPA 25, zrównoważoną buforem AcOH/AcNH4 w pH 6,1. Żywicę przemywa się za pomocą 5,4 l buforu AcOH/AcNH4 w pH 6,1, a frakcję zawierającą polisacharyd eluuje się za pomocą 5,4 l wodnego roztworu 0,5 M AcNH4. Eluat zatęża się do 0,3 l w warunkach zmniejszonego ciśnienia. Zatężony roztwór poddaje się dializie za pomocą stycznej ultrafiltracji z 6 l oczyszczonej wody przy użyciu spiralnej membrany o punkcie odcięcia 10000 w polietersulfonie.

Retentat odzyskuje się i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość suszy się w wysokiej temperaturze pod próżnią, otrzymując 7,1 g proszku w kolorze kości słoniowej (miano HPLC polisacharydu: 96%).

Polisacharyd ma średnią masę cząsteczkową 1,3 x 10⁵ (s=5365), z <Mn 14320 (s=2180), co pozostaje w zgodzie z pomiarem za pomocą LALLS (Low Angle Laser Light Scattering, Małokątowe Rozpraszanie Światła Laserowego) i składa się z kwasu galakturonowego, galaktozy, arabinozy i ramnozy w stosunku 10,25:1,75:2,5:0,5 (analiza HPAEC). Polisacharyd ma charakterystyczne widma ¹H-NMR, ¹³C-NMR i profil GCP, co przedstawiono na Fig. 1-3.

P r z y k ł a d 3

Odzyskiwanie polisacharydu poprzez wstępne oczyszczanie za pomocą ultrafiltracji oraz chromatografię sączenia molekularnego.

170 g całkowitego ekstraktu polisacharydów z etapu b) przykładu 1 rozpuszcza się w 850 ml oczyszczonej wody. Roztwór dializuje się za pomocą ultrafiltracji stycznej za pomocą 10 l oczyszczonej wody oraz membrany spiralnej o punkcie odcięcia 50000 w polietersulfonie.

Retentat zawierający 110,5 g oczyszczonego ekstraktu odzyskuje się i nanosi na kolumnę chromatograficzną utrzymywaną pod średnim ciśnieniem i zawierającą 22 l żywicy Toyopearl HW-65S zrównoważonej wodą. Elucję przeprowadza się za pomocą oczyszczonej wody, dzieląc eluaty na frakcje 200 ml każda. Frakcje analizuje się za pomocą GPC, a te zawierające wystarczającą ilość polisacharydu zbiera się.

Następnie zebrane frakcje zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość suszy się w wysokiej temperaturze pod próż nią , otrzymują c 5,7 g proszku w kolorze koś ci sł oniowej (miano polisacharydu w HPLC: 95%).

P r z y k ł a d 4

Odzyskiwanie polisacharydu poprzez wstępne trawienie enzymatyczne oraz chromatografię anionowymienną.

170 g całkowitego ekstraktu polisacharydów z etapu b) przykładu 1 rozpuszcza się w 3230 ml oczyszczonej wody i dodaje się 850 mg enzymu - inulinazy. Mieszaninę pozostawia się w warunkach łagodnego mieszania w 40°C przez 24 godziny, a następnie enzym inaktywuje się za pomocą 80 mg trypsyny, mieszając przez 2 godziny w 36°C. Roztwór podgrzewa się w 85°C przez 2 godziny i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem do 1,7 l.

Zatężony roztwór poddaje się dializie za pomocą ultrafiltracji stycznej za pomocą 17 l oczyszczonej wody oraz membrany spiralnej o punkcie odcięcia 100000 w polietersulfonie. Retentat (zawierający 11,5 g oczyszczonego ekstraktu) odzyskuje się i nanosi na kolumnę chromatograficzną zawierającą 0,8 l żywicy Diaion HPA 25, zrównoważoną buforem AcOH/AcNH4 w pH 6,1. Żywicę przemywa się za pomocą 4,8 l buforu AcOH/AcNH4 w pH 6,1, a frakcję zawierającą polisacharyd eluuje się za pomocą 4,8 l wodnego roztworu 0,5 M AcNH4. Eluat zatęża się do 150 ml pod zmniejszonym ciśnieniem. Zatężony roztwór poddaje się dializie za pomocą ultrafiltracji stycznej z 1,5 l oczyszczonej wody przy użyciu spiralnej membrany o punkcie odcięcia 50000 w polietersulfonie.

Retentat zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość suszy się w wysokiej temperaturze pod próżnią, otrzymując 6,9 g proszku w kolorze kości słoniowej (miano polisacharydu w HPLC: 97%).

Część biologiczna

Eksperyment 1

Badanie wytwarzania interferonu-γ przez limfocyty T (Zucca M i wsp., New Microbiol. 1996, 19,

39-46)

Mysie limfocyty T otrzymane poprzez rozdział splenocytów na kolumnach z watą nylonową hodowano w pożywce 1640 RPMI z 4% cielęcej surowicy płodowej w płytkach do mikromiareczkowania ewentualnie preinkubowanych z a-CD3 (przeciwciało monoklonalne anty-CD3 działa jako

PL 209 967 B1 aktywator komórek, prowadzący do produkcji interferonu-γ). Do dołków podawano substancje testowe i po 48 godzinach oceniano ilość interferonu-γ uwalnianego do pożywki.

T a b e l a 1

Czynnik	interferon-γ pg/ml
Pożywka	4,5 ± 0,5
a-CD3	149,5 ± 25,0
a-CD3 + polisacharyd 0,1 μ9/ΐΓΐ!	410,0 ± 45,7
a-CD3 + polisacharyd 1,0 μg/ml	466,3 ± 71,8
a-CD3 + polisacharyd 10,0 μg/ml	690,5 ± 95,5

Eksperyment 2

Wpływ na śmiertelność indukowaną przez Candida alhicans u myszy (Microbiology, 2000, 146, 1881-9)

Drożdżaki hodowano w pożywce agarowej Sabouraud i wstrzykiwano dożylnie w stężeniu 2,9 x ₅

10⁵ myszom z immunosupresją indukowaną 1 mg/kg i.p. (dootrzewnowo) cyklosporyny A (CsA). Myszy poddawano codziennie działaniu 5 i 10 mg/kg i.p. (dootrzewnowo) polisacharydu według wynalazku, aż do chwili śmierci wszystkich myszy kontrolnych (bez sacharydu). Wyniki oceniano jako ilość myszy, które przeżyły w grupach testowych.

T a b e l a 2

Czynnik	% przeżywających zwierząt
Candida albicans (CA) + CsA	0
CA + CsA + polisacharyd 5 mg/kg	30
CA + CsA + polisacharyd 10 mg/kg	50

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Polisacharyd z korzeni Echinacea angustifolia o masie cząsteczkowej 1,3 x 10⁵, składający się z ramnozy, arabinozy, galaktozy i kwasu galakturonowego w proporcji 0,5:2,5:1,75:10,25.
2. Polisacharyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zbudowany jest ze szkieletu, w którym części proste i rozgałęzione występują zamiennie, przy czym części proste składają się z częściowo acetylowanych i metylowanych reszt kwasu galakturonowego połączonych wiązaniem α-(1-4), a części rozgałęzione składają się zamiennie z kwasu galakturonowego i ramnozy, do których przyłączone są łańcuchy boczne zawierające arabinozę i galaktozę w proporcji 2,5:1,75.
3. Sposób wytwarzania polisacharydu określonego w zastrzeżeniu 1 lub 2, znamienny tym, że składa się z następujących etapów:

a) usunięcia składników nie-polisacharydowych wybranych spośród echinakozydu i jego analogów oraz alkilamidów z korzeni za pomocą ekstrakcji acetonem lub alkoholem zawierającym od jednego do trzech atomów węgla,

b) wielokrotnej ekstrakcji frakcji polisacharydowej z korzeni otrzymanej w poprzednim etapie za pomocą 15% (objętościowo/objętościowo) etanolu w temperaturze 70°C,

c) wyodrębniania polisacharydu za pomocą chromatografii sączenia molekularnego lub chromatografii jonowymiennej frakcji polisacharydowej.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że w etapie a) stosuje się rozpuszczalnik w połączeniu z wodą.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że zawartość wody w rozpuszczalniku jest nie większa niż 40%.
6. Sposób według zastrz. 4, albo 5, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik stosuje się etanol o stężeniu od 80 do 95% (objętościowo/objętościowo).

PL 209 967 B1
7. Sposób według zastrz. 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że temperatura ekstrakcji wynosi od 20°C do temperatury wrzenia rozpuszczalnika.
8. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że przed etapem chromatografii w punkcie c) frakcje polisacharydu z punktu b) poddaje się jednej lub większej liczbie procesów wstępnego oczyszczania.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, ż e wstępne oczyszczanie jest wybrane spośród: c1) wytrącania i wyodrębniania frakcji wzbogaconej w polisacharydy poprzez rozpuszczenie w mieszaninie wody i 50-70% (obję toś ciowo/obję toś ciowo) acetonu lub wody i 50-70% (obję toś ciowo//objętościowo) alkoholu zawierającego od jednego do trzech atomów węgla, c2) usunięcia frakcji nierozpuszczalnych polisacharydów poprzez działanie za pomocą wody, c3) poddawania działaniu inulinazy, c4) ultrafiltracji z punktem odcięcia 10000 lub więcej.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wykonywane jest wstępne oczyszczanie c1) i c2).
11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wykonywane jest wstępne oczyszczanie c3), ewentualnie poprzedzone jednym lub dwoma oczyszczaniami c1) i c2).
12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wykonywane jest wstępne oczyszczanie c4) ewentualnie poprzedzone jednym lub dwoma oczyszczaniami c1) i c2).