PL211236B1 - Gen mod-rsfp, jego sekwencja, jej otrzymywanie i jego zastosowanie jako gen markerowy - Google Patents

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 211236 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 386941 ^{(51) Int.Cl.}

C07H 21/04 (2006.01) C12N 15/70 (2006.01) C12N 1/20 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 29.12.2008 _{C12N 15/65 (2006.01)}

Gen mod-rsfp, jego sekwencja, jej otrzymywanie i jego zastosowanie jako gen markerowy

	(73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA GDAŃSKA, Gdańsk, PL
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 05.07.2010 BUP 14/10	(72) Twórca(y) wynalazku:
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	HUBERT CIEŚLIŃSKI, Gdańsk, PL ANNA DŁUGOŁĘCKA, Ostrołęka, PL JÓZEF KUR, Wejherowo, PL MARIANNA TURKIEWICZ, Łódź, PL
30.04.2012 WUP 04/12	(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Czesław Popławski

PL 211 236 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest gen mod-rsfp kodujący białko MOD-RSFP (ang. rhodamine B sensitive fluorescent protein), sposób klonowania genu mod-rsfp, plazmidy rekombinantowe niosące gen mod-rsfp, sposób użycia genu mod-rsfp jako genu markerowego w komórkach bakterii E. coli.

Gen mod-rsfp został wyizolowany w oparciu o badania przesiewowe biblioteki metagenomowego DNA. Użyte w jej konstrukcji całkowite DNA genomowe wyizolowano z próbki gleby antarktycznej pochodzącej z plaży będącej terenem kolonii słoni morskich, znajdującej się w sąsiedztwie polskiej bazy polarnej im. H. Arctowskiego na wyspie Króla Jerzego w archipelagu Szetlandów Południowych. Badanie to miało na celu wyizolowanie genów enzymów lipolitycznych z wykorzystaniem testu selekcyjnego opartego o użycie płytek Petriego ze złożem zawierającym oliwę z oliwek oraz rodaminę B. Jedna z bibliotecznych kolonii rekombinantowych E. coli oznaczona numerem 23 wykazywała silną fioletową fluorescencję w warunkach prowadzenia badania przesiewowego pod katem poszukiwania kolonii bakteryjnych o aktywności lipolitycznej. Dalsze badania wykluczyły powiązanie zaobserwowanej aktywności z obecnością genów enzymów lipolitycznych w komórkach rekombinantowych E. coli klonu 23. Odkrycie to doprowadziło do wyizolowania genu mod-rsfp. Białko MOD-RSFP, wywołuje silną fluorescencję rekombinantowych kolonii E. coli w świetle UV o długości fali 312 nm na podłożach agarowych zawierających rodaminę B. Kolonie kontrolne E. coli różniące się tylko brakiem obecności genu mod-rsfp nie posiadają zdolności do świecenia w świetle UV o długości fali 312 nm na tym samym podłożu selekcyjnym.

Gen mod-rsfp jest zbudowany z 960 pz. Produktem jego ekspresji jest białko MOD-RFSP zbudowane z 319 reszt aminokwasowych o masie 34,6 kDa. Białko MOD-RSFP jest białkiem fuzyjnym zbudowanym z białka RSFP z domeną fuzyjną na końcu N białka o długości 22 reszt aminokwasowych. Analiza sekwencji aminokwasowej białka RSFP wykazała duże podobieństwo do sekwencji aminokwasowej białka pełniącego prawdopodobnie rolę fosforylazy nukleozydów purynowych szczepu Psychrobacter antarcticus 273-4. Mechanizm działania białka MOD-RSFP nie jest znany. Znany jest efekt biologiczny jego działania w komórkach E. coli. Podczas wzrostu na podłożu płynnym lub stałym z dodatkiem rodaminy B, komórki E. coli produkujące białko RSFP akumulują produkt jej „metabolizmu” odpowiedzialny za fluorescencję komórek w świetle UV.

Na podstawie uzyskanych wyników doszliśmy do wniosku, że gen mod-rsfp może zostać wykorzystany jako gen markerowy w badaniach naukowych i aplikacyjnych prowadzonych na szczepach mikroorganizmów adaptowanych do zimna (psychrofile i psychrotrofy) i mezofilnych pozbawionych aktywności produktu genu mod-rsfp.

Genem markerowym może zostać każdy gen, którego funkcja oraz położenie na chromosomie lub plazmidzie w komórkach niosącego go organizmu są znane. W przypadku konstrukcji organizmów rekombinantowych wykorzystuje się wektory DNA. Wektory, te służące do wprowadzenia wybranego genu do obcego organizmu posiadają zwykle gen markerowy. Genem markerowym najczęściej jest gen oporności na określony antybiotyk. W takim przypadku pożywkę, w której hodujemy komórki zmodyfikowanego genetycznie organizmu wzbogacamy w ten antybiotyk (bakterie, które nie przyjęły wektora nie niosą cząsteczki DNA wektora nie są zdolne do wzrostu).

Inny przykład systemu markerowego to tzw. alfa komplementacja z wykorzystaniem elementów genetycznych operonu laktozowego E. coli. Komórki akceptorowe zawierają część genu lacZ, drugą część genu niesie wektor DNA np. pUC19 [Yanisch-Perron, C. et al. (1985) Gene, Vol. 33, 103-119]. Produkt alfa komplementacji, beta-galaktozydaza, powstanie tylko w komórkach niosących DNA wektora pUC19. Pożywka wzbogacana jest w X-Gal - substrat dla beta-galaktozydazy, która po reakcji daje barwny, niebieski produkt. Selekcja rekombinantów zachodzi na podstawie barwy kolonii. Jeszcze prostsza sytuacja jest w przypadku użycia popularnego w biologii molekularnej genu kodującego fluoryzujące białko GFP [Tsien R (1998) Annu Rev Biochem Vol. 67, 509-44]. Chcąc wykryć kolonie bakterii, które produkują GFP należy jedynie wzbudzić fluorescencję światłem UV.

Niestety żaden z obecnie wykorzystywanych genów markerowych nie jest „uniwersalnym genem markerowym”. Konstrukcja roślin, zwierząt i mikroorganizmów GMO wymaga zastosowania genów markerowych „wysoce wyspecjalizowanych” dla potrzeb konstrukcji konkretnego organizmu GMO. Stąd, poszukuje się wciąż nowych genów markerowych. Od kilku lat trwają prace nad konstrukcją układu pozwalającego na wydajną biosyntezę i łatwą izolację enzymów pochodzących z organizmów adaptowanych do wzrostu w niskich temperaturach, 0-25°C, tzw. psychrozymów. Psychrozymy o aktywności lipazy, proteazy, beta-galaktozydazy dzię ki swoim unikalnym wł aś ciwością znajdują się

PL 211 236 B1

m.in. w kręgu zainteresowania przemysłu chemicznego, spożywczego i farmaceutycznego. Produkcja tych enzymów w rekombinantowych komórkach bakterii mezofilnych czy też pozyskiwanie ich z organizmów produkujących je w naturze, nastręcza na ogół sporo trudności. W efekcie koszt uzyskania psychrozymów ze wspomnianych źródeł jest wysoki i w znacznym stopniu uniemożliwia ich przemysłowe pozyskiwanie i zastosowanie. Rozwiązania wspomnianych problemów upatruje się w konstrukcji rekombinantowych szczepów bakterii psychrotrofowych, produkujących wydajniej niż organizm źródłowy wybrany psychrozym, tj. w warunkach w których wyeliminujemy niekorzystne warunki istniejące podczas produkcji psychrozymu w komórkach mezofilnych bakterii, np. temperatura powyżej 30°C. Kluczowym etapem dla uzyskania rekombinantowych mikroorganizmów psychrotrofowych jest konstrukcja wektorów wahadłowych wyposażonych między innymi w geny markerowe. Celem wynalazku jest dostarczenie genu markerowego pozwalającego na selekcję nowych rekombinantowych szczepów mikroorganizmów adoptowanych do zimna oraz mezofilnych (np. E. coli).

Nieoczekiwanie określony powyżej cel został osiągnięty w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest system selekcyjny dla szczepów rekombinantowych E. coli niosących gen mod-rsfp jako gen markerowy. System ten pozwala na selekcję rekombinantowych szczepów E. coli uzyskanych na drodze klonowania molekularnego zawierających w obrębie genu mod-rfsp fragmentów DNA o dowolnej sekwencji. Prowadzi to do utraty funkcji genu markerowego genu mod-rfsp w komórkach E. coli podczas ich wzrostu w podłożu wzrostowym zawierającym rodaminę B). Szczególnie korzystnie gen - mod-rfsp posiada sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:1.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest białko MOD-RFSP kodowane przez gen markerowy mod-rfsp. Korzystnie, posiada ono sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:2.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja oligonukleotydu służącego do otrzymywania sekwencji DNA kodującej białko RFSP według wynalazku zdefiniowanego powyżej wybrana spośród sekwencji SEQ ID No.:3 -4.

Kolejnym przedmiotem wynalazku są sekwencje DNA zawierające sekwencję genu mod-rsfp kodującą białko MOD-RSFP według wynalazku jak zdefiniowano powyżej. Korzystnie, posiadają one sekwencję SEQ ID No.:5 oraz SEQ ID No.:6.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja genu rsfp. Korzystnie gen rsfp posiada sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:7.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest białko RFSP kodowane przez gen rfsp. Korzystnie, posiada ono sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:8.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest plazmid rekombinowany p23 zawierający sekwencję DNA kodującą białko RFSP według wynalazku zdefiniowanego powyżej pod kontrolą promotora Plac. Korzystnie, plazmid według wynalazku zawiera ponadto: gen oporności na ampicylinę bla oraz origin replikacji Rep(pMB1). Szczególnie korzystnie plazmid według wynalazku posiada sekwencję DNA: SEQ ID No.:9

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest plazmid rekombinowany pSec zawierający sekwencję DNA kodującą białko MOD-RFSP według wynalazku zdefiniowanego powyżej pod kontrolą promotora Plac. Korzystnie, plazmid według wynalazku zawiera ponadto: gen oporności na ampicylinę bla oraz origin replikacji Rep(pMB1). Szczególnie korzystnie plazmid według wynalazku posiada sekwencję SEQ ID No.:10.

Wynalazek ujawnia też rekombinantowy szczep bakterii transformowany plazmidem pSec posiadającym sekwencje DNA: SEQ ID No.:10 według wynalazku zdefiniowanym powyżej. Korzystnie szczep bakterii według wynalazku może być otrzymany z jednego ze znanych szczepów bakterii wybranych spośród szczepów Echerichia sp., korzystnie wybranego spośród następujących szczepów - szczepu Escherichia coli TOP10F'.

Wynalazek ujawnia również sposób wykorzystania genu mod-rfsp jako genu markerowego w rekombinantowych szczepach E. coli podczas ich wzrostu na podłoż ach zawierających czynnik selekcyjny, jakim jest rodamina B. Gen mod-rfsp znajdujący się na plazmidzie rekombinantowych pSec pod promotorem Plac (SEQ ID No.:10) po wprowadzeniu na drodze transformacji do komórek E. coli np. szczepu E. coli TOP10F' podczas ich wzrostu na podłożu selekcyjnym zawierającym rodaminę B w określonych warunkach nadaje im zdolność do fluorescencji, np. w skutek absorpcji światła UV o długości fali 312 nm. Klonowanie molekularne w obrębie genu mod-rfsp dowolnego fragmentu DNA znosi zdolność rekombinantowych szczepów E. coli niosących tak zmodyfikowaną wersję genu mod-rfsp do absorpcji promieniowania UV (312 nm) i fluorescencji podczas wzrostu rekombinantowych komórek E. coli na podłożach zawierających rodaminę B. Nieoczekiwanie zaobserwowana

PL 211 236 B1 zależność wynikająca z modyfikacji sekwencji genu mod-rfsp na zdolność lub jej brak rekombinowanych szczepów E. coli podczas ich wzrostu na podłożach z rodaminą B do fluorescencji po ich ekspozycji na promieniowanie UV o długości fali 312 nm jest istotą systemu selekcji, który jest kolejnym przedmiotem zgłoszonego wynalazku.

Skonstruowano bibliotekę metagenomowego DNA wyizolowanego z próbki gleby antarktycznej pochodzącej z plaży będącej terenem kolonii słoni morskich, znajdującej się w sąsiedztwie polskiej bazy polarnej im. H. Arctowskiego na wyspie Króla Jerzego w archipelagu Szetlandów Południowych w komórkach E. coli. Z jednej z kolonii E. coli uzyskanej biblioteki metagenomowej wyizolowano rekombinantowy plazmid p23. Nieoczekiwanie stwierdzono, że obecność DNA plazmidu p23 (SEQ ID No.:9) w komórkach E. coli nadaje im nową cechę fenotypową - zdolność do absorpcji promieniowania UV (np. 312 nm) i fluorescencji podczas ich wzrostu na podłożu zawierającym rodaminę B (fig. 1). W celu zidentyfikowania genu odpowiedzialnego za tę nową cechę fenotypową rekombinantowych komórek E. coli zsekwencjonowano insert metagenomowego DNA znajdujący się w obrębie DNA plazmidu p23. W obrębie tego insertu zidentyfikowano 7 otwartych ramek odczytu (fig. 2). Dalsza analiza DNA insertu plazmidu p23 z zastosowaniem technik inżynierii genetycznej pozwoliła określić, że ramka odczytu oznaczona nr ORF-4 (fig. 2) koduje gen odpowiedzialny za obserwowaną zdolność do fluorescencji przez rekombinantowe kolonie szczepu E. coli TOP10F' transformowane DNA plazmidu p23. Otwarta ramka odczytu ORF-4 została nazwana jako gen rsfp. Dalsza analiza sekwencji plazmidu p23 wykazała, że gen rsfp został wklonowany w ramkę odczytu zgodną z ramką odczytu dla fragmentu genu kodującego α-factor β-galaktozydazy LacZ E. coli. Efektem tego jest powstanie „genu fuzyjnego” rsfp. Gen fuzyjny rsfp został nazwany mod-rsfp. Gen fuzyjny mod-rsfp koduje białko fuzyjne MOD-RSFP zbudowane z białka RSFP z dołączoną na końcu N tego białka domeną fuzyjną zbudowaną z 22 reszt aminokwasowych.

Sekwencję aminokwasową białka RSFP porównano z sekwencjami białek zdeponowanymi w bazach NCBI. Pozwoliło to ustalić wysokie podobieństwo sekwencji aminokwasowej białka RSFP (93%) do fosforylazy methylotioadenozyny z Psychrobacter arcticus 273-4, enzymu zaangażowanego w szlak metabolizmu metioniny.

Następnie skonstruowano plazmid rekombinantowy pSec (SEQ ID No.:10) zawierający sekwencję genu mod-rsfp pod kontrolą promotora Plac (fig. 3). Nieoczekiwanie stwierdzono, że komórki E. coli transformowane DNA plazmidu pSec posiadają zdolność do fluorescencji pod wpływem naświetlenia ich kolonii UV (312 nm), które rosły na podłożu Luria-Bertani (tzw. pożywka LB) zestalonym agarem bakteriologicznym i zawierającym rodaminę B (0,01 mg/ml pożywki LB) (fig. 4).

Następnie przeprowadzono klonowanie molekularne fragmentu DNA o wybranej sekwencji (Przykład No.:6) w unikalne miejsce dla restryktazy EcoRV znajdujące się w obrębie sekwencji genu mod-rsfp. Uzyskany plazmid rekombinantowy nazwano pSec-16S-EcoRV. Nieoczekiwanie stwierdzono, że komórki E. coli transformowane DNA plazmidu pSec-16S-EcoRV nie posiadają zdolności do fluorescencji pod wpływem naświetlenia ich kolonii, które rosły na podłożu Luria-Bertani (tzw. Pożywka LB) zestalonym agarem bakteriologicznym i zawierającym rodaminę B (0,01 mg/ml pożywki LB) (fig. 5).

Nieoczekiwanie stwierdzono porównując wyniki doświadczeń przeprowadzonych dla rekombinowanych szczepów E. coli transformowanych odpowiednio DNA plazmidów pSec i pSec-16S-EcoRV podczas ich wzrostu na podłożach zawierających rodaminę B, że gen mod-rsfp pełni rolę nowego nieznanego wcześniej genu markerowego.

Ponadto, nieoczekiwanie plazmid rekombinantowy pSec okazał się być użytecznym w konstrukcji nowego systemu selekcji opartego o obecność genu mod-rsfp oraz jego produktu białka RSFP w komórkach E. coli i obecności rodaminy B w pożywce podczas ich wzrostu na pożywce Luria-Bertani.

Następnie ustalono optymalny skład podłoża hodowlanego zawierającego rodaminę B oraz optymalne warunki hodowli rekombinowanych szczepów E. coli niosących plazmid pSec oraz plazmidów pochodnych plazmidu pSec (np. pSec-16S-EcoRV), w których w unikalne miejsce restrykcyjne dla restryktazy EcoRV dla genu mod-rsfp wklonowano DNA o wybranej sekwencji nukleotydowej (Przykład 6). Wybór właściwych stężeń składników odżywczych oraz stężenia rodaminy B pozwolił na uzyskanie optymalnych warunków funkcjonowania genu mod-rsfp jako genu markerowego w plazmidzie pSec oraz plazmidach uzyskanych na opisanej powyżej drodze jego modyfikacji.

Szczególną realizację wynalazku stanowią startery oligonukleotydowe do reakcji amplifikacji DNA o symbolach F_primer oraz R19_primer.

PL 211 236 B1

Realizację wynalazku stanowi także sekwencja DNA otrzymana w wyniku konstrukcji biblioteki metagenomowego DNA wyizolowanego z próbki gleby antarktycznej pochodzącej z plaży będącej terenem kolonii słoni morskich, znajdującej się w sąsiedztwie polskiej bazy polarnej im. H. Arctowskiego na wyspie Króla Jerzego w archipelagu Szetlandów Południowych w komórkach E. coli z zastosowaniem plazmidowego wektora DNA pUC19 (Fermentas). Ta sekwencja DNA o symbolu MetaGenom-p23 zawiera 7 otwartych ramek odczytu, z których ramka oznaczona ORF-4 koduje białko RFSP.

Realizację wynalazku stanowi również plazmid biblioteczny o symbolu p23 zawierający wklonowany fragment DNA opisany powyżej jako MetaGenom-p23, sekwencję promotora Plac oraz genu oporności na ampicylinę bla.

Realizację wynalazku stanowi w szczególności sekwencja DNA otrzymana w wyniku amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych o symbolach F_primer i R19_primer zawierająca fragment DNA kodujący białko MOD-RSFP fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny Xbal i fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny BamHl, o symbolu insert-rsfp.

Realizację wynalazku stanowi również plazmid rekombinantowy o symbolu pSec zawierający fragment DNA opisany powyżej jako insert-rsfp, promotor Plac, fragmenty DNA rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Xbal, BamHI i EcoRV oraz gen oporności na ampicylinę bla.

Realizacją wynalazku jest również sposób wykorzystania genu mod-rsfp jako genu markerowego w konstrukcji nowych rekombinantowych szczepów bakterii w tym E. coli jak pokazano w przykładzie No.:2.

W tym wariancie realizacji wynalazku fragment zawierający gen mod-rsfp o symbolu insert-rsfp uzyskuje się poprzez amplifikację DNA z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych o symbolach F_primer i R19_primer na matrycy DNA plazmidu bibliotecznego o symbolu p23. Uzyskany produkt PCR klonuje się do wektora pUC19 firmy Fermentas otrzymując plazmid rekombinantowy o symbolu pSec. Otrzymanym DNA plazmidu rekombinantowego pSec transformuje się komórki E. coli TOP10F', w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep E. coli o symbolu E. coli TOP10F' pSec. Wykorzystując hodowlę szczepu o symbolu E. coli TOP10F' pSec na standardowym podłożu mikrobiologicznym, np. Luria Bertani Broth z dodatkiem ampicyliny, uzyskaną biomasę wykorzystuje się do izolacji plazmidowego DNA rekombinantowego plazmidu pSec.

W wariancie realizacji tego wynalazku, DNA plazmidu rekombinantowego o symbolu pSec wykorzystuje się jako wektor selekcyjny w klonowaniu molekularnym dzięki obecności w jego sekwencji genu mod-rsfp z unikalnym miejscem restrykcyjnym dla enzymu restrykcyjnego EcoRV. Nieoczekiwanie, obecność unikalnego miejsca restrykcyjnego EcoRV w DNA plazmidu rekombinantowego o symbolu pSec w obrębie genu mod-rsfp pozwala klonować w to miejsce dowolne sekwencje DNA o długości w zakresie od kilkuset do 7-8 kpz, o symbolu ogólnym INSERT. Po wklonowaniu wybranego fragmentu DNA w miejsce restrykcyjne EcoRV w plazmidzie pSec otrzymujemy plazmidy pochodne plazmidu pSec o ogólnym symbolu pSec-INSERT-EcoRV. Transformacja DNA plazmidu o symbolu ogólnym pSec-INSERT-EcoRV szczepu E. coli TOP10F' prowadzi do powstania szczepu rekombinantowego o symbolu E. coli TOP10F' pSec-INSERT-EcoRV. W przykładzie 6 jako INSERT użyto produkt reakcji PCR o długości ~1500 pz uzyskany z użyciem starterów dla zakonserwowanego fragmentu genu 16SrDNA na matrycy genomowego DNA szczepu Pseudoalteromonas sp. 643A.

W wariancie realizacji tego wynalazku hodowla szczepu E. coli o symbolu E. coli TOP10F' pSec oraz szczepu rekombinantowego o symbolu E. coli TOP10F' pSec-16S-EcoRV podczas ich wzrostu na pożywce Luria-Bertani zawierającym rodaminę B pozwala na rozróżnienie obu szczepów. Szczep E. coli o symbolu E. coli TOP10F' pSec w odróżnieniu od szczepu rekombinantowego o symbolu E. coli TOP10F' pSec-16S-EcoRV posiada zdolność do fluorescencji po naświetleniu komórek bakterii tego szczepu światłem UV o długości fali 312 nm. Zaobserwowana różnica fenotypową pomiędzy opisanymi szczepami jest podstawą realizacji tego wynalazku jako nowego systemu selekcji w klonowaniu molekularnym DNA oraz konstrukcji nowych szczepów rekombinantowych E. coli.

Realizację wynalazku stanowi również sposób przygotowania podłoży mikrobiologicznych z dodatkiem rodaminy B umożliwiających rozróżnienie szczepów E. coli o symbolach E. coli TOP10F' pSec oraz szczepów rekombinantowych o symbolu ogólnym E. coli TOP10F' pSec-INSERT-EcoRV.

Wynalazek objaśniony jest bliżej w przykładach wykonania i na rysunkach, na którym:

fig. 1. przedstawia sekwencję DNA genu mod-rsfp z zaznaczeniem sekwencji kodowanego przez ten gen białka MOD-RSFP (domena fuzyjna na N-końcu białka MOD-RSFP została zaznaczona kolorem czerwonym),

PL 211 236 B1 fig. 2. przedstawia zdolność kolonii bakterii E. coli TOP10F' transformowanych DNA plazmidu o wzorze 6 i o symbolu p23 do absorpcji promieniowania UV (312 nm) i fluoroscencji podczas ich wzrostu na podłożu zawierającym rodaminę B, fig. 3. przedstawia mapę genetyczną DNA plazmidu o wzorze 6 i o symbolu p23, fig. 4. przedstawia mapę genetyczną DNA plazmidu o wzorze 7 i o symbolu pSec, fig. 5. przedstawia zdolność kolonii bakterii E. coli TOP10F' transformowanych DNA plazmidu o wzorze 7 i o symbolu pSec do absorpcji promieniowania UV (312 nm) i fluoroscencji podczas ich wzrostu na podłożu zawierającym rodaminę B, fig. 6. przedstawia brak zdolności kolonii bakterii E. coli TOP10F' transformowanych DNA plazmidu o symbolu pSec-16S-EcoRV do absorpcji promieniowania UV (312 nm) i fluoroscencji podczas ich wzrostu na podłożu zawierającym rodaminę B, fig. 7. przedstawia schemat testu selekcyjnego opartego o aktywność genu rsfp (lub jej brak dla zmodyfikowanej wersji genu rsfp) w komórkach szczepu E. coli 10F' z zastosowaniem podłoża selekcyjnego z dodatkiem rodaminy B (Przykład 8).

P r z y k ł a d 1.

Konstrukcja biblioteki metagenomowego DNA z próbki gleby antarktycznej

W celu izolacji metagenomowego DNA bę d ą cego ź ródł em genu rsfp o wzorze 7 opracowano unikalną procedurę ekstrakcji całkowitego DNA z gleby pobranej na terenie kolonii słoni morskich znajdującej się w sąsiedztwie polskiej stacji polarnej im. H. Arctowskiego na wyspie Króla Jerzego w archipelagu Szetlandów Poł udniowych. 5 g gleby zosta ł o zmieszane z 13,5 ml buforu A (100 mM

Tris-HCl pH 8,0; 100 mM EDTA pH 8,0; 100 mM Na3PO4 pH 8,0; 1,5 M NaCl; 1% (w/v) CTAB) oraz z 25 μΐ lizozymu (10 mg/ml, A&A Biotechnology). Mieszaninę wytrząsano (225 rpm) 30 min w 37°C. Następnie dodano 50 μl proteinazy K (20 mg/ml, A&A Biotechnology) i kontynuowano wytrząsanie 30 min w 37°C, 225 rpm, po czym dodano 1,5 ml 20% roztworu wodnego SDS (w/v). Po dodaniu SDS próbkę inkubowano w łaźni wodnej (65°C, 2 godziny) mieszając ją delikatnie co 15-20 min. Po zakończeniu inkubacji próbkę wirowano przy 6000xg przez 10 min w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu supernatant zachowano a osad poddano dwukrotnej ekstrakcji. W tym celu dodano do osadu każdorazowo 4,5 ml buforu A i 0,5 ml 20% roztworu wodnego SDS (w/v). Frakcje płynne uzyskane podczas ekstrakcji połączono z wcześniej zebranym supernatantem. Uzyskaną mieszaninę poddano ekstrakcji z równoważną objętością mieszaniny chloroform-alkohol izoamylowy (24:1, v/v). Po ostrożnym oddzieleniu fazy wodnej od fazy organicznej zachowano fazę wodną. Z fazy wodnej DNA precypitowano izopropanolem (0,6 obj. próbki) poprzez inkubacje próbki 16 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie próbkę zwirowano 16000xg przez 20 min w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu supernatant odrzucono, natomiast osad zawieszono w 0,5 ml dejonizowanej wody. Wodny roztwór DNA zachowano do dalszych analiz w -20°C lub wykorzystano bezpośrednio w konstrukcji biblioteki metagenomowej. W tym celu całkowite DNA zostało częściowo potrawione restryktazą Bsp143I i poddane reakcji ligacji z oczyszczonym DNA plazmidu pUC19 (Fermentas) poddanym uprzednio trawieniu restryktazą BamHl. Uzyskaną mieszaniną ligacyjną transformowano komórki szczepu E. coli TOP10F' i następnie wysiano je na płytki Petriego z zestalonym agarem podłożem Luria Bertani z dodatkiem 0.1 mg/ml ampicyliny, 2% oliwy z oliwek (v/v) oraz 1% roztworu wodnego rodaminy B o st. 0,1 mg/ml (v/v). W wyniku wzrostu kolonii bakterii przez 24 godzin w temp. 30°C wyselekcjonowano jedną kolonię bakteryjną oznaczoną numerem 23 wykazującą zdolność do fluorescencji po naświetleniu promieniowaniem UV o długości 312 nm. Następnie za pomocą ezy komórki E. coli z kolonii nr. 23 zaszczepiono na płynne podłoże Luria Bertani z dodatkiem ampicyliny o stężeniu końcowym 0,1 mg/ml (v/v) i hodowano w celu izolacji DNA plazmidowego. W wyniku izolacji uzyskuje się DNA plazmidu o wzorze 9 i o symbolu p23, który zawiera fragment DNA kodujący białko MOD-RSFP pod kontrolą promotora Plac, co potwierdza się poprzez analizę restrykcyjną i sekwencjonowanie DNA metodą Sangera.

P r z y k ł a d 2.

Otrzymywanie sekwencji DNA kodującej białko MOD-RSFP

Amplifikuje się fragment DNA z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze 3 i symbolu F_primer (0,2 μM) oraz wzorze 4 i symbolu R19_primer (0,2 μM), na matrycy DNA plazmidu rekombinantowego o wzorze 9 i symbolu p23 (0,2 μg), w buforze zawierającym: 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM KCl, 3,4 mM MgCl₂, 0,15% Triton X-100, 250 μM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 1 U polimerazy DNA Hypernova produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.c, Gdańsk, Polska. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowo-czasowych: 94°C - 2 minuty, 1 pętla (94°C - 30 sekund, 51°C - 30 sekund, 72°C - 60 sekund; 9 cykli),

PL 211 236 B1 druga pętla (94°C - 30 sekund, 63°C - 45 sekund, 72°C - 60 sekund; 21 cykli) 72°C - 5 minut, uzyskując fragment DNA o wzorze 5 i symbolu insert-rsfp. Produkt PCR zawiera sekwencję DNA genu mod-rsfp i sekwencje fragmentów DNA rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne Xbal i BamHI.

P r z y k ł a d 3.

Otrzymywanie plazmidu o wzorze 10 i o symbolu pSec

W celu uzyskania plazmidu o wzorze 10 i o symbolu pSec przeprowadza się reakcję ligacji fragmentu DNA o wzorze 6 i o symbolu insert-rsfp, uzyskanego na drodze trawienia enzymami restrykcyjnymi Xbal i BamHI, z DNA wektora plazmidowego pUC19 (Fermentas) trawionego tymi samymi enzymami restrykcyjnymi w temperaturze 16°C przez 3 godziny z użyciem 2U DNA ligazy faga T4, stosując bufor reakcyjny: 33 mM Tris-CH3COOH pH 7,8, 10 mM (CH3COO)2Mg, 66 mM CH3COOK,

0,5 mM DTT, 2 mM ATP. Następnie mieszaniną ligacyjną transformuje się komórki Escherichia coli

TOP10F' i wysiewa na podłoże Luria Bertani zestalone agarem zawierające 100 μg/ml ampicyliny. Uzyskane kolonie bakteryjne zawierające plazmidy rekombinantowe przesiewa się na pożywkę płyną Luria Bertani z dodatkiem 100 μg/ml ampicyliny i hoduje się w celu izolacji DNA plazmidowego. W wyniku izolacji uzyskuje się DNA plazmidu o wzorze 7 i o symbolu pSec, który zawiera fragment DNA kodujący białko RSFP pod kontrolą promotora Plac, co potwierdza się poprzez analizę restrykcyjną i sekwencjonowanie DNA metodą Sangera.

P r z y k ł a d 4.

Otrzymywanie rekombinantowego szczepu E. coli TOP10F' pSec

W celu uzyskania rekombinantowego szczepu E. coli TOP10F' pSec wykonuje się transformację komórek E. coli TOP10F' DNA plazmidu o wzorze 10 i o symbolu pSec. Komórki bakterii wysiewa się na podłoże Luria Bertani zestalone agarem zawierające 100 μg/ml ampicyliny. Uzyskany szczep E. coli TOP10F' pSec podczas wzrostu na podłożu selekcyjnym z dodatkiem rodaminy B (przykład 7) wykazuje zdolność do fluorescencji po wzbudzeniu jej światłem UV o długości fali 312 nm. W celu stwierdzenia obecności genu mod-rsfp w obrębie komórek szczepu E. coli TOP10F' pSec wykonuje się izolację plazmidowego DNA, a następnie reakcję amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów o wzorze 3 oraz 4 i symbolach F_primer i R19_primer zgodnie z przykładem 2.

P r z y k ł a d 5.

Otrzymywanie plazmidu o symbolu pSec-16S-EcoRV

W celu uzyskania plazmidu o symbolu pSec-16S-EcoRV przeprowadza się reakcję ligacji fragmentu genu uzyskanego na drodze amplifikacji w reakcji PCR (np. 16SrDNA Pseudoalteromonas sp. 643A; Cieśliński et al. Arch Microbiol (2007) 188:27-36), z DNA wektora plazmidowego pUC19 (Fermentas) trawionego enzymem restrykcyjnym EcoRV, w temperaturze 16°C, przez 3 godziny, z użyciem 2U DNA ligazy faga T4, stosując bufor reakcyjny: 33 mM Tris-CH3COOH pH 7,8, 10 mM (CH3COO)2Mg, 66 mM CH3COOK, 0,5 mM DTT, 2 mM ATP. Następnie mieszaniną ligacyjną transformuje się komórki Escherichia coli TOP10F' i wysiewa na podłoże Luria Bertani zestalone agarem zawierające 100 μg/ml ampicyliny. Uzyskane kolonie bakteryjne zawierające plazmidy rekombinantowe przesiewa się na pożywkę płyną Luria Bertani z dodatkiem 100 μg/ml ampicyliny i hoduje się w celu izolacji DNA plazmidowego. W wyniku izolacji uzyskuje się DNA plazmidu o symbolu pSec-16S-EcoRV. Przedstawiony schemat konstrukcji plazmidu pSec-16S-EcoRV jest przykładem konstrukcji jednego z możliwych wariantów plazmidu o wzorze ogólnym pSec-lNSERT-EcoRV.

P r z y k ł a d 6.

Otrzymywanie rekombinantowego szczepu E. coli TOP10F'pSec-INSERT-EcoRV

W celu uzyskania rekombinantowego szczepu E. coli TOP10F' pSec-INSERT-EcoRV wykonuje się transformację komórek E. coli TOP10F' DNA plazmidu o symbolu ogólnym pSec-INSERT-EcoRV. Procedura ta została przeprowadzona z sukcesem dla plazmidu pSec-16S-EcoRV pozwalając na uzyskanie szczepu rekombinantowego E. coli TOP10F' pSec-16S-EcoRV. Komórki bakterii wysiewa się na podłoże Luria Bertani zestalone agarem zawierające 100 μg/ml ampicyliny. Uzyskany szczep E. coli TOP10F' pSec-16S-EcoRV podczas wzrostu na pożywce Luria-Bertani z dodatkiem rodaminy B (przykład 7) nie nabywa zdolności do fluorescencji pod wpływem oświetlenia światłem UV o długości fali 312 nm. W celu stwierdzenia obecności genu mod-rsfp w obrębie komórek szczepu E. coli TOP10F' pSec wykonuje się izolację plazmidowego DNA, a następnie reakcję amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów o wzorze 3 oraz 4 i symbolach F_primer i R19_primer zgodnie z przykładem 2.

P r z y k ł a d 7.

Otrzymywanie podłoża selekcyjnego dla szczepu E. coli TOP10F' niosącego funkcjonalny i niefunkcjonalny wariant genu rsfp

PL 211 236 B1

W celu uzyskania „warunków selekcji wynikających z obecności funkcjonalnej formy genu mod-rsfp (szczep E. coli TOP10F' pSec) oraz niefunkcjonalnej formy genu rsfp (szczep E. coli TOP10F' pSec-16S-EcoRV) stosuje się podłoże mikrobiologiczne otrzymane według następującej procedury. Należy odważyć 10 g peptonu K lub tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g soli oraz 15 g agaru bakteriologicznego. Następnie dodać wody redestylowanej do objętości 1 l, zamieszać i autoklawować w temp 121°C przez 20 min. Po zakoń czonym autoklawowaniu zamieszać cał o ść w celu uniknię cia rozwarstwienia agaru i po schłodzeniu do 50°C dodać 1 ml roztworu wodnego rodaminy B (1 mg/ml). Powyższa procedura pozwala na przygotowanie wyjściowej wersji pożywki Luria-Bertani wzbogaconego dodatkiem barwnika fluorescencyjnego rodaminy B, stanowiącej punkt wyjścia do dalszych modyfikacji składu. Ze względu na obecność w rekombinowanych plazmidach o wzorze 10 i symbolu pSec oraz plazmidach pochodnych plazmidu pSec o symbolu ogólnym pSec-INSERT-EcoRV (np. DNA plazmidu pSec-16S-EcoRV) genu bla do 1 l pożywki Luria-Bertani suplementowanej dodatkiem rodaminy B, należy dodać 1 ml roztworu ampicyliny (100 mg/ml). Ponadto ze względu na obecność sekwencji wiązania białka Lacl pomiędzy promotorem Plac a genem mod-rsfp w rekombinowanych plazmidach o wzorze 10 i symbolu pSec oraz plazmidach pochodnych tego plazmidu o symbolu ogólnym pSec-INSERT-EcoRV do 1 l pożywki Luria-Bertani suplementowanej dodatkiem rodaminy B należy dodać także 1 ml 1 M roztworu IPTG (izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozyd). Tak przygotowane podłoże należy wylać na sterylne płytki Petriego. Po zestaleniu podłoża, płytki wysuszyć przed użyciem w temperaturze 37°C. Płytki można przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C. Warunki i sposób przygotowania podłoża zostały zoptymalizowane pod kątem optymalnego stężenia rodaminy B zapewniającego optymalne warunki do wykrywania różnic w fluorescencji (zgodnie z warunkami prowadzenia selekcji na drodze fluorescencji opisanymi w przykładzie 8) dla szczepów E. coli TOP10F' pSec i E. coli TOP10F' pSec-INSERT-EcoRV (np. E. coli TOP10F' pSec-16S-EcoRV), co przedstawiono na rysunkach oznaczonych jako fig 5 i fig 6.

P r z y k ł a d 8.

Sposób użycia genu mod-rsfp jako genu markerowego w komórkach bakterii szczepu E. coli TOP10F'

Użycie genu mod-rsfp jako genu markerowego w komórkach bakterii szczepu E. coli TOP10F' wymaga:

1. wprowadzenia wybranego fragmentu DNA (INSERT) w obrębie genu mod-rsfp; Przykład 5,

2. wprowadzenia zmodyfikowanego genu mod-rsfp do komórek E. coli za pomocą wektorów DNA o wzorze ogólnym pSec-INSERT-EcoRV, Przykład 6,

3. wprowadzenia genu mod-rsfp do komórek E. coli za pomocą wektora DNA pSec (kontrola pozytywna); Przykład 4,

4. wzrostu szczepów^* E. coli TOP10F' pSec i E. coli TOP10F' pSec-lNSERT-EcoRV (np. E. coli TOP10F' pSec-16S-EcoRV) na podłożu selekcyjnym z rodaminą B; Przykład 7,

5. Oświetlenia światłem UV o długości 312 nm kolonii szczepów E. coli TOP10F' pSec i E. coli TOP10F' pSec-INSERT-EcoRV (np. E. coli TOP10F' pSec-16S-EcoRV) znajdujących się na płytkach z podłożem selekcyjnym zawierającym rodaminę B w celu określenia ich zdolności do fluorescencji.

Schemat testu selekcyjnego opartego o aktywność genu rsfp (lub jej brak dla zmodyfikowanej wersji genu rsfp) w komórkach szczepu E. coli 10F' z zastosowaniem podłoża selekcyjnego z dodatkiem rodaminy B przedstawia fig. 7.

^* Testowane warunki wzrostu i aktywności genu mod-rsfp w komórkach bakterii E. coli obejmowały temperatury wzrostu rekombinantowych kolonii E. coli w zakresie 15-40°C. W temperaturze powyżej 37°C fluorescencja kolonii szczepu E. coli TOP10F' pSec gwałtownie spada i nie można w sposób jednoznaczny rozróżnić kolonii E. coli TOP10F' pSec i E. coli TOP10F' pSec-16S-EcoRV. Gen rsfp może pełnić rolę genu markerowego w szerokim zakresie temperatur 15-37°C. Pozwala to zastosować go także w innych gatunkach mikroorganizmów, szczególnie bakteriach psychrotrofowych i psychrofilowych pozbawionych analogów funkcjonalnych tego genu.

PL 211 236 B1

SEQ No.:l

ATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCATT

TGGAGCCCAATATGACTTCAACCGCAGTAGAAATTACGGTAAAAAACGCTGCCG

ATATCGCTATTATCGGCGGTAGCGGTCTGTATCAAATGCAAGCTTTGACCAATAA

GCGCAGCGTTAAAATTGAGACACCCTATGGTGAGCCATCTGATGACATCGTGCTC

GGTGAACTTAATGGCGTCACAGTTGCATTCTTAACGCGACATGGTCAAGGACACA

GGTTAACCCCCTCTGAGGTGCCTTATCGTGCCAACATCTATGCCTTAAAGACTTTA

GGCGTACGCTATATCGTCTCAGTATCAGCGGTTGGCTCATTGCAAGAAACGCTGA

AACCACTAGATATGGTCATCCCCGATCAAATGATTGATATGACCAAGCAGAGAGT

AAGCACGTTCTTTGGAGATGGTGCGGTCGCCCATGTGTCAATGGCTGACCCTTTA

TGCCCTGAAGTAGCAGACATCTTGATTCGAGCTTATGACAACGCGGATATTGCCG

ATGGGCAGTGCCACGCAAAAGCCACCTATGTCTGTATCGAAGGACCTCAGTTTTC

AACTCGCGCAGAATCACACTGGTATCGGCAGATGCAAGCGGATATTATCGGCATG

ACCAATATGCCAGAAGCTAAACTCGCTCGCGAAGCCAGTATCGCCTATGCAACGT

TAGCGCTAGTGACAGATTTTGATTGTTGGCATCCAAATGAGCAAGCCGTCAGTGC

AGATTATGCCATACAAAATCTAATGAAAAATGCAGACAACGCGCAGCAAGTCAT

TAAGCAAGCTGTGGCATTAATTGCATCCGAACAGCCGAAATCAATCGCTCATACT

GCTTTGACCCAAGCATTAGTCACGCCTGTTGAAGCGATGAGCGCAGAGACTAAGA

CAAGACTTGCAGCATTACTTCCGTAG

SEQ No.:2

MTMITPSLHACRSTLEDHLEPNMTSTAVEITVKNAADIAIIGGSGLYQMQALTNKRSV

KIETPYGEPSDDIVLGELNGVTVAFLTRHGQGHRLTPSEVPYRANIYALKTLGVRYIV

SVSAVGSLQETLKPLDMVIPDQMIDMTKQRVSTFFGDGAVAHVSMADPLCPEVADIL

IRAYDNADIADGQCHAKATYVCIEGPQFSTRAESHWYRQMQADIIGMTNMPEAKLA

REASIAYATLALVTDFDCWHPNEQAVSADYAIQNLMKNADNAQQVIKQAVALIASE

QPKSIAHTALTQALVTPVEAMSAETKTRLAALLP

SEQ No.:3

PL 211 236 B1

F_primer - 5'-GACTCTAGAGGATCATTTGGAGCCCAATATG-3'

SEQ No.:4

R19_primer - 5'-AATGGATCCTACGGAAGTAATGCTGCAAGT-3'

SEQ No.:5

GATCACCCTGTAAGTAAGCGCGCTCTAAAAGCTTACTGGTTTGCTCAGGACTGGC

TGTGCTCGCACTAGATAAAAAGCTGTCTGAGTTTGAGTAGCGTGGCGGCGGTGAA

TCGGTGGGTAAGGTCTCAAGAATTTGTTGGTCGCTTTTTGGAATAAAGGGTGCAG

CATGAAGAAGGGGGCTGCCGATAAGTAATAACGGTAGTAGTCCAATAAAGGGCT

TAATCCAGTTCATAAGATCTCTCAGCTCAAAACATAAAGAAACACCTGATCAAGA

GTTTGATCAGGTGTCAGGTTTATATCACGTCAGATTACAACGAGGCGTTGGCACC

TGTTACCGCAACAGGCTCTGCTAGATTGGCTTCGGGAAGGATAATCCGATCAATA

TCTTGCGGTTCGTCGGTATTTACATCCTTACTGGCGTTGATCACAGTAGAGACTCT

CTCGACTGCTAGATTTGCCTTCACTTGATCTGCTGCTACATCGGGATTGCCCTGAT

TTCCTGTCTCAAAGTTCTTGTTGTCGTTATCACCGAAACAGCCAGAAAGAGCAGC

CGATCCGGTAACCAATATCGCTAAAAGTACATAGCGCATGGTGTTTCTCCTTAGG

TTAGATTCAGCTTAGCGACTGCCTGCATTAGGGGTTTTTAGATAAGGAAAGACTG

AGTCAAAAGCAGTGGCAGATTTTACGACTCCATCAGTAAATGGCGCTGTACCAGC

TTTCGCATCAGCAGGGACACAAGTAGCTTCTGGAGGTAGTCCAGCATGACATAGG

ACGCCCATCGCTACTCTTAACGATACATCAGTTACATCATCACCAGGTCGTCTACC

ATTCGGGAAACCTGCTGTATCACCACCAATAACACCTAAGTCATTTTGACTTGCC

GCTACTACAGTAGGTGTCGTGGTATTTAAGCGTAACATATCAGCTGGGACTAAAG

CTTTGTTAGCTGGTTTGTTGATAGTAGGAACGCCCGTTAGGAACGCAGTTACTAG

ATCTTGACGCGGGAAGTTAGTAGGTGCTGGCGCACTTGGATATAGTTTTTGAATC

AAAGCAGGTAACGTAGGATAGAACACATAATTCTTGAAATTAGCCACGTCATCTT

TTGGCTCTGAGGCGTTAAATTTGTCTTTGTCTTTAAGACCAATGACGACCTCATTG

ACCAGCGGCATACCCAATCTTGAAACTTGAGTCCATGCACCACCTTTCTTAGCGG

TGGTACTGATACCAGAAGCAGGTGAAGGATTGACTAAGGTAGCCTGACGAACAC

TGGCAGTCGTCCAAGCGCCGATCACAGGATCTACACCTCTCTTATTATTGCCTAA

ATCTACTTGGGCGGCGTTAACGAGACAAGCTTTAGGTATCTCCATTGCAATCGAG

PL 211 236 B1

GTAATATTCTTATCTGCTAGTACGTTTGTCCCGCCGTCACGTGGACCTAATGGATT

TAAATTAATCAGATCGAACACTCTACCCAAATCAATAGCAAAGCTTTCAGCGCGT

TGACCGACAAAGACCTTGCCAGCCCCACAAGTGCCTAAGTTTAACGGTTGAATAA

AGCCTCTTGCATAGCCTGGATAGTCTGCAAAAGACTTGGTGCCGATATAGTCAAA

TGGCTTGTTAAAATTCCCCAGTGGTGTACGCGCGCCGCTACGGCGATCACCTTTA

ACCATCGTCACACCATAGCTTTCACTGGTTTGCACGTTAGCTGGGTTTGAGGCATC

GCCCGCGTTAGATAATGGTATCGCAACATTTGACGGACCGCCTGAGGGTATTTCG

ATGCTATTTAGTGTTTGTTTGAAGTCAAATTGGAAGGTGACGTCTTCGACCGCATC

ACCGTTGTTATCAATGTGGATCTCATATAGAGCATCATCATCTAACGAAAAATAG

TTAGGCCCGCCATAGGCGTCTTGCAGTGGTAAATAGTTAGCAATGATGGTGACGT

AATCTGCTCGGCCACTCTCATAGCTGTTAAACATATAGAGGTCAGTGGCATCGAC

TTTAGGCGTTTTGGTGATTGAAGGCGCTTCACGGTGACTAGAGCTACAGCGCTTG

CACTTGCGCATAAAGCCATCGCTGCTAATAGAGCGTGTATAGTGTATTTCATACG

AATCCTTGTAGAAAAACTTGAGGGCTAAGGGGTATTTAAATCATAAATATATAGA

CGGTATATACTTGGATATTGCATTTCTAAATGGTTGATTTTGAAATATTTCCGAGA

GGTTCCTGAGACAATTTAAATTTTTATTATATATAATCCATATATAAATATATCTA

AACTATCCTCTGAATAAGTTAAACGAAACTATATGCTTAAGCAAGAATTTTATTA

TGGCACTCATCGGGTTTATCGTAACGTTCATCGGATTTATTGGGATAAGTGTTGTT

TTTCTGTTACAAAAGCGTTTTTAAATCACTTATAAAGGTATTTACTTAAAAACATA

AGGGAAATAAATGGAATATTAGCGCAAGAAAAGCAAGGATAATGGAATAATAA

GCTGATAAAAAAGGCTCATTATTCAGGAGAGAATGGCACACGCTTTTAAGTCGTT

CAAAGTTTTGAAAATATCGCAGCTTCATCTTGTCCTTATATATACCTAACATTATA

AATGTTCAATGATCTAAGATTAATGGCAATACATCAGAAAAAATAAGGTATTATT

AATTAGATTAGCTTTATATAAGCAGTAGATTTATAAGACAAACACTATCTATACC

AAAAATTTAATGATGTCCATTTATAATCAAGAAGACTGACAACTGGATTCTATAC

CATTATGAAATCTACCATTGAATTACTCGAAGATACTGATTTTCCTACTATTAAAA

GGCGAGAGCTTAAAATCTTGCAAGTGAATATGGGTTACTTATGCAATATGTCCTG

TGTGCATTGTCATGTTGCCGCCAGTCCGTACCGTACAGAGATGATGTCACGTGAG

CTGGTTGAGCTGATTCCACAAATTTTACAAGCGCAAAATATCGATACACTGGATT

TGACTGGTGGCGCGCCTGAAATGCATGAAGACTTTAAGTACTTGGTTAAAGCGGC

PL 211 236 B1

ACGAGCGCTGGGTGTCAAAGTGATTGACCGCTGCAATCTGACGATTCTGATGGTA

GAAGGTTATGAGGATATGGCGCAGTTCTTGGCGGACAATGAGGTTGAGGTTGTTG

CTTCGCTCCCCTGTTACTCATTAGAAAACGTAGACAAGCAGCGCGGCAAAGGGGC

GTTTGATGACAGTATCTTAGGACTACACAAGCTTAATGCTTTAGGTTATGGTAAA

TCTGGTTCGAATTTGACATTGAATCTTGTGTATAACCCGCAAGGGGCGACACTAC

CACCCAATCAGCAGCAGCTAGAAGCTGATTATAAGCGCGAGTTGAAAGCGCACT

TCGATATTGAGTTTAATCAGCTATTTGCGTTAACCAATATGCCTATTCAGCGCTTT

GGTGCGGTTTTATTGGCTAAAAAACAGTTCCATTCTTATATGGATTTACTCAAAGC

CAATTATGTGGCTTCCAATTTAACCGAAGTGATGTGTCGCTCGACTATCAGTGTA

AATTGGCTGGGAGAATTATTTGATTGCGATTTCAATCAGCAGCTTGAGATTCCGG

TACCAAACAAAGCCCGCCGTCATCTACGAGATTTATTAACACAAAATCCTGCAGG

TGATGATATTGCCATTGCGGACCATTGCTATGGGTGTACGGCAGGACAGGGCAGT

AGCTGCGGCGGTATTTTAGAAGAGTCAGCTATATAGCTTTATTAGAGTAGATTAG

ATAAAACTGGAATAAATGAGATTAGGATAGGCAAAAACCTATCTATCTAAGCGG

AGTTACTACCATGTCATTATTCAATAACTTAATAGTCAAAACGACTATTGCCACC

GCTGTTTTGTTATCAAGCGCAGCCGCCTATGCAGATTTTAATCACAGCAGTTGGG

ATACGTTGCTAGATAAACATGTAACCATGACCAATGCTGGCAAAGCGTCTGTAGT

TGATTATGTTGGCATGCAGTCAGATAAAAGTAAATTAGATAGCTATATGGCTGCC

ACTAGTAAGGTCAGTCAATCTGAATTTAACGGTTGGAATAAAGATGAGCAGCTAG

CCTTTTTAATCAATGTCTATAACGCAGGCACGGTGGAGTTGGTGCTCACCAAGTA

TCCAAATATCAAATCAATTAAAGATATTGGATCTGTATTAAGCTCACCTTGGAAG

CAGAATTTCATTCCACTATTGGGTAAAACACGCTCGCTAGATGATATTGAACACA

ATCTGATTCGCGGCTCCAAGCGTTATAATGACCCGCGTATTCACTTTGCGGTTAAT

TGTGCCAGCATTGGCTGTCCTGCGCTCCTAGACGATGCGTTTACTGGAAAGCGCT

TAGAGAAGCAGTTAGAGCAAGTGACCAGTAAGTTTTTGGCAGACAGCAGCCGTA

ATCGCTTGAAGGGAAATGCGCTTGAGGTATCACCAATTTTTAAATGGTACAAAGA

AGATTTTACGATGGGTTGGCGCGGTACTAATGACGTTGCAGGATTTTTGGGACGT

TATAGTCAAGCATTAGGAATGAATAGTACTCAAGTGAAGGCCTTAGAGCAGGGT

AAAATAAAAGTCAGTTATACCAACTATGATTGGCGGTTGAATAAGAAATAAACT

GGGCGTTAATAAAAATGACTGCTGTGCCAATCACACTCTCTATCGTAATACCGTT

PL 211 236 B1

ATTGAACGAAGCGGATAATTTGCCTAAATTGATGGGTCATCTTGCTCATCTGAAT

CCAGCACCTTATCAGGTCATACTAGTGGATGGCGGTTCAACAGATAACTCAGTTG

CCCTTGCCAAGGAACTGATTGAAAGTTTGATAGATAGCAGTCCATCCGTTATTAG

TGTACAGGTTATTGATTGGCAAATAATAGAGTCCGCCGCTGGACGTGCGCTGCAA

ATGAATGCAGGTGCTGAGCTAGCAATGGGTGATGTGTTGTTGTGTTTGCATGCGG

ATACGCAGCTGCCGAACCACGCTATTGCTGATATTACGTCAGCCGTCAGGCAAGC

CGCGTGGGGGCGTTTTGATGTGCGTTTGGACAGTTCTGCATGGATGCTCAAGGTA

GTCAGCCAGATGATCAATTGGCGTTCCAGATTAAGTGGGATTGCAACGGGTGATC

AAGCGATATTTATCAAAAAACCACTTTTTAAGCAGCTGGGTGGTTACCCTCAGCA

GCCACTTATGGAAGATATTGAACTTTGCAAACGTCTTAAAGCTATTGGTAAGCCA

GCTTGTCTACGAAGCAAGGTGATAACTTCGGCACGGCGCTGGCAACAGTATGGA

ACTTGGCGCACGATAGGTTTGATGTGGCATCTGCGTTTTGATTACTGGCGCGGTGT

CTCTGCTGATAATATTAAGCAGCGTTATTATAAGACTTAGTAGCTAACAATTGCC

CTTATTAGCAGTAAAGAGTCCTAGAGTGCGCTCAAACCATTTCAACTTGTAATAA

TAAAAATTCAAATACTTATGCCAAGAGATGCTATGCAAACAGACACGCTTATTAT

TATCTTCGCTAAGTTCCCCGCTCGTGGTATGGCAAAGACACGTTTGCAGCCTGCG

CTTGGTCTTGAGGGTGCATCACTTATAGCAAAACAGCTGTTATTGCATAGCGTTG

AGCAGGCACTAGCAACCGGATTGAGCGTCGAGCTGTGCGTGAGTCCAGCGCCAA

CTGATTTATGTTGGCAGACGCTTGGTTTACCTGAGTCATTGCAGTGGTCAGCGCA

AGCAAATGATGACTTAGGCTTACGCATGTTAGCTGCTAGCCAGCAAGGTTTATAC

AAATTTAAACAGGTGGTATTGATTGGTACGGATTGTCCAAGTTTAACGCCATTAC

GTATTCAAGATGCAGTGCATCAATTAGAGCAGTCTGATACGGTCATGATTCCTGC

CTCAGATGGTGGTTACGTGCTCCTAGGATTTAAGCAAGCTGATGCCAGTTTATTTT

CGGATATCGAGTGGAGTACTGCCAGCGTAGCGGCGGTGACTCGACAACGTATTGC

AGCATTGGGTTGGACATTGGCGTTATTAGACCCACTGCATGACATTGATGAGCCT

ACAGATTTAAAACATTTGCCCGTAGGTTGGCTTGAAAAAATAGGCTCTTGATTAG

CTGGTTCTTTAAATATGATTCATATTTCTTATCTTTAGGATGACTCTGATATAGGG

TGCTGAATAAGGTTGATTAAGCCGTTTTATTATTAACAAGGAAGTTATTATGCAT

GAGGTCGTTCAAGATTATTATGGCAAGCAGCTACAAAGTACTGAGGATTTAAAAA

CGTCAGCATGCTGTGATATTAGCAATATGCCAAGTTGGTTAAAGCCTTTGTTAGC

PL 211 236 B1

GAATATTCATGATGAGGTTCTAAGTCGATATTATGGTTGTGGCTTGGTCTGCCCAG

CGCTACTTGAAGGCTGCCGTATCCTAGATTTGGGCTGCGGTTCGGGCCGTGATGT

CTATGCATTAGCACAATTGGTTGGACGTACAGGTCATGTGGTCGGTGTCGACATG

ACAGATGAACAACTAGCCATTGCAAAGCAGCATCAAAATTATCATGTGGATAAA

TTTGGCTACGACAATGTGACTTTTCTCAAGGGCTACATCGAAAAGCTAGATGAGC

TCAATTTAGACCCTGATAGCTTCGATATCATTGTCTCAAATTGTGTTATTAACCTT

TCACCTGATAAAGCAGCGGTGATGGCCAGTGTGCAGCGTTTGCTCAAGCCTGGCG

GTGAGTTTTATTTCTCTGATGTCTATGCAGACCGCCGTATCCCGCAGCATTTAGTC

AATGATCCTGTCCTTTATGGAGAGTGTTTAAGTGGTGCCTTATACTGGAAGGATTT

TGAGCGCTTAGCGCGACATGCTGATTTTTTAGACCCGCGTTTGGTTGAAGATCGTC

CGCTTGAAATCACCGATCCGCTACTTGCTGCTAAGATTGGCGATATTCAGTTTTTT

TCCGCTACTTATCGATTATTCAAGATTGCCACGCTGGAAGATGCTTGTGAAGACC

ACGGTCAAGCAGTCATTTATCACGGAACCATTGACCAGCTACCGCATCATTTTAA

TTTAGATAAACATCATACGATTGAGACAGGCCGCGTTTTCCCTGTCTGTGGTAAT

ACTTTTCGTATGCTAAAAGAGTCACGCTTTGCTAAGCATTTTGATTTTATTGGCGA

TGATAGTCGCCACTATGGTATTTTTGCAGGTTGTGGTGATATCCTACCGTTTGGTC

ATCAAGCGGACATAGTGTCTGGGCCGTTTGTTAATTCAGGAAGCTGTTGCTAACA

GTAAGACCTGTATGATGTTGAAAAAGCTATCTCTCCAAAAAGCTGGCTGCCAAAA

ATAAAAGTGGTCCTCAAACTATTTGAGGGCCTCTTTTATATGAAAAAACATTATA

AATGTCTAAGGTTTTAACCTCTACGGAAGTAATGCTGCAAGTCTTGTCTTAGTCTC

TGCGCTCATCGCTTCAACAGGCGTGACTAATGCTTGGGTCAAAGCAGTATGAGCG

ATTGATTTCGGCTGTTCGGATGCAATTAATGCCACAGCTTGCTTAATGACTTGCTG

CGCGTTGTCTGCATTTTTCATTAGATTTTGTATGGCATAATCTGCACTGACGGCTT

GCTCATTTGGATGCCAACAATCAAAATCTGTCACTAGCGCTAACGTTGCATAGGC

GATACTGGCTTCGCGAGCGAGTTTAGCTTCTGGCATATTGGTCATGCCGATAATA

TCCGCTTGCATCTGCCGATACCAGTGTGATTCTGCGCGAGTTGAAAACTGAGGTC

CTTCGATACAGACATAGGTGGCTTTTGCGTGGCACTGCCCATCGGCAATATCCGC

GTTGTCATAAGCTCGAATCAAGATGTCTGCTACTTCAGGGCATAAAGGGTCAGCC

ATTGACACATGGGCGACCGCACCATCTCCAAAGAACGTGCTTACTCTCTGCTTGG

TCATATCAATCATTTGATCGGGGATGACCATATCTAGTGGTTTCAGCGTTTCTTGC

PL 211 236 B1

AATGAGCCAACCGCTGATACTGAGACGATATAGCGTACGCCTAAAGTCTTTAAGG

CATAGATGTTGGCACGATAAGGCACCTCAGAGGGGGTTAACCTGTGTCCTTGACC

ATGTCGCGTTAAGAATGCAACTGTGACGCCATTAAGTTCACCGAGCACGATGTCA

TCAGATGGCTCACCATAGGGTGTCTCAATTTTAACGCTGCGCTTATTGGTCAAAG

CTTGCATTTGATACAGACCGCTACCGCCGATAATAGCGATATCGGCAGCGTTTTTT

ACCGTAATTTCTACTGCGGTTGAAGTCATATTGGGCTCCAAATGATCCTAG

SEQ No.:6

GACTCTAGAGGATCATTTGGAGCCCAATATGACTTCAACCGCAGTAGAAATTACG

GTAAAAAACGCTGCCGATATCGCTATTATCGGCGGTAGCGGTCTGTATCAAATGC

AAGCTTTGACCAATAAGCGCAGCGTTAAAATTGAGACACCCTATGGTGAGCCATC

TGATGACATCGTGCTCGGTGAACTTAATGGCGTCACAGTTGCATTCTTAACGCGA

CATGGTCAAGGACACAGGTTAACCCCCTCTGAGGTGCCTTATCGTGCCAACATCT

ATGCCTTAAAGACTTTAGGCGTACGCTATATCGTCTCAGTATCAGCGGTTGGCTC

ATTGCAAGAAACGCTGAAACCACTAGATATGGTCATCCCCGATCAAATGATTGAT

ATGACCAAGCAGAGAGTAAGCACGTTCTTTGGAGATGGTGCGGTCGCCCATGTGT

CAATGGCTGACCCTTTATGCCCTGAAGTAGCAGACATCTTGATTCGAGCTTATGA

CAACGCGGATATTGCCGATGGGCAGTGCCACGCAAAAGCCACCTATGTCTGTATC

GAAGGACCTCAGTTTTCAACTCGCGCAGAATCACACTGGTATCGGCAGATGCAAG

CGGATATTATCGGCATGACCAATATGCCAGAAGCTAAACTCGCTCGCGAAGCCAG

TATCGCCTATGCAACGTTAGCGCTAGTGACAGATTTTGATTGTTGGCATCCAAAT

GAGCAAGCCGTCAGTGCAGATTATGCCATACAAAATCTAATGAAAAATGCAGAC

AACGCGCAGCAAGTCATTAAGCAAGCTGTGGCATTAATTGCATCCGAACAGCCG

AAATCAATCGCTCATACTGCTTTGACCCAAGCATTAGTCACGCCTGTTGAAGCGA

TGAGCGCAGAGACTAAGACAAGACTTGCAGCATTACTTCCGTAGGATCCATT

SEQ No.:7

ATGACTTCAACCGCAGTAGAAATTACGGTAAAAAACGCTGCCGATATCGCTATTA

TCGGCGGTAGCGGTCTGTATCAAATGCAAGCTTTGACCAATAAGCGCAGCGTTAA

AATTGAGACACCCTATGGTGAGCCATCTGATGACATCGTGCTCGGTGAACTTAAT

PL 211 236 B1

GGCGTCACAGTTGCATTCTTAACGCGACATGGTCAAGGACACAGGTTAACCCCCT

CTGAGGTGCCTTATCGTGCCAACATCTATGCCTTAAAGACTTTAGGCGTACGCTAT

ATCGTCTCAGTATCAGCGGTTGGCTCATTGCAAGAAACGCTGAAACCACTAGATA

TGGTCATCCCCGATCAAATGATTGATATGACCAAGCAGAGAGTAAGCACGTTCTT

TGGAGATGGTGCGGTCGCCCATGTGTCAATGGCTGACCCTTTATGCCCTGAAGTA

GCAGACATCTTGATTCGAGCTTATGACAACGCGGATATTGCCGATGGGCAGTGCC

ACGCAAAAGCCACCTATGTCTGTATCGAAGGACCTCAGTTTTCAACTCGCGCAGA

ATCACACTGGTATCGGCAGATGCAAGCGGATATTATCGGCATGACCAATATGCCA

GAAGCTAAACTCGCTCGCGAAGCCAGTATCGCCTATGCAACGTTAGCGCTAGTGA

CAGATTTTGATTGTTGGCATCCAAATGAGCAAGCCGTCAGTGCAGATTATGCCAT

ACAAAATCTAATGAAAAATGCAGACAACGCGCAGCAAGTCATTAAGCAAGCTGT

GGCATTAATTGCATCCGAACAGCCGAAATCAATCGCTCATACTGCTTTGACCCAA

GCATTAGTCACGCCTGTTGAAGCGATGAGCGCAGAGACTAAGACAAGACTTGCA

GCATTACTTCCGTAG

SEQ No.:8

MTSTAVEITVKNAADIAIIGGSGLYQMQALTNKRSVKIETPYGEPSDDIVLGELNGVT

VAFLTRHGQGHRLTPSEVPYRANIYALKTLGVRYIVSVSAVGSLQETLKPLDMVIPDQ

MIDMTKQRVSTFFGDGAVAHVSMADPLCPEVADILIRAYDNADIADGQCHAKATYV

CIEGPQFSTRAESHWYRQMQADIIGMTNMPEAKLAREASIAYATLALVTDFDCWHPN

EQAVSADYAIQNLMKNADNAQQVIKQAVALIASEQPKSIAHTALTQALVTPVEAMS

AETKTRLAALLP

SEQ No.:9

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGAC

GGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGC

GTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAG

ATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGG

AGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAG

GGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGC

PL 211 236 B1

TGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAA

ACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCACCCTGTAAGTAAGCG

CGCTCTAAAAGCTTACTGGTTTGCTCAGGACTGGCTGTGCTCGCACTAGATAAAA

AGCTGTCTGAGTTTGAGTAGCGTGGCGGCGGTGAATCGGTGGGTAAGGTCTCAAG

AATTTGTTGGTCGCTTTTTGGAATAAAGGGTGCAGCATGAAGAAGGGGGCTGCCG

ATAAGTAATAACGGTAGTAGTCCAATAAAGGGCTTAATCCAGTTCATAAGATCTC

TCAGCTCAAAACATAAAGAAACACCTGATCAAGAGTTTGATCAGGTGTCAGGTTT

ATATCACGTCAGATTACAACGAGGCGTTGGCACCTGTTACCGCAACAGGCTCTGC

TAGATTGGCTTCGGGAAGGATAATCCGATCAATATCTTGCGGTTCGTCGGTATTT

ACATCCTTACTGGCGTTGATCACAGTAGAGACTCTCTCGACTGCTAGATTTGCCTT

CACTTGATCTGCTGCTACATCGGGATTGCCCTGATTTCCTGTCTCAAAGTTCTTGT

TGTCGTTATCACCGAAACAGCCAGAAAGAGCAGCCGATCCGGTAACCAATATCG

CTAAAAGTACATAGCGCATGGTGTTTCTCCTTAGGTTAGATTCAGCTTAGCGACT

GCCTGCATTAGGGGTTTTTAGATAAGGAAAGACTGAGTCAAAAGCAGTGGCAGA

TTTTACGACTCCATCAGTAAATGGCGCTGTACCAGCTTTCGCATCAGCAGGGACA

CAAGTAGCTTCTGGAGGTAGTCCAGCATGACATAGGACGCCCATCGCTACTCTTA

ACGATACATCAGTTACATCATCACCAGGTCGTCTACCATTCGGGAAACCTGCTGT

ATCACCACCAATAACACCTAAGTCATTTTGACTTGCCGCTACTACAGTAGGTGTC

GTGGTATTTAAGCGTAACATATCAGCTGGGACTAAAGCTTTGTTAGCTGGTTTGTT

GATAGTAGGAACGCCCGTTAGGAACGCAGTTACTAGATCTTGACGCGGGAAGTT

AGTAGGTGCTGGCGCACTTGGATATAGTTTTTGAATCAAAGCAGGTAACGTAGGA

TAGAACACATAATTCTTGAAATTAGCCACGTCATCTTTTGGCTCTGAGGCGTTAA

ATTTGTCTTTGTCTTTAAGACCAATGACGACCTCATTGACCAGCGGCATACCCAAT

CTTGAAACTTGAGTCCATGCACCACCTTTCTTAGCGGTGGTACTGATACCAGAAG

CAGGTGAAGGATTGACTAAGGTAGCCTGACGAACACTGGCAGTCGTCCAAGCGC

CGATCACAGGATCTACACCTCTCTTATTATTGCCTAAATCTACTTGGGCGGCGTTA

ACGAGACAAGCTTTAGGTATCTCCATTGCAATCGAGGTAATATTCTTATCTGCTA

GTACGTTTGTCCCGCCGTCACGTGGACCTAATGGATTTAAATTAATCAGATCGAA

CACTCTACCCAAATCAATAGCAAAGCTTTCAGCGCGTTGACCGACAAAGACCTTG

CCAGCCCCACAAGTGCCTAAGTTTAACGGTTGAATAAAGCCTCTTGCATAGCCTG

PL 211 236 B1

GATAGTCTGCAAAAGACTTGGTGCCGATATAGTCAAATGGCTTGTTAAAATTCCC

CAGTGGTGTACGCGCGCCGCTACGGCGATCACCTTTAACCATCGTCACACCATAG

CTTTCACTGGTTTGCACGTTAGCTGGGTTTGAGGCATCGCCCGCGTTAGATAATGG

TATCGCAACATTTGACGGACCGCCTGAGGGTATTTCGATGCTATTTAGTGTTTGTT

TGAAGTCAAATTGGAAGGTGACGTCTTCGACCGCATCACCGTTGTTATCAATGTG

GATCTCATATAGAGCATCATCATCTAACGAAAAATAGTTAGGCCCGCCATAGGCG

TCTTGCAGTGGTAAATAGTTAGCAATGATGGTGACGTAATCTGCTCGGCCACTCT

CATAGCTGTTAAACATATAGAGGTCAGTGGCATCGACTTTAGGCGTTTTGGTGAT

TGAAGGCGCTTCACGGTGACTAGAGCTACAGCGCTTGCACTTGCGCATAAAGCCA

TCGCTGCTAATAGAGCGTGTATAGTGTATTTCATACGAATCCTTGTAGAAAAACT

TGAGGGCTAAGGGGTATTTAAATCATAAATATATAGACGGTATATACTTGGATAT

TGCATTTCTAAATGGTTGATTTTGAAATATTTCCGAGAGGTTCCTGAGACAATTTA

AATTTTTATTATATATAATCCATATATAAATATATCTAAACTATCCTCTGAATAAG

TTAAACGAAACTATATGCTTAAGCAAGAATTTTATTATGGCACTCATCGGGTTTAT

CGTAACGTTCATCGGATTTATTGGGATAAGTGTTGTTTTTCTGTTACAAAAGCGTT

TTTAAATCACTTATAAAGGTATTTACTTAAAAACATAAGGGAAATAAATGGAATA

TTAGCGCAAGAAAAGCAAGGATAATGGAATAATAAGCTGATAAAAAAGGCTCAT

TATTCAGGAGAGAATGGCACACGCTTTTAAGTCGTTCAAAGTTTTGAAAATATCG

CAGCTTCATCTTGTCCTTATATATACCTAACATTATAAATGTTCAATGATCTAAGA

TTAATGGCAATACATCAGAAAAAATAAGGTATTATTAATTAGATTAGCTTTATAT

AAGCAGTAGATTTATAAGACAAACACTATCTATACCAAAAATTTAATGATGTCCA

TTTATAATCAAGAAGACTGACAACTGGATTCTATACCATTATGAAATCTACCATT

GAATTACTCGAAGATACTGATTTTCCTACTATTAAAAGGCGAGAGCTTAAAATCT

TGCAAGTGAATATGGGTTACTTATGCAATATGTCCTGTGTGCATTGTCATGTTGCC

GCCAGTCCGTACCGTACAGAGATGATGTCACGTGAGCTGGTTGAGCTGATTCCAC

AAATTTTACAAGCGCAAAATATCGATACACTGGATTTGACTGGTGGCGCGCCTGA aatgcatgaagactttaagtacttggttaaagcggcacgagcgctgggtgtcaaa

GTGATTGACCGCTGCAATCTGACGATTCTGATGGTAGAAGGTTATGAGGATATGG

CGCAGTTCTTGGCGGACAATGAGGTTGAGGTTGTTGCTTCGCTCCCCTGTTACTCA

TTAGAAAACGTAGACAAGCAGCGCGGCAAAGGGGCGTTTGATGACAGTATCTTA

PL 211 236 B1

GGACTACACAAGCTTAATGCTTTAGGTTATGGTAAATCTGGTTCGAATTTGACATT

GAATCTTGTGTATAACCCGCAAGGGGCGACACTACCACCCAATCAGCAGCAGCTA

GAAGCTGATTATAAGCGCGAGTTGAAAGCGCACTTCGATATTGAGTTTAATCAGC

TATTTGCGTTAACCAATATGCCTATTCAGCGCTTTGGTGCGGTTTTATTGGCTAAA

AAACAGTTCCATTCTTATATGGATTTACTCAAAGCCAATTATGTGGCTTCCAATTT

AACCGAAGTGATGTGTCGCTCGACTATCAGTGTAAATTGGCTGGGAGAATTATTT

GATTGCGATTTCAATCAGCAGCTTGAGATTCCGGTACCAAACAAAGCCCGCCGTC

ATCTACGAGATTTATTAACACAAAATCCTGCAGGTGATGATATTGCCATTGCGGA

CCATTGCTATGGGTGTACGGCAGGACAGGGCAGTAGCTGCGGCGGTATTTTAGAA

GAGTCAGCTATATAGCTTTATTAGAGTAGATTAGATAAAACTGGAATAAATGAGA

TTAGGATAGGCAAAAACCTATCTATCTAAGCGGAGTTACTACCATGTCATTATTC

AATAACTTAATAGTCAAAACGACTATTGCCACCGCTGTTTTGTTATCAAGCGCAG

CCGCCTATGCAGATTTTAATCACAGCAGTTGGGATACGTTGCTAGATAAACATGT

AACCATGACCAATGCTGGCAAAGCGTCTGTAGTTGATTATGTTGGCATGCAGTCA

GATAAAAGTAAATTAGATAGCTATATGGCTGCCACTAGTAAGGTCAGTCAATCTG

AATTTAACGGTTGGAATAAAGATGAGCAGCTAGCCTTTTTAATCAATGTCTATAA

CGCAGGCACGGTGGAGTTGGTGCTCACCAAGTATCCAAATATCAAATCAATTAAA

GATATTGGATCTGTATTAAGCTCACCTTGGAAGCAGAATTTCATTCCACTATTGGG

TAAAACACGCTCGCTAGATGATATTGAACACAATCTGATTCGCGGCTCCAAGCGT

TATAATGACCCGCGTATTCACTTTGCGGTTAATTGTGCCAGCATTGGCTGTCCTGC

GCTCCTAGACGATGCGTTTACTGGAAAGCGCTTAGAGAAGCAGTTAGAGCAAGT

GACCAGTAAGTTTTTGGCAGACAGCAGCCGTAATCGCTTGAAGGGAAATGCGCTT

GAGGTATCACCAATTTTTAAATGGTACAAAGAAGATTTTACGATGGGTTGGCGCG

GTACTAATGACGTTGCAGGATTTTTGGGACGTTATAGTCAAGCATTAGGAATGAA

TAGTACTCAAGTGAAGGCCTTAGAGCAGGGTAAAATAAAAGTCAGTTATACCAA

CTATGATTGGCGGTTGAATAAGAAATAAACTGGGCGTTAATAAAAATGACTGCTG

TGCCAATCACACTCTCTATCGTAATACCGTTATTGAACGAAGCGGATAATTTGCCT

AAATTGATGGGTCATCTTGCTCATCTGAATCCAGCACCTTATCAGGTCATACTAGT

GGATGGCGGTTCAACAGATAACTCAGTTGCCCTTGCCAAGGAACTGATTGAAAGT

TTGATAGATAGCAGTCCATCCGTTATTAGTGTACAGGTTATTGATTGGCAAATAA

PL 211 236 B1

TAGAGTCCGCCGCTGGACGTGCGCTGCAAATGAATGCAGGTGCTGAGCTAGCAAT

GGGTGATGTGTTGTTGTGTTTGCATGCGGATACGCAGCTGCCGAACCACGCTATT

GCTGATATTACGTCAGCCGTCAGGCAAGCCGCGTGGGGGCGTTTTGATGTGCGTT

TGGACAGTTCTGCATGGATGCTCAAGGTAGTCAGCCAGATGATCAATTGGCGTTC

CAGATTAAGTGGGATTGCAACGGGTGATCAAGCGATATTTATCAAAAAACCACTT

TTTAAGCAGCTGGGTGGTTACCCTCAGCAGCCACTTATGGAAGATATTGAACTTT

GCAAACGTCTTAAAGCTATTGGTAAGCCAGCTTGTCTACGAAGCAAGGTGATAAC

TTCGGCACGGCGCTGGCAACAGTATGGAACTTGGCGCACGATAGGTTTGATGTGG

CATCTGCGTTTTGATTACTGGCGCGGTGTCTCTGCTGATAATATTAAGCAGCGTTA

TTATAAGACTTAGTAGCTAACAATTGCCCTTATTAGCAGTAAAGAGTCCTAGAGT

GCGCTCAAACCATTTCAACTTGTAATAATAAAAATTCAAATACTTATGCCAAGAG

ATGCTATGCAAACAGACACGCTTATTATTATCTTCGCTAAGTTCCCCGCTCGTGGT

ATGGCAAAGACACGTTTGCAGCCTGCGCTTGGTCTTGAGGGTGCATCACTTATAG

CAAAACAGCTGTTATTGCATAGCGTTGAGCAGGCACTAGCAACCGGATTGAGCGT

CGAGCTGTGCGTGAGTCCAGCGCCAACTGATTTATGTTGGCAGACGCTTGGTTTA

CCTGAGTCATTGCAGTGGTCAGCGCAAGCAAATGATGACTTAGGCTTACGCATGT

TAGCTGCTAGCCAGCAAGGTTTATACAAATTTAAACAGGTGGTATTGATTGGTAC

GGATTGTCCAAGTTTAACGCCATTACGTATTCAAGATGCAGTGCATCAATTAGAG

CAGTCTGATACGGTCATGATTCCTGCCTCAGATGGTGGTTACGTGCTCCTAGGATT

TAAGCAAGCTGATGCCAGTTTATTTTCGGATATCGAGTGGAGTACTGCCAGCGTA

GCGGCGGTGACTCGACAACGTATTGCAGCATTGGGTTGGACATTGGCGTTATTAG

ACCCACTGCATGACATTGATGAGCCTACAGATTTAAAACATTTGCCCGTAGGTTG

GCTTGAAAAAATAGGCTCTTGATTAGCTGGTTCTTTAAATATGATTCATATTTCTT

ATCTTTAGGATGACTCTGATATAGGGTGCTGAATAAGGTTGATTAAGCCGTTTTAT

TATTAACAAGGAAGTTATTATGCATGAGGTCGTTCAAGATTATTATGGCAAGCAG

CTACAAAGTACTGAGGATTTAAAAACGTCAGCATGCTGTGATATTAGCAATATGC

CAAGTTGGTTAAAGCCTTTGTTAGCGAATATTCATGATGAGGTTCTAAGTCGATA

TTATGGTTGTGGCTTGGTCTGCCCAGCGCTACTTGAAGGCTGCCGTATCCTAGATT

TGGGCTGCGGTTCGGGCCGTGATGTCTATGCATTAGCACAATTGGTTGGACGTAC

AGGTCATGTGGTCGGTGTCGACATGACAGATGAACAACTAGCCATTGCAAAGCA

PL 211 236 B1

GCATCAAAATTATCATGTGGATAAATTTGGCTACGACAATGTGACTTTTCTCAAG

GGCTACATCGAAAAGCTAGATGAGCTCAATTTAGACCCTGATAGCTTCGATATCA

TTGTCTCAAATTGTGTTATTAACCTTTCACCTGATAAAGCAGCGGTGATGGCCAGT gtgcagcgtttgctcaagcctggcggtgagttttatttctctgatgtctatgcaga

CCGCCGTATCCCGCAGCATTTAGTCAATGATCCTGTCCTTTATGGAGAGTGTTTAA

GTGGTGCCTTATACTGGAAGGATTTTGAGCGCTTAGCGCGACATGCTGATTTTTTA

GACCCGCGTTTGGTTGAAGATCGTCCGCTTGAAATCACCGATCCGCTACTTGCTG

CTAAGATTGGCGATATTCAGTTTTTTTCCGCTACTTATCGATTATTCAAGATTGCC

ACGCTGGAAGATGCTTGTGAAGACCACGGTCAAGCAGTCATTTATCACGGAACCA

TTGACCAGCTACCGCATCATTTTAATTTAGATAAACATCATACGATTGAGACAGG

CCGCGTTTTCCCTGTCTGTGGTAATACTTTTCGTATGCTAAAAGAGTCACGCTTTG

CTAAGCATTTTGATTTTATTGGCGATGATAGTCGCCACTATGGTATTTTTGCAGGT

TGTGGTGATATCCTACCGTTTGGTCATCAAGCGGACATAGTGTCTGGGCCGTTTGT

TAATTCAGGAAGCTGTTGCTAACAGTAAGACCTGTATGATGTTGAAAAAGCTATC

TCTCCAAAAAGCTGGCTGCCAAAAATAAAAGTGGTCCTCAAACTATTTGAGGGCC

TCTTTTATATGAAAAAACATTATAAATGTCTAAGGTTTTAACCTCTACGGAAGTA

ATGCTGCAAGTCTTGTCTTAGTCTCTGCGCTCATCGCTTCAACAGGCGTGACTAAT

GCTTGGGTCAAAGCAGTATGAGCGATTGATTTCGGCTGTTCGGATGCAATTAATG

CCACAGCTTGCTTAATGACTTGCTGCGCGTTGTCTGCATTTTTCATTAGATTTTGT

ATGGCATAATCTGCACTGACGGCTTGCTCATTTGGATGCCAACAATCAAAATCTG

TCACTAGCGCTAACGTTGCATAGGCGATACTGGCTTCGCGAGCGAGTTTAGCTTC

TGGCATATTGGTCATGCCGATAATATCCGCTTGCATCTGCCGATACCAGTGTGATT

CTGCGCGAGTTGAAAACTGAGGTCCTTCGATACAGACATAGGTGGCTTTTGCGTG

GCACTGCCCATCGGCAATATCCGCGTTGTCATAAGCTCGAATCAAGATGTCTGCT

ACTTCAGGGCATAAAGGGTCAGCCATTGACACATGGGCGACCGCACCATCTCCAA

AGAACGTGCTTACTCTCTGCTTGGTCATATCAATCATTTGATCGGGGATGACCATA

TCTAGTGGTTTCAGCGTTTCTTGCAATGAGCCAACCGCTGATACTGAGACGATAT

AGCGTACGCCTAAAGTCTTTAAGGCATAGATGTTGGCACGATAAGGCACCTCAGA

GGGGGTTAACCTGTGTCCTTGACCATGTCGCGTTAAGAATGCAACTGTGACGCCA

TTAAGTTCACCGAGCACGATGTCATCAGATGGCTCACCATAGGGTGTCTCAATTT

PL 211 236 B1

TAACGCTGCGCTTATTGGTCAAAGCTTGCATTTGATACAGACCGCTACCGCCGAT

AATAGCGATATCGGCAGCGTTTTTTACCGTAATTTCTACTGCGGTTGAAGTCATAT

TGGGCTCCAAATGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAAT

CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAAC

ATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAA

CTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTG

CCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGG

GCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGC

GAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGG

ATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGT

AAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATC

ACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGAT

ACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCG

CTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAG

CTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG

TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTT

GAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAAC

AGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGG

CCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGC

CAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGC

TGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGA

TCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAA

ACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGAT

CCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACT

TGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCT

ATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGG

AGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACC

GGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAG

TGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTA

GAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGG

PL 211 236 B1

CATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAAC

GATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTT

CGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTT

ATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGT

GACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGT

TGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAA

AAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACC

GCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCA

TCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCG

CAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTT

TCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTG

AATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGT

GCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGG

CGTATCACGAGGCCCTTTCGTC

SEQ No.:10

CTAGAGGATCATTTGGAGCCCAATATGACTTCAACCGCAGTAGAAATTACGGTAA

AAAACGCTGCCGATATCGCTATTATCGGCGGTAGCGGTCTGTATCAAATGCAAGC

TTTGACCAATAAGCGCAGCGTTAAAATTGAGACACCCTATGGTGAGCCATCTGAT

GACATCGTGCTCGGTGAACTTAATGGCGTCACAGTTGCATTCTTAACGCGACATG

GTCAAGGACACAGGTTAACCCCCTCTGAGGTGCCTTATCGTGCCAACATCTATGC

CTTAAAGACTTTAGGCGTACGCTATATCGTCTCAGTATCAGCGGTTGGCTCATTGC

AAGAAACGCTGAAACCACTAGATATGGTCATCCCCGATCAAATGATTGATATGAC

CAAGCAGAGAGTAAGCACGTTCTTTGGAGATGGTGCGGTCGCCCATGTGTCAATG

GCTGACCCTTTATGCCCTGAAGTAGCAGACATCTTGATTCGAGCTTATGACAACG

CGGATATTGCCGATGGGCAGTGCCACGCAAAAGCCACCTATGTCTGTATCGAAGG

ACCTCAGTTTTCAACTCGCGCAGAATCACACTGGTATCGGCAGATGCAAGCGGAT

ATTATCGGCATGACCAATATGCCAGAAGCTAAACTCGCTCGCGAAGCCAGTATCG

CCTATGCAACGTTAGCGCTAGTGACAGATTTTGATTGTTGGCATCCAAATGAGCA

AGCCGTCAGTGCAGATTATGCCATACAAAATCTAATGAAAAATGCAGACAACGC

PL 211 236 B1

GCAGCAAGTCATTAAGCAAGCTGTGGCATTAATTGCATCCGAACAGCCGAAATCA

ATCGCTCATACTGCTTTGACCCAAGCATTAGTCACGCCTGTTGAAGCGATGAGCG

CAGAGACTAAGACAAGACTTGCAGCATTACTTCCGTAGGATCCCCGGGTACCGAG

CTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTT

ACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCG

AAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATG

GCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATAT

GGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACA

CCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCT

TACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGT

CATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGT

TAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAAT

GTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCT

CATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTAT

GAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCC

TGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTG

GGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGA

GTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGT

GGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATAC

ACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTAC

GGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAA

CACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCT

TTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGC

TGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGG

CAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCA

ACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCG

GCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGT

CTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGT

TATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGC

TGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCA

PL 211 236 B1

TATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAA

GATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACT

GAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCT

GCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGT

TTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAG

CGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAA

GAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTG

CTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACC

GGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTT

GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAG

CGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGT

CGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTA

TAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGT

CAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCT

GGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGT

GGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACG

ACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAA

ACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTT

CCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACT

CATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAAT

TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAA

GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACT

PL 211 236 B1

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Gen markerowy mod-rsfp, znamienny tym, że posiada sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:1.
2. 2. Białko MOD-RSFP będące produktem ekspresji genu mod-rsfp, znamienne tym, że posiada sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:2.
3. 3. Gen markerowy rsfp, znamienny tym, że posiada sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:7.
4. 4. Białko RSFP będące produktem ekspresji genu rsfp, znamienne tym, że posiada sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:8.
5. 5. Insert DNA MetaGenom-p23 plazmidu bibliotecznego p23, znamienny tym, że posiada sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:5.
6. 6. Plazmid p23 zawierający sekwencję DNA MetaGenom-p23, gen oporności na ampicylinę (bla), origin replikacji rep(pMB1) oraz gen rsfp, znamienny tym, że posiada sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:9.
7. 7. Sekwencja oligonukleotydu służącego do otrzymywania sekwencji DNA kodującej białko MOD-RSFP jak zdefiniowano w zastrz. 1, znamienna tym, że posiada sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:3.
8. 8. Sekwencja oligonukleotydu służącego do otrzymywania sekwencji DNA kodującej białko MOD-RSFP jak zdefiniowano w zastrz. 1, znamienna tym, że posiada sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:4.
9. 9. Produkt PCR otrzymany z wykorzystaniem sekwencji oligonukleotydów jak zdefiniowano w zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że posiada sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:6.
10. 10. Plazmid pSec zawierający: sekwencję DNA insert-p23, gen oporności na ampicylinę (bla), origin replikacji rep(pMB1) oraz gen mod-rsfp, znamienny tym, że posiada sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:10.

    PL 211 236 B1

    Rysunki

    AACAATTTCA CACAGGAAAC AGCTATGACC ATCiTTŁCGC CAAGCTTGCA TGCCTGCAGG TCGACTCTAG K-GATCATTT GGAGCCC&AT ATGACTTCAA TTGTTAAAGT GTGTCCTTTG TCGATACTGG TACTAATGCG GTTCGAACGT ACGGACGTCC AGCTGAGATC TCCTAGTAAA CCTCGGGTTA TACTGAAGTT

    GTAAATATTA CAAAAAAGTA TATTTTCTCC GGGAGTTTAT CAAACTCCTG GTGAAAATAA AAACCGTCGG TCGAAAAACC TCTCTATCGA A.