PL211510B1

PL211510B1 - Kompozycja zawierająca MX-DTPA i jej zastosowanie do wytwarzania radioznakowanego MX-DTPA

Info

Publication number: PL211510B1
Application number: PL350903A
Authority: PL
Inventors: Paul Chinn; Albert Gyorkos; Michael J. Labarre; Steve Ruhl; Thomas Ryskamp
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 1999-03-03
Filing date: 2000-03-02
Publication date: 2012-05-31
Also published as: JP5357368B2; JP2002538137A; JP2013144705A; ES2304944T3; CN1548419A; WO2000051976A1; EP1157004A1; CN1342141A; AU3509900A; NO328049B1; NO20014194D0; MXPA01008784A; PT1157004E; ATE396175T1; PL350903A1; US6207858B1; AU778816B2; CN1290830C; ZA200106750B; EP1157004B1

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej regioizomer kwasu 2-(p-izotiocyjanianobenzylo)-6-metylodietylenotriamino-N,N,N'N”,N”-pentaoctowego (MX-DTPA), który jest stosowany jako bifunkcyjny chelator w radioimmunoterapii i obrazowaniu. MX-DTPA jest otrzymywany w wysokowydajnym procesie regiospecyficznej syntezy. MX-DTPA jest stosowany do wytwarzania radioznakowanego MX-DTPA.

Rosnącym zainteresowaniem cieszą się nowe czynniki do radioznakowania przy obrazowaniu, wykrywaniu nowotworu i immunoterapii, które zmniejszają różne ujemne cechy wykazywane przez czynniki konwencjonalne.

Czynniki konwencjonalne generalnie opierają się o radioaktywne związki chlorowcowe, takie jak związki radioaktywne na bazie izotopów jodu. Jednak czynniki te wykazują liczne ograniczenia. Przykładowo, stosowanie izotopów jodu jest w znacznej mierze ograniczone przez wysoki stopień rozkładu wiązania węgiel-jod, in vivo. Inne ograniczenie odnosi się do mniej niż idealnych cech emisji i fizycznego okresu półtrwania radionuklidów jodu. W związku z tym, czyni się wysiłki, aby opracować nowe czynniki wykrywania nowotworów, które omijają wady radioaktywnych czynników znakujących na bazie chlorowców.

Jedną z dróg zapewniających skuteczniejsze czynniki obrazujące i wykrywające nowotwory, oferują związki organometaliczne w postaci radionuklidów kompleksów metalicznych. Sprzęganie czynnika obrazującego i wykrywającego nowotwory z białkiem, uzyskuje się generalnie przez wiązanie kowalentne tworzone między chelatem i białkiem przez acylowanie z aktywowanymi grupami karbonylowymi, aromatyczne sprzężenie diazoniowe, alkilowanie bromoacetylowe lub poprzez wiązania tiomocznikowe. Jednak, istniejące kompleksy organometaliczne nie zapewniają optymalnej skuteczności dla radioznakowania i terapii. Przykładowo, poza wyborem poszczególnego radioizotopu, powodzenie wykrywania nowotworu i radioimmunoterapii zależą także od wyboru skutecznego chelatu, który łączy się łatwo z poszczególnym przeciwciałem i pozwala radionuklidowi na insercję, zabezpieczając całość przeciwciała.

Podczas planowania przeciwciał chelatowanych metalem radioaktywnym do obrazowania i wykrywania nowotworu i/lub immunoterapii, pod uwagę trzeba wziąć kilka czynników. Przykładowo, muszą być wybrane skuteczne radionuklidy, zgodnie z ich fizycznymi, chemicznymi i biologicznymi właściwościami. Optymalny nuklid powinien być rutynowo dostępny, łatwy do sprzęgania z MAb i mieć odpowiedni fizyczny okres półtrwania do selektywnego wykrywania i/lub eliminacji docelowej tkanki nowotworowej, oszczędzając jednocześnie tkankę normalną. MAb, które służy do niesienia radionuklidu do docelowego nowotworu musi być wybrane na podstawie dystrybucji jego celu antygenowego i specyficzności oraz powinowactwa wią zania przeciwciała ze swym celem.

Inny istotny aspekt brany pod uwagę przy planowaniu skutecznych przeciwciał chelatowanych metalem radioaktywnym, odnosi się do wyboru czynnika chelatującego (CA) stosowanego do sprzęgania radionuklidu z przeciwciałem. Przykładowo, skuteczne przeciwciała chelatowane metalem radioaktywnym muszą być stabilne in vivo. Stabilność in vivo zależy od warunku, że zarówno wiązanie chylatowe, jak i procedury radioznakowania, nie zmieniają specyficzności przeciwciała i biodystrybucji.

Oprócz tego, wybór i synteza czynnika chelatującego są krytyczne dla optymalizacji dopasowania między chelatem i wybranym radionuklidem oraz MAb. W szczególności, wybór i synteza chelatu powinny zapobiegać nieodpowiedniemu uwalnianiu radionuklidu in vivo. Ten aspekt jest szczególnie istotny, ponieważ większość powszechnych problemów związanych z konwencjonalnymi czynnikami chelatującymi, jest ich niemożność wiązania i pewnego utrzymywania przeciwciała. W konsekwencji, istnieje istotny rozdział radionuklidu in vivo od kompleksu MAb-CA przed dostarczeniem tych czynników do powierzchni komórki nowotworowej. Akumulacja wolnych, toksycznych radionuklidów w tkance normalnej uszkadza tkankę normalną bez korzyści leczenia i/lub wykrywania celu nowotworowego. Inny ważny aspekt odnosi się do oczekiwania, aby wybrany czynnik chelatujący pozwalał kompleksowi MAb-CA na utrzymanie korzyści zapewnionej przez specyficzność wybranego MAb.

Tak więc, należy wziąć pod uwagę kilka kryteriów przy wyborze adekwatnych chelatów dla wybranego MAb. Przykładowo, (a) dodawanie CA nie powinno zmieniać specyficzności lub powinowactwa wiązania MAb z celem antygenowym; (b) jego dodanie do MAb nie powinno w inny sposób uszkadzać przeciwciała, a więc zmieniać jego szybkości katabolizmu lub wzorów dystrybucji tkankowej; (c) powinien on trzymać radiometal mocno tak, aby nie zachodziło przedwczesne wymywanie radioizotopu z kompleksu MAb-CA in vivo; (d) wiązanie z MAb powinno być specyficzne, aby utrzymać

PL 211 510 B1 radionuklid; (e) sposób wiązania z MAb powinien być tak specyficzny jak to możliwe, aby ułatwić planowanie protokołów specyficznego wykrywania i terapii celów nowotworowych, jak również analizy danych związanych z detekcją i leczeniem nowotworów; oraz (f) chelat powinien być zdolny do pomagania klirensu radionuklidu po katabolizmie kompleksu MAb-CA-radionuklid.

Jedną grupę odpowiednich chelatów metali zapewniają kwas dietylenotriaminopentaoctowy (DTPA) i kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i ich pochodne. Chemicznie modyfikowane pochodne (DTPA) i (EDTA) wykorzystywano jako ligandy metali zdolne do skutecznego chelatowania metali radioaktywnych, które można łatwo sprzęgać z immunoglobulinami. Jednak reagenty te były minimalnie skuteczne z powodu zmniejszonego powinowactwa do związanego radionuklidu i późniejszego odkładania związków radiochemicznych w normalnych tkankach.

Dostępne są liczne metody sprzęgania kompleksów metali EDTA i DTPA z białkami. Jednak, metody te nie osiągnęły wysokich współczynników skuteczności wymaganych dla skutecznego obrazowania i wykrywania nowotworu. Przykładowo, metody konwencjonalne wykazują liczne wady, takie jak potrzeba ekstensywnego oczyszczania przed radioznakowaniem oraz nieskuteczność chelatowania metalu, wynikająca ze stosowania miejsca wiązania metalu przy tworzeniu wiązania kowalentnego z biał kiem. Tak wię c, bada się nowe sposoby wią zania białkowego i proponuje nowe sposoby, które zabezpieczają wszystkie miejsca wiązania metalu.

Przykładowo, szczegółowy opis chemicznie modyfikowanych ligandów, które reagowałyby szybko i skutecznie z przeciwciałem i które zachowują metal przez czas długi w porównaniu z okresami półtrwania radionuklidów użytecznych przy obrazowaniu lub terapii, podaje się u Brechbiel i innych w „Synthesis of 1-(p-isothiocyanatobenzyl) derivatives of DTPA and EDTA. Antibody Labeling and Tumor-Imaging Studies.” Inorg. Chem. 1986, 25, 2772-2781, których zawartości w całości załącza się w niniejszym przez odniesienie.

Brechbiel i inni proponują chemicznie modyfikowane chelaty EDTA i DTPA mające grupę izotiocyjanianową zdolną do skutecznego sprzęgania z białkami. Syntezę chelatów można streścić jako „proces dwuetapowy”, w którym pierwszy etap obejmuje powstawanie etylenodiaminy lub dietylenotriaminy, po czym alkilowanie amin z utworzeniem odpowiadającego kwasu polioctowego, a etap drugi obejmuje przekształcanie grupy funkcyjnej podstawionego benzylu, aby otrzymać reaktywną cząsteczkę stosowaną przy sprzęganiu z białkiem.

Jednak powyższy „dwuetapowy” proces syntezy MX-DTPA i analogu EDTA jest ograniczony do niskiej wydajności całkowitej, poniżej 2%. Proces wymaga żmudnego oczyszczania związków pośrednich, który obejmuje chromatografię kationo- oraz anionowymienną. Oprócz tego, w wyniku syntezy powstają oba regioizomery MX-DTPA i wykazała ona słabą powtarzalność.

Tak więc, istnieje potrzeba alternatywnego procesu syntezy do wytwarzania pochodnych DTPA z wysoką wydajnością. Pożądane jest, aby nowa synteza eliminowała konieczność chromatografii jonowymiennej przy rozdzielaniu związków pośrednich, zapewniając w ten sposób proces, którego skalę można łatwo zwiększyć. Ponadto, pożądane jest także, aby taki proces powodował wytwarzanie pojedynczego regioizomeru chelatu, pozwalając tym samym na regiospecyficzną syntezę żądanych chelatów użytecznych jako skuteczne czynniki radioznakujące.

Brechbiel i Gansow (Bioconjugate Chem.1991, 2, 187-194) opisali syntezę bifunkcyjnych ligandów DTPA, włącznie z MX-DTPA, dostarczając środki chelatujące do radioimmunoterapii z ⁹⁰Y.

Streszczenie wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej regioizomer kwasu 2-(p-izotiocyjanianobenzylo)-6-metylodietylenotriamino-N,N,N'N”,N”-pentaoctowego (MX-DTPA) o wzorze (I):

PL 211 510 B1 gdzie procentowa zawartość tego regioizomeru, w stosunku do każdego innego regioizomeru, jest co najmniej 90%.

Korzystnie, procentowa zawartość tego regioizomeru, w stosunku do każdego innego regioizomeru, jest co najmniej 95%, bardziej korzystnie co najmniej 99%.

W innym aspekcie, wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji MX-DTPA do wytwarzania radioznakowanego MX-DTPA.

Radioznakowany MX-DTPA może być przyłączony do białka, takiego jak przeciwciało.

Sposób regioselektywnej syntezy pochodnych DTPA odpowiednich do chelatowania metali radioaktywnych i sprzęgania z immunoglobulinami. Opisany tutaj sposób obejmuje sprzęganie jednozabezpieczonej diaminy i związku zawierającego aminę i ugrupowanie zdolne skutecznie sprzęgać pochodną DTPA z immunoglobulinami.

Sposób wytwarzania pochodnej DTPA o wzorze (II)

obejmuje:

(a) sprzęganie N-tert-butoksykarbonylo-p-nitro-L-fenyloalaniny (A) i jednozabezpieczonej diaminy (B) z utworzeniem związku (C);

(b) usuwanie grup zabezpieczających aminę w (C) z utworzeniem soli TFA (D);

(c) redukcję (D) z utworzeniem (E);

(d) pentaalkilowanie (E) z utworzeniem (F);

(e) usuwanie grup zabezpieczających aminę w (F) z utworzeniem soli kwasu trifluorooctowego (G);

(f) redukcję grupy nitrowej w (G) z utworzeniem soli kwasu trifluorooctowego (H); i (g) przekształcenie grupy aminowej w (H) z utworzeniem pochodnej DTPA.

Sposób pozwala na syntezę różnych pochodnych DTPA, włącznie z MX-DTPA, 1B3M-DTPA i CHx-DTPA.

Charakter pochodnej DTPA określa się przez wybór jednozabezpieczonej diaminy (B). R1 i R2 w związku (B) wybiera się tak, aby otrzymać żądaną chemicznie modyfikowaną pochodną DTPA.

Sposób wytwarzania MX-DTPA obejmuje:

(a) sprzęganie N-tert-butoksykarbonylo-p-nitro-L-fenyloalaniny (A) i diaminy zabezpieczonej mono-N-tert-butoksykarbonylem (B') z utworzeniem N-(2-N-tert-butoksykarbonyloaminopropylo)-N-tert-butoksykarbonylo-p-nitrofenyloalaninoamidu (C');

(b) usuwanie grup boc w (C') z utworzeniem soli TFA N-(2-aminopropylo)-p-nitrofenyloalaninoamidu (D');

(c) redukcję (D') z utworzeniem trichlorowodorku 2-metylo-6-(p-nitrobenzylo)dietylenotriaminy (E');

(d) penta-alkilowanie (E') z utworzeniem N,N,N',N”,N”-pentakis[(tert-butoksykarbonylo)metylo]-2-[(4-nitrofenylo)metylo]-6-metylodietylenotriaminy (F');

(e) usuwanie grup boc w (F') z utworzeniem soli kwasu trifluorooctowego N,N,N',N”,N”-pentakis(karboksymetylo)-2-[(4-nitrofenylo)metylo]-6-metylodietylenotriaminy (G');

(f) redukcję grupy nitrowej w (G') z utworzeniem soli kwasu trifluorooctowego N,N,N',N”,N”-pentakis(karboksymetylo)-2-[(4-aminofenylo)metylo]-6-metylodietylenotriaminy (H'); i (g) przekształcenie grupy aminowej w (H') z utworzeniem kwasu 2-(p-izotiocyjanianobenzylo)-6-metylodietylenotriamino-N,N,N'N”,N”-pentaoctowego (MX-DTPA).

W jednym aspekcie sposobu syntezy MX-DTPA, etap (a) obejmuje stosowanie heksafluorofosforanu benzotriazol-1-iloksytris(dimetyloamino)fosfoniowego (BOP) jako czynnika sprzęgającego.

W innym aspekcie sposobu syntezy MX-DTPA, etap (a) obejmuje stosowanie chlorku bis-(2-okso-3-oksazolidynylo)fosfinowego (BOP-Cl) jako czynnika sprzęgającego.

PL 211 510 B1

W jeszcze innym aspekcie sposobu syntezy MX-DTPA, diaminę zabezpieczoną jedną grupą boc (B') otrzymuje się sposobem obejmującym:

(i) traktowanie laktonitrylu wodorotlenkiem amonu z utworzeniem α-aminonitrylu (2);

(ii) traktowanie (2) kwasem chlorowodorowym z utworzeniem soli chlorowodorku aminy (3);

(iii) zabezpieczanie aminy di-tert-butylodiwęglanem z utworzeniem pochodnej zabezpieczonej boc (4);

(iv) redukcję nitrylu przy użyciu niklu Raneya z nasyconym roztworem etanolu pod ciśnieniem dwóch atmosfer wodoru, z utworzeniem diaminy zabezpieczonej jedną grupą boc (B').

(i) alkilowanie zasady Schiffa (5) w warunkach przejścia fazowego z utworzeniem produktu monoalkilowanego (6);

(ii) odbezpieczanie (6) 1N kwasem chlorowodorowym, po czym zabezpieczanie aminy di-tert-butylodiwęglanem z utworzeniem aminy zabezpieczonej boc (4); i (iii) redukcję (4) niklem Raneya z utworzeniem diaminy zabezpieczonej jedną grupą boc (B').

W następnym aspekcie sposobu syntezy MX-DTPA, usuwanie grup boc w (C') z utworzeniem (D') przeprowadza się przy użyciu kwasu trifluorooctowego w dichlorometanie.

W innym aspekcie sposobu syntezy MX-DTPA, etap redukcji (D') obejmuje traktowanie (D') kompleksem borowodór-tetrahydrofuran, po czym traktowanie chlorowodorem z utworzeniem soli chlorowodorku triaminy (E').

W jeszcze innym aspekcie sposobu syntezy MX-DTPA, pentaalkilowanie związku pośredniego (E') przeprowadza się stosując acetonitryl i węglan potasu.

W jeszcze innym aspekcie sposobu syntezy MX-DTPA, pentaalkilowanie związku pośredniego (E') przeprowadza się przy użyciu bromo-tert-butylooctanu w dimetyloformamidzie i węglanie sodu.

W dodatkowym aspekcie sposobu syntezy MX-DTPA, (F') jest oczyszczany przy użyciu chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym.

W jeszcze innym aspekcie sposobu syntezy MX-DTPA, etap odbezpieczania kwasów karboksylowych w (F') z utworzeniem pochodnej kwasu pentaoctowego (G') przeprowadza się przy użyciu kwasu trifluorooctowego.

W jeszcze innym aspekcie sposobu syntezy MX-DTPA, redukcję grupy nitrowej w (G') z utworzeniem (H') przeprowadza się przy użyciu palladu na węglu pod ciśnieniem dwóch atmosfer wodoru w wodzie.

W jeszcze innym aspekcie sposobu syntezy MX-DTPA, etap przekształcania (H') w MX-DTPA obejmuje przekształcenie aminy (H') w związaną grupę izotiocyjanianową poprzez tiofosgen. Konwersję można prowadzić na kilka sposobów, przykładowo, przez:

(i) dodawanie tiofosgenu do dwufazowej mieszaniny zawierającej pochodną kwasu pentaoctowego (H) w chloroformie i wodzie;

(ii) szybkie mieszanie mieszaniny przez dwie godziny;

(iii) usuwanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem z utworzeniem pozostałości;

(iv) oczyszczanie pozostałości na krzemionce z odwrotną fazą; i (v) wymywanie 25% acetonitrylem w wodzie zawierającej 1% kwas octowy.

Konwersję można także przeprowadzić przy użyciu dichlorometanu i trietyloaminy lub acetonitrylu i wodorowęglanu sodu lub węglanu sodu.

Wynalazek zastrzega kompozycję MX-DTPA, która zasadniczo zawiera tylko pojedynczy regioizomer chelatu. Przez „zasadniczo zawiera tylko” pojedynczy regioizomer, w niniejszym wynalazku rozumie się, że udział procentowy pojedynczego regioizomeru, w stosunku do jakiegokolwiek innego regioizomeru wynosi co najmniej 90%, korzystniej co najmniej 95% i najkorzystniej co najmniej 99%.

W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dotyczy zastosowania takich kompozycji MX-DTPA do wytwarzaniu jego radioznakowanej postaci, środka chelatującego z białkiem lub przeciwciałem jego radioznakowanej postaci.

W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dotyczy zastosowania takiej kompozycji MX-DTPA przy wytwarzaniu radioznakowanych chelatów.

Opisano tutaj również sposób wytwarzania CHx-DTPA obejmujący:

(a) sprzęganie N-tert-butoksykarbonylo-p-nitro-L-fenyloalaniny (A) i zabezpieczonej jedną grupą diaminy (B”) z utworzeniem związku (C”);

(b) usuwanie grup zabezpieczających aminę w (C”) z utworzeniem soli TFA (D”);

PL 211 510 B1 (c) redukcję (D”) z utworzeniem (E”);

(d) pentaalkilowanie (E”) z utworzeniem (F”);

(e) usuwanie grup zabezpieczających aminę w (F”) z utworzeniem soli kwasu trifluorooctowego (G”);

(f) redukcję grupy nitrowej w (G”) z utworzeniem soli kwasu trifluorooctowego (H”); i (g) przekształcenie grupy aminowej w (H”) z utworzeniem CHx-DTPA.

Monozabezpieczoną diaminę (B”) można stosować w postaci izomeru sys lub trans.

Krótki opis rysunków

Figura 1 jest schematem reakcji omawiającym siedmioetapowy proces regiospecyficznej syntezy pochodnych DTPA o wzorze (I).

Figura 2 jest schematem reakcji omawiającym siedmioetapowy proces regiospecyficznej syntezy MX-DTPA.

Figura 3 jest schematem czteroetapowej reakcji syntezy (B').

Figura 4 jest alternatywnym schematem reakcji syntezy (B').

Figura 5 jest schematem reakcji dla alternatywnego etapu 1 w schemacie reakcji z fig. 2.

Figura 6 jest schematem reakcji przedstawiającym niezadowalającą kondensację (B') z użyciem estru metylowego 4-nitro-L-fenyloalaniny (a) w metanolu i (b) w toluenie.

Figura 7 pokazuje dwa alternatywne schematy reakcji (a) i (b) dla alkilowania (E') z utworzeniem (F').

Figura 8 jest schematem alternatywnej reakcji dla przemiany (H') w MX-DTPA.

Figura 9 jest schematem reakcji siedmioetapowego procesu regiospecyficznej syntezy CHx-DTPA.

Figura 10 jest schematem opisującym regioizomery CHx-DTPA selektywnie wytworzone sposobem podanym w wynalazku.

Figura 11 jest schematem dwuetapowej reakcji syntezy (B”).

Szczegółowy opis zalecanych postaci realizacji

Z wyjątkiem innych określeń, wszystkie okreś lenia techniczne i naukowe stosowane w niniejszym mają takie samo znaczenie jak powszechnie rozumiane przez specjalistę w dziedzinie, do jakiej ten wynalazek przynależy. Chociaż w praktyce lub testowaniu niniejszego wynalazku można stosować jakiekolwiek metody i materiały podobne lub równoważne do opisanych w niniejszym, opisuje się zalecane metody i materiały.

Kompozycja MX-DTPA według niniejszego wynalazku może być w procesie wysokowydajnej regioselektywnej syntezy chemicznie modyfikowanych pochodnych DTPA, który eliminuje konieczność rozdzielania związków pośrednich za pomocą chromatografii jonowymiennej. Ponadto, ponieważ w wyniku sposobu powstaje pojedynczy regioizomer chelatu, to prowadzi do regiospecyficznej syntezy wymaganych chelatów stosowanych jako środki radioznakujące.

Konkretniej, fig. 1 jest schematem reakcji omawiającym siedmioetapowy proces regiospecyficznej syntezy pochodnych DTPA o wzorze (II) obejmujący etapy:

(a) sprzęgania N-tert-butoksykarbonylo-p-nitro-L-fenyloalaniny (A) i zabezpieczonej jedną grupą diaminy (B) z utworzeniem związku (C);

(b) usuwania grup zabezpieczających aminę w (C) z utworzeniem soli TFA (D);

(c) redukcji (D) z utworzeniem (E);

(d) pentaalkilowania (E) z utworzeniem (F);

(e) usuwania grup zabezpieczających aminę w (F) z utworzeniem soli kwasu trifluorooctowego (G);

(f) redukcji grupy nitrowej w (G) z utworzeniem soli kwasu trifluorooctowego (H); i (g) przekształcenia grupy aminowej w (H) z utworzeniem pochodnej DTPA o wzorze (I).

Sposób pozwala na syntezę różnych pochodnych DTPA, włącznie z MX-DTPA, 1B3M-DTPA i CHx-DTPA. Charakter pochodnej DTPA jest okreś lony przez wybór zabezpieczonej jedną grupą diaminy (B). R1 i R2 w związku (B) wybiera się tak, aby otrzymać żądaną chemicznie modyfikowaną pochodną DTPA.

Figura 2 zawiera schemat reakcji omawiający siedmioetapowy proces regiospecyficznej syntezy MX-DTPA. W tej postaci realizacji, regioselektywną syntezę MX-DTPA przeprowadza się w następujących etapach:

(a) sprzęgania N-tert-butoksykarbonylo-p-nitro-L-fenyloalaniny (A) i diaminy zabezpieczonej mono-N-tert-butoksykarbonylem (B') z utworzeniem N-(2-N-tert-butoksykarbonyloaminopropylo)-N-tert-butoksykarbonylo-p-nitrofenyloalaninoamidu (C');

PL 211 510 B1 (b) usuwania grup boc w (C') z utworzeniem soli TFA N-(2-aminopropylo)-p-nitrofenyloalaninoamidu (D');

(c) redukcji (D') z utworzeniem trichlorowodorku 2-metylo-6-(p-nitrobenzylo)dietylenotriaminy (E');

(d) pentaalkilowanie (E') z utworzeniem N,N,N',N”,N”-pentakis[(tert-butoksykarbonylo)metylo]-2-[(4-nitrofenylo)metylo]-6-metylodietylenotriaminy (F');

(e) usuwania grup boc w (F') z utworzeniem soli kwasu trifluorooctowego N,N,N',N”,N”-pentakis(karboksymetylo)-2-[(4-nitrofenylo)metylo]-6-metylodietylenotriaminy (C);

(f) redukcji grupy nitrowej w (G') z utworzeniem soli kwasu trifluorooctowego N,N,N',N”,N”-pentakis(karboksymetylo)-2-[(4-aminofenylo)metylo]-6-metylodietylenotriaminy (H'); i (g) przekształcenie grupy aminowej w (H') z utworzeniem kwasu 2-(p-izotiocyjanianobenzylo)-6-metylodietylenotriamino-N,N,N',N”,N”-pentaoctowego (MX-DTPA).

Proces regiospecyficznej syntezy MX-DTPA ma wydajność całkowitą wynoszącą około 20% wychodząc z diaminy zabezpieczonej jedną grupą boc (B') i boc-p-nitro-L-fenyloalaniny (A) i jest możliwe zwiększanie skali. Tak więc, synteza MX-DTPA, która jest stosowana w kompozycji zgodnie z wynalazkiem pozwala na uzyskanie całkowitej wydajności syntezy około jednego rzędu wyższej niż całkowita wydajność otrzymywana z zastosowaniem wcześniejszego procesu (poniżej 2%). Dodatkowo, wcześniejsze procesy syntezy wymagały oczyszczania związku pośredniego poprzez żmudną chromatografię aniono- i kationowymienną. W przeciwieństwie do tego, w sposobie z fig. 2 wymagana jest tylko jedna kolumna do chromatografii z normalną fazą i kolumna z odwróconą fazą do wymaganej czystości końcowego związku.

Figura 3 jest schematem czteroetapowej syntezy diaminy zabezpieczonej jedną grupą boc (B').

Syntezę (B') prowadzi się przez traktowanie dostępnego na rynku laktonitrylu wodorotlenkiem amonu, uzyskując α-aminonitryl (2), z którego po traktowaniu kwasem chlorowodorowym otrzymuje się sól chlorowodorku aminy (3). Zabezpieczanie aminy di-tert-butylodiwęglanem daje pochodną zabezpieczoną boc (4). Redukcja nitrylu przy użyciu niklu Raneya z nasyconym roztworem etanolu pod ciśnieniem dwóch atmosfer wodoru, daje wymaganą diaminę zabezpieczoną jedną grupą boc (B'). Ta sekwencja reakcji jest szczególnie atrakcyjna z ekonomicznego punktu widzenia, ponieważ jest powtarzalna i można łatwo zwiększać skalę.

Badano również kilka innych warunków dla wytwarzania (B'). Przykładowo, fig. 4 pokazuje schemat reakcji syntezy (B'), gdzie (B') wytwarza się przez alkilowanie zasady Schiffa (5) w warunkach przejścia fazowego, z wytworzeniem produktu monoalkilowanego (6) ze średnią wydajnością. Odbezpieczanie (6) 1N kwasem chlorowodorowym daje aminę zabezpieczoną boc (4), która po redukcji niklem Raneya daje wymaganą diaminę zabezpieczoną jedną grupą boc (B').

W postaci realizacji pokazanej na fig. 1, synteza wykorzystuje N-tert-butoksykarbonylo-p-nitro-L-fenyloalaninę (A), którą sprzęga się z diaminą zabezpieczoną jedną grupą N-tert-butoksykarbonylową (B'). Zalecanym reagentem sprzęgającym do przeprowadzenia tego etapu jest heksafluorofosforan benzotriazol-1-iloksytris(dimetyloamino)fosfoniowy (BOP). Warunki te pozwalają na syntezę związku (C') z wydajnością izolowania wynoszącą od 72 do 83%. Oczyszczanie (C') można uzyskać przez przemywanie kwasem/zasadą, po czym ucieranie z heksanami.

Figura 5 jest schematem reakcji przedstawiającym alternatywny etap 1 w schemacie reakcji z fig. 2. Jak ukazano na fig. 5, stosowanie chlorku bis(2-okso-3-oksazolidynylo)fosfinowego (BOP-Cl) także daje w rezultacie utworzenie żądanego produktu (C'); jednak wydajność tej reakcji wynosi 23% w porównaniu z wydajnością 83%, którą można uzyskać w etapie 1 według fig. 2.

Inne drogi reakcji syntezy (C') były niezadowalające. Przykładowo, jak pokazano schematycznie na fig. 6, wysiłki utworzenia pokrewnej pochodnej (C') poprzez bezpośrednią kondensację (B') z estrem metylowym 5 4-nitro-L-fenyloalaniny (1) albo przez (a) mieszanie w metanolu, albo (b) ogrzewanie w temperaturze refluksu w toluenie, były niezadowalające.

Mając uzyskaną możliwą do przeprowadzenia syntezę związku (C'), grupy zabezpieczające boc można usunąć przy użyciu kwasu trifluorooctowego w dichlorometanie, z utworzeniem diaminy (D'). W tym procesie, (D') wytwarza się z wydajnością ilościową (100%) w postaci ciała stałego.

Jak opisano na fig. 2, redukcja amidu (D') i kompleksem borowodór-tetrahydrofuran, po czym traktowanie chlorowodorem, daje utworzenie soli chlorowodorku triaminy (E'). Oprócz etapu alkilowania opisanego na fig. 2, można stosować inne drogi reakcji. Przykładowo, fig. 7 pokazuje dwa schematy reakcji (a) i (b) alkilowania (E') z utworzeniem (F'). Pentaalkilowanie związku pośredniego (E') można przeprowadzić przy użyciu bromo-tert-butylooctanu w dimetyloformamidzie i węglanie sodu jako zasady albo alternatywnie przy użyciu acetonitrylu jako rozpuszczalnika oraz węglanu potasu.

PL 211 510 B1

Ostatnie warunki bardziej sprzyjają zwiększaniu skali i eliminują stosowanie dimetyloformamidu, który jest ogólnie trudny do usunięcia. Wydajność izolowanego związku dla tego etapu jest rzędu 60%, gdy pozwala się na przebieg reakcji przez 72 do 96 godzin. Oczyszczanie (F') przeprowadza się korzystnie poprzez chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym.

Jak ukazano schematycznie na fig. 2, pochodną kwasu pentaoctowego (G') można otrzymać przez odbezpieczenie kwasów karboksylowych, korzystnie przez stosowanie kwasu trifluorooctowego. Redukcję grup nitrowych prowadzi się przy użyciu palladu na węglu pod ciśnieniem dwóch atmosfer wodoru w wodzie. Należy zauważyć, że unika się wad wcześniejszych znanych procesów syntezy. Przykładowo, unika się stosowania wodorotlenku amonu, który jest trudny do usuwania i komplikuje proces syntezy przez wymóg etapu tworzenia izocyjanianu, z powodu tworzenia jako produktu ubocznego tiomocznika.

Końcowy etap reakcji według schematu z fig. 2 odnosi się do przekształcenia aminy w związaną grupę izotiocyjanianową poprzez tiofosgen. Z tego względu, Zgłaszający prześledzili różne warunki operacyjne.

Zalecane warunki dla przekształcania (H') w MX-DTPA są opisane w ostatnim etapie schematu na fig. 2. Warunki te obejmują dodawanie tiofosgenu do dwufazowej mieszaniny, zawierającej pochodną kwasu pentaoctowego (H') w chloroformie i wodzie oraz szybkie mieszanie mieszaniny przez dwie godziny. Usuwanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym oczyszczanie pozostałości na krzemionce z odwrotną fazą i wymywanie 25% acetonitrylem w wodzie zawierającej 1% kwas octowy, dawało docelowy związek MX-DTPA z dobrą wydajnością.

Prześledzono także inne warunki operacyjne. Przykładowo, fig. 8 pokazuje schemat reakcji konwersji (H') w MX-DTPA przy użyciu dichlorometanu jako rozpuszczalnika i trietyloaminy jako zasady. Jednak, oprócz MX-DTPA reakcja powoduje także utworzenie chlorowodorku trietyloaminy jako produktu ubocznego, którego nie można było łatwo usunąć.

Przemianę (H') w MX-DTPA można także przeprowadzić przy użyciu acetonitrylu jako rozpuszczalnika i wodorowęglanu sodu lub węglanu sodu jako zasady. W wyniku tej reakcji powstają również inne zanieczyszczenia.

Kompozycja MX-DTPA według wynalazku może być skutecznie stosowana w wielu zastosowaniach wymagających chelatorów (środków chelatujących). Przykładowo, kompozycja MX-DTPA zapewnia skuteczne radioznakowane środki chelatujące, środki chelatujące przeciwciała i środki chelatujące białka. Radioznakowany MX-DTPA zapewnia skuteczne narzędzie do licznych zastosowań, takich jak scyntygrafia, radioterapia i testy radioimmunologiczne.

Sposób syntezy MX-DTPA przedstawia liczne korzyści. Przykładowo, sposób nie wymaga chromatografii kationo- i anionowymiennej koniecznej przy uciążliwym oczyszczaniu związków pośrednich. Unikając potrzeby chromatografii kationo- i anionowymiennej zapewnia się sposób, którego skalę można łatwo powiększyć.

Inna korzyść odnosi się do wysokiej wydajności uzyskiwanej w tym sposobie. Jak omawiano powyżej, chelaty skuteczne przy stosowaniu w testach radioimmunologicznych muszą być łatwo dostępne w ilościach wystarczających do zaspokojenia potencjalnie wysokiego zapotrzebowania.

Sposób może zapewnić MX-DTPA z wydajnością tak wysoką jak 20%, jeden rząd wielkości wyższą niż istniejące procesy syntezy MX-DTPA.

Chelaty MX-DTPA syntetyzowane tym sposobem mają wysoką czystość. Dostarczanie chelatu w postaci czystej zapewnia liczne korzyści, takie jak łatwiejsze kondycjonowanie i wytwarzanie chelatowanych MAb, gdzie obecność niepożądanych produktów ubocznych jest zminimalizowana. Minimalizacja zanieczyszczeń w syntetyzowanych chelatach pozwala na łatwiejsze kondycjonowanie chelatu do zastosowań biologicznych.

Dodatkowa korzyść odnosi się do regiospecyficzności uzyskanej tym sposobem, który zapewnia regiospecyficzną syntezę MX-DTPA.

Nie wiążąc się z jakąkolwiek teorią, regiospecyficzną syntezę MX-DTPA, można uzyskać przez stosowanie związku (A) w postaci pojedynczego izomeru. Po wybraniu poszczególnego izomeru związku (A) do rozpoczęcia procesu syntezy, konfiguracja wokół węgla chiralnego w (A) jest utrzymywana przez proces syntezy.

Stosowanie MX-DTPA w postaci pojedynczego regioizomeru przedstawia kilka korzyści. Przykładowo, stosowanie pojedynczego izomeru MX-DTPA zapewnia lepsze wyniki scyntygrafii i unika utraty sygnału optycznego, związanej z użyciem mieszanin racemicznych. Także stosowanie pojedynczego izomeru pozwala na planowanie kompleksów MAb-CA o wysokiej specyficzności. Z tego

PL 211 510 B1 względu, stosowanie pojedynczego izomeru pozwala na związanie wszystkich cząsteczek chelatu z MAb w zasadniczo taki sam sposób.

Inna korzyść specyficznej syntezy pojedynczego regioizomeru MX-DTPA dotyczy kontroli zapewnionej przez pozycjonowanie chelatowanego radionuklidu w stosunku do MAb i ostatecznie docelowego nowotworu. Kontrolowanie pozycjonowania radionuklidu jest możliwe przez stosowanie pojedynczego izomeru MX-DTPA. Korzyści zapewnienia pojedynczego sposobu wiązania przez użycie pojedynczego izomeru, obejmują potencjalną poprawę obrazowania i wyników immunoterapeutycznych uzyskiwanych z kompleksem MAb-CA.

Chelat MX-DTPA według wynalazku jest odpowiedni do chelatowania różnych radionuklidów. Chelat jest także odpowiedni do kompleksowania z różnymi MAb i białkami. Tak więc, uważa się, że chelat MX-DTPA według wynalazku zapewnia równie skuteczne czynniki radioznakujące i terapeutyczne jeśli łączy się je z jakimkolwiek radionuklidem lub MAb odpowiednim do łączenia z MX-DTPA.

W jednej postaci realizacji, MX-DTPA sprzęga się z przeciwciał em 2B8 z utworzeniem 2B8-MX-DTPA. 2B8 jest przeciwciałem anty-CD20 które jak się okazuje, wpływa na utratę limfocytów B przy podawaniu pacjentom z chłoniakiem. Szczegółowe protokoły tworzenia 2B8-MX-DTPA są opisane szczegółowo w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 5 736 137, którego zawartość załącza się w niniejszym przez odniesienie w całości.

Jednak, powinno być widoczne dla fachowców, że środki chelatujące MX-DTPA według wynalazku można stosować w radioznakowaniu innych przeciwciał anty-CD20 lub jakiegokolwiek innego przeciwciała, które sprzęga się z DTPA lub innym poliwalentnym środkiem chelatującym. Także, chelaty MX-DTPA wytwarzane można dołączyć do innych białek i peptydów, np. receptorów, hormonów, czynników wzrostu, takich jak peptydy somatostatyny.

Choć wyżej wyszczególniony opis skupia się na syntezie MX-DTPA, sposób jest równie możliwy do stosowania w syntezie innych chemicznie modyfikowanych pochodnych DTPA. Z tego względu, sposób ten można korzystnie stosować w regioselektywnej syntezie różnych pochodnych DTPA odpowiednich do chelatowania metali radioaktywnych i sprzęgania z immunoglobulinami. Sposób obejmuje sprzęganie jednozabezpieczonej diaminy i związku obejmującego aminę i cząstkę zdolną do skutecznego sprzęgania pochodnej DTPA z immunoglobulinami lub cząstkę zdolną do przekształcania w celu skutecznego sprzęgania pochodnej DTPA z immunoglobulinami. Jak fachowiec może łatwo zauważyć, sposób jest szczególnie korzystny pod tym względem, że można sprzęgać różne jednozabezpieczone diaminy z różnymi związkami obejmującymi aminę i cząstkę zdolną do skutecznego sprzęgania pochodnej DTPA z immunoglobulinami lub cząstkę zdolną do przekształcania w celu skutecznego sprzęgania pochodnej DTPA z immunoglobulinami.

Przykładowo, pochodne, 1B3M-DTPA mogą być wytworzone zgodnie ze schematem reakcji podobnym do schematu reakcji z fig. 2. 1B3M-DTPA wytwarza się przez użycie izomeru (B'), gdzie pozycje R1 (czyli H) i R2 (czyli CH3) są wymieniane.

CHx-DTPA jest innym przykładem pochodnych DTPA, które można wytworzyć zgodnie ze sposobem opisanym na fig. 9, która jest schematem reakcji omawiającym proces syntezy CHx-DTPA. W etapie (a) schematu z fig. 9, diaminocykloheksan zabezpieczony jedną grupą Boc (B”) poddaje się kondensacji ze związkiem (A) tworząc związek (C”). Po utworzeniu związku (C”) synteza CHx-DTPA przebiega w etapach podobnych do tych z fig. 2.

Diaminę (B”) można stosować w postaci sys lub trans w celu wytworzenia odpowiadających izomerów CHx-DTPA. fig. 10 opisuje regioizomery CHx-DTPA, które można wytworzyć przez łączenie wybranych izomerów związku (A) i (B”).

Jednozabezpieczoną diaminę (B”) można wytworzyć różnymi sposobami. Zalecana droga wytwarzania (B”) jest opisana w schemacie dwuetapowej reakcji z fig. 11.

P r z y k ł a d y

Dostępne na rynku odczynniki i klasy HPLC lub bezwodne rozpuszczalniki stosowano bez dodatkowego oczyszczania. Chromatografię kolumnową z normalną fazą i TLC przeprowadzano na żelu krzemionkowym ICN (63-200, 60A) i żelu krzemionkowym Merck (60A) odpowiednio ze wskaźnikiem fluorescencyjnym. Chromatografię kolumnową z odwrotną fazą i TLC przeprowadzano na EM Science

LiChroprep RP-18 (40-63 μm) i Techware RPS-F żelu krzemionkowym z odwrotną fazą, impregnowanym węglowodorem odpowiednio ze wskaźnikiem fluorescencyjnym.

Synteza 1-N-tert-butoksykarbonylo-2-metyloetylenodiaminy (B')

a. Chlorowodorek 2-aminopropanonitrylu (3)

PL 211 510 B1

Mieszaninę zawierającą 23,1 g (324, 99 mmola) laktonitrylu (klasa techniczna czystość 90%), 7,1 g (132,74 mmola) chlorku amonu i 86 ml (2208,3 mmola) wodorotlenku amonu pozostawiano do mieszania w temperaturze pokojowej na 2 godziny. Środowisko reakcyjne ekstrahowano dichlorometanem (2 x 500 ml) i fazę organiczną suszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Mieszaninę filtrowano i rozpuszczalnik usuwano pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem 24 g żółtego oleju (2). Żółty olej rozcieńczano 250 ml bezwodnego eteru dietylowego i chłodzono w łaźni z lodem. Następnie, dodawano 350 ml (350 mmola) 1N kwas chlorowodorowy w eterze. Po mieszaniu przez 10 minut, otrzymane ciało stałe filtrowano, przemywano eterem i suszono pod próżnią z wytworzeniem 28,79 g produktu z wydajnością 92,83%, na podstawie czystości wyjściowego laktonitrylu.

b. N-tert-butoksykarbonylo-2-aminopropanonitryl (4)

Do mieszaniny zawierającej 28,5 g (268,79 mmola) chlorowodorku 2-amino propanonitrylu w 300 ml bezwodnego dichlorometanu dodawano 104 ml (746,16 mmola) trietyloaminy. Mieszanin ę chłodzono w łaźni z lodem po czym dodawano 64,5 g (295,53 mmola) di-tert-butylodiwęglanu w 100 ml bezwodnego dichlorometanu przez 30 minut. Środowisko reakcyjne pozostawiano do ogrzania do temperatury pokojowej przy mieszaniu przez 48 godzin. Mieszaninę reakcyjną filtrowano przez lejek ze szkła spiekanego i przesącz redukowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodawano 1 litr eteru dietylowego i mieszaninę pozostawiano do mieszania przez 15 minut. Mieszaninę ponownie filtrowano przez lejek ze szkła spiekanego w celu usunięcia pozostałego chlorowodorku trietyloaminy. Przesącz zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem. Chromatografia kolumnowa pozostałości na żelu krzemionkowym z wymywaniem mieszaniną 30% octan etylu/heksany dała 18,50 g produktu z wydajnością 40,44%.

c. 1-N-tert-butoksykarbonylo-2-metyloetylenodiamina (B')

Do 500 ml kolby Parra dodawano 18,4 g (108,10 mmola) N-tert-butoksykarbonylo-2-aminopropanonitrylu i 200 ml absolutnego etanolu nasyconego amoniakiem. Następnie, dodawano nikiel Raneya (10 g 50% zawiesiny w wodzie) i kolbę poddawano ciśnieniu 50 psi (0,33 MPa) gazowego wodoru i wentylowano. Kolbę ponownie poddawano ciśnieniu 50 psi (0,33 MPa) gazowego wodoru i wentylowano. Następnie, kolbę poddawano ciśnieniu 50 psi (0,33 MPa) gazowego wodoru i wytrząsano dopóki nie było już dalszego wychwytu wodoru, co generalnie uzyskuje się przez noc. Kolbę wentylowano i mieszaninę filtrowano przez wkład celitu 521. Przesącz zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem 19,2 g produktu w postaci bezbarwnego oleju z wydajnością ilościową (100%). Alternatywnie, chlorowodorek 2-aminopropanonitrylu (3) można wytworzyć z N-(difenylometyleno)aminoacetonitrylu, w następujący sposób.

a. N-(difenylometyleno)-2-metyloaminoacetonitryl (6)

Do roztworu zawierającego 50 g (226,98 mmola) N-(difenylometyleno)aminoacetonitrylu w 250 ml toluenu dodawano 4,5 g (19,76 mmola) chlorku benzylotrietyloamoniowego (BTEAC) po czym dodawano 28,3 g (707,50 mmola) wodorotlenku sodu w 50 ml wody. Środowisko reakcyjne chłodzono w ł a ź ni z lodem po czym wkraplano 22 ml (232,51 mmola) siarczanu metylu przez 1 godzinę . Ś rodowisko reakcyjne pozostawiano do ogrzania do temperatury pokojowej przez 24 godziny. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczano 1 litrem dichlorometanu i przemywano wodą (2 x 1 litr). Fazę organiczną suszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Filtracja, usuwanie rozpuszczalnika i chromatografia kolumnowa pozostałości na żelu krzemionkowym z wymywaniem mieszaniną 20% octan etylu/heksany dawało 46,2 g produktu z wydajnością 62,05%.

b. Chlorowodorek 2-aminopropanonitrylu (3)

Mieszaninę zawierającą 3,0 g (12,80 mmola) N-difenylometyleno)-2-metyloaminoacetonitrylu w 30 ml heksanu i 25 ml (25 mmola) 1N wodnego roztworu kwasu chlorowodorowego pozostawiano do mieszania w temperaturze pokojowej przez 72 godziny. Fazę wodną oddzielano i przemywano heksanem. Zatężanie fazy wodnej pod zmniejszonym ciśnieniem dało 1,25 g produktu z wydajnością 92,10%.

N-(2-N-tert-butoksykarbonyloaminopropylo)-N-tert-butoksykarbonylo-p-nitrofenyloalaninoamid (C')

Do roztworu zawierającego 25 g (80,57 mmola) N-t-boc-p-nitro-L-fenyloalaniny w 300 ml bezwodnego dichlorometanu dodawano 12,5 ml (89,68 mmola) trietyloaminy, po czym 37 g (83,66 mmola) heksafluorofosforanu benzotriazol-1-iloksy-tris(dimetyloamino)fosfoniowego (BOP). Po mieszaniu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę , dodawano 15,1 g (86,66 mmola) 1-N-tert-butoksykarbonylo-2-metyloetylenodiaminy w 40 ml bezwodnego dichlorometanu. Środowisko reakcyjne pozostawiano do mieszania w temperaturze pokojowej przez 20 godzin. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczaPL 211 510 B1 no 300 ml dichlorometanu i przemywano 1N wodnym roztworem kwasu chlorowodorowego (2 x 500 ml), nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2 x 500 ml) i wodą (1 x 500 ml). Fazę organiczną suszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Filtracja i usuwanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem dało żółte ciało stałe. Następnie dodawano heksany (600 ml) i mieszaninę pozostawiono przy mieszaniu przez 20 minut. Ciało stałe filtrowano i suszono uzyskując 27,0 g (71,83%) produktu w postaci białego ciała stałego.

Sól TFA N-(2-aminopropylo)-p-nitrofenyloalaninoamidu (D')

Do roztworu zawierającego 26,50 g (56,80 mmola) N-(2-N-tert-butoksykarbonyloaminopropylo)-N-tert-butoksykarbonylo-p-nitrofenyloalaninoamidu w 300 ml dichlorometanu, dodawano 65 ml (843,77 mmola) kwasu trifluorooctowego. Środowisko reakcyjne pozostawiano do mieszania w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Rozpuszczalnik usuwano pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym dodawano 500 ml bezwodnego eteru dietylowego. Otrzymane ciało stałe filtrowano przez lejek ze szkła spiekanego i przemywano 400 ml eteru dietylowego. Ciało stałe suszono pod próżnią uzyskując 32,0 g (100%) produktu zawierającego pewne pozostałości kwasu trifluorooctowego i eteru dietylowego. Materiał stosowano bez dodatkowego oczyszczania.

Trichlorowodorek 2-metylo-6-(p-nitrobenzylo)dietylenotriaminy (E')

Do roztworu zawierającego 35 g (70,80 mmola) soli TFA N-(2-aminopropylo)-p-nitrofenyloalaninoamidu w 500 ml bezwodnego tetrahydrofuranu dodawano 500 ml 1M kompleksu borowodór-tetrahydrofuran przez 30 minut. Środowisko reakcyjne ogrzewano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin przez 16 godzin. Po ochłodzeniu reakcji w łaźni z lodem, dodawano powoli 122 ml metanolu, aby zobojętnić nadmiar odczynnika borowodorowego. Po zakończeniu wydzielania gazu, rozpuszczalnik usuwano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość odbierano w 265 ml absolutnego etanolu i roztwór nasycano kwasem chlorowodorowym (g) podczas chłodzenia w łaźni lodowej. Następnie mieszaninę rozcieńczano 200 ml bezwodnego eteru dietylowego i otrzymane ciało stałe filtrowano i suszono pod próżnią z wytworzeniem 19,39 g produktu, z wydajnością 75,72%.

N,N,N',N”,N”-pentakis-[(tert-butoksykarbonylo)metylo]-2-[(4-nitrofenylo)metylo]-6-metylodietylenotriamina (F')

Do mieszaniny zawierającej 19,0 g (52,53 mmola) trichlorowodorku 2-metylo-6-p-nitrobenzylo)-dietylenotriaminy w 550 ml bezwodnego acetonitrylu dodawano 86,60 g (626,58 mmola) węglanu potasu, po czym 42 ml (284, 44 mmola) tert-butylobromooctanu. Po mieszaniu w temperaturze pokojowej przez 90 godzin, środowisko reakcyjne rozcieńczano 500 ml wody i ekstrahowano octanem etylu (2 x 500 ml). Fazę organiczną suszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Filtracja i usuwanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem dało żółty olej. Chromatografia kolumnowa tego oleju na żelu krzemionkowym z wymywaniem mieszaniną 30% octan etylu/heksany dało 26,37 g produktu z wydajnoś cią 60,99%.

Sól kwasu trifluorooctowego N,N,N'N”,N”-pentakis(karboksymetylo)-2-[(4-nitrofenylo)metylo]-6-metylodietylenotriaminy (G')

Roztwór zawierający 5,0 g (6,08 mmola) N,N,N',N”,N”-pentakis[(tert-butoksykarbonylo)metylo]-2-[(4-nitrofenylo)metylo]-6-metylodietylenotriaminy w 35 ml kwasu trifluorooctowego pozostawiano do mieszania w temperaturze pokojowej na 48 godzin. Rozpuszczalnik usuwano pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymane ciało stałe suszono pod próżnią z wytworzeniem 4,02 g produktu w postaci bladożółtego ciała stałego, z wydajnością 74,75%.

Sól kwasu trifluorooctowego N,N,N',N”,N”-pentakis(karboksymetylo)-2-((4-aminofenylo)metylo]-6-metylodietylenotriaminy (H')

Do kolby Parra dodawano 3,40 g soli kwasu trifluorooctowego (3,84 mmola) N,N,N',N”,N”-pentakis(karboksymetylo)-2-[(4-nitrofenylo)metylo]-6-metylodietylenotriaminy i 50 ml wody, po czym dodawano 0,3 g 5% palladu na węglu. Kolbę poddawano ciśnieniu 30 psi (0,21 MPa) wodoru i dwukrotnie wentylowano. Naczynie następnie poddawano ciśnieniu 45 psi (0,31 MPa) i wytrząsano. Po zaniknięciu wychwytu wodoru, zwykle po 2 do 4 godzinach, kolbę wentylowano i mieszaninę filtrowano przez wkład celitu. Celit przemywano 20 ml wody. Przesącz zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 3,02 g produktu z wydajnością 92,03%. Dane widma otrzymane dla tego produktu są zgodne z danymi odnośnego standardu.

Kwas 2-(p-izotiocyjanianobenzylo)-6-metylodietylenotriamino-N,N,N',N”,N”-pentaoctowy (MX-DTPA)

PL 211 510 B1

W 1-litrowej okrąg ł odennej kolbie zaopatrzonej w mieszadł o magnetyczne, dodawano 7,0 g soli kwasu trifluorooctowego (7,23 mmola) N,N,N',N”,N”-pentakis(karboksymetylo)-2-[(4-aminofenylo)metylo]-6-metylodietylenotriaminy do mieszaniny zawierającej 150 ml wody i 300 ml chloroformu, po czym 4,67 g (44, 06 mmola) węglanu sodu. Otrzymany roztwór miał pH wynoszące około 9,0. Do tej dwufazowej mieszaniny dodawano 0,64 ml (8,39 mmola) tiofosgenu i roztwór pozostawiano do mieszania w temperaturze pokojowej na 2 godziny. Rozpuszczalnik usuwano pod zmniejszonym ciśnieniem z utworzeniem pozostałości. Pozostałość rozpuszczano w 15 ml 1% kwasu octowego w wodzie i umieszczano na kolumnie z ż elem krzemionkowym o odwrotnej fazie, z wymywaniem 1% kwasem octowym, po czym mieszaniną 25% acetonitryl/woda zawierająca 1% kwas octowy. Frakcje zawierające produkt zlewano i rozpuszczalnik usuwano pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem 2,47 g produktu w postaci bladożółtego ciała stałego, z wydajnością 61,60%.

Claims

1. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera regioizomer metylodietylenotriamino-N,N,N',N”,N”-pentaoctowego (MX-DTPA) o wzorze (I):

gdzie procentowa zawartość tego regioizomeru, w stosunku do każdego innego regioizomeru, jest co najmniej 90%.

2. Zastosowanie kompozycji takiej jak podano w zastrzeżeniu 1 do wytwarzania radioznakowanego MX-DTPA.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, gdzie radioznakowany MX-DTPA jest przyłączony do białka.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, gdzie białkiem jest przeciwciało.