PL240801B1 - Polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza bakteryjnego oraz białko bakteriofaga TP-84 i jego zastosowanie - Google Patents
Polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza bakteryjnego oraz białko bakteriofaga TP-84 i jego zastosowanie Download PDFInfo
- Publication number
- PL240801B1 PL240801B1 PL418712A PL41871216A PL240801B1 PL 240801 B1 PL240801 B1 PL 240801B1 PL 418712 A PL418712 A PL 418712A PL 41871216 A PL41871216 A PL 41871216A PL 240801 B1 PL240801 B1 PL 240801B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- protein
- dna
- bacteriophage
- pcr
- lane
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 154
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 107
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title claims description 71
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims description 25
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims description 25
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims description 25
- 241000366466 Phage TP-84 Species 0.000 title claims description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 84
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 13
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims description 9
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 4
- 101100002068 Bacillus subtilis (strain 168) araR gene Proteins 0.000 claims description 3
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 claims description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 claims description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 3
- 101150044616 araC gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 85
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 24
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 10
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 10
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 102000003844 DNA helicases Human genes 0.000 description 6
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 108090000133 DNA helicases Proteins 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 3
- 101710116602 DNA-Binding protein G5P Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 101710162453 Replication factor A Proteins 0.000 description 3
- 101710176758 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit Proteins 0.000 description 3
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 description 3
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 description 3
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000001066 phage therapy Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 101710179497 DNA replication helicase Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710094581 Distal tail protein Proteins 0.000 description 2
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229910001428 transition metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 used as vaccines Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150015935 ATP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710183434 ATPase Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000870242 Bacillus phage Nf Tail knob protein gp9 Proteins 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 101710158030 Endonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000626621 Geobacillus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229940121759 Helicase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010014594 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Proteins 0.000 description 1
- 101700012268 Holin Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 229910021577 Iron(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710196756 Protein 33K Proteins 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 101710175389 Terminase, small subunit Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000005497 Thymidylate Synthase Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 108010021083 hen egg lysozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L iron dichloride Chemical compound Cl[Fe]Cl NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
PL 240 801 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza bakteryjnego oraz białko bakteriofaga TP-84 i jego zastosowanie.
Bakteriofag TP-84 infekuje niektóre gatunki termofilne bakterii Bacillus (nowa nomenklatura: Geobacillus). Polinukleotydy według wynalazku mogą być stosowane do modyfikacji genetycznych genomu TP-84, polegających w szczególności na klonowaniu, ekspresji lub modyfikacji genów TP-84, zwłaszcza mających zastosowanie w technologiach biologii i biotechnologii molekularnej, medycynie oraz przemyśle. Termofilne geny bakteriofagowe, kodujące białka kapsydu mogą znaleźć zastosowanie do konstrukcji systemów phage display’, a geny kodujące helikazy lub białka wiążące DNA mogą służyć do usprawnienia reakcji powielania kwasów nukleinowych, konstrukcji szczepionek, adjuwantów, biosensorów, systemów wychwytu jonów metali lub terapii fagowej. Ponadto ujawniono sposób uzyskiwania klonów wspomnianych białek oraz wektory DNA do realizacji tego sposobu.
Saunders i Campbell, Biochemistry 4:2836-2844 (1965) ujawniają charakterystykę DNA bakteriofaga TP-84, infekującego bakterię Bacillus stearothermophilus szczep 10. DNA kodujące genom bakteriofaga ma długość 13,6 μm, masę cząsteczkową 22,4-22,6 mln Da i zawiera 42% par GC.
Saunders i Campbell, Journal of Bacteriology 91:340-348 (1966) ujawniają odkrycie i charakterystykę termofilnego bakteriofaga TP-84, infekującego bakterię Bacillus stearothermophilus szczep 10. Ujawniono, że TP-84 jest bakteriofagiem litycznym dla 3 spośród 24 testowanych szczepów Bacillus stearothermophilus w zakresie temperatur 43°C do 76°C, wykazujących czas eklipsy 22 do 24 minut. Ujawniono, że kasyd TP-84 zawiera wielościenną (heksagonalną) główkę o wymiarach 53 χ 30 nm oraz ogonek o długości 130 nm i 3-5 nm szerokości. Ujawniono, że całkowita masa cząsteczkowa TP-84 wynosi ok. 50 mln Daltonów oraz jego genom zawiera 42% par zasad GC.
Egbert i Mitchell, Journal of Virology 1:610-616 (1967) ujawnili odkrycie i charakterystykę termofilnego bakteriofaga Τφ3 infekującego Bacillus stearothermophilus ATCC8005 w temperaturze 60°C. Bakteriofag ten wykazuje termostabilność w zakresie temperatur do 75°C.
Bassel i współpracownicy Journal of Virology 7:663-672 (1971) ujawnili wrażliwość bakteriofaga TP-84 na dysocjację pod wpływem czynników chelatujących, w szczególności EDTA oraz fosforany, oraz powstałe w wyniku dysocjacji substruktury bakteriofagowe: główki, ogonki, wolne DNA i cienie bakteriofagowe.
Epstein i Campbell, Applied Microbiology 29:219-223 (1975) ujawniają sposób wydajnej produkcji i oczyszczanie termofilnego bakteriofaga TP-84. Ujawniono warunki hodowli gospodarza bakteryjnego oraz infekcji bakteriofagiem, pozwalające na uzyskanie miana bakteriofagów 5 χ 1011/ml, polegające na zastosowaniu wzbogaconego składu pożywki, zapobiegającego produkcji przetrwalników, pH 6,5, temperatury 58°C oraz dodatku chlorku magnezu i prowadzeniu procesu w fermentorze stosując środowisko aerobowe. Ujawniono sposób oczyszczania bakteriofaga TP-84, polegający na precypitacji glikolem polietylenowym oraz ultrawirowaniem w gradiencie chlorku cezu.
Sharpy i współpracownicy, Journal of General Microbiology 132:1709-1722 (1986) ujawniają izolowanie i charakterystykę 24 bakteriofagów, infekujących obligatoryjnie termofilne szczepy bakterii Bacillus, izolowane z różnorodnych źródeł: m.in. kompostu, gleby, gnijącego siana. Ujawniono powszechność infekcyjności bakterii Bacillus przez bakteriofagi, o różnorodnych rozmiarach, morfologii i biochemii: od cylindrycznych do wielościennych z ogonkiem długości 15-500 nm, a ich genomowe DNA wykazywało różnice wielkości fragmentów podczas analizy restrykcyjnej. Ujawniono, że większość bakteriofagów była stabilna w temperaturze 50°C przez 4-5 godzin, natomiast w temperaturze 70°C w ciągu 2 godzin miana bakteriofagów obniżały się 102-107-krotnie.
Blanc i współpracownicy, Int J Syst Bacteriol. 47:1246-1248 (1997) ujawniają metodę identyfikacji heterotroficznych, termofilnych, tworzących przetrwalniki bakterii, izolowanych z kompostu. Ujawniają sposób profilowania analizą restrykcyjną fragmentów DNA genomowego, kodującego 16S rDNA, powielonego metodą Polymerase Chain Reaction (PCR), pozwalający na określenie i różnicowanie gatunków i szczepów bakterii Bacillus sp. Ujawniono wyniki analiz powielenia i sekwencjonowania 1409 par zasad, kodujących 16S rDNA bakteriofaga TP-84 i zdeponowano je w GeneBank pod numerem dostępu AJ002154.
Golec i współpracownicy, Journal of Microbiological Methods 84:486-489 (2011) ujawniają metodę przechowywania bakteriofagów. Przedstawiony sposób jest uniwersalny i pozwala na długoterminowe przechowywanie bakteriofagów w postaci zainfekowanych komórek bakteryjnych, zamrożo
PL 240 801 B1 nych w temperaturze -80°C. W tych warunkach utrata żywotności komórek bakteryjnych jest niewielka, a przeżywalność znajdujących się wewnątrz komórek bakteriofagów wysoka.
Lee i współpracownicy, International Journal of Nanomedicine 8:3917-3925 (2013) ujawniają w pracy przeglądowej rozwinięcia technologii phage display’ w kierunku konstrukcji biosensorów, opartych na zabiegach inżynierii genetycznej, przeprowadzonych na genomach bakteriofagów.
Pouyanfard i współpracownicy, PLOS One 7:e49539 (2012) ujawniają konstrukcję zmodyfikowanego genetycznie bakteriofaga T7, eksponującego w systemie phage display’ immunodominujące epitopy pochodzące ze szczurzej onkoproteiny HER2/neu. Ujawniono, że tak skonstruowana chimeryczna nanocząstka bakteriofaga T7 wykazuje wysoką immunogenność w modelowych liniach myszy BALB/c, wykazując działanie przeciwnowotworowe zarówno profilaktyczne jak i terapeutyczne, tym samym stanowiąc prototyp szczepionki przeciwnowotworowej.
Nadal problemem jest łatwe uzyskiwanie użytecznych praktycznie konstruktów genetycznych, opartych na genach termofilnych bakteriofagów, w szczególności bakteriofaga TP-84.
Celem wynalazku jest rozwiązanie tego problemu i zaproponowanie sposobu, który pozwalałby na łatwe uzyskiwanie tego typu konstruktów. W szczególności, celem wynalazku jest dostarczenie konstruktów typu phage display’, eksponujących na powierzchni kapsydu polipeptydy i białka naturalne oraz uzyskane w wyniku zabiegów inżynierii genetycznej, przykładowo - sztuczne białka poliepitopowe. Konstrukty takie mogą tworzyć nanocząstki biologiczne, stosowane jako szczepionki, adjuwanty, biosensory, układy wychwytu jonów metali, elementy terapii fagowej. Kolejnym celem wynalazku są klonowane i eksprymowane geny, kodujące białka użyteczne w biologii i biotechnologii molekularnej, medycynie i przemyśle, w szczególności helikazy i białka wiążące DNA, usprawniające reakcje powielania kwasów nukleinowych.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA posiadający sekwencję nukleotydową o numerze 2.
Przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd kodujący gen rekombinantowy składający się z polinukleotydu kodującego białko bakteriofaga TP-84 określone powyżej oraz polinukleotydu kodującego sześć reszt histydyny, korzystnie posiadający sekwencję nukleotydową o numerze 4.
Przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera origin replikacji, korzystnie pBR322 ori, gen oporności na antybiotyk, korzystnie ampicylinę, promotor transkrypcji, korzystnie BAD operonu arabinozowego, gen represora, korzystnie araC, sygnał inicjacji translacji, sekwencję kodującą sygnał stopu translacji oraz połączony z nimi operacyjnie polinukleotyd kodujący białko określony powyżej.
Korzystnie, wektor ekspresyjny według wynalazku posiada sekwencję o numerze 6.
Przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza bakteryjnego, zwłaszcza Escherichia coli, transformowana wektorem ekspresyjnym określonym powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA kodowane przez polinukleotyd określony powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA posiadające sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji o numerach: 3 lub 5.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka bakteriofaga TP-84 posiadającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji o numerach: 3 lub 5 do przeprowadzenia in vitro manipulacji DNA obejmującej wiązanie dwuniciowego DNA i rozplatanie helisy DNA.
Szczegółowy opis wynalazku
Ujawniono polinukleotyd kodujący element funkcjonalny pochodzący z genomu bakteriofaga TP-84. Jako element funkcjonalny należy rozumieć polinukleotyd posiadający sekwencję DNA pochodzącą z genomu bakteriofaga TP-84, który może znaleźć praktyczne zastosowanie, przykładowo w wytwarzaniu termofilnych systemów phage display’, zmodyfikowanych nanocząstek biologicznych, szczepionek, adjuwantów, biosensorów, terapeutyków bakteriofagowych. W szczególności takim elementem funkcjonalnym może być polinukleotyd kodujący pełen genom bakteriofaga TP-84 lub polinukleotyd kodujący jej dowolny fragment funkcjonalny, w szczególności taki jak: promotor, terminator lub otwarta ramka odczytu kodująca białko. Fragmenty funkcjonalne zidentyfikowane w genomie bakteriofaga TP-84 zostały wskazane na Fig. 2.
PL 240 801 B1
Mogą one znaleźć szereg praktycznych zastosowań. W szczególności mogą być one użyteczne w produkcji termofilnych genów bakteriofagowych, zwłaszcza kodujących białka kapsydu, które nadają się do konstrukcji systemów phage display’, a także innych białek fagowych, przykładowo helikaz lub białek wiążących DNA.
Korzystnie polinukleotyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że koduje białko bakteriofaga TP-84, przy czym stanowi on polinukleotyd o sekwencji o numerze 2.
Ujawniono polinukleotyd kodujący gen rekombinantowy składający się z polinukleotydu kodującego białko bakteriofaga TP-84 zdefiniowanego powyżej oraz sekwencji kodującej sześć reszt histydyny, korzystnie posiadający sekwencję wybraną spośród sekwencji o numerach 4 lub 9.
Białka fagowe mogą być wykorzystane między innymi do usprawnienia reakcji powielania kwasów nukleinowych, produkcji szczepionek, adjuwantów, biosensorów, systemów wychwytu jonów metali lub stosowania w terapii fagowej.
Przykładowe realizacje stanowią polinukleotyd posiadający sekwencję genu rekombinantowego kodującego białko TP84_31, o aktywności enzymatycznej helikazy DNA oraz sekwencja aminokwasowa białka TP84_31. W korzystnym wariancie, ww. sekwencje są połączone z sekwencją nukleotydową kodującą znacznik sześciu reszt histydyny, prowadzącą do biosyntezy fuzyjnego białka TP84_31-His6, ułatwiającego izolowanie produkowanego białka metodą chromatografii metalopowinowactwa.
Ujawniono również wektor ekspresyjny charakteryzujący się tym, że zawiera origin replikacji, korzystnie pBR322 ori, gen oporności na antybiotyk, korzystnie ampicylinę, promotor transkrypcji, korzystnie BAD operonu arabinozowego, gen represora, korzystnie araC, sygnał inicjacji translacji, sekwencję kodującą sygnał stopu translacji oraz połączony z nimi operacyjnie polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 lub białko fuzyjne, który został zdefiniowany powyżej.
Korzystnie, wektor ekspresyjny posiada sekwencję o numerze 6.
Przykładowymi realizacjami tego aspektu są wektory DNA, zawierające sklonowane geny bakteriofaga TP-84 (TP84_31), kodujące helikazę DNA lub białko wiążące DNA (TP84-35) w układzie ekspresyjnym bakterii Escherichia coli nadające się do ekspresji i izolowania tych białek z bakterii.
Ujawniona została również komórka gospodarza bakteryjnego, zwłaszcza Escherichia coli, transformowana wektorem ekspresyjnym opisanym powyżej.
Przykładowy sposób uzyskiwania rekombinantowego, fuzyjnego białka TP84_31 -His6 (ssb) charakteryzuje się tym, że połączony z białkiem znacznik sześciu reszt histydyny jest wykorzystany do izolowania białka metodą metalopowinowactwa.
Przykładowy sposób uzyskiwania rekombinantowego, fuzyjnego białka TP84_35-His6 charakteryzuje się tym, że połączony z białkiem znacznik sześciu reszt histydyny jest wykorzystany do izolowania białka metodą metalopowinowactwa.
Ujawniono również białko bakteriofaga TP-84 lub jego pochodną kodowane przez polinukleotyd opisany powyżej. Ujawnione białko bakteriofaga TP-84 lub jego pochodna posiadają sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji o numerach: 3 i 5.
Uzyskiwane zgodnie z wynalazkiem białka fagowe lub ich pochodne (np. białka fuzyjne z sekwencjami ułatwiającymi ich oczyszczanie), w szczególności białka TP84_31-His6 oraz TP84_35-His6 mogą być wykorzystane do usprawnienia metod biologii molekularnej, biotechnologii molekularnej, medycyny oraz przemysłu, korzystnie metod manipulacji DNA, w szczególności powielania kwasów nukleinowych.
Niniejszy opis został również wzbogacony o opisane poniżej przykłady wykonania, nie powinny być one jednak utożsamiane z pełnym zakresem wynalazku, który został omówiony powyżej oraz zdefiniowany w załączonych zastrzeżeniach patentowych.
P r z y k ł a d 1. Namnażanie termofilnego bakteriofaga TP-84 w bakteriach Bacillus stearothermophilus szczep 10.
W przykładowej realizacji namnożono bakterie Bacillus stearothermophilus szczep 10, korzystnie będący jednym z możliwych gospodarzy dla bakteriofaga TP-84. Do hodowli gospodarza Bacillus stearothermophilus szczep 10 oraz infekcji i namnażania bakteriofaga TP-84 stosowano pożywkę T, zawierającą na 1 L pożywki: 20 g Trypticase™, 3 g ekstraktu drożdżowego, 1,47 g CaC^2H2O, 7 mg FeCl2^6H2O, 15 mg MgSO^7H2O, 1 mg MnCl24H2O, pH 7,4. Do przygotowania inoculum bakteryjnego pożywkę T zestalano poprzez dodanie i rozpuszczenie 2% agaru oraz przygotowanie płytek Petriego, zawierających 30 ml zestalonej pożywki T, inkubowane z wysianymi bakteriami w temperaturze
PL 240 801 B1
55°C przez 18-48 godzin. Pobierano pojedyncze kolonie Bacillus stearothermophilus szczep 10 w celu namnożenia w płynnej pożywce T. Kultury bakteryjne inkubowano w temperaturze 65°C, stosując intensywne napowietrzanie poprzez wytrząsanie w inkubatorze-wytrząsarce. Do przygotowania inoculum bakteriofaga TP-84 pożywkę T zestalano poprzez dodanie i rozpuszczenie 2% agaru oraz przygotowanie płytek Petriego, zawierających 30 ml zestalonej pożywki T. Następnie przygotowano 2,5 ml pożywki T, do której dodano i rozpuszczono 0,65% agaru, chłodzono do 60°C, dodano 0,3 ml zawiesiny bakterii Bacillus stearothermophilus szczep 10, znajdujących się w fazie logarytmicznego wzrostu oraz 0,1 ml zawiesiny bakteriofaga TP-84, inkubowano 10 min w temperaturze 55°C i wylewano jako warstwę górną na płytki Petriego, zawierające 30 ml zestalonej pożywki T. Po zestaleniu warstwy górnej płytki inkubowano w temperaturze 55°C przez 12-20 godzin. W celu hodowli bakteriofaga TP-84 w skali preparatywnej, przygotowano 5 kultur Bacillus stearothermophilus szczep 10, zaszczepiając porcje po 1 L pożywki T za pomocą 1 ml hodowli bakterii, znajdującej się w logarytmicznej fazie wzrostu. Hodowle intensywne napowietrzano poprzez wytrząsanie w inkubatorze-wytrząsarce w temperaturze 65°C, aż do osiągnięcia miana populacji bakteryjnej ok. 5 χ 108 komórek w 1 ml. Bakterie infekowano lizatem bakteriofaga TP-84, stosując wielokrotność infekcji (MOI) 0,1 oraz dodano roztworu glukozy do stężenia 0,5%. Kontynuowano napowietrzanie przez 3-4 godziny, aż do osiągnięcia lizy komórek i przejaśnienia hodowli. Uzyskane lizaty bakteriofagowe typowo charakteryzowały się mianem bakteriofagów ok. 1011 PFU (jednostek formowania łysinek fagowych).
P r z y k ł a d 2. Oczyszczanie bakteriofaga TP-84 oraz izolowanie genomowego DNA TP-84.
W przykładowej realizacji namnożone bakteriofagi TP-84 jak wskazano w Przykładzie 1, poddano oczyszczeniu od pozostałości zlizowanych i całych komórek gospodarza Bacillus stearothermophilus szczep 10, stosując wieloetapową procedurę: (i) lizat bakteriofaga poddano różnicowemu wirowaniu w wirówce preparatywnej, rotorze kątowym stosując przyśpieszenie 16 000 g przez 15 min. Supernatant, zawierający bakteriofagi TP-84 dekantowano znad debris bakteryjnego; (ii) celem usunięcia bakteryjnego DNA i RNA z lizatu, dodawano DNazę I do stężenia 10 ug/ml i RNazę A do stężenia 1 ug/ml, a następnie inkubowano przez 30 min w temperaturze 37°C; (iii) bakteriofagi precypitowano za pomocą (NH4)2SO4, stopniowo dodanego w ilości 30 g/1 L lizatu bakteriofagowego oraz inkubowano przez 18 godzin w temperaturze 4°C. Precypitat bakteriofagowy odwirowywano w wirówce w rotorze kątowym, stosując przyśpieszenie 12 000 g przez 15 minut w temperaturze 4°C, supernatant odrzucano, bakteriofagi TP-84 zawieszano w wodzie destylowanej, dializowano przez 18 godzin wobec wody destylowanej oraz odwirowywano w wirówce w rotorze kątowym, stosując przyśpieszenie 16 000 g przez 10 minut, osad odrzucono; (iv) supernatant wirowano stosując przyśpieszenie 27 000 g przez 2 godziny, supernatant odrzucono, osad zawieszono w buforze: 15 mM cytrynian trójsodowy pH 7,0; 0,15 M NaCI; (v) do zawiesiny bakteriofaga TP-84 dodawano CsCI do osiągnięcia gęstości roztworu 1,51 g/cm3 oraz ultrawirowano w rotorze SW-39 przy przyśpieszeniu 30 000 g przez 24 godziny. Białe pasmo w gradiencie CsCI, zawierające stężoną zawiesinę bakteriofaga TP-84 wybierano poprzez igłę strzykawki, przebijając ściankę probówki. Zawiesinę bakteriofaga dializowano wobec roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,5 M NaCI, 10 mM MgCl2 i przechowywano w 4°C lub po dodaniu glicerolu do 20% w temperaturze -80°C.
DNA bakteriofaga TP-84 izolowano po dodaniu EDTA do stężenia 50 mM za pomocą 3-krotnej ekstrakcji fenolem, nasyconym 20 mM buforem fosforanowym pH 7,0 i 2-krotnej ekstrakcji chloroformem. DNA precypitowano 2-ma objętościami alkoholu etylowego w obecności 0,3 M octanu sodu o pH 7,0, odwirowano, przemywano osad DNA 70% alkoholem etylowym, suszono i rozpuszczano w buforze TE o składzie: 10 mM Tris-HCI pH 8,0, 1 mM EDTA.
P r z y k ł a d 3. Sekwencjonowanie genomu i analiza bioinformatyczna genomu bakteriofaga TP-84.
W przykładowej realizacji, izolowane i oczyszczone DNA bakteriofaga TP-84 uzyskane jak wskazano w Przykładzie 2 poddano sekwencjonowaniu genomowego, korzystnie przy użyciu technologii Next Generation Sequencing (NGS) na Sekwenatorze Genomowym HiSeq 2000 firmy Illumina w trybie PE250. Wykonano bibliotekę genomową z krótkimi wstawkami 100-600 par zasad, otrzymane odczyty składano i analizowano programami: CutAdapt, CLCGenomicWorkbench i PROKKA. Uzyskano 140683713 nukleotydów, 626934 sekwencji w parach, ostateczna złożona sekwencja stanowiła pojedynczy, liniowy segment dwuniciowego DNA o długości 47703 par zasad (Sek. 1). Uzyskaną sekwencję poddano dalszej analizie bioinformatycznej, korzystnie przy użyciu specjalistycznego oprogramowania: MyRAST, Kodon, BLASTP and SnapGene oraz korekcie wizualnej.
PL 240 801 B1
Fig. 1 przedstawia mapę całego genomu bakteriofaga TP-84 z uwidocznionymi Otwartymi Ramami Odczytu (ORF) z przypisanymi indywidualnymi nazwami genów, unikatowymi sekwencjami rozpoznawanymi przez endonukleazy restrykcyjne, rejonami promotorów inicjacji transkrypcji (oznaczonymi jako ‘promoter’), hipotetycznymi rejonami regulatorowymi (oznaczonymi jako ODD’, ‘regulatory ODD’, ‘miscaleneous’ i ‘regulatory region’) oraz rejonami regulacji inicjacji translacji - sekwencji wiązania rybosomów (oznaczonymi jako ‘RBS’). Fig. 2 przedstawia pełną sekwencję dwuniciowego DNA, kodującego genom bakteriofaga TP-84 wraz z zaznaczonymi sekwencjami nukleotydowymi Otwartych Ram Odczytu (ORF) z przypisanymi indywidualnymi nazwami genów, promotorów transkrypcji, hipotetycznymi rejonami regulatorowymi oraz rejonami inicjacji translacji RBS. Fig. 3 przedstawia tabelę zawierającą listę Otwartych Ram Odczytu, kodujących hipotetyczne białka wraz z ich podstawowymi właściwościami, ustalonymi na podstawie analizy bioinformatycznej. Wyniki zaprezentowane na Fig. 1, 2, 3 oraz Sek. 1 ujawniają, że genom posiada 85 Otwartych Ram Odczytu (ORF), kodujących hipot etyczne białka bakteriofaga TP-84. Znamienne jest, że niemal wszystkie - 83 (Fig. 1, 2, 3), są skierowane w tym samym kierunku, zgodnym z kierunkiem arbitralnie ustalonej nici górnej DNA genomu, co prowadzi do wniosku, że również dominujący przebieg transkrypcji zachodzi w tym samym kierunku. Tym samym jedna z nici DNA genomu bakteriofaga jest silnie dominująca pod względem kodowania produktów mRNA i białek, jak wskazano w Fig. 1, 2, 3. W kierunku przeciwnym skierowane są jedynie 2 niewielkie Otwarte Ramy Odczytu (ORF): TP84_22 (204 pary zasad) i TP84_54 (264 pary zasad), potencjalnie kodujące polipeptydy o nieustalonej funkcji. Znamiennym również jest, że informacja genetyczna jest wysoce skondensowana, Otwarte Ramy Odczytu (ORF) są położone bardzo blisko siebie, a w szeregu wypadkach są wzajemnie zachodzącą. Właściwość ta służy typowo konserwacji kodującej przestrzeni w obrębie genomu, który ma ograniczoną wielkość ze względu na pojemność kapsydu bakteriofaga. Wśród wykrytych Otwartych Ram Odczytu (ORF), większość (54), koduje hipotetyczne białka o nieustalonej funkcji, wśród których mogą znajdować się białka o użytecznych właściwościach. Wśród kodowanych białek o funkcji przypisanej na podstawie homologii do sekwencji białek umieszczonych w publicznych bazach danych znajduje się m.in. (Fig. 3): 5 hipotetycznych białek membranowych (TP84_01, TP84_18, TP84_37, TP84_64, Tp84_84) (Fig. 3); 12 hipotetycznych białek replikacji, rekombinacji, regulacji i metabolizmu DNA (TP84_24 - regulator transkrypcji,
TP84_25 - białko RecB-podobne, TP84_26 - białko wspomagające hybrydyzację jednoniciowego DNA, TP84_30 - inhibitor replikacyjnej helikazy DNA, TP84_31 - replikacyjna helikaza DNA,
TP84_33 - HNH endonukleaza typu hom/ng’, TP84_35 - białko wiążące jednoniciowe DNA (single-stranded binding protein, ssb), TP84_40 syntetaza tymidylanowa, TP84_41 - dUTP difosfataza,
TP84_44 - RecU białko rekombinacyjne, TP-84_56 - terminaza, mała podjednostka, TP84_57 - terminaza, duża podjednostka) (Fig. 3); 9 hipotetycznych białek zaangażowanych w budowę otoczki białkowej (kapsydu) bakteriofaga (TP84_61 - białko strukturalne kapsydu, TP_63 - mniejsze białko kapsydu, TP84_65 - proteaza dojrzewania pro-głowy kapsydu, TP84_67 - główne białko kapsydu, TP84_72 - białko składania ogonka, TP84_76 - białko mierzące długość ogonka, TP84_77 - dystalne białko ogonka, TP84_78 - białko ogonka, TP84_80 - dystalne białko ogonka; 1 hipotetyczna glikozylaza zaangażowana w proces sporulacji (TP84_81); 2 hipotetyczne białka lizy ściany i błony komórkowej (TP84_82 - holina, TP84_83 - endolizyna). Ww. grupy białek mogą zostać rozszerzone o niektóre z pozostałych hipotetycznych białek o w tej chwili nieustalonej funkcji. Białka bakteriofaga TP-84 mogą znaleźć szereg zastosowań praktycznych, m.in. do: usprawnienia metod powielania kwasów nukleinowych, klonowania, diagnostyki molekularnej (korzystnie spośród hipotetycznych białek replikacji, rekombinacji, regulacji i metabolizmu DNA), tworzenia systemu phage display’, szczepionek, adjuwantów, prezentacji bio- i chemaktywnych motywów aminokwasowych (korzystnie spośród hipotetycznych białek zaangażowanych w budowę otoczki białkowej), dezintegracji komórek bakteryjnych (korzystnie spośród hipotetycznych białek lizy ściany i błony komórkowej).
P r z y k ł a d 4. Klonowanie molekularne genu TP84_31, kodującego helikazę DNA bakteriofaga TP-84.
W przykładowej realizacji wykorzystania sekwencji nukleotydowej genomu bakteriofaga TP-84 (Sekw. 1) jak wskazano w przykładach 1,2 i 3 powielono w reakcji Polymerase Chain Reaction (PCR) korzystnie gen TP84_31 o długości 564 par zasad, kodujący replikacyjną helikazę DNA, składającą się z łańcucha polipeptydowego o długości 187 aminokwasów, o masie cząsteczkowej 21,7 kDa i teoretycznym punkcie izoelektrycznym 5,32. Fig. 4 przedstawia wyniki reakcji PCR, do której zaprojektowano i zastosowano startery reakcji PCR, korzystnie wprowadzające sekwencję nukleotydową,
PL 240 801 B1 kodującą znacznik sześciu reszt histydyny do genu helikazy TP-84 oraz sekwencję rozpoznawaną przez endonukleazę restrykcyjną Ncol do klonowania do wektora ekspresyjnego pBAD-MycHisA: 5’-GGAGGACCATGGCTCACCATCATCATCATCATGATTTTGACGATAAAACACGTGAACG-3’ (kodon Start ATG i znacznik sześciu reszt histydyny podkreślony) oraz 5’ -TT GAGAT CTT CAT GATGCTTCATCGAATCGGCG-3’ (kodon Stop w nici dolnej DNA podkreślony). Sekwencję nukleotydową kodującą znacznik sześciu reszt histydyny wprowadzono na koniec 5’ genu, tworząc fuzję z N-końcem białka TP84_31, jakkolwiek może być ona wprowadzona również na koniec 3’, tworząc fuzję z C-końcem białka. Sekw. 2 przedstawia sekwencję nukleotydową genu TP84_31, Sekw. 3 przedstawia sekwencję aminokwasową białka TP84_31. Korzystnie zastosowano następujące parametry reakcji PCR: stężenie starterów - 0,4 μΜ, dNTPs - 0,8 mM, bufor reakcyjny 1x (10 mM Tris-HCI pH 8,8 w 25°C, 50 mM KCI, 0,08% (v/v) Nonidet P40), MgCl2 - 2 mM, 2 jednostki Polimerazy TaqNova (BLIRT S.A., Polska), DNA genomowe bakteriofaga TP-84 - 2 ng, początkowa denaturacja 94°C przez 180 sekund, 30 cykli termicznych: 94°C - 30 sekund, 55°C - 30 sekund, 72°C - 30 sekund; końcowe wydłużanie 72°C - 120 sekund. Zaprezentowany w Fig. 4 powielony i zmodyfikowany za pomocą użytych starterów gen TP84_31 o długości 585 par zasad, koduje replikacyjną helikazę DNA TP-84, opatrzoną znacznikiem 6-ciu reszt histydyny oraz dodatkową resztą aminokwasu alaniny, znajdującą się za kodonem Start, składającą się z łańcucha polipeptydowego o długości 194 aminokwasów, o masie cząsteczkowej 22,6 kDa i teoretycznym punkcie izoelektrycznym 5,92. Sekw. 4 przedstawia zmodyfikowaną sekwencję nukleotydową genu TP84_31, Sekw. 5 przedstawia zmodyfikowaną sekwencję aminokwasową białka TP84_31. W uzyskanym produkcie PCR gen TP84_31 opatrzony jest flankującymi segmentami DNA, zawierającymi przeznaczone do klonowania , korzystnie do wektora pBAD-MycHisA, sekwencje rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne Ncol i BglII. Tak uzyskany moduł genetyczny może być przeniesiony drogą klonowania do różnych klas wektorów. Na Fig. 4 przedstawiono kolejno: ścieżka M, wzorzec wielkości DNA - GeneRuler 1kb (Thermo Scientific, USA); ścieżka 1, reakcja PCR na matrycy genomowego DNA TP-84; ścieżka 2, kontrolna reakcja PCR, bez dodanej matrycy. Oczyszczony produkt PCR oraz DNA wektora pBAD-MycHisA zostały strawione endonukleazami restrykcyjnymi Ncol i BglII oraz poddane reakcji kierunkowej ligacji ligazą bakteriofaga T4 w taki sposób, że nastąpiła fuzja z zachowaniem ciągłości Otwartej Ramy Odczytu (ORF) opatrzonego znacznikiem 6-ciu reszt histydyny genu TP84_31 z sygnałami inicjacji translacji wektora pBAD-MycHisA. Fig. 5 przedstawia wyniki uzyskane po transformacji mieszaniną ligacyjną bakterii Escherichia coli TOP10. Kolonie rekombinantowych bakterii poddano analizie PCR, stosując startery, zastosowane wcześniej do powielenia genu TP84_31 z genomu bakteriofaga TP-84, uzyskując w przypadku 3 klonów powielenie odcinka DNA o oczekiwanej długości genu TP84_31, opatrzonego sekwencjami flankującymi, wprowadzonymi przez startery. Na Fig. 5 przedstawiono kolejno: ścieżka M, wzorzec wielkości DNA - GeneRuler 1 kb (Thermo Scientific); ścieżki K1-K10, analizowane DNA poszczególnych klonów. Klon oznaczony K9, z przypisaną nazwą konstruktu pBADMycHisA-TP-84_helicase poddano sekwencjonowaniu DNA, potwierdzając pełną zgodność uzyskanej sekwencji nukleotydowej z sekwencją zmodyfikowanego genu TP84_31, wskazaną w Sekw. 4. Sekw. 6 przedstawia sekwencję nukleotydową konstruktu pBADMycHisA-TP-84_helicase.
P r z y k ł a d 5. Ekspresja genetyczna klonu, kodującego białko helikazę DNA - TP84_31-Hiss bakteriofaga TP-84.
Klon pBADMycHisA-TP-84_helicase, zawierający gen TP84_31 wklonowany w wektorze pBAD-MycHisA, jak wskazano w Przykładach 3 i 4, pod kontrolą indukowalnego promotora arabinozowego BAD, którego poziom transkrypcji jest regulowany stężeniem cukru arabinozy, poddano eksperymentowi ekspresji (biosyntezy białka in vivo) w rekombinantowych komórkach bakterii Escherichia coli TOP10. Rekombinantowe bakterie Escherichia coli TOP10 [pBADMycHisA-TP-84_helicase] korzystnie hodowano w pożywce LB, zawierającą na 1 L pożywki: 10 g Tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCI, pH 7,4, w temperaturze 37°C, stosując intensywne napowietrzanie w inkubatorze-wytrząsarce. Po osiągnięciu przez hodowlę bakterii gęstości optycznej OD = 0,45, wykonano indukcję chemiczną promotora BAD i inicjację biosyntezy rekombinantowego białka TP84_31 -His6 poprzez dodanie arabinozy do stężenia 0,02%.
Fig. 6 przedstawia mapę klonu plazmidowego pBADMycHisA-TP-84_helicase, zawierającego gen wskazany w Przykładach 3 i 4, kodujący białko TP84_35-His6, wklonowane w wektorze pBAD-MycHisA, pod kontrolą indukowalnego promotora arabinozowego BAD. Na Fig. 7 przedstawiono analizę rezultatów ekspresji transformowanego DNA klonu pBADMycHisA-TP-84_helicase, zawie
PL 240 801 B1 rającego fuzyjny gen, kodujący rekombinantowe białko TP84_31-His6. Wykonana została analiza elektroforetyczna eksprymowanego białka w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących; żel barwiono Coomassie Blue. Pobierano próbki hodowli w odstępach czasowych w zakresie 0 do 16 godzin, odwirowywano bakterie i wykonywano elektroforetyczną analizę profilu białkowego z całych komórek. Na Fig. 7 przedstawiono kolejno: ścieżka 1, hodowla przed indukcją; ścieżka 2, hodowla 2 godziny po indukcji; ścieżka 3, 4 godziny po indukcji; ścieżka 4, 16 godzin po indukcji; ścieżka M, wzorce masy cząsteczkowej białek - LMW-SDS Marker Kit (GE Healthcare, USA). Ewidentna jest masywna biosynteza rekombinantowego białka TP84_31-His6, widoczna jako przyrost intensywności prążka białkowego na wysokości żelu odpowiadającej ok. 22 kDa, zgodnej z oczekiwaną wielkością ustaloną na podstawie sekwencji aminokwasowej TP84_31-His6. Ze względu na to, że TP84_31-His6 jest białkiem fuzyjnym, zawierającym znacznik sześciu reszt histydyny, do jego oczyszczania mają zastosowanie metody izolowania metodą metalochromatografii powinowactwa IMAC na immobilizowanych jonach metali przejściowych, korzystnie Ni2+.
P r z y k ł a d 6. Klonowanie molekularne genu TP84_35 bakteriofaga TP-84, kodującego białko wiążące jednoniciowe DNA (ssb).
W przykładowej realizacji wykorzystania sekwencji nukleotydowej genomu bakteriofaga TP-84 (Sekw. 1) powielono w reakcji PCR, korzystnie gen TP84_35 o długości 468 par zasad, kodujący białko wiążące jednoniciowe DNA jak wskazano w Przykładzie 3, składające się z łańcucha polipeptydowego o długości 155 aminokwasów, o masie cząsteczkowej 17,4 kDa i teoretycznym punkcie izoelektrycznym 5,16. Sekw. 7 przedstawia sekwencję nukleotydową genu TP84_35, Sekw. 8 przedstawia sekwencję aminokwasową białka TP84_35. Fig. 8 przedstawia wyniki reakcji PCR, do której zaprojektowano i zastosowano startery reakcji PCR, korzystnie wprowadzające sekwencję nukleotydową, kodującą znacznik sześciu reszt histydyny do genu białka wiążącego jednoniciowe DNA oraz sekwencję rozpoznawaną przez endonukleazę restrykcyjną Ncol do klonowania do wektora ekspresyjnego pBAD-MycHisA: 5'-ggaggaccatGgctcaccatcatcatcatcataacaatgtgacgttagtgggaagattgacg-3' (kodon Start ATG i znacznik sześciu reszt histydyny podkreślony) oraz 5’-TTGAGATCTCTA AAATGGCAGATCGTCATCATTCACATAAATCGG-3’ (kodon Stop w nici dolnej DNA podkreślony). Sekwencję nukleotydową kodującą znacznik sześciu reszt histydyny wprowadzono na koniec 5’ genu, tworząc fuzję z N-końcem białka TP84_35, jakkolwiek może być ona wprowadzona również na koniec 3’, tworząc fuzję z C-końcem białka. Sekw. 9 przedstawia zmodyfikowaną sekwencję nukleotydową genu TP84_35, Sekw. 10 przedstawia zmodyfikowaną sekwencję aminokwasową białka TP84_35. Korzystnie zastosowano następujące parametry reakcji PCR: stężenie starterów - 0,4 μM, dNTPs - 0,8 mM, bufor reakcyjny 1x, MgCl2 - 2 mM, 2 jednostki Polimerazy TaqNova (BLIRT S.A.) DNA genomowe bakteriofaga TP-84 - 2 ng, początkowa denaturacja 94°C przez 180 sekund, 30 cykli termicznych: 94°C - 30 sekund, 55°C - 30 sekund, 72°C - 30 sekund; końcowe wydłużanie 72°C - 120 sekund. Zaprezentowany w Fig. 8 powielony i zmodyfikowany za pomocą użytych starterów gen TP84_35 o długości 489 par zasad, koduje białko wiążące jednoniciowe DNA, opatrzone znacznikiem 6-ciu reszt histydyny oraz dodatkową resztą aminokwasu alaniny, znajdującą się za kodonem Start (Sekw. 9), składające się z łańcucha polipeptydowego o długości 162 aminokwasów (Sekw. 10), o masie cząsteczkowej 18,3 kDa i teoretycznym punkcie izoelektrycznym 6,28. Na Fig. 8 przedstawiono kolejno: ścieżka M, wzorzec wielkości DNA - GeneRuler 1 kb (Thermo Scientific); ścieżka 1, reakcja PCR na matrycy genomowego DNA TP-84; ścieżka 2, kontrolna reakcja PCR, bez dodanej matrycy. W uzyskanym produkcie PCR gen TP84_35 opatrzony jest flankującymi segmentami DNA, zawierającymi przeznaczone do klonowania, korzystnie do wektora pBAD-MycHisA, sekwencje rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne Ncol i BglII. Tak uzyskany moduł genetyczny może być przeniesiony drogą klonowania do różnych klas wektorów. Produkt PCR oraz DNA wektora pBAD-MycHisA zostały strawione endonukleazami restrykcyjnymi Ncol i BglII oraz poddane reakcji kierunkowej ligacji ligazą bakteriofaga T4 w taki sposób, że nastąpiła fuzja z zachowaniem ciągłości Otwartej Ramy Odczytu (ORF) opatrzonego znacznikiem 6-ciu reszt histydyny genu TP84_35-His6 z sygnałami inicjacji translacji wektora pBAD-MycHisA. Fig. 9 przedstawia wyniki uzyskane po transformacji mieszaniną ligacyjną bakterii Escherichia coli TOP10. Kolonie rekombinantowych bakterii poddano analizie PCR, stosując startery, zastosowane wcześniej do powielenia genu TP84_35 z genomu bakteriofaga TP-84, uzyskując w przypadkach 5-ciu klonów powielenie odcinka DNA o oczekiwanej długości genu TP84_35-His6, opatrzonego sekwencjami flankującymi, wprowadzonymi przez startery. Na Fig. 9 przedstawiono kolejno: ścieżka M, wzorzec wielkości DNA - GeneRuler 1 kb
PL 240 801 B1 (Thermo Scientific); ścieżki K1-K9, analizowane DNA poszczególnych klonów. Klon oznaczony K7, z przypisaną nazwą konstruktu pBADMycHisA-TP-84_ssb poddano sekwencjonowaniu DNA, potwierdzając pełną zgodność uzyskanej sekwencji nukleotydowej z sekwencją zmodyfikowanego genu TP84_35-His6, wskazaną w Sekw. 9. Sekw. 11 przedstawia sekwencję nukleotydową konstruktu pBADMycHisA-TP-84_ssb.
P r z y k ł a d 7. Ekspresja genetyczna klonu, kodującego białko TP84_35-His6 bateriofaga TP-84, wiążące jednoniciowe DNA (ssb).
Fig. 10 przedstawia mapę klonu plazmidowego pBADMycHisA-TP-84_ssb, zawierający gen wskazany w Przykładach 3 i 6, kodujący białko TP84_35-His6, wklonowane w wektorze pBAD-MycHisA, pod kontrolą indukowalnego promotora arabinozowego BAD. Transformowane DNA klonu poddano eksperymentowi ekspresji w komórkach bakterii Escherichia coli TOP10. Rekombinantowe bakterie Escherichia coli TOP10 [pBADMycHisA-TP-84_ssb] korzystnie hodowano w pożywce LB, w temperaturze 37°C, stosując intensywne napowietrzanie w inkubatorze-wytrząsarce. Po osiągnięciu przez hodowlę bakterii gęstości optycznej OD = 0,40, wykonano indukcję chemiczną promotora BAD i inicjację biosyntezy rekombinantowego białka TP84_35-His6 poprzez dodanie arabinozy do stężenia 0,02%.
Na Fig. 11 została przedstawiona analiza rezultatów ekspresji fuzyjnego genu, kodującego rekombinantowe białko TP84_35-His6. Wykonana została analiza elektroforetyczna eksprymowanego białka w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących, który barwiono Coomassie Blue. Pobierano próbki hodowli w odstępach czasowych w zakresie 0 do 16 godzin, odwirowywano bakterie i wykonywano analizę profilu białkowego z całych komórek za pomocą elektroforezy denaturującej. Na Fig. 11 przedstawiono kolejno: ścieżka M, wzorce masy cząsteczkowej białek - LMW-SDS Marker Kit (GE Healthcare); ścieżka 1, hodowla przed indukcją; ścieżka 2, hodowla 2 godziny po indukcji; ścieżka 3, 4 godziny po indukcji; ścieżka 4, 16 godzin po indukcji. Ewidentna jest masywna biosynteza rekombinantowego białka TP84_35-His6, widoczna jako przyrost intensywności prążka białkowego na wysokości żelu odpowiadającej ok. 17 kDa, zgodnej z oczekiwaną wielkością ustaloną na podstawie sekwencji aminokwasowej TP84_35-His6. Ze względu na to, że TP84_35-His6 jest białkiem fuzyjnym, zawierającym znacznik sześciu reszt histydyny, do jego oczyszczania mają zastosowanie metody izolowania metodą metalochromatografii powinowactwa IMAC na immobilizowanych jonach metali przejściowych, korzystnie Ni2+.
P r z y k ł a d 8. Izolowanie rekombinantowego białka TP84_35-His6 bakteriofaga TP-84, wiążącego jednoniciowe DNA.
W przykładowej realizacji komórki rekombinantowych bakterii Escherichia coli TOP10 [pBADMycHisA-TP-84_ssb], wskazane w Przykładach 6 i 7, zawierające eksprymowane białko TP84_35-His6, wiążące jednoniciowe DNA poddano procesowi separacji białka. Ekspresję genetyczną wykonano w 50 ml pożywki LB, komórki po trwającej 16 godzin indukcji promotora BAD odwirowano i zawieszono w 20 ml buforu do dezintegracji ultradźwiękowej: 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,5 M NaCI, 0,01% Triton X-100, 0,5 mg/ml lizozymu jaja kurzego, 5 mM beta-merkaptoetanol, 1/5 tabletki SIGMAFAST™ Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-Free. Zawiesinę, chłodzoną w łaźni lodowej, poddano sonikacji, a pozostałości komórek bakteryjnych odwirowano przy 19 500 g w temperaturze 4°C przez 30 minut, uzyskując 20 ml supernatantu. 5 ml uzyskanego supernatantu, zawierającego białko TP84_35-His6 naniesiono na kolumnę, zawierającą 2 ml złoża do chromatografii metalopowinowactwa Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare). Kolumnę płukano 10-ma ml buforu A zawierającego: 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,5 M NaCI, 5 mM imidazol, a następnie 10-ma ml buforu A zawierającego: 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,5 M NaCI, 40 mM imidazol. Związane do kolumny białko TP84_35-His6 eluowano 10-ma ml buforu E zawierającego: 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,5 M NaCI, 300 mM imidazol. Frakcje zawierające wyeluowane białko TP84_35-His6 dializowano wobec buforu S zawierającego: 20 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0,2 mM beta-merkaptoetanol, 0,01% Triton X100, 50% glicerol i przechowywano w temperaturze -20°C. Fig. 12 przedstawia analizę elektroforetyczną w warunkach denaturujących kolejnych etapów izolowania rekombinantowego białka TP84_35-His6: ścieżki M, wzorce masy cząsteczkowej białek - LMW-SDS Marker Kit (GE Healthcare); ścieżka 2, przesącz z kolumny, zawierający niezwiązane białka; ścieżki 2-5, frakcje po płukaniu buforem A; ścieżki 6-9, frakcje po płukaniu buforem B; ścieżki 10-18, frakcje zawierające wyeluowane buforem E rekombinantowe białko TP84_35-His6.
PL 240 801 B1
P r z y k ł a d 9. Funkcjonalna aktywność biologiczna rekombinantowego białka helikazy DNA - TP84_34-His6 bakteriofaga TP-84.
W przykładowej realizacji komórki rekombinantowych bakterii Escherichia coli TOP10 [pBADMycHisA-TP-84_helicase], wskazane w Przykładach 3 i 4, 5, zastosowano do otrzymania oczyszczonego, rekombinantowego białka TP84_35-Hiss, któremu na podstawie analizy bioinformatycznej wskazanej w Przykładzie 3, przypisano funkcję enzymu helikazy, rozplatającego dwuniciowe DNA. Idea testu funkcjonalnego polega na wykazaniu zdolności termostabilnego białka TP84_34-Hiss do rozplatania zhybrydyzowanych nici DNA, monitorowane zaawansowaną metodą pomiaru zmiany poziomu fluorescencji barwnika interkalującego jedynie do dwuniciowego DNA (Eva Green, Jena Bioscience, Niemcy), mierzoną w urządzeniu metodą real time PCR (model MyGoPRO, IT-IS Life Science Ltd., Ireland). Spadek poziomu fluorescencji po dodaniu rekombinantowego białka TP84_35-Hiss jest wyznacznikiem jego aktywności biologicznej.
Fig. 13 przedstawia wyniki analizy kinetyki zmian fluorescencji w urządzeniu real time PCR. Zaprojektowano dwa wzajemnie komplementarne fragmenty jednoniciowego DNA, które zostały zsyntetyzowane chemicznie o sekwencjach: 5’-GCTAGTCGTCGCGTAAGCCAATCGACCCCAAAATAGCGA GCATCAGTGTAGAGAGTTGGA-3’ oraz 5’-TCCAACTCTCTACACTGATGCTCGCTATTTTGGGGTC GATTGGCTTACGCGACGACTAGC-3’. Korzystnie zastosowano następujące parametry reakcji monitorowania zmian fluorescencji, przeprowadzonych w objętościach po 20 μl: stężenie jednoniciowych odcinków DNA - 1,5 μM, dNTPs - 0,1 mM, bufor reakcyjny 1 x: 20 mM Tris-HCI pH 7,5, MgCl2 10 mM, BSA - 1 mg/ml, ATP - 2 mM. Zastosowano schemat cykli termicznych: 37°C - 1 minuta, 55°C - 30 minut. Komponenty reakcji były dodawane do mieszaniny reakcyjnej w temperaturze 0°C a następnie umieszczone w urządzeniu do real time PCR i niezwłocznie poddane cyklom termicznym. Na Fig. 13 przedstawiono wykres obrazujący kinetykę hybrydyzacji jednoniciowych odcinków DNA, gdzie w próbie kontrolnej bez dodanego rekombinantowego białka TP84_34-Hiss widoczny jest stopniowy wzrost stężenia form odcinków DNA zhybrydyzowanych do dwuniciowych odcinków, tym samym zwiększając poziom fluorescencji w czasie cykli hybrydyzacyjnych. W próbach zawierających dodane rekombinantowe białko TP84_34-Hiss widoczny jest znacznie niższy poziom wzrostu fluorescencji lub jej spadek, w zależności od ilości dodanego rekombinantowego białka TP84_34-Hiss. Krzywe na wykresie w Fig. 13 oznaczono kolorami: purpurowym - reakcja kontrolna bez dodanego rekombinantowego białka TP84_34-Hiss; czarnym - reakcja zawierająca 1,65 μg rekombinantowego białka TP84_34-Hiss; czerwonym - reakcja zawierająca 1,24 μg rekombinantowego białka TP84_34-Hiss; zielonym - reakcja zawierająca 0,825 μg rekombinantowego białka TP84_34-Hiss; niebieskim - reakcja zawierająca 0,412 μg rekombinantowego białka TP84_34-Hiss. Obserwowana jest negatywna zależność kinetyki hybrydyzacji jednoniciowego DNA, od ilości dodanego rekombinantowego białka TP84_34-Hiss. Tym samym wykazano, że rekombinantowe białko TP84_34-Hiss wykazuje aktywność biologiczną helikazy oddziaływującej z DNA, wywierając efekt rozplatania helisy dwuniciowego DNA. Właściwość ta może mieć istotne zastosowania praktyczne w technologiach manipulacji DNA, w szczególności w usprawnieniu reakcji powielania DNA.
P r z y k ł a d 10. Funkcjonalna aktywność biologiczna rekombinantowego białka TP84_35-Hiss bakteriofaga TP-84, wiążącego jednoniciowe DNA.
W przykładowej realizacji komórki rekombinantowych bakterii Escherichia coli TOP10 [pBADMycHisA-TP-84_ssb], wskazane w Przykładach 6, 7, 8 zastosowano do otrzymania oczyszczonego rekombinantowego białka TP84_35-Hiss, wiążącego jednoniciowe DNA. Idea testu funkcjonalnego polega na wykazaniu zdolności termostabilnego białka TP84_35-Hiss do usprawniania reakcji PCR poprzez wiązanie do jednoniciowych starterów i tym samym stymulowanie specyficzności hybrydyzacji do matrycowego DNA, eliminując lub zmniejszając artefakty reakcji PCR, obserwowane podczas technik analitycznych reakcji PCR, takie jak pojawianie się obserwowanych na elektroforetycznych żelach agarozowych lub akrylamidowych dodatkowych prążków DNA, ‘smugi’ DNA, dimerów starterów. Artefakty te są efektem hybrydyzacji starterów do nie w pełni homologicznych sekwencji nukleotydowych w matrycy oraz wzajemnej hybrydyzacji starterów.
Fig. 14 przedstawia wyniki reakcji PCR, do której zaprojektowano i zastosowano startery reakcji PCR: 5’-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG-3’ oraz 5’-CCGATCCCTAGTCGGCATAG-3’, powielające testowy odcinek 470 par zasad z genomu Candida albicans, gdzie reakcja powielania nie skutkuje powstaniem wyłącznie oczekiwanego jednorodnego, pojedynczego prążka DNA. Tym samym zawiera liczne artefakty, widoczne na agarozowym żelu elektroforetycznym w postaci prążków dodatkowych
Claims (8)
- PL 240 801 B1 oraz ‘smugi’ DNA. Korzystnie zastosowano następujące parametry reakcji PCR przeprowadzonych w objętości 25 μΙ: stężenie starterów - 0,4 μM, dNTPs - 0,1 mM, bufor reakcyjny 1x, MgCl2 - 3 mM, 2 jednostki Polimerazy TaqStoffel, DNA genomowe Candida albicans - 23 ng, początkowa denaturacja 95°C przez 180 sekund, 30 cykli termicznych: 95°C - 30 sekund, 45°C - 30 sekund, 72°C 30 sekund; końcowe wydłużanie 72°C - 180 sekund. Czerwona strzałka oznacza oczekiwany produkt PCR o długości 470 par zasad, przedstawiony na Sekw. 12. Na Fig. 14 przedstawiono kolejno: ścieżki M, marker wielkości fragmentów DNA 100 bp Plus (Fermentas, Litwa); ścieżka 1, kontrolna reakcja PCR na matrycy genomowego Candida albicans bez dodanego białka TP84_35-His; ścieżka 2, reakcja PCR, przeprowadzono jak w ścieżce 1 z dodatkiem 0,36 ng białka TP84_35-His; ścieżka 3, PCR z 0,72 ng białka TP84_35-His; ścieżka 4, PCR z 1,08 ng białka TP84_35-His; ścieżka 5, PCR z 1,44 ng białka TP84_35-His; ścieżka 6, PCR z 2,16 ng białka TP84_35-His; ścieżka 7, PCR z 2,88 ng białka TP84_35-His; ścieżka 8, PCR z 3,60 ng białka TP84_35-His. Komponenty reakcji były dodawane do mieszaniny reakcyjnej w temperaturze 0°C, a następnie umieszczone w termocyklerze PCR (model TPROFESSIONAL BASIC, Biometra, Niemcy) i niezwłocznie poddane cyklom termicznym. Wyniki wykazują stopniowe zmniejszanie się ilości artefaktów w ścieżkach 2-7, aż do całkowitej ich eliminacji w ścieżce 8. Tym samym wykazano, że rekombinantowe białko TP84_35-His wykazuje aktywność biologiczną oddziaływania z DNA, w przeprowadzonym teście objawiającą się dodatkowo jako usprawnienie reakcji PCR. Właściwość ta może mieć istotne zastosowania praktyczne w technologiach manipulacji DNA, w szczególności w usprawnieniu reakcji powielania DNA.Zastrzeżenia patentowe1. Polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA posiadający sekwencję nukleotydową o numerze 2.
- 2. Polinukleotyd kodujący gen rekombinantowy składający się z polinukleotydu kodującego białko bakteriofaga TP-84 określone w zastrz. 1 oraz polinukleotydu kodującego sześć reszt histydyny, korzystnie posiadający sekwencję nukleotydową o numerze 4.
- 3. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera origin replikacji, korzystnie pBR322 ori, gen oporności na antybiotyk, korzystnie ampicylinę, promotor transkrypcji, korzystnie BAD operonu arabinozowego, gen represora, korzystnie araC, sygnał inicjacji translacji, sekwencję kodującą sygnał stopu translacji oraz połączony z nimi operacyjnie polinukleotyd kodujący białko określony w zastrz. 1 albo 2.
- 4. Wektor ekspresyjny według zastrz. 3, znamienny tym, że posiada sekwencję o numerze 6.
- 5. Komórka gospodarza bakteryjnego, zwłaszcza Escherichia coli, transformowana wektorem ekspresyjnym określonym w zastrz. 3 lub 4.
- 6. Białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA kodowane przez polinukleotyd określony w zastrz. 1 albo 2.
- 7. Białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA posiadające sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji o numerach: 3 lub 5.
- 8. Zastosowanie białka bakteriofaga TP-84 posiadającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji o numerach: 3 lub 5 do przeprowadzenia in vitro manipulacji DNA obejmującej wiązanie dwuniciowego DNA i rozplatanie helisy DNA.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL434589A PL240802B1 (pl) | 2016-09-15 | 2016-09-15 | Polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące jednoniciowy DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza bakteryjnego oraz białko bakteriofaga TP-84 i jego zastosowanie |
| PL418712A PL240801B1 (pl) | 2016-09-15 | 2016-09-15 | Polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza bakteryjnego oraz białko bakteriofaga TP-84 i jego zastosowanie |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL418712A PL240801B1 (pl) | 2016-09-15 | 2016-09-15 | Polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza bakteryjnego oraz białko bakteriofaga TP-84 i jego zastosowanie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL418712A1 PL418712A1 (pl) | 2018-03-26 |
| PL240801B1 true PL240801B1 (pl) | 2022-06-06 |
Family
ID=61661203
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL434589A PL240802B1 (pl) | 2016-09-15 | 2016-09-15 | Polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące jednoniciowy DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza bakteryjnego oraz białko bakteriofaga TP-84 i jego zastosowanie |
| PL418712A PL240801B1 (pl) | 2016-09-15 | 2016-09-15 | Polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza bakteryjnego oraz białko bakteriofaga TP-84 i jego zastosowanie |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL434589A PL240802B1 (pl) | 2016-09-15 | 2016-09-15 | Polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące jednoniciowy DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza bakteryjnego oraz białko bakteriofaga TP-84 i jego zastosowanie |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (2) | PL240802B1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL449273A1 (pl) * | 2024-07-19 | 2026-01-26 | Uniwersytet Gdański | Fuzyjne białko rekombinowane, sposób otrzymywania fuzyjnego białka rekombinowanego i jego zastosowanie |
-
2016
- 2016-09-15 PL PL434589A patent/PL240802B1/pl unknown
- 2016-09-15 PL PL418712A patent/PL240801B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL434589A1 (pl) | 2018-03-26 |
| PL418712A1 (pl) | 2018-03-26 |
| PL240802B1 (pl) | 2022-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11939604B2 (en) | Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof | |
| AU2020267249B2 (en) | Genome editing using campylobacter jejuni crispr/cas system-derived rgen | |
| Zinder et al. | The filamentous phage (Ff) as vectors for recombinant DNA—a review | |
| CN107922931B (zh) | 热稳定的Cas9核酸酶 | |
| CN110527697B (zh) | 基于CRISPR-Cas13a的RNA定点编辑技术 | |
| Gaudin et al. | Extracellular membrane vesicles harbouring viral genomes | |
| JPS63159397A (ja) | 組換えｂ型肝炎ウィルス抗原 | |
| CN104388368B (zh) | 一株低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株及构建方法 | |
| TWI221854B (en) | Lac shuttle vectors, kit for expression of a heterologous gene and DNA vaccine carrier containing the same | |
| PL240801B1 (pl) | Polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza bakteryjnego oraz białko bakteriofaga TP-84 i jego zastosowanie | |
| CN110066819B (zh) | 一种基于dna磷硫酰化修饰的抗噬菌体和抗病毒系统 | |
| JP2009514506A (ja) | Ｅ．コリ株ｄｓｍ６６０１のプラスミド不含のクローン | |
| US20250223578A1 (en) | Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof | |
| CA2957441C (en) | Genome editing using campylobacter jejuni crispr/cas system-derived rgen | |
| CN112359060B (zh) | 含有靶向突变型kras融合基因的重组载体、融合蛋白及蛋白质复合物及其构建方法和应用 | |
| JP6399589B2 (ja) | 肺炎球菌における発現プロモーター | |
| JP6341541B2 (ja) | 肺炎球菌における発現プロモーター | |
| SOCOL et al. | Molecular cloning of ovine cDNA leptin gene |