PL212129B1

PL212129B1 - Peptyd wiążący się do cząsteczki MHC, kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten peptyd i zastosowanie peptydu

Info

Publication number: PL212129B1
Application number: PL371549A
Authority: PL
Inventors: David Cameron Wraith; Heather Barbara Streeter; Frances Mary Ponsford; Graziella Mazza
Original assignee: Apitope Technology Bristol Ltd
Priority date: 2002-02-01
Filing date: 2003-01-30
Publication date: 2012-08-31
Also published as: KR20040108650A; MXPA04007510A; CN1625564A; ZA200405546B; PL371549A1; NO20043210L; BRPI0307276B1; JP4559082B2; AU2003202701B2; NZ534233A; SI1474443T1; CY1110862T1; EP1474443B1; EP1474443A1; HK1066551A1; BRPI0307276B8; ATE477269T1; US20050058643A1; CO5601035A2; CA2473469A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest peptyd zdolny do wiązania się z cząsteczką MHC klasy I i II bez dalszego przekształcania (to znaczy apitop), który zawiera część regionu (131-158) zasadowego białka mieliny, zwłaszcza dostarcza apitop, który jest wybrany z grupy następujących zasadowych peptydów mieliny:(134-148, 135-149, 136-150, 137-151, 138-152, 139-153, 140-154). Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie takiego peptydu w kompozycji farmaceutycznej i także sposób leczenia i/lub zapobiegania chorobie stosując taki peptyd.

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy peptydu wiążącego się do cząsteczki MHC, kompozycji farmaceutycznej zawierającej ten peptyd i zastosowania tego peptydu. Wynalazek opisuje peptydy z zasadowego białka mieliny i ich zastosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu chorobie.

Tło wynalazku

W adaptatywnej odpowiedzi immunologicznej, limfocyty T są zdolne do rozpoznawania wewnętrznych epitopów antygenu białkowego. Komórki prezentujące antygen (APC)(ang. antigen presenting cells) pobierają antygeny białkowe i rozkładają je na krótkie fragmenty peptydowe. Peptyd może wiązać się z cząsteczką głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) (ang. major histocompatibility complex) klasy I lub II i jest skierowywany na powierzchnię komórki. Kiedy zostaje zaprezentowany na powierzchni komórki w połączeniu z cząsteczką MHC peptyd ten może być rozpoznany przez komórkę T (poprzez receptor komórki T (TCR), ang. T cell receptor), i w tym przypadku peptyd ten jest epitopem komórki T.

Epitopy komórek T grają główną rolę w adaptatywnej odpowiedzi immunologicznej na każdy, czy to swój czy obcy, antygen. Główna rola jaką grają epitopy komórek T w chorobach nadwrażliwości (obejmujących alergie, choroby autoimmunologiczne i odrzuty przeszczepów) była pokazywana z zastosowaniem modeli doświadczalnych. Możliwe jest wywoływanie chorób zapalnych lub alergicznych przez wstrzyknięcie syntetycznych peptydów (w oparciu o budowę epitopów komórki T) w połączeniu z adiuwantem.

W przeciwieństwie do tego, wykazano, że możliwe jest wywołanie tolerancji immunologicznej w stosunku do poszczególnych epitopów peptydowych przez podanie epitopów peptydów w postaci rozpuszczalnej. Podanie rozpuszczalnych antygenów peptydowych pokazano jako skuteczny środek hamujący chorobę w doświadczalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu (EAE - model stwardnienia rozsianego (MS)) (Metzler and Wright (1993) Int. Immunol. 5:1159-1165; Liu i Wraith (1995) Int. Immunol. 7:1255-1263; Anderton I Wraith (1998) Eur. L. Immunol. 28:1251-1261); i w doświadczalnych modelach zapalenia stawów, cukrzycy i zapaleniu błony naczyniowej siatkówki (wspomniane w Anderton i Wraith (1998) jak wyżej). Zademonstrowano to także jako sposoby lecznicza początku choroby w EAE (Anderton i Wraith (1998) jak wyżej). Zastosowanie tolerogenicznych peptydów do leczenia lub zapobiegania chorobie spotkało się z dużym zainteresowaniem. Jedną z przyczyn było to, że jak wykazano, pewne tolerogeniczne epitopy mogą ujemnie regulować odpowiedź komórek T na różne antygeny w obrębie tej samej tkanki. To zjawisko, znane jako bystander suppresion („przygodnego widza) znaczy, że byłoby możliwym indukowanie tolerancji na więcej niż jeden epitop (korzystnie wszystkie epitopy) w obrębie danego antygenu i na więcej niż jeden antygen dla danej choroby, stosując określony peptyd tolerogeniczny (Anderton i Wraith (1998) jak wyżej). Mogłoby to zapobiegać konieczności identyfikowania wszystkich antygenów patogenicznych w określonej danej chorobie.

Peptydy są także korzystną ewentualnością dla terapii z powodu ich stosunkowo niewielkich kosztów i faktu, że analogi peptydowe mogą być wytwarzane z zmienionymi właściwościami immunologicznymi. Peptydy mogą zatem być modyfikowane w celu zmiany ich wzajemnych oddziaływań z MHC albo TRC.

Jednym ewentualnym problemem w podejściu tym jest to, że jak wykazano, nie wszystkie peptydy, które działają jak epitopy komórek T, są zdolne do wywoływania tolerancji. Peptyd 89-101 zasadowego białka mielinowego (MBP) jest immunodominującym antygenem po immunizacji i jest także bardzo skutecznym immunogenem zarówno pod względem primingu reaktywności komórki T i indukcji EAE. Jednakże, peptyd ten był pokazany jako nieskuteczny przy indukowaniu tolerancji gdy był podawany w roztworze (Anderton i Wraith (1998) jak wyżej).

Proponowano wiele wyjaśnień obserwowanej hierarchii zdolności epitopów komórki T do indukowania tolerancji (opisanych w Anderton i Wraith (1998) jak wyżej). Zwłaszcza, zaproponowano, że istnieje korelacja pomiędzy powinowactwem tego peptydu dla MHC a tolerogenicznością (Liu i Wraith (1995), lecz to nie zgadza się z pewnymi obserwacjami. Na przykład, MBP[89-101], które nie jest tole_S rogeniczne, wiąże I-A^S z względnie wysokim powinowactwem. Nie można zatem w prosty sposób przewidzieć, który peptyd będzie wywoływał tolerancję.

Niniejszy wynalazek pokazuje, że jeśli epitop peptydu jest odpowiedniej wielkości aby był prezentowany przez niedojrzałe komórki prezentujące antygen bez obróbki antygenu, to może on indukować tolerancję immunologiczną (Międzynarodowe zgłoszenie patentowe o numerze PCT/GB01/03702). Spostrzeżenie, że pewne epitopy komórek T są tolerogeniczne a inne są niezdolne do indukowania

PL 212 129 B1 tolerancji można wytłumaczyć faktem, że pewne epitopy wymagają dalszej obróbki zanim będą zdolne do prezentowania ich przez cząsteczkę MHC. Te epitopy, które wymagają dalszej obróbki nie indukują tolerancji, gdy podane są w rozpuszczalnej postaci, pomimo tego, że są zdolne do indukowania choroby kiedy są wstrzyknięte w połączeniu z adiuwantem.

Te epitopy, które nie wymagają dalszej obróbki są zdolne do wywoływania tolerancji, i zostały nazwane ,,apitopami (epitopy niezależne od obróbki antygenu) (ang. Antigen Processing Independent epiTOPES).

Streszczenie wynalazku

Twórcy niniejszego wynalazku przebadali region 131-158 MBP i znaleźli wiele peptydów, które mogą być prezentowane komórkom T przez utrwalone komórki prezentujące antygen.

Peptydy te są zdefiniowane jako apitopy, ponieważ są one zdolne do wiązania MHC klasy I lub II bez dalszej obróbki.

Dlatego, w pierwszym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy peptydu zdolnego do wiązania się do cząsteczki MHC klasy I lub II bez dalszej obróbki i który jest wybrany z następujących peptydów zasadowego białka mieliny: YKKKSAHKGFKGVDAQG (134-148),

KSAHKGFKGVDAQGT (135-149),

SAHKGFKGVDAQGTL (136-150),

AHKGFKGVDAQGTLS (137-151),

HKGFKGVDAQGTLSK (138-152),

GFKGVDAQGTLSKIF (140-154).

Peptyd ten w korzystnym wykonaniu wynalazku stanowi peptyd GFKGVDAQGTLSKIF (140-154) zasadowego białka mieliny.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca jeden lub więcej peptydów zdefiniowanych powyżej.

Kompozycja farmaceutyczna może korzystnie zawierać pomiędzy 1 a 15 tolerogenicznych peptydów zasadowego białka mieliny.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku, korzystnie jest w postaci zestawu, przy czym pewien lub wszystkie peptydy są dostarczane osobno do jednoczesnego, osobnego lub kolejnego podawania.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie peptydu zdefiniowanego powyżej do wytwarzania leku do stosowania w zapobieganiu i (lub) leczeniu stwardnienia rozsianego.

Korzystnie lek jest do podawania donosowego.

W niniejszym wynalazku zidentyfikowano także dwa minimalne epitopy w tych regionach, które są rozpoznawane przez poszczególne klony komórek T. Peptyd może zawierać jeden lub oba te epitopy, którymi są MBP 142-152 i 140-148.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 pokazuje odpowiedź klonu MS60:D2 komórki T na prezentację przez APC zagnieżdżonych peptydów MBP w regionie 131-158.

Fig. 2. pokazuje odpowiedź klonu N5 komórki T na prezentację przez APC peptydu 140-154.

Fig. 3 pokazuje odpowiedź klonu N5 komórki T na prezentację przez APC zagnieżdżonych peptydów MBP w regionie 136-157.

Szczegółowy opis wynalazku

W pierwszym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy peptydu.

Peptydy

Określenie „peptyd stosowane w normalnym znaczeniu oznacza serię reszt, zwykle L-aminokwasów, połączonych jeden z drugim wiązaniem peptydowym pomiędzy grupami α-aminowymi i karboksylowymi sąsiednich aminokwasów. Określenie to obejmuje modyfikowane peptydy i syntetyczne analogi peptydów.

Peptyd według wynalazku może być każdej długości jaka jest zdolna do związania cząsteczki

MHC klasy I lub II bez dalszej obróbki.

Peptydy które wiążą cząsteczki MHC klasy I typowo są długości typowo 7 do 13, zwykle 8 do 10 aminokwasów. Wiązanie peptydu jest stabilizowane na jego dwóch końcach przez styk pomiędzy atomami w głównym łańcuchu tego peptydu a miejscami niezmienniczymi w bruździe wiążącej peptydy wszystkich cząsteczek MHC klasy I. Na obu końcach bruzdy są miejsca niezmiennicze, które wiążą końce aminowe i karboksylowe peptydu. Wahania długości peptydu są dostosowywane przez tworze4

PL 212 129 B1 nie pętli na łańcuchu peptydowym, często przy resztach proliny i glicyny, które pozwalają na wymaganą giętkość.

Peptydy, które wiążą cząsteczki MHC klasy I typowo są peptydami o długości 8 do 20 aminokwasów, częściej między 10 do 17 aminokwasów długości, a mogą też być dłuższe. Peptydy te leżą w przedłużonej konformacji wzdłuż bruzdy wiążącej peptydy MHC klasy II, która (nie tak jak wiążąca peptydy bruzda MHC klasy I) jest otwarta na obu końcach. Peptyd jest utrzymywany na miejscu głównie za pomocą kontaktów głównego łańcucha z resztami konserwatywnymi, które wypełniają bruzdę wiążącą peptydy.

Peptyd według niniejszego wynalazku może być wytworzony przez zastosowanie metod chemicznych (Peptide Chemistry, A practcal Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlin.). Na przykład, peptydy mogą być syntetyzowane w technice fazy stałej (Roberge JY i wsp., (1995) Science 269: 202-204, odłączane od żywicy i oczyszczane w preparatywnej wysokosprawnej cieczowej (np., Creighton (1983) Protein Structures and Molecular principles, WH Freeman and Co, New York NY). Syntezę automatyczną można osiągnąć na przykład, stosując Syntetyzator Peptydowy (Perkin Elmer) zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta.

Peptyd można wytworzyć alternatywnie środkami rekombinacji, lub przez odczepienie od większego peptydu. Na przykład, peptyd może być otrzymany przez odczepienie od zasadowego białka mieliny. Skład peptydu może być potwierdzony przez analizę aminokwasów lub przez sekwencjonowanie (np., procedura degradacji Edman'a).

Peptyd według wynalazku można otrzymać z regionu 131-158 MBP. Korzystnie peptyd ten można otrzymać z fragmentu antygenu, który powstaje przez naturalne przekształcanie antygenu przez APC

Dla celów praktycznych, istnieją różne inne charakterystyki, które dany peptyd powinien wykazywać. Przykładowo peptyd powinien być rozpuszczalny w stężeniu, które pozwala na jego zastosowanie in vivo. Korzystnie, peptyd powinien być rozpuszczalny w stężeniu do 0,5 mg/ml, bardziej korzystnie peptyd powinien być rozpuszczalny w stężeniu do 1 mg/ml, najbardziej korzystnie peptyd powinien być rozpuszczalny w stężeniu do 5 mg/ml.

Dla podawania donosowego, maksymalna dawka, która może być przyjęta stosując bieżące procedury wynosi około 200 μΐ na nozdrze. Jeśli peptyd rozpuszczany jest przy 1 mg/ml, podwójna dawka do każdego nozdrza umożliwia podanie mg w pacjentowi 800 μg. Zwykle nie podaje się więcej niż każdej pojedynczej dawce.

Ważnym jest także to, że peptyd jest wystarczająco trwały in vivo będąc skutecznym terapeutycznie. Zostało stwierdzone, że 30 minut po podaniu całkowitej ilości kropli peptydu testowego in vivo, obniża się do około 50%, w 4 godziny po podaniu ilość spada do około 30%, lecz po 5 dniach peptyd ten jest wciąż wykrywalny (w około 5%). Okres półtrwania tego peptydu in vivo powinien wynosić co najmniej 10 minut, korzystnie 30 minut, bardziej korzystnie co najmniej 4 godziny, najbardziej korzystnie co najmniej 24 godziny.

Stwierdzono, że w następstwie donosowego podawania, ilość peptydu w węzłach chłonnych osiąga szczyt w około 4 godziny po podaniu, choć po 5 dniach peptyd jest wciąż wykrywalny (na poziomie około 5% maksymalnie). Korzystnie, peptyd ten jest wystarczająco trwały aby jego obecność w terapeutycznie aktywnym stężeniu w Iimfatycznych węzłach chłonnych wywierała efekt leczniczy.

Peptyd powinien także wykazywać dobrą biodostępność in vivo. Peptyd powinien in vivo utrzymywać konformację, która pozwala na wiązanie się z cząsteczka MHC na powierzchni komórki bez przeszkód.

Zasadowe białko mieliny (MBP)

MBP jest antygenem z mieliny, który był poprzednio scharakteryzowany i zsekwencjonowany (Roth i wsp., (1987) J. Neurosci. Res. 17(4)321-328; Numer dostępu M30516).

Peptydy według wynalazku mogą pochodzić z regionu 131-158.

Korzystnie peptyd stanowi lub zawiera w regionie jeden lub więcej minimalnych epitopów komórek T, przykładowo minimalny epitop MBP142-152 lub 140-148.

Epitop korzystnie jest wybrany z następujących peptydów zasadowego białka mieliny:

PL 212 129 B1

Peotyd MBP	Sekwencja
134-148	YKKKSAHKGFKGVDAQG
135-149	KSAHKGFKGVDAQGT
136-150	SAHKGFKGVDAQGTL
137-151	AHKGFKGVDAQGTLS
138-152	HKGFKGVDAQGTLSK
140-154	GFKGVDAQGTLSKIF

Obróbka antygenowa niezależnych epitopów (APITOPY)

Peptyd według niniejszego wynalazku jest zdolny do wiązania się z cząsteczką MHC klasy I i II (w bruździe wiążącej peptyd) bez dalszej obróbki. Takie peptydy są określane jako ,,apitopy (epiTopy Niezależne od Obróbki Antygenowej).

Prezentacja pochodzących z danego antygenu peptydów na powierzchni komórki nie jest rzadka i ma tendencję aby być zdominowaną przez małą ilość często występujących epitopów. Ta dominacja szczególnego peptydu będzie zależała od wielu czynników, takich jak powinowactwo względne do wiązania z cząsteczką MHC, czasowo-przestrzenny punkt generacji spośród APC i od odporności na rozkład. Hierarchia epitopu dla antygenu może się zmieniać wraz z postępem odpowiedzi immunologicznej, co ma ważne implikacje dla samo-tolerancji i autoimmunizacji. Regiony immundominujących determinant są prawdopodobnie wysoce tolerogenne. Zatem, w korzystnej postaci, apitop według niniejszego wynalazku jest oparty na epitopie dominującym.

Jednakże, po pierwotnej odpowiedzi immunologicznej na peptydy immunodominujące, „rozprzestrzenianie” się epitopu że zachodzić na determinanty sub-dominujące (Lehmann i wsp., (1992) nature 358:155-157). Prezentacja epitopów sub-dominujących może być ważna w wyzwalaniu autoimmunizacji. Dlatego, apitop według niniejszego wynalazku może być oparty na epitopie subdominującym.

Mogą istnieć także dla każdego antygenu epitopy ukryte. Ukryte epitopy są tymi, które mogą stymulować odpowiedź komórek T kiedy podawane są jako peptyd lecz, które nie wytwarzają takiej odpowiedzią gdy są podawane jako cały antygen. Być może, podczas obróbki antygenu w peptyd w APC, ten ukryty epitop zostaje zniszczony.

Ukryty epitop może działać jako apitop in vitro, wtedy może on być zdolny do wiązania się z cząsteczką MHC bez dalszej obróbki i do indukowania anergii w komórce T, która rozpoznaje ten ukryty epitop. Jednakże, taki apitop nie mógłby być użyteczny ponieważ mógłby być niezdolny do tolerowania komórek T, które rozpoznają naturalnie przekształcany przez obróbkę epitop antygenu.

Epitopy dla antygenu mogą być zidentyfikowane poprzez mierzenie odpowiedzi komórki T na nakładające się peptydy spajające cały antygen (patrz poniżej) kiedy jest on prezentowany przez APC. Takie badania zwykle dają w wyniku ,,miejsca zakotwiczenia peptydów a minimalny epitop dla poszczególnej komórki T linia/klon może być oceniony poprzez mierzenie odpowiedzi na skrócone peptydy.

Nie można zakładać, że minimalny epitop antygenu będzie zachowywał się tak jak apitop. Może być też tak, że dla optymalnego wiązania do MHC konieczne będą aminokwasy flankujące minimalny epitop. Apitop ten powinien być wyznaczony w celu wykorzystania takiej możliwości iż mogą istnieć subtelne różnice pomiędzy minimalnymi epitopami różnych klonów komórki T.

Należy podkreślić, że być może nie jest możliwym zidentyfikowanie apitopu dla wszystkich epitopów, Istnieją wyraźne dowody, że pewne epitopy wiążą MHC na takiej drodze, która zależny od ładowania MHC w endosomach i dlatego wymagają obróbki (Vine i wsp., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:2214-2218). To jest druga przyczyna dla której nikt nie mógł przypuszczać, że każdy minimalny epitop będzie nieuchronnie zachowywał się jak apitop.

Identyfikacja peptydów zawierających epitopy komórek T Istnieje wiele metod znanych w stanie techniki do identyfikowania epitopów komórek T w danym antygenie.

Naturalnie przekształcane epitopy mogą być zidentyfikowane na podstawie analizy spektrofotometrycznej peptydów eluowanych z naładowanych antygenem APC. To są APC, które są albo przeznaczone do pobrania antygenu lub zostały zmuszone do wytwarzania białka wewnątrzkomórkowe poprzez transformację za pomocą odpowiedniego genu. Typowo APC są inkubowane z białkiem albo

PL 212 129 B1 w roztworze lub odpowiednio nakierowywane na powierzchnię komórki APC. Po inkubacji w 37°C komórki te są poddawane lizie w detergencie i białka klasy II są na przykład oczyszczane w chromatografii powinowactwa. Traktowanie oczyszczonych MHC odpowiednim chemicznym medium (na przykład, środowiskiem kwasowym) powoduje eluowanie peptydów z MHC. Ta pula peptydów jest oddzielana i profil jest porównywany z peptydem z kontrolnej APC traktowanej w ten sam sposób. Unikalne dla białka piki wyrażającego/komórek żernych analizuje się (na przykład, spektrometrią masową) a fragmenty peptydowe identyfikuje. Ta procedura zwykle daje informację o zakresie peptydów (zwykle znajdowanych w miejscach zakotwiczenia) generowanych z poszczególnego antygenu przez obróbkę antygenu.

Innym sposobem identyfikowania epitopów jest przesiewowe badanie biblioteki syntetycznej peptydów, które zachodzą na siebie i stanowią długość antygenu w próbie in vitro. Na przykład mogą być zastosowane te peptydy, które są aminokwasami o długości 15 i które zachodzą co 5 do 10 aminokwasów. Peptydy te są testowane w układzie prezentującym antygen, który zawiera komórki prezentujące antygen i komórki T. Przykładowo, układem prezentacji antygenu może być preparat śledziony mysiej, preparat komórek ludzkich z migdałków lub PMBC Alternatywnie, układ prezentujący antygen może zawierać poszczególne linie komórek T/klony i/lub poszczególne typy komórek prezentujących antygen.

Aktywację komórek T można zmierzyć proliferacją komórki T (na przykład, stosując włączanie ₃ ³H-tymidyny) lub wytwarzaniem cytokin. Aktywację komórek CD4+ typu TH1 można wykryć na przykład poprzez produkcję INFy, którą można wykryć technikami standartowymi, takimi jak test ELISPOT .

Badania zachodzenia na siebie peptydów zwykle wskazują ten obszar antygenu, w którym zlokalizowany jest epitop. Minimalny epitop dla określonej komórki T może być oceniony przez zmierzenie odpowiedzi na skrócone peptydy. Na przykład, jeżeli uzyskuje się odpowiedź na peptyd zawierający reszty 1-15 w bibliotece nakładających się peptydów, zestawy które są skrócone na obu końcach (to jest 1-14, 1-13, 1-12, itd., oraz 2-15, 3-15, 4-15 itd.) mogą być używane dla identyfikowania epitopu minimalnego.

Układ prezentacji niezależny od obróbki antygenu (APIPS) (Antigen Processing Independent

Presentation System)

Gdy epitop zostanie zidentyfikowany, następnym etapem jest zbadanie czy zachowuje się on jak apitop.

Apitop musi być prezentowany komórkom T bez potrzeby obróbki antygenu. Po zidentyfikowaniu peptydów zawierających epitopy komórki T, apitopy mogą być zidentyfikowane stosując układ bez obróbki. Skrócone peptydy i analogi peptydów mogą być testowane pod kątem aktywacji stosując układ prezentacji antygenu niezależny od obróbki (APIPS).

Przykłady APIPS obejmują:

a) utrwalone APC (z lub bez przeciwciał do CD28);

b) błony lipidowe zawierające cząsteczki MHC klasy I lub II (z lub bez przeciwciał do CD28); i

c) oczyszczony naturalny lub rekombinowany MHC w postaci związanej z płytką (z lub bez przeciwciał na CD28).

Znane jest zastosowanie utrwalonych APC do badania odpowiedzi komórki T, na przykład w badaniach mających na celu wykrycie minimalnego epitopu w peptydzie, poprzez mierzenie odpowiedzi na skrócone polipeptydy (Fairchild i wsp., (1996) Int. Immunol. 8:1035-1043) APC może być utrwalany stosując na przykład formaldehyd (zwykle paraformaldehyd) lub glutaraldehyd.

Błony lipidowe (które mogą być błonami planarnymi lub liposomami) mogą być przygotowane stosując sztuczne lipidy lub błony plazmatyczne frakcje mikrosomalne z APC.

W użyciu APIPS może być nakładany do studzienek na płytkach do hodowli tkankowej. Antygeny peptydowe są następnie dodawane i wiązanie tego peptydu do części MHC tego APIPS jest wykrywane przez dodanie wybranych linii lub klonów komórki T. Aktywowanie linii lub klonu komórki T może być zmierzone przy pomocy jednej ze znanych w stanie techniki metod, na przykład poprzez ₃ włączanie ³H-tymidyny lub wydzielanie cytokiny.

Tolerancja

Peptydy według niniejszego wynalazku powinny być zdolne do indukowania tolerancji jako, że są one apitopami dla tego antygenu.

Tak jak zastosowano w niniejszym opisie tolerogeniczny oznacza zdolny do indukowania tolerancji.

PL 212 129 B1

Tolerancja jest upośledzeniem odpowiedzi na antygen. Tolerancja na własne antygeny jest zasadniczą cechą układu immunologicznego, kiedy następuje jego utrata, w wyniku może wystąpić choroba autoimmunologiczna. Adaptatywny układ immunologiczny musi utrzymywać zdolność do odpowiedzi na olbrzymią różnorodność czynników infekcyjnych unikając jednocześnie ataku autoimmunologicznego na własne antygeny zawarte wewnątrz własnych tkanek. Jest to kontrolowane w dużym zakresie przez wrażliwość niedojrzałych limfocytów T na apoptyczną śmierć komórek w grasicy (tolerancja ośrodkowa). Jednakże, nie wszystkie własne antygeny są wykrywane w grasicy, tak że śmierć samo-reaktywnych tymocytów pozostaje niecałkowita. Istnieją zatem także mechanizmy przez które tolerancja może zostać osiągnięta przez dojrzałe samo-reaktywne limfocyty T w tkankach obwodowych (tolerancja obwodowa). Przegląd tych mechanizmów tolerancji centralnej i obwodowej jest podana u Andertona i wsp., (1999) (Immunology Reviews 169:123-137).

Tolerancja może wynikać lub być scharakteryzowana przez indukcję anergii w co najmniej części komórek CD4+ T. W celu aktywacji komórki T, peptyd musi być związany z ,,profesjonalnym APC zdolnym do dostarczania dwóch sygnałów do komórek T. Pierwszy sygnał (sygnał 1) jest dostarczany przez kompleks MHC-peptyd na powierzchnię komórki APC i otrzymywany przez komórkę T poprzez TCR. Drugi sygnał (sygnał 2) jest dostarczany przez cząsteczki ko-stymulatorowe na powierzchnię APC, takie jak CD80 i CD86 i otrzymywane przez CD28 na powierzchni komórki T. Uważa się, że kiedy komórka T otrzymuje sygnał 1 w nieobecności sygnału 2, nie jest aktywowana i rzeczywiście staje się anergiczną. Anergiczne komórki T są oporne na następne obciążenie antygenem i mogą zahamować inne odpowiedzi immunologiczne. Anergiczne komórki T są uważane za zaangażowane w pośredniczenie w tolerancji komórek T.

Nie będąc związanym tą teorią, niniejszy wynalazek przewiduje, że peptydy wymagające obróbki przed tym kiedy mogą być prezentowane w połączeniu z cząsteczkami MHC nie indukują tolerancji ponieważ nie były opracowane przez dojrzałe komórki prezentujące antygen. Dojrzałe komórki prezentujące antygen (takie jak makrofagi, komórki B i komórki dendrytyczne), są zdolne do obróbki antygenowej, lecz także dostarczania zarówno sygnału 1 jak i 2 do komórki T prowadzącego do aktywacji komórki T. Z drugiej strony, apitopy będą w stanie wiązać MHC klasy II na niedojrzałym APC. Zatem będą one prezentowane komórkom T bez kostymulacji, prowadząc do anergii i tolerancji komórki T.

Oczywiście, apitopy są także zdolne do wiązania cząsteczek MHC na powierzchni komórki dojrzałego APC. Chociaż, układ immunologiczny zawiera większą obfitość niedojrzałych APC (uważa się że mniej niż 10% komórek dendrytycznych jest aktywowanych, Summers i wsp., (2001) Am. J. Pathol. 159: 285-295). Pozycją domyślną dla epitopu będzie dlatego raczej anergia/tolerancja niżeli aktywacja.

Wskazano, że gdy jest tolerancja indukowana przez inhalację peptydu, zdolność specyficznych co do antygenu komórek T CD+ do proliferacji jest zmniejszona. Także, wytwarzanie IL-2, INF-γ i IL-4 przez te komórki jest regulowana ujemnie, lecz wytwarzanie IL-10 wzrasta. Wykazano że neutralizowanie IL-10 u myszy w stanie tolerancji indukowanej peptydowo odbudowuje całkowicie wrażliwość na chorobę. Zaproponowano, że populacja komórek regulatorowych pozostaje w stanie tolerancji, który wytwarza IL-10 i pośredniczy w regulacji immunologicznej (Burkhart i wsp., (1999) Int. Immunol. 11:1625-1634).

Indukcja tolerancji może być dlatego monitorowana różnymi technikami włączając:

(a) zredukowaną wrażliwość na skracanie choroby dla której ten peptyd jest docelowym epitopem in vivo (b) indukcja anergii w populacji komórek T CD+4, (która może być wykryta przez następne obciążenie antygenem in vitro);

(i) zmniejszenie proliferacji;

(ii) regulację ujemną w wytwarzaniu IL-2, INF-γ i IL-4; oraz (iii) wzrost wytwarzania IL-10.

Choroby docelowe

Peptyd według wynalazku można stosować do leczenia i/lub zapobiegania chorobie.

Peptydy według niniejszego wynalazku są szczególnie użyteczne w leczeniu i/lub zapobieganiu stwardnienia rozsianego (MS) . Stwardnienie rozsiane (MS) jest chroniczną chorobą zapalną charakteryzującą się wieloma licznymi martwicami demielinizacyjnymi rozsianymi w istocie białej CNS (centralnego układu nerwowego CUN) i występującą w różnych miejscach i czasie (McFarlain i McFarland, 1982 New England J. Medicine 307:1183-1188 i 1246-1251). Uważa się, że w MS pośredniczą autoreaktywne komórki T.

PL 212 129 B1

MBP jest immunogeniczne i MBP-specyficzne limfocyty T mają aktywność encefalogeniczną u zwiąrzat (Sengal i wsp., 1994 J. Neuroimmunol. 51:7-19; Voskuhl iwsp., 1993 J. Neuroimmunol. 42:187-192; Zamvil i wsp., 1985 Nature 317:355-8).

Kompozycja farmaceutyczna

W drugim aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej jeden lub więcej peptydów według wynalazku z pierwszego aspektu wynalazku. Kompozycja ta może także zawierać jeden lub więcej apitopów z innego regionu MBP lub z innego antygenu.

Twórcy niniejszego wynalazku przewidują, że pomimo „bystander suppresion (pol. efekt „przygodnego widza”), może być koniecznym skierowanie wielu różnych klonów komórki T dla efektywnego indukowania tolerancji. Zatem, dla zapobieżenia lub leczenia choroby można podawać osobnikowi wiele różnych peptydów.

Kompozycja farmaceutyczna może przykładowo zawierać pomiędzy 1 a 50 apitopów, korzystnie pomiędzy 1 a 15 apitopów. Jeżeli istnieje więcej niż jeden apitop, korzystnie apitopy są albo wszystkie zdolne do wiązania się do MHC klasy I, lub są zdolne do wiązania MHC klasy II, bez dalszej obróbki.

Jeśli są dwa lub więcej apitopów, kompozycja farmaceutyczna może być w postaci zestawu, w którym kilka lub każdy z apitopów jest dostarczany osobno dla jednoczesnego, osobnego lub sekwencyjnego podawania.

Zamiast (lub dodatkowo) jeśli kompozycja farmaceutyczna (lub jakaś jej część) ma być podawana w wielokrotnych dawkach, każda dawka może być pakowana osobno.

Kompozycją farmaceutyczna może zawierać terapeutycznie lub profilaktycznie skuteczną ilość tego lub każdego epitopu i ewentualnie farmaceutycznie akceptowalny nośnik, rozpuszczalnik lub zaróbkę.

Także, w kompozycjach farmaceutycznych według niniejszego wynalazku, ten lub każdy apitop może być podawany z każdym odpowiednim lepiszczem, nawilżaczem, czynnikiem zawiesinowym, czynnikiem pokrywającym lub czynnikiem roztwarzającym.

Podawanie

Peptyd może być podawany w postaci rozpuszczonej w nieobecności adiuwantu.

Korzystnie, peptyd może być podawany do śluzówki.

Badania wykazały, że peptyd kiedy jest podany w rozpuszczalnej postaci dootrzewnowo, dożylnie (i.v.) lub donosowo (i.n.) lub doustnie może indukować tolerancję komórki T (Anderton i Wriaith (1998) jak wyżej; Liu i Wraith (1995) jak wyżej; Motzler i Wraith (1999) Immunology 97:257-263).

Korzystnie, peptyd może być podawany donosowo.

Badania na myszach wykazały, że czas trwania podawania peptydu wymagany dla indukowania tolerancji zależy od częstości prekursora komórek T u biorcy (Burkhart i wsp., (1999) jak wyżej). W wielu badaniach doświadczalnych, wykazano, że powtórzone dawki peptydu są wymagane dla indukowania tolerancji (Burkhart i wsp., (1999) jak wyżej). Dokładna dawka i ilość dawek peptydu będzie dlatego zależała od osobnika, jednakże w korzystnym wykonaniu podawane jest wiele dawek peptydów.

Jeśli jednocześnie podawanych jest wiele peptydów, mogą być one w postaci ,,koktajlu, który jest odpowiedni do podawania w pojedynczej lub wielokrotnej dawce. Alternatywnie, korzystnym może być podanie dawek wielokrotnych lecz różniących się pod względnym stężenia peptydów pomiędzy dawkami.

W korzystnej postaci wynalazku można przeprowadzić protokół ,,zwiększania dawki, gdzie wiele dawek jest podawanych pacjentowi w stężeniach zwiększających się. Takie podejście było stosowane na przykład, dla peptydów fosfolipazy A2 w zastosowaniach immunoterapeutycznych przeciwko alergii na jad pszczoły (Muller i wsp., (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101:747-754 i Akdis i wsp., (1998) J. Clin. Invest. 102;98-106).

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1. Identyfikacja apitopów w regionie 134-154 MBP

Materiał i Metody

Antygeny

Ludzki MBP jest sporządzany z istoty białej mózgu jak opisano przez Deibler i wsp., (Deibler i wsp., 1972 Preparative Biochemistry 2:139), i jego czystość oceniano przez SDS-PAGE. MBP i oczyszczone pochodne białkowe Mycobacterium tuberculosis (PPD) (UK Central Veterinary Laboratory, Surrey) są stosowane w badaniach proliferacyjnych przy uprzednio oznaczonym stężeniu optymalnym; optymalne stężenie dla każdego antygenu wynosi 20 μg/ml. Panel 15-merowy zachodzących

PL 212 129 B1 na siebie peptydów spajających region MBP 135-158 jest syntetyzowany stosując skład standardowy F-moc na syntetyzatorze peptydowym wielokrotnym Abimed AMS 422 (Abimed, Langelfeld, Niemcy). Każdy peptyd jest przemieszczony o 1aa i pokryty przez 14aa.

Tkankowe medium do hodowli

Medium RPMI-1640 uzupełnione 20 mM HEPES (Sigma, Poole, UK), penicyliną (100 U/ml), siarczanem streptomycyny 100 mg/ml) i 4 mM L-glutaminą (wszystko z Life Technologies, Paisly, Scotland), jest stosowane jako medium hodowlane. Medium bez surowicy jest używane do przemywania komórek Iimfoidalnych i TCL. Dla wszystkich hodowlanych warunków i testów, medium jest uzupełnione 10% inaktywowaną gorącem surowicą autologiczną.

Generowanie klonów komórek T

Specyficzne dla MBT linie komórek T (TCL) generowano od 8 pacjentów MS i 2 zdrowych kontrolnych dawców. PBMC od każdego osobnika oddzielano jak opisano powyżej i umieszczano przy

1x10⁶ komórek/ml w 6-studzienkowych płytkach w obecności MBP (50 μg/ml); porcję PBMC od każdego osobnika regularnie mrożono i przechowywano do następnej re-stymulacji. Siedem dni później komórki odżywiono świeżym medium zawierającym 2% IL-2 (Lymphocult-HT; Biotest LTD., Birningham, UK) i na 12 dzień hodowli wszystkie komórki były re-stymulowane za pomocą antygenu, IL-2 i napromieniowanymi (2500 rad) autologicznymi PBMC jako źródłem prezentujących antygen komórek (APC), przy stosunku komórek - 1 komórka T:5 APC. Komórki rosną w IL-2 przez 3-4 dni i na 14 dzień są re-stymulowane antygenem, IL-2 i PBMC, jak opisano powyżej. W dniu pierwszej re-stymulacji 55 komórki są badane na specyficzną proliferację dla MBP. W skrócie, 2X10⁵ komórek T i 1X10⁵ naświetlonych autologicznych PBMC hoduje się przez dwa dni a podczas ostatnich 18 godzin hodowli podda₃ je je się impulsowi ( H)-tymidyny przy 0,4 μCi/studzienkę. Następnie komórki są zbierane jak opisano powyżej i TCL jest uważane jako MBP-specyficzne z δ^ηρ>1000 i SI>3.

Po 3 cyklach restymulacja/ekspansja TCL klonuje się stosując PHA (Sigma, Poole, Dorset, UK) w obecności autologicznych naświetlonych PBMC jako APC. Komórki T są nanoszone na płytki w warunkach rozcieńczenia granicznego przy 0,1 komórki/studzienkę, 0,3 komórki/studzienkę i hodowane na szalkach Terasaki (Nunc International, Costar) z 1x10⁴ naświetlonymi PBMC, 5 μg/ml PHA i 2% IL-2. Po 10-12 dniach wzrostowo-pozytywne studzienki nanosi się na 96-studzienkowe okrągłodenne szalki, używając 1x10 napromieniowanych PBMC, 5 μg/ml PHA i IL-2. Trzy dni później studzienki napełnia się świeżym medium zawierającym IL-2 i na 7 dzień klony nanosi się na ₅

48-studzienkowe szalki stosując 5x10⁵ napromieniowanych PBMC, PHA i IL-2; w tym momencie klony są testowane w próbach proliferacji pod względem odpowiedzi specyficznej na MBP. MBPspecyficzne klony w tydzień później nanosi się na 24-studzienkwe szalki, stosując 1x10⁶ napromieniowanych PBMC z PHA lub Dynabeads (Dynal, UK) i IL-2. Klony są utrzymywane w 24-studzienkowych szalkach stosując 7-10 dniowy cykl restymulacja/ekspansja.

Badanie proliferacji

Żywe lub utrwalone w p-formaldehydzie komórki Mgar (HLA-DR2+ve) były inkubowane z peptydami tylko w surowicy lub w surowicy razem z komórkami T. Proliferacyjna odpowiedź komórek T była ₃ mierzona poprzez wychwyt H-tymidyny, w sposób następujący. 100 μl porcje w powtórzeniach trzykrotnych każdej hodowli hodowano w 96-studzienkowych płytkach okrągłodennych przez 48 godzin, ₃ następnie poddawano je działaniu impulsu μ^[ H]-tymidyny (Amersham International, Amersham,

UK). Po 20 godzinach komórki są zbierane na szklane włókniste maty (IKB-Wallac, Turku, Finlandia), ₃ stosując Match 111 harvester 96 (Tomtec, Orange, New Jersey, USA). Włączanie [³H]-tymidyny oznaczano stosując ciekły licznik scyntylacyjny Mikrobeta (LKB-Wallac). Studzienki testowe zawierające antygen są uważane jako pozytywne kiedy 5 δcpm>1000 i indeks stymulacji (Stimulation Index) (SI)>3, gdzie SI=CPM zawierającej antygen hodowli/CPM hodowli bez antygenu.

Wyniki

Odpowiedź klonu MS60:D2 komórki T na prezentację zagnieżdżonych peptydów MBP w regionie 131-158 pokazano na Figurze 1. Peptydy 134-148, 135-149, 136-150, 137-151, 138-152, 139-153 i 140-154 są definiowane jako apitopy jakie mogły być zaprezentowane przez utrwalone APC komórkom T bez dalszej obróbki.

Odpowiedź klonu N5 komórki T na prezentację peptydu 140-154 pokazano na figurze 2. Potwierdza ona również, że peptyd 140-154 może być prezentowany przez utrwalone APC bez dalszej obróbki.

PL 212 129 B1

P r z y k ł a d 2. Identyfikacja minimum epitopu rozpoznawanego przez klon N5 i MS60:D2 komórki T.

Komórki Live Mgar inkubowano z peptydami zachodzącymi na siebie z regionu 136-157 MBP tylko w surowicy lub w surowicy razem z N5 komórkami T. Proliferację komórki T mierzono wychwy₃ tem [³H]-tymidyny.

Wyniki przedstawiono na Figurze 3. Minimalnym epitopem rozpoznawanym przez klon N5 komórki T jest MBP 142-152.

Podobne doświadczenie było przeprowadzone dla klonu MS60:D2 komórki T (Fig. 1, nie utrwalone Mgar). Minimalnym epitopem rozpoznawanym przez ten klon komórki T jest MBP 140-148.

Claims

1. Peptyd zdolny do wiązania się do cząsteczki MHC klasy I lub II bez dalszej obróbki i który jest wybrany z następujących peptydów zasadowego białka mieliny:

YKKKSAHKGFKGVDAQG (134-148),

KSAHKGFKGVDAQGT (135-149),

SAHKGFKGVDAQGTL (136-150),

AHKGFKGVDAQGTLS (137-151),

HKGFKGVDAQGTLSK (138-152),

GFKGVDAQGTLSKIF (140-154).

2. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi peptyd GFKGVDAQGTLSKIF (140-154) zasadowego białka mieliny.

3. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca jeden lub więcej peptydów zdefiniowanych w zastrz. 1 lub 2.

4. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera pomiędzy 1 a 15 tolerogenicznych peptydów zasadowego białka mieliny.

5. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 3, lub 4 w postaci zestawu, przy czym pewien lub wszystkie peptydy są dostarczane osobno do jednoczesnego, osobnego lub kolejnego podawania.

6. Zastosowanie peptydu zdefiniowanego w zastrz. 1 lub 2 do wytwarzania leku do stosowania w zapobieganiu i (lub) leczeniu stwardnienia rozsianego.

7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że lek jest do zastosowania donosowego.

PL 212 129 B1

Rysunki

Proliferacja komórki T (wychwyt 3H-tymidyny/ccpm)

PL 212 129 B1

Proliferacja komórki T (wychwyt iH-tymidyny/ccpirs)

PL 212 129 B1

Proliferacja komórki T (wychwyt. 3h tymidyny/ccpm)