PL213568B1

PL213568B1 - Zastosowanie inhibitora IL-18 oraz zastosowanie wektora ekspresyjnego

Info

Publication number: PL213568B1
Application number: PL366802A
Authority: PL
Inventors: Charles Dinarello; Benjamin Pomerantz; Leonid Reznikov; Alden Harken; Yolande Chvatchko
Original assignee: Serono Lab
Priority date: 2001-01-29
Filing date: 2002-01-28
Publication date: 2013-03-29
Also published as: ATE380558T1; CN1326562C; JP2004522748A; DK1355668T3; EE05534B1; BG108128A; SK10892003A3; RS51125B; DE60224004D1; EP1355668B1; NO20033228D0; UA80676C2; CY1107203T1; WO2002060479A1; AR032422A1; IL157024A0; HU229164B1; EP1355668A1; BR0206819A; HK1062810A1

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny chorób sercowo-naczyniowych. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie inhibitora IL-18 oraz zastosowanie wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18 do leczenia i/lub zapobiegania kardiomiopatii.

Cytokinę interleukinę 18 (IL-18) pierwotnie opisano jako czynnik indukujący interferon-γ (Nakamura i wsp., 1989). Jest ona wczesnym sygnałem w rozwoju odpowiedzi komórek limfocytów T pomocniczych typu I (THI). IL-18 działa wspólnie z IL-12, IL-2, antygenami, mitogemani i prawdopodobnie dodatkowymi czynnikami, w celu wywołania wytwarzania IFN-γ. IL-18 wzmacnia również wytwarzanie GM-CSF i IL-2, wzmaga proliferację zaindukowanych komórek T anty-CD3 oraz wzmacnia cytotoksyczność krwinek białych o działaniu cytotoksycznym za pośrednictwem Fas.

Dojrzała IL-18 jest wytwarzana ze swojego prekursora przez enzym konwertujący IL-1 β (ICE, kaspaza-1).

Receptor IL-18 składa się z przynajmniej dwóch składników, współdziałających w wiązaniu ligandu. Miejsca wiązania o wysokim i niskim powinowactwie wobec IL-18 znaleziono w mysich komórkach T stymulowanych IL-12 (Yoshimoto i wsp., 1998), co sugeruje kompleks receptorowy z wieloma łańcuchami. Do tej pory zidentyfikowano dwie podjednostki receptora, obie należą do rodziny receptorów IL-1 (Parnet i wsp., 1996; Kim i wsp., 2001). Transdukcja sygnału IL-18 wiąże się z aktywacją NF-κΒ (DiDonato i wsp., 1997). Kompleks receptorowy IL-18 składa się z dwóch łańcuchów receptorowych: łańcucha wiążącego ligand, nazywanego łańcuchem IL-18Rα i łańcucha transdukującego sygnał, nazywanego łańcuchem IL-^β. Łańcuch IL-18R początkowo wyizolowano jako powierzchniowe białko komórkowe wiążące się do radioaktywnej IL-18; białko oczyszczono, a sekwencja aminokwasowa wykazała identyczność z wcześniej znanym sierocym receptorem, zwanym białkiem związanym z IL-IR (IL-1Rrp) (Torigoe i wsp., 1997).

Ostatnio z ludzkiego moczu wyizolowano rozpuszczalne białko, o wysokim powinowactwie do IL-18 oraz skłonowano ludzki i mysi cDNA, jak również ludzki gen (Novick i wsp., 1999; WO 99/09063). Białko oznaczono jako białko wiążące IL-18 (IL-18BP).

IL-18BP nie jest zewnątrzkomórkową domeną jednego ze znanych receptorów IL-18, lecz jest wydzielanym, naturalnie krążącym białkiem. Należy ono do nowej rodziny wydzielanych białek, dodatkowo zawierającej kilka białek kodowanych przez wirus ospy (Novick i wsp., 1999). Pochodzące z moczu, jak również rekombinowane IL-18BP specyficznie wiąże IL-18 z wysokim powinowactwem i moduluje biologiczne powinowactwo IL-18.

Gen dla IL-18BP zlokalizowano na ludzkim chromosomie 11q13, a w 8,3 kb genomowej sekwencji i nie znaleziono żadnego eksonu kodującego domenę transbłonową. Do tej pory u człowieka zidentyfikowano cztery warianty składania lub izoformy IL-18BP wytwarzane na drodze alternatywnego składania. Oznaczono je jako IL-18BP a, b, c oraz d i wszystkie mają taki sam N-koniec i różnią się na C-końcu (Novick i wsp, 1999). Izoformy te różnią się w ich zdolnością do wiązania IL-18. Spośród czterech izoform hlL-18BP, a i c są znane z neutralizujących zdolności wobec IL-18. Ludzka izoforma IL-18BP reaguje krzyżowo z mysim IL-18.

Choroby serca są zdefiniowane jako zaburzenia dotykające mięsień sercowy lub sercowe naczynia krwionośne (The Merck Manual Home Edition, www.merck.com). Zaburzenie naczyniowe jest problemem naczyń krwionośnych, takim jak złe krążenie spowodowane zablokowaniem. Choroby serca są również nazywane zaburzeniami sercowo-naczyniowymi.

Niedokrwienna choroba serca jest powszechną przyczyną niewydolności serca i jest najczęstszą przyczyną śmierci w zachodnich społeczeństwach. Jest to zwykle spowodowane miażdżycą tętnicy wieńcowej. Uszkodzenia mięśnia sercowego obejmują niedokrwienne zwłóknienie i ostry zawał. W normalnych warunkach, przepływ krwi w tętnicach wieńcowych jest blisko powiązany z zapotrzebowaniem metabolicznym mięśnia sercowego. Niedokrwienna choroba serca powstaje, gdy zasób krwi jest niewystarczający, z powodu uszkodzenia samego zasobu krwi lub gdy mięsień sercowy staje się hipertroficzny i wykazuje większe zapotrzebowanie pod względem dostarczania tlenu. Prawidłowy przepływ wieńcowy jest niezależny od ciśnienia aorty. Istnieje efektywny mechanizm autoregulatorowy, kontrolujący przepływ krwi przez wieńcowe łożysko naczyniowe.

Gdy w głównej tętnicy wieńcowej rozwija się niedrożność, zwykle spowodowana miażdżycą tętnic lub stwardnieniem tętnic, przepływ wieńcowy jest początkowo zachowany, ponieważ obwodowy opór dystalny wobec niedrożności, jest zmniejszony. Gdy światło naczynia jest zatkane w ponad 75%, dochodzi do niedokrwienia, szczególnie, gdy wieńcowe krążenie oboczne jest słabo rozwinięte.

PL 213 568 B1

Mięsień sercowy jest niezwykle aktywny metabolicznie, a mitochondria stanowią ponad 30% objętości pojedynczych włókien. Metabolizm tlenowy jest istotny, z powodu bardzo skromnej rezerwy fosforanów o wysokiej energii. Do śmierci mięśnia sercowego dochodzi, gdy poziomy tkankowego adenozynotrifosforanu (ATP) są bardzo niskie oraz gdy beztlenowa glikoliza ustaje. Tak jak dla pozostałych tkanek, dokładna przyczyna śmierci jest nieokreślona, lecz śmiertelne uszkodzenie mięśnia sercowego związane są z uszkodzeniem błony oraz gwałtownym napływem wapnia do cytoplazmy komórek. Po krótkich okresach niedokrwienia, przepływ wieńcowy może być przywrócony (reperfuzja) Jednakże, po krytycznej przerwie reperfuzja jest niemożliwa, prawdopodobnie w wyniku nabrzmienia włosowatych komórek nabłonkowych.

Miażdżycą tętnic wyjaśnia się olbrzymią większość chorób tętnicy wieńcowej. Niedokrwienna choroba serca może również wynikać z niskiej perfuzji tętnicy wieńcowej. Udar, a w szczególności krwotok, jest częstą tego przyczyną.

Jak wyszczególniono powyżej, niedokrwienna choroba serca jest spowodowana brakiem równowagi pomiędzy przepływem krwi w mięśniu sercowym, a zapotrzebowaniem metabolicznym mięśnia sercowego. Przepływ krwi może być dodatkowo obniżony przez nakładające się zdarzenia, takie jak skurcz mięśnia, zakrzepica lub zmiany krążeniowe prowadzące do hipoperfuzji.

Perfuzja tętnicy wieńcowej zależy od różnicy ciśnienia pomiędzy ujściami (tętnicze ciśnienie rozkurczowe) a zatoką wieńcową (ciśnienie prawego przedsionka). Przepływ wieńcowy jest obniżony podczas skurczu serca z powodu efektów Venturiego w otworach wieńcowych oraz kompresji tętnic wewnątrzmięśniowych podczas skurczów komór. Czynniki zmniejszające przepływ wieńcowy obejmują obniżone rozkurczowe ciśnienie aorty, zwiększone ciśnienie wewnątrzkomorowe oraz skurcz mięśnia sercowego, zwężenie tętnicy wieńcowej, zwężenie zastawki aorty i cofanie się krwi do serca przy niedomykalności zastawki aorty oraz podwyższone ciśnienie prawego przedsionka.

Leczenie rozpuszczaniem skrzepliny czynnikami, takimi jak streptokinaza lub tkankowy aktywator plazminogenu (TPA) jest często stosowane do rozpuszczania niedawno uformowanej skrzepliny. Takie leczenie, obejmujące rozpuszczanie skrzepliny w większości przypadków może przywrócić przepływ krwi. Pomaga to zapobiec znacznemu uszkodzeniu mięśnia sercowego, jeżeli jest wczesne (w przybliżeniu mniej niż godzina) w trakcie trwania zdarzeń i przynajmniej może pomóc w zmniejszeniu dalszego uszkodzenia.

Dusznica bolesna jest zespołem objawów niedokrwiennej choroby serca, charakteryzującym się nagłymi atakami bólu klatki piersiowej i jest zwykle podmostkowa lub przedsercowa. Jest wywoływana niedokrwieniem mięśnia sercowego, które kończy się niepomyślnym wywołaniem zawału. Może pojawić się nagła śmierć serca, która jest nieoczekiwaną śmiercią ze związanego z sercem powodu, zwykle w ciągu godziny od zdarzenia sercowego lub pojawienia się objawów. Dotyka ona 300000-400000 osób rocznie.

Inne formy choroby serca obejmują kardiomiopatię alkoholową, wypadnięcie zastawki aorty, zwężenie zastawki aorty, arytmię, wstrząs sercowy, wrodzoną chorobę serca, kardiomiopatię rozstrzeniową, atak serca, niewydolność serca, nowotwór serca, zwężenie zastawki tętnicy płucnej, kardiomiopatię przerostową, kardiomiopatię idiopatyczną, niedokrwienną chorobę serca, kardiomiopatię niedokrwienną, cofanie się krwi z lewej komory do przedsionka, zwężenie zastawki lewej komory, kardiomiopatię peripartum oraz trwałą anginę.

Zawał serca jest kolejną formą niedokrwiennej choroby serca. Patogeneza może obejmować okluzyjną skrzeplinę wewnątrzwieńcową, tj. skrzeplinę pokrywającą owrzodzialą lub pękniętą zwężoną płytkę. Okluzyjna skrzeplina wewnątrzwieńcową wywołuje 90% przezściennych ostrych zawałów serca. Skurcz naczynia może następować z lub bez miażdżycy tętnic wieńcowych i możliwego związku z agregacją płytek krwi. Przy zawale serca, występować mogą również czopy zatorowe.

Ogólny wygląd morfologiczny zawału serca może być różny. Zawał przezścienny obejmuje całkowitą grubość ściany lewej komory od wsierdzia do nasierdzia. Zawał podwsierdziowy obejmuje wieloogniskowe obszary martwicy ograniczone do wewnętrznej 1/3-1/2 ściany lewej komory. Komplikacje zawałów serca mogą obejmować arytmię i zaburzenia przewodzenia z możliwą „nagłą śmiercią”, rozszerzenie zawału lub ponowny zawał, zastoinową niewydolność serca (obrzęk płucny), wstrząs sercowy, zapalenie osierdzia, zakrzepice ścienną z możliwą embolizacją, pęknięcie ściany mięśnia sercowego z możliwą tamponadą, pęknięcie mięśnia brodawkowego z możliwą niedomykalnością zastawki, tworzeniem się tętniaka komory.

Zawał mięśnia sercowego (MI) jest zdefiniowany jako niedokrwienna martwica mięśnia sercowego zwykle wynikająca z nagłego zmniejszenia przepływu wieńcowego do segmentu mięśnia sercowego.

PL 213 568 B1

U > 90% pacjentów z ostrym MI, ostra skrzeplina, często z pęknięciem płytki, zatyka tętnicę (pierwotnie częściowo zatkaną przez płytkę miażdżycową), zasilającą uszkodzoną powierzchnię. Zmieniona funkcja płytek krwi, wywołana zmianą nabłonka w płytce miażdżycowej prawdopodobnie bierze udział w tworzeniu skrzepliny. Spontaniczne rozpuszczanie skrzepliny zachodzi u około 2/3 pacjentów, dlatego też, 24 godz. później okluzja skrzeplinowa jest wykrywana tylko u 30%.

Zawał serca jest czasami spowodowany embolizacją tętnicy (np. w zwężeniu zastawki dwudzielnej lub aorty, infekcyjne zapalenie wsierdzia, kachektyczne zapalenie wsierdzia). Zawał serca wykrywano u pacjentów ze skurczem wieńcowym i poza tym prawidłowymi tętnicami wieńcowymi. Kokaina wywołuje silny skurcz tętnic wieńcowych i zażywający mogą wykazywać dusznicą lub zawał serca wywołane kokainą. Badania autopsyjne oraz angiografia wieńcowa wykazały, że do tworzenia się skrzepliny wywołanej kokainą może mieć miejsce w prawidłowych tętnicach wieńcowych lub nakładać się z istniejącym przedtem ogniskiem miażdżycowym.

Zawał serca jest przede wszystkim chorobą lewej komory, jednakże uszkodzenie może rozszerzyć się na prawa komorę (RV) lub przedsionki. Zawał prawej komory wynika zwykle z okluzji prawej tętnicy wieńcowej lub dominującej lewej tętnicy okalającej i charakteryzuje się wysokim ciśnieniem napełniania się komory, często z ciężkim trójdzielnym cofaniem się krwi i zredukowaną pojemnością minutową serca. Pewien stopień zaburzenia prawej komory występuje u około połowy pacjentów z dolno-tylnym zawałem serca, powodując nieprawidłowość hemodynamiczną u 10 do 15%.

Zdolność serca do zachowania działania jako pompa zależy bezpośrednio od stopnia uszkodzenia mięśnia sercowego.

Zawały przezścienne obejmują całkowitą grubość ściany mięśnia sercowego od wsierdzia do nasierdzia i zwykle charakteryzują się nieprawidłowymi załamkami Q na EKG. Zawały nieprzezścienne lub podwsierdziowe nie rozszerzają się przez ścianę komory i wywołują jedynie nieprawidłowości odcinka ST i załamka T. Zawały podwsierdziowe zwykle obejmują wewnętrzną 1/3 mięśnia sercowego, gdzie napięcie ściany jest największe i przepływ krwi przez mięsień sercowy jest najbardziej wrażliwy na zmiany krążenia. Może po nich również następować długotrwałe podciśnienie. Ponieważ przezścienna głębokość nekrozy nie może być dokładnie wyznaczona klinicznie, zawały są lepiej klasyfikowane przez EKG jako załamek Q i brak załamka Q. Objętość uszkodzonego mięśnia sercowego może być oszacowana na podstawie zakresu i trwania uniesienia odcinka CK.

Kardiomiopatia niedokrwienna jest kolejną chorobą w ramach niedokrwiennej choroby serca. W tym stanie, może dochodzić do uprzedniego zawału mięśnia sercowego, lecz choroba powstaje w wyniku ciężkiej miażdżycy tętnic wieńcowych obejmującej wszystkie główne gałęzie. Wynikiem jest nieodpowiednie zasilanie naczyń, prowadzące do utraty włókien mięśniowych. Utrata włókien mięśniowych w połączeniu ze zwłóknieniem w postaci śródmiąższowego odkładania się złogów kolagenu powoduje obniżoną podatność, która razem z towarzyszącym rozszerzeniem serca powoduje przeciążenie pozostałych włókien mięśniowych. To powoduje podtrzymanie procesu z kompensacją poprzez ciągłą hipertrofię włókna mięśniowego. Może nawet dochodzić do kompensacji poprzez rozrost, jak również hipertrofię, co może wyjaśniać ogromną wielkość (2 do 3 razy wielkość prawidłowa) serca. W końcu, serce nie może dłużej kompensować i dochodzi do niewydolności serca z arytmią i/lub zdarzeniami niedokrwiennymi. Zatem, klinicznie, istnieje wolna, postępująca niewydolność serca z lub bez historii uprzedniego zawału mięśnia sercowego lub bólu dusznicowego. Kardiomiopatia niedokrwienna jest powodem 40% śmiertelności przy niedokrwiennej chorobie serca.

Podczas niedokrwienia, jak również reperfuzji serca wytwarzanych jest wiele endogennych czynników pośredniczących, takich jak drobnocząsteczowi drugorzędowi posłańcy (ang. small molecule second messenger), które wpływają na czynność mięśnia sercowego. W czasie minut od zdarzenia niedokrwiennego, siła kurczliwa mięśnia sercowego maleje i całkowite przywrócenie siły kurczliwej jest w dużym stopniu zależna od czasu trwania okresu niedokrwienia (Daemen i wsp., 1999). Na przykład, podczas zdarzenia niedokrwiennego zaburzona jest homeostaza Ca²⁺, wytwarzane są wolne rodniki pochodzenia tlenowego oraz dochodzi do syntezy i uwalniania tlenku azotu (NO). Dodatkowo, zachodzi również miejscowe wytwarzanie cytokin, w szczególności TNFa i IL-1 β (Bolli, 1990). W nieuszkodzonym sercu, cytokiny te przyczyniają się do wywołanej niedokrwieniem zaburzenia mięśnia sercowego, poprzez indukcję ekspresji genów dla syntazy NO (iNOS) (Daemen i wsp., 1999), cyklooksygenazy-2 (COX-2) i fosfolipazy A2, jak również cząsteczek adhezji naczynia i kilku chemokin. W wyniku, zachodzi natychmiastowe zahamowanie siły kurczliwej mięśnia sercowego za pośrednictwem drobnocząsteczkowych posłańców, po którym następuje naciek białych krwinek obojętnochłonnych (neutrofili) kontrolowanych przez cytokiny, który dalej uszkadza mięsień sercowy. Badania serc zwierząt

PL 213 568 B1 w nieobecności krwi lub produktów krwi szczegółowo wyjaśniły działanie TNFa (Herskowitz i wsp., 1995) i IL-1 β podczas prowokacji niedokrwienia. Włókna mięśnia sercowego również tracą siłę kurczliwą na skutek działania tych endogennych cytokin (Meldrum i wsp., 1998).

Większość danych eksperymentalnych dotyczących zaburzenia mięśnia sercowego za pośrednictwem TNFα i IL-1 β pochodzi z badań nad zwierzętami. Jednakże, ludzką tkankę mięśnia sercowego otrzymaną od pacjentów, który byli poddawani planowanym zabiegom tworzenia przepływu omijającego sercowo-płucnego, badano w kontrolowanych warunkach ex vivo (Gurevitch i wsp., 1996; Cleveland i wsp., 1997). W takim modelu eksperymentalnym, ludzkie beleczki przedsionka są zawieszane w wolnej od krwi, fizjologicznie natlenianej łaźni buforowej, a następnie poddawane zdarzeniom stymulowanego niedokrwienia. W tym czasie siła kurczliwa zmniejsza się dramatycznie, gdy tkanka jest ponownie poddawana działaniu tlenu, siła kurczliwa powraca, lecz jest zmniejszona (redukcja do 60-70%) i uszkodzenie mięśnia sercowego obserwowane jest przez uwalnianie kinazy kreatyniny (CK) (Gurevitch i wsp., 1996; Cleveland i wsp., 1997). Gdy bioaktywność TNF jest specyficznie neutralizowana podczas niedokrwienia/reperfuzji (I/R), obserwowany jest większy powrót siły kurczliwej, co sugeruje, że endogenna aktywność TNF w mięśniu sercowym przyczynia się do zaburzenia kurczliwej indukowanej zdarzeniem niedokrwiennym (Cain i wsp., 1999).

Daemen i wsp. (1999) badali uszkodzenie tkanki jako wynik niedokrwienia, po którym następowała reperfuzja, używając mysiego modelu niedokrwienia nerkowego. Wykazali, że zwiększenie nerkowego mRNA IL-18 występuje równocześnie z aktywacją kaspazy-1 pierwszego dnia po niedokrwieniu. mRNA IFN-γ i IL-12 ulegało następnie zwiększeniu szóstego dnia po niedokrwieniu. Łączona, ale nie oddzielna, neutralizacja cytokin IL-12 i IL-18 indukujących IFN-γ in vivo obniżała zależną od IFN-gamma podwyższenie MHC klasy I i II w tym samym stopniu, co neutralizacja IFN-γ.

W stanie techniki opisywano uprzednio inhibitory IL-18 i ich potencjalny udział w mechanizmach różnych chorób. Na przykład, w WO 99/09063 ujawniono zastosowanie białka wiążącego IL-18 (IL-18BP) do leczenia lub zapobiegania niedokrwiennej chorobie serca, w tym zawału mięśnia sercowego. W WO 98/24804 ujawniono inhibitory enzymu konwertującego IL-1 β (ICE) oraz wskazano na ich potencjalną rolę w programowanej śmierci komórkowej lub apoptozie. W publikacji tej opisano również szereg terapeutycznych zastosowań hamowania apoptozy, w tym do leczeniu zawału serca. W publikacji WO 01/85201 opisano natomiast zastosowanie inhibitorów IL-18 w leczeniu miażdżycy tętnic. Jednakże, jak dotąd IL-18 nie została opisana jako odgrywająca rolę w kardiomiopatii.

Wynalazek oparty jest na ujawnieniu, że inhibitor IL-18 istotnie poprawia czynność kurczliwą serca w modelu niedokrwienia/reperfuzji suprafuzowanego ludzkiego mięśnia sercowego przedsionka. Hamowanie kaspazy-1 (ICE) również osłabiła obniżenie siły kurczliwej po niedokrwieniu i reperfuzji.

Ponadto, podanie inhibitora IL-18 w mysim modelu zawału mięśnia sercowego spowodowało zwiększoną przeżywalność i istotną poprawę czynności komorowej.

Badania te wykazały, że inhibitory IL-18 są odpowiednie do leczenia lub zapobiegania zaburzenia mięśnia sercowego.

Zatem, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie inhibitora IL-18 wybranego spośród inhibitora kaspazy-1 (ICE), przeciwciał skierowanych przeciwko IL-18, przeciwciał skierowanych przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18, oraz białek wiążących IL-18 lub ich izoform, mutein, białek fuzyjnych lub funkcjonalnych pochodnych hamujących biologiczną aktywność IL-18, do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania kardiomiopatii.

Korzystnie, inhibitorem stosowanym zgodnie z wynalazkiem jest przeciwciało skierowane przeciwko IL-18, przeciwciało skierowane przeciwko receptorowi a IL-18, lub przeciwciało skierowane przeciwko receptorowi β IL-18.

Korzystniej, przeciwciało jest przeciwciałem humanizowanym lub ludzkim.

Ponadto, korzystnie inhibitorem ICE stosowanym zgodnie z wynalazkiem jest Ac-Try-Val-Ala-Asp-chlorometyloketon (YVAD).

Również korzystnie, inhibitorem IL-18 stosowanym zgodnie z wynalazkiem jest białko wiążące IL-18 lub jego izoforma, muteina, białko fuzyjne, lub funkcjonalne pochodne hamujące biologiczną aktywność IL-18.

Korzystniej, inhibitor IL-18 jest glikozylowany w jednym lub większej liczbie miejsc.

Jeszcze korzystniej, białko fuzyjne zawiera fuzję immunoglobuliny (Ig). Bardziej korzystnie funkcjonalna pochodna zawiera przynajmniej jedną resztę, korzystnie resztą polietylenową, przyłączoną do jednej lub większej liczby grup funkcyjnych, która występuje jako jeden lub więcej łańcuchów bocznych na resztach aminokwasowych.

PL 213 568 B1

W korzystnej postaci wykonania lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku dodatkowo zawiera antagonistę czynnika martwicy nowotworów (TNF).

Korzystniej, inhibitor IL-18 jest stosowany jednocześnie, kolejno lub oddzielnie względem antagonisty TNF.

Najkorzystniej, antagonistą TNF jest TBPI i/albo TBPII.

Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, inhibitor IL-18 jest korzystnie stosowany w stężeniu w zakresie pomiędzy około 0,001 do 100 mg/kg albo około I do 10 mg/kg lub 2 do 5 mg/kg.

W celu zastosowania podejścia związanego z terapią genową przy dostarczaniu inhibitora IL-18 do chorej tkanki lub komórki, wynalazek w dalszej części dotyczy zastosowania wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18 do leczenia i/lub zapobiegania kardiomiopatii.

Zatem, przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania kardiomiopatii, przy czym inhibitor IL-18 jest wybrany spośród przeciwciał skierowanych przeciwko IL-18, przeciwciał skierowanych przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18 oraz białek wiążących IL-18 lub ich izoform, mutein, białek fuzyjnych lub funkcjonalnych pochodnych hamujących biologiczną aktywność IL-18.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie wektora ekspresyjnego do indukowania i/lub wzmacniania endogennego wytwarzania inhibitora IL-18 w komórce do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania kardiomiopatii, przy czym inhibitor IL-18 jest wybrany spośród białek wiążących IL-18 lub ich izoform hamujących biologiczną aktywność IL-18.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia wpływ IL-18BP na zaburzenia kurczliwości mięśnia sercowego wywołaną niedokrwieniem.

(A) Odpowiedź kinetyczna na uszkodzenie niedokrwienne. Po wyrównaniu (eq), kontrolne (Ctrl) beleczki suprafuzowano w normoksywnych warunkach podczas trwania eksperymentu. Beleczki poddano niedokrwieniu/reperfuzji przy braku lub w obecności IL-18BP (5 μg/ml). Oś pionowa przedstawia procent siły rozwiniętej w porównaniu z początkiem eksperymentu (czas 0). Dane pochodzą z beleczek pojedynczego pacjenta i są reprezentatywne dla metod użytych do obliczania średniej zmiany w sile rozwiniętej przez 90 minut.

(B) Poniedokrwienna siła rozwinięta po neutralizacji IL-18 lub 5 μg/nl IL-18BP. Wyniki przestawiono jako średni procent zmian w sile rozwiniętej względem Ctrl po zakończeniu reperfuzji (90 minut). Liczby w nawiasach przedstawiają IL-18BP w μg/ml. N = 6 * p < 0,01 w porównaniu z I/R (niedokrwienie/reperfuzja).

Figura 2 przedstawia zawartość białka IL-18 w mięśniu sercowym. Beleczki homogenizowano po 90 minutach suprafuzji w normoksywnych warunkach (kontrola) lub po 45 minutach po 30 minutach niedokrwienia (I/R). Łączono beleczki z tych samych osobników badanych. Poziomy IL-18 przestawiono na osi pionowej w pg/ml. N = 4 * p < 0,01

Figura 3 przedstawia poziomy mRNA IL-18 i IL-18BP w stanie ustalonym w kontrolnej i niedokrwionej tkance przedsionka. Poziomy mRNA IL-18 i IL-18BP określono przez RT-PCR. Dane pochodzą z jednego z dwóch badanych osobników. (A) przedstawia żel agarozowy barwiony bromkiem etydyny, w którym rozdzielono produkty PCR, a (B) przedstawia wyniki zliczania ilości produktów PCR jako krotność zmian względem kontroli (GAPDH).

Figura 4 przedstawia wpływ inhibicji ICE na siłę rozwiniętą po niedokrwieniu. Wyniki przestawiono jako średni procent zmian w sile rozwiniętej względem kontroli (Ctrl) po niedokrwieniu/reperfuzji (I/R). Liczby w nawiasach przedstawiają stężenie ICEi w μg/ml. N = 7 * p < 0,01 w porównaniu z I/R.

Figura 5 przestawia aktywność tkankowej kinazy kreatyniny (CK) po I/R. CK przedstawiono w jednostkach aktywności na miligram mokrej masy tkanki. Warunki eksperymentalne przestawiono pod osią poziomą. Ctrl i I/R, N = 6; IL-18BP (5 μg/ml), N = 5; ICEi (10 i 20 μg/ml), N = 5 każdy, * p < 0,05 w porównaniu z I/R.

Figura 6 przedstawia średnią zmianę w sile rozwiniętej względem siły rozwiniętej po okresie wyrównania, traktowaniej jako 100% (n = 5), beleczek inkubowanych z 10 μg/ml przez 15 minut przed dodaniem TNFα (1 ng/ml). TNFα i IL-18BP dodawano przy każdej zmiany łaźni.

Figura 7 przedstawia tymczasową odpowiedź ludzkich beleczek przedsionka na IL-18 w normoksywnych warunkach. Dojrzałą IL-18 (100 ng/ml) dodawano do beleczek przedsionka przez 90 minut trwania eksperymentu. Oś pionowa przedstawia średni procent siły rozwiniętej zmian w stosunku do poziomu podstawowego. Poziom podstawowy określono w końcu okresu wyrównania (nie poPL 213 568 B1 kazano) (n = 6) * P < 0,05, **P < 0,001 w porównaniu z kontrolą w tym samym interwale i przez pozostałą część czasu trwania eksperymentu.

Figura 8 przedstawia zachowanie aktywności kinazy kreatyniny w tkance komórek mięśniowych po narażeniu na I/R, TNFa (1 ng/ml) i TNFa (10 ng/ml) + IL-18BP. Aktywność CK wyrażono w jednostkach aktywności CF na miligram mokrej masy tkanki (n = 6).

Szczegółowy opis wynalazku

Obecny wynalazek oparty jest na ujawnieniu, że inhibitory IL-18 wywierają korzystny efekt w chorobach serca, w szczególności w niedokrwiennej chorobie serca. Jak przedstawiono w przykładach poniżej, dla kilku różnych inhibitorów IL-18 wykazano, że mają one znaczący korzystny wpływ na silę mięśnia sercowego rozwiniętą po niedokrwieniu.

Dodatkowo, inhibitor IL-18 testowany w modelu zawału mięśnia sercowego in vivo i powodował zwiększoną przeżywalność oraz istotnie poprawioną czynność komorową.

Wynalazek zatem dotyczy zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania kardiomiopatii.

Kardiomiopatia jest dowolną strukturalną lub funkcjonalną nieprawidłowością mięśnia sercowego komory.

Termin „zapobieganie” w kontekście tego wynalazku dotyczy nie tylko całkowitego zapobiegania określonego efektu, ale również dowolnego częściowego lub istotnego zapobiegania, osłabiania, redukcji, obniżenia lub zmniejszenia efektu przed lub we wczesnym początku choroby.

Termin „leczenie” w kontekście tego wynalazku dotyczy dowolnego korzystnego wpływu na postęp choroby, włączając osłabienie, redukcję, obniżenie lub zmniejszenie rozwoju patologicznego po początku choroby.

Termin „inhibitor IL-18” kontekście tego wynalazku dotyczy dowolnej cząsteczki modulującej wytwarzanie i/lub działanie IL-18 w taki sposób, że wytwarzanie, i/lub działanie IL-18 jest osłabione, zredukowane lub częściowo, znacznie lub całkowicie zapobiegnięte lub zablokowane.

Inhibitory IL-18 mogą być przeciwciałami przeciwko IL-18, takimi jak poliklonalne lub monoklonalne przeciwciała.

Według wynalazku, inhibitor IL-18 wybrany jest spośród inhibitorów kaspazy-1 (ICE), przeciwciał skierowanych przeciwko IL-18, przeciwciał skierowanych przeciwko dowolnej podjednostce receptora IL-18 oraz białek wiążących IL-18 i ich izoform, mutein, białek fuzyjnych lub funkcjonalnych pochodnych hamujących biologiczną aktywność IL-18.

Termin „białka wiążące IL-18” jest tutaj używany synonimicznie z „białkiem wiążącym IL-18” lub „IL-18BP”. Obejmuje on białka wiążące IL-18, tak jak zdefiniowano w WO 99/09063 lub w Novick i wsp., 1999, włączając warianty będące wynikiem różnego składania i/lub izoformy tak, jak zdefiniowano w Kim i wsp., 2000, które wiążą IL-18. W szczególności, w rozwiązaniach według wynalazku ludzkie użyteczne są izoformy a i c IL-18BP. Białka użyteczne według wynalazku mogą być glikozylowane lub nieglikozylowane, mogą one pochodzić z naturalnych źródeł, takich jak mocz, lub korzystnie mogą być wytwarzane rekombinacyjnie. Ekspresja rekombinacyjna może być przeprowadzana w prokariotycznych układach ekspresyjnych, jak E. coli lub w eukariotycznych, a korzystnie w układach ekspresyjnych ssaka.

Termin „muteiny”, tak jak używany tutaj dotyczy analogów IL-18BP lub analogów wirusowego IL-18BP, w których jedna lub więcej reszt aminokwasowych naturalnego IL-18BP lub wirusowego IL-18BP jest zamienionych przez inne reszty aminokwasowe lub jest usunięta lub jedna lub więcej reszt aminokwasowych jest dodana do naturalnej sekwencji IL-18BP, lub wirusowego IL-18BP, bez zmiany w znaczący sposób aktywności powstałych produktów w porównaniu z IL-18BP typu dzikiego lub wirusowego IL-18BP. Muteiny te są przygotowywane znanymi technikami syntezy i/lub ukierunkowanej metagenezy lub innymi odpowiednimi do tego znanymi technikami.

Muteiny zgodne z obecnym wynalazkiem obejmują białka kodowane przez kwas nukleinowy, taki jak DNA lub RNA, który hybrydyzuje z DNA lub RNA, kodującym IL-18BP lub wirusowy IL-18BP, zgodnie z wynalazkiem, w ostrych warunkach.

Termin „ostre warunki” dotyczy hybrydyzacji i następujących po niej warunków płukania, które specjaliści w dziedzinie umownie nazywają „ostrymi”. Patrz Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N. Y., §§ 6.3 i 6.4 (1987, 1992) i Sambrook i wsp., supra. Bez ograniczania, przykłady ostrych warunków obejmują warunki płukania 12-20°C poniżej obliczonej Tm badanej hybrydy w np. 2 x SSC i 0,5% SDS przez 5 minut, 2 x SSC i 0,1% SDS przez 15 minut; 0,1 x SSC i 0,5% SDS w 37°C przez 30-60 minut, następnie 0,1 x SSC i 0,5% SDS w 68°C przez 30-60

PL 213 568 B1 minut. Specjaliści w dziedzinie rozumieją, że ostrość warunków również zależy od długości sekwencji DNA, sond oligonukleotydowych (o długości takiej jak 10-40 zasad) lub mieszanych sond oligonukleotydowych. Jeżeli mieszane sondy są stosowane, korzystne jest stosowanie chlorku tetrametyloamonu (TMAC) zamiast SSC. Patrz Ausubel, supra.

Dowolna taka muteina ma sekwencję aminokwasów wystarczająco zduplikowaną względem IL-18BP lub wystarczająco zduplikowaną względem wirusowego IL-18BP, tak by mieć aktywność porównywalną do IL-18BP. Jedną aktywnością IL-18BP jest jego zdolność do wiązania IL-18. Gdy muteina ma znaczną aktywność wiążącą IL-18, może być zastosowana w oczyszczaniu IL-18, tak jak za pomocą chromatografii powinowactwa, a zatem może być uznawana za posiadają w znacznej mierze podobną aktywność do IL-18BP. Zatem może być określone, czy dowolna muteina ma w znacznej mierze tę samą aktywność co IL-18BP za pomocą przeprowadzenia rutynowego eksperymentu obejmującego poddawanie takiej muteiny np. prostemu kanapkowemu testowi kompetycyjnemu, w celu określenia, czy wiąże się lub nie do odpowiednio wyznakowanej IL-18, takiemu jak test radioimmunologiczny lub test ELISA.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, dowolna taka muteina ma przynajmniej 40% identyczności lub homologii z sekwencją IL-18BP lub homologiem IL-18BP kodowanym przez wirus, jak zdefiniowano w WO 99/09063. Bardziej korzystnie, ma przynajmniej 50%, przynajmniej 60%, przynajmniej 70%, przynajmniej 80% lub najbardziej korzystnie przynajmniej 90% identyczności lub homologii z nimi.

Muteiny polipeptydów IL-18BP lub muteiny wirusowych IL-18BP, które mogą być stosowane zgodnie z obecnym wynalazkiem lub kodujący je kwas nukleinowy, obejmują określony zestaw zasadniczo zgodnych sekwencji, takich jak podstawione peptydy lub polipeptydy, które mogą być rutynowo otrzymane przez specjalistę w dziedzinie bez nadmiernego przeprowadzania eksperymentu, w oparciu o nauki i wskazówki tutaj przedstawione.

Korzystnymi zmianami mutein zgodnie z obecnym wynalazkiem są podstawiania określane jako „konserwatywne”. Konserwatywne podstawiania aminokwasów polipeptydów lub białek IL-18BP lub wirusowych IL-18BP, mogą obejmować synonimiczne aminokwasy w obrębie grupy, która ma wystarczająco podobne właściwości fizykochemiczne, tak że podstawienie pomiędzy członkami grupy pozwoli na zachowanie funkcji biologicznej cząsteczki (Grantham, 1974). Jest zrozumiałe, że insercje i delecje aminokwasów mogą być dokonywane w powyżej zdefiniowanych sekwencjach bez zmieniania ich funkcji, w szczególności jeżeli insercje lub delecje obejmują wyłącznie kilka aminokwasów np. mniej niż trzydzieści, a korzystnie mniej niż dziesięć i nie usuwają lub przemieszczają aminokwasów, które są niezbędne dla funkcjonalnej konformacji np. reszty cysteino we. Białka i muteiny wytwarzane na drodze takich delecji i/lub insercji wchodzą w obraz obecnego wynalazku.

Korzystnie, synonimiczne grupy aminokwasów są tymi, które zdefiniowano w tabeli 1. Korzystniej, synonimiczne grupy aminokwasów są tymi, zdefiniowanymi w tabeli 2, a najkorzystniej, synonimiczne grupy aminokwasów są tymi, zdefiniowanymi w tabeli 3.

T a b e l a 1

Korzystne grupy synonimicznych aminokwasów

Aminokwas	Synonimiczna grupa
1	2
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu	Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, He, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile

PL 213 568 B1 cd tabeli 1

1	2
Phe	Trp, Met, Tyr, He, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, He, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met	Phe, He, Val, Leu, Met
Trp	Trp

T a b e l a 2

Korzystniejsze grupy synonimicznych aminokwasów

Aminokwas	Synonimiczna grupa
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, lie, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, Ile
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gin, Arg
Gin	Glu, Gin, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gln
Met	Met, Phe, He, Val, Leu
Trp	Trp

PL 213 568 B1

T a b e l a 3

Najkorzystniejsze grupy synonimicznych aminokwasów

Aminokwas	Synonimiczna grupa
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, Ile, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gln, Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, Ile, Leu
Trp	Met

Przykłady wytwarzania podstawień aminokwasów w białkach, które mogą być stosowane w celu otrzymania mutein polipeptydów lub białek IL-18BP, lub mutein wirusowych IL-18BP, do zastosowania w obecnym wynalazku obejmują dowolne znane etapy sposobów, takie jak przedstawione w opisach patentowych USA nr 4 959 314, nr 4 588 585 i nr 4 737 462 dla Mark i wsp.; nr 5 116 943 dla Koths i wsp.; nr 4 965 195 dla Namen i wsp.; nr 4 879 111 dla Chong i wsp.; oraz nr 5 017 691 dla Lee i wsp.; i białka podstawione lizyną przedstawione w patencie USA nr 4 904 584 (Shaw i wsp.).

Termin „białka fuzyjne” dotyczy polipeptydu zawierającego IL-18BP lub wirusowe IL-18BP, lub muteiny, lub ich fragment połączony z innym białkiem, które np. mają wydłużony czas przebywania w płynach ustrojowych. IL-18BP lub wirusowy IL-18BP może zatem być połączony z innym białkiem, polipeptydem lub tym podobnymi np. immunoglobuliną lub jej fragmentem.

„Funkcjonalne pochodne” jak użyte tutaj, obejmują pochodne IL-18BP lub wirusowego IL-18BP i ich mutein, i białek fuzyjnych, które mogą być wytwarzane z funkcjonalnych grup, występujących jako łańcuchy boczne reszt lub grupy N-, lub C-końcowe, za pomocą środków znanych w dziedzinie i są włączone do wynalazku, jeżeli pozostają dopuszczalne farmaceutycznie, tj. nie uszkadzają aktywności białka, która jest w znacznej mierze podobna do aktywności IL-18BP lub wirusowych IL-18BP i nie nadaje toksycznych właściwości zawierającym je kompozycjom.

Pochodne te mogą, na przykład, obejmować łańcuchy boczne glikolu polietylenowego, który może maskować miejsca antygenowe i wydłużać przebywanie IL-18BP i wirusowego IL-18BP w płynach ustrojowych. Inne pochodne obejmują estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych poprzez reakcję z amoniakiem lub z pierwszorzędowymi, lub drugorzędowymi aminami, pochodne N-acylowe wolnych grup aminowych reszt aminokwasów tworzonych z grupami acylowymi (np. grupami alkanoilowymi lub karbocyklicznymi grupami arylowymi) lub pochodne O-acylowe wolnych grup hydroksylowych (na przykład reszt seryny i treoniny) tworzonych z reszt acylowych.

PL 213 568 B1

W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku, inhibitor IL-18BP jest przeciwciałem skierowanym przeciw IL-18 lub jej receptorowi, IL-18R. Przeciwciała skierowane przeciw dowolnej z podjednostek IL-18R, nazwanej IL-18Rα i β, mogą być stosowane zgodnie z obecnym wynalazkiem.

Przeciwciała według wynalazku mogą być poliklonalne lub monoklonalne, chimerowe, humanizowane lub nawet w pełni ludzkie. Rekombinowane przeciwciała i ich fragmenty charakteryzują się wiązaniem z wysokim powinowactwem do IL-18 lub IL-18R in vivo oraz małą toksycznością. Przeciwciała, które mogą być stosowane w rozwiązaniach według wynalazku charakteryzują się zdolnością do leczenia pacjentów przez okres wystarczający, aby powodować dobrą lub doskonałą regresję lub złagodzenie stanu patogennego lub dowolnego objawu lub grupy objawów związanej ze stanem patogennym oraz małą toksycznością.

Neutralizujące przeciwciała są z łatwością wytwarzane w zwierzętach, takich jak króliki, kozy, myszy poprzez immunizację IL-18 lub IL-18Rα lub β. Immunizowane myszy są szczególnie użyteczne przy zapewnianiu źródła komórek B do wytwarzania hybrydom, hodowanych kolejno w celu wytworzenia dużych ilości monoklinalnych przeciwciał anty-IL-18.

Chimerowe przeciwciała są cząsteczkami immunoglobulin, charakteryzującymi się dwoma lub większą liczbą segmentów lub części pochodzących z różnych gatunków zwierząt. Ogólnie, region zmienny chimerowego przeciwciała pochodzi z niepochodzącego od ludzi, ssaczego przeciwciała, takiego jak mysie monoklonalne przeciwciało, a stały region immunoglobuliny pochodzi z ludzkiej cząsteczki immunoglobuliny.

Korzystnie, oba regiony i kombinacja ma małą immunogenność, co można oznaczyć rutynowo (Elliott i wsp., 1994). Humanizowane przeciwciała są cząsteczkami immunoglobulin, wytworzonymi technikami inżynierii genetycznej, w których mysie regiony stałe są zastępowane ludzkimi odpowiednikami, z jednoczesnym zachowaniem mysich regionów wiążących antygen. Powstające przeciwciało chimeryczne mysz-człowiek, ma korzystnie obniżoną immunogenność i poprawioną farmakokinetykę u ludzi (Knight i wsp., 1993).

Zatem, w kolejnym korzystnym wykonaniu, przeciwciało przeciw IL-18 i IL-18R jest humanizowanym przeciwciałem. Korzystne przykłady humanizowanych przeciwciał anty-IL-18 opisane są na przykład w europejskim zgłoszeniu patentowym EP nr 0 974 600.

W jeszcze kolejnym korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest w pełni ludzkie. Technologia wytwarzania ludzkich przeciwciał jest opisana szczegółowo np. w WO nr 00/76310, WO nr 99/53049, US nr 6 162 963 lub AU nr 5 336 100.

Jedna metoda wytwarzania w pełni ludzkich przeciwciał obejmuje „humanizację” mysiego humoralnego układu immunologicznego, tj. wytwarzanie mysich szczepów zdolnych do wytwarzania ludzkich Ig (ksenomyszy), poprzez wprowadzenie myszom, których endogenne geny Ig inaktywowano, Ioci ludzkich immunoglobulin. Loci Ig są złożone zarówno pod względem struktury fizycznej, jak i rearanżacji genów i procesów ekspresji wymaganych do ostatecznego wytwarzania szerokiej odpowiedzi immunologicznej. Złożoność przeciwciał jest przede wszystkim generowana poprzez kombinatoryczną rearanżację pomiędzy różnymi genami V, D i J występującymi w Ioci Ig. Loci te zawierają również włączone elementy regulatorowe, kontrolujące ekspresję przeciwciał, wyłączanie alleli, przełączanie klas oraz dojrzewanie powinowactwa. Wprowadzenie do myszy ludzkich transgenów Ig, które nie uległy rearanżacji wykazało, że mysie mechanizmy rekombinacyjne są zgodne z ludzkimi genami. Dodatkowo, hybrydomy wydzielające swoiste wobec antygenu hu-mAbs różnych izotopów mogą być otrzymywane przez immunizację ksenomyszy antygenem.

W pełni ludzkie przeciwciała oraz metody ich wytwarzania są znane w technice (Mendez i wsp., (1997); Buggemann i wsp., (1991); Tomizuka i wsp., (2000) patent WO nr 98/24893).

W bardzo korzystnym wykonaniu obecnego wynalazku, inhibitorem IL-18 jest IL-18BP, jego izoforma, muteina, białko fuzyjne lub funkcjonalna pochodna. Te izoformy, muteiny, białka fuzyjne, funkcjonalne pochodne zachowują aktywność biologiczną IL-18BP, w szczególności wiązanie do IL-18 i korzystnie koniecznie mają przynajmniej aktywność podobną do IL-18BP. Idealnie takie białka mają wzmocnioną aktywność biologiczną w porównaniu ze zmodyfikowanym IL-18BP.

Sekwencje IL-18BP i wariantów jego składania/izoform mogą być wzięte z WO nr 99/09063 lub z Novick i wsp., 1999, jak również z Kim i wsp., 2000.

Funkcjonalne pochodne IL-18BP mogą być sprzęgane z polimerami w celu poprawienia właściwości białka, takich jak stabilność, okres półtrwania, biodostępność, tolerancja przez ludzkie przeciwciała lub immunogenność. W celu osiągnięcia tego celu, IL18BP może być łączony z np. glikolem

PL 213 568 B1 polietylenowym (PEG). Modyfikacja z użyciem PEG może być przeprowadzana znanymi metodami, opisanymi na przykład w WO nr 92/13095.

Zatem, w korzystnym wykonaniu obecnego wynalazku, inhibitory IL-18, a w szczególności IL-18BP są modyfikowane PEG.

W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku, inhibitor IL-18 obejmuje fuzję immunoglobuliny, tj. inhibitor IL-18 jest białkiem fuzyjnym, zawierającym całość lub część białka wiążącego IL-18, która jest połączona z całością lub częścią immunoglobuliny. Metody przygotowywania białek fuzyjnych immunoglobulin są dobrze znane w technice, na przykład takie, jak te opisane w WO nr 01/03737. Specjalista w dziedzinie zrozumie, że powstające białko fuzyjne wynalazku zachowuje aktywność biologiczną IL-18BP, w szczególności wiązanie do IL-18. Fuzja może być bezpośrednia lub przez krótki peptyd łącznikowy, który może być krótki, jak 1 do 3 reszt aminokwasowych długości lub dłuższy, na przykład 13 do 20 reszt aminokwasowych długości. Łącznik taki może być, na przykład, tripeptydem o sekwencji E-F-M (Glu-Phe-Met) lub 13-aminokwasową sekwencją łącznika zawierającą Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, wprowadzoną pomiędzy sekwencję IL-18BP a sekwencję immunoglobuliny. Powstające białko fuzyjne ma udoskonalone właściwości, takie jak wydłużony czas przebywania w płynach ciała (okres półtrwania), zwiększoną aktywność właściwą, zwiększony poziom ekspresji lub ułatwione jest oczyszczanie białka fuzyjnego.

W korzystnym wykonaniu, 1L-18BP jest połączony z regionem stałym cząsteczki Ig. Korzystnie, jest połączony z regionami łańcucha ciężkiego, jak na przykład domeny CH2 i CH3 ludzkiej IgGl. Wytwarzanie określonych białek fuzyjnych zawierających IL-18BP i część immunoglobuliny opisano na przykład w przykładzie 11 WO nr 99/09063. Inne izoformy cząsteczek Ig są również odpowiednie do wytwarzania białek fuzyjnych zgodnie z obecnym wynalazkiem, na przykład takie, jak izoformy IgG2 lub IgG4 lub inne klasy Ig, jak IgM lub IgA. Białka fuzyjne mogą być monomeryczne lub miltimeryczne, hetero- lub homomultimeryczne.

W jeszcze kolejnym wykonaniu wynalazku, inhibitor IL-18 jest użyty w kombinacji z antagonistą TNF. Antagoniści TNF manifestują swoją aktywność na kilka sposobów. Po pierwsze, antagoniści mogą wiązać się lub maskować samą cząsteczkę TNF z wystarczającym powinowactwem i specyficznością, aby częściowo lub znacznie neutralizować epitop lub epitopy TNF, odpowiadające za wiązanie receptora TNF (nazywane tutaj „antagonistami maskującymi”). Maskującym antagonistą może być na przykład przeciwciało skierowane przeciw TNF.

Alternatywnie, antagoniści TNF mogą hamować ścieżką sygnałową TNF, aktywowaną przez receptor na powierzchni komórki po związaniu TNF (nazywane tutaj „antagonistami sygnałowymi''). Obie grupy antagonistów są użyteczne, zarówno pojedynczo, jak i razem, w kombinacji z inhibitorem IL-18 w terapii lub zapobieganiu chorobom serca.

Antagoniści TNF mogą być łatwo identyfikowani i oceniani na drodze rutynowego przeszukiwania kandydatów pod względem ich wpływu na aktywność natywnego TNF na wrażliwe linie komórkowe in vitro, na przykład ludzkie komórki B, w których TNF wywołuje proliferację i wydzielanie immunoglobulin. Test zawiera formulację TNF w różnych rozcieńczeniach antagonisty-kandydata np. od 0,1 do 100 razy molarnej ilości TNF użytego w teście oraz kontrole przy braku TNF lub tylko antagonistę (Tucci i wsp., 1992).

Antagoniści maskujący są korzystnymi antagonistami TNF przy zastosowaniu według obecnego wynalazku. Spośród antagonistów maskujących, korzystne są te polipeptydy, które wiążą TNF z wysokim powinowactwem i mają małą immunogenność. Szczególnie korzystne są rozpuszczalne cząsteczki receptora TNF i przeciwciała neutralizujące TNF. Na przykład, rozpuszczalne TNF-RI i TNF-RII są użyteczne w obecnym wynalazku. Skrócone formy tych receptorów, zawierające zewnątrzkomórkowe domeny receptorów lub ich funkcjonalne części są szczególniej korzystnymi antagonistami według obecnego wynalazku. Skrócone rozpuszczalne receptory TNF typu I i typu II są opisane na przykład w EP nr 914 431.

Skrócone formy receptorów TNF są rozpuszczalne i były wykrywane w moczu oraz surowicy jako 30 kDa i 40 kDa inhibitorowe białka wiążące TNF, nazywane odpowiednio TBPI i TBPII (Engelmann i wsp., 1990). Jednoczesne, sekwencyjne lub oddzielne stosowanie inhibitora IL-18 z antagonistą TNF jest korzystne według wynalazku.

W kolejnym korzystnym wykonaniu, ludzki rozpuszczalny TNF-RI (TBPI) jest antagonistą TNF stosowanym według wynalazku. Naturalne i rekombinowane rozpuszczalne cząsteczki receptora TNF i metody ich wytwarzania opisano w europejskich patentach nr EP 308 378, nr EP 398 327 i EP nr 433 900.

PL 213 568 B1

Pochodne, fragmenty, regiony i biologicznie aktywne części cząsteczek receptora są podobne funkcjonalnie do cząsteczek receptora i mogą być również stosowane w obecnym wynalazku. Takie biologicznie aktywne ekwiwalenty lub pochodne cząsteczki receptora dotyczą części polipeptydu lub sekwencji kodującej cząsteczkę receptora, wystarczającej wielkości i zdolnej do wiązania TNF w takim powinowactwem, że oddziaływanie ze związanym z błoną receptorem TNF jest zahamowane lub zablokowane.

Inhibitor IL-18 może być stosowany jednocześnie, sekwencyjnie lub oddzielne z inhibitorem TNF.

Zgodnie z obecnym wynalazkiem, lek może dodatkowo zawierać znane czynniki stosowane w leczeniu chorób serca, takie jak azotany, np. nitrogliceryna, środki moczopędne, inhibitory ACE, naparstnicę, beta blokery, blokery wapna, w kombinacji z inhibitorem IL-18. Aktywne składniki mogą być stosowane jednocześnie, sekwencyjnie lub oddzielne.

W kolejnym korzystnym wykonaniu obecnego wynalazku, inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości około 0,001 do 100 mg/kg lub około I do 10 mg/kg lub 2 do 5 mg/kg.

Inhibitor IL-18 według wynalazku korzystnie jest podawany systematycznie i korzystnie podskórnie lub domięśniowo.

Wynalazek dalej dotyczy zastosowania wektora ekspresyjnego, zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18 wybrany spośród przeciwciał skierowanych przeciwko IL-18, przeciwciał skierowanych przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18 oraz białek wiążących IL-18 lub ich izoform, mutein, białek fuzyjnych lub funkcjonalnych pochodnych hamujących biologiczną aktywność IL-18, do wytwarzania leku do zapobiegania i/lub kardiomiopatii. Zatem, podejście związane z terapią genową jest rozpatrywane w celu dostarczenia inhibitora IL-18 do wymaganego miejsca. Aby leczyć i/lub zapobiegać chorobie serca, wektor terapii genowej, zawierający sekwencję inhibitora IL-18 może być na przykład wstrzykiwany bezpośrednio do chorej tkanki, w ten sposób omijając problemy związane z ogólnoustrojowym podawaniem wektorów terapii genowej, jak rozcieńczenie wektorów, osiąganie i wiązanie się do komórek lub tkanek docelowych oraz efektów ubocznych.

Stosowanie wektora do wywołania i/lub wzmocnienia endogennego wytwarzania inhibitora IL-18 w komórce normalnie wyciszonej pod względem ekspresji inhibitora IL-18 lub wyrażającej ilości inhibitora, które są niewystarczające jest również rozważane według wynalazku. Wektor może zawierać sekwencje regulatorowe funkcjonujące w komórkach, potrzebne do wyrażania inhibitora IL-18. Takie regulatorowe sekwencje mogą być, na przykład, promotorami lub wzmacniaczami. Sekwencje regulatorowe mogą być następnie wprowadzane w odpowiednie locus w genomie, na drodze homologicznej rekombinacji, w ten sposób łącząc operacyjnie sekwencje regulatorowe z genem, którego wywołanie lub wzmocnienie ekspresji jest wymagane. Technologia jest zwykle nazywana „Aktywacją Endogennego Genu” (EGA) i jest opisana np. w WO nr 91/09955.

Będzie zrozumiałe dla specjalisty w dziedzinie, że jest również możliwe bezpośrednie wyłącznie ekspresji IL-18 tą samą techniką, bez stosowanie inhibitora IL-18. Aby to osiągnąć, negatywny element regulatorowy, jak np. element wyciszający, może być wprowadzony do locus genu IL-18, w ten sposób prowadząc do regulacji w dół lub zapobiegania ekspresji IL-18. Specjalista w dziedzinie zrozumie, że taka regulacja dół lub wyciszenie ekspresji IL-18 ma ten sam efekt jak stosowanie inhibitora IL-18 w celu zapobiegania i/lub leczenia choroby serca.

Inhibitor IL-18, który ma być stosowany zgodnie z obecnym wynalazkiem może być korzystnie podawany jako kompozycja farmaceutyczna, opcjonalnie w kombinacji z skuteczną terapeutycznie ilością inhibitora TNF.

IL-18BP i jego izoformy, muteiny, białka fuzyjne, funkcjonalne pochodne, jak opisano powyżej, są korzystnymi aktywnymi składnikami kompozycji farmaceutycznych.

Definicja „farmaceutycznie dopuszczalny” ma w zamierzeniu zawierać dowolny nośnik, który nie zakłóca skuteczności aktywności biologicznej aktywnego składnika i który nie jest toksyczny dla gospodarza, któremu jest podawany. Na przykład, pozajelitowe podawanie aktywnego białka (białek) może być formułowane w formie jednostek dawkowania do wstrzyknięcia w podłożach, takich jak roztwór soli, roztwór dekstrozy, albumina surowicy lub roztwór Ringera.

Aktywne składniki kompozycji farmaceutycznej według wynalazku mogą być podawane osobnikowi na wiele sposobów. Drogi podawania obejmują drogi doskórne, przezskóme (np. w wolno uwalnianych formulacjach), domięśniowe, śródotrzewnowe, dożylne, podskórne, doustne, wewnątrzczaszkowe, nadtwardówkowe, miejscowe i donosowe. Dowolna inna terapeutycznie skuteczna droga podawania może być stosowana, na przykład adsorpcja przez tkanki nabłonkową lub śródbłonkową lub na drodze terapii genowej, w której cząsteczka DNA kodująca czynnik aktywny jest podawana

PL 213 568 B1 pacjentowi (np. via wektor), co powoduje ekspresję i wydzielanie czynnika aktywnego in vivo. Dodatkowo, białko (białka) według wynalazku mogą być podawane razem z innymi składnikami czynników aktywnych biologicznie, takimi jak farmaceutycznie dopuszczalne surfaktanty, zaróbki, nośniki, rozcieńczalniki i podłoża.

W przypadku pozajelitowego (dożylnego, podskórnego, domięśniowego) podawania, białko (białka) aktywne może być formułowane jako roztwór, zawiesina, emulsja lub liofilizowany proszek w połączeniu z farmaceutycznie akceptowanym pozajelitowym podłożem (np. woda, roztwór soli, roztwór dekstrozy) i dodatkami utrzymującymi izotoniczność (np. mannitol) lub stabilność chemiczną (np. środki konserwujące, bufory). Formulacja jest sterylizowana powszechnie stosowanymi technikami.

Biodostępność aktywnego białka (białek) według wynalazku może być również ulepszona przez stosowanie procedur sprzęgania, które podnoszą okres półtrwania cząsteczki w ludzkim ciele, na przykład łączenie cząsteczki do glikolu polietylenowego, tak jak opisano w zgłoszeniu patentowym PCT nr WO 92/13095.

Terapeutycznie skuteczne ilości aktywnego białka (białek) będą funkcją wielu zmiennych, włączając typ antagonisty, powinowactwo antagonisty do IL-18, dowolną szczątkową aktywność cytotoksyczną wykazywaną przez antagonistów, drogę podawania, stan kliniczny pacjenta (włączając pożądanie utrzymywania nietoksycznego poziomu aktywności endogennego IL-18).

„Terapeutycznie skuteczna ilość” to taka, po podaniu której inhibitor IL-18 powoduje zahamowanie biologicznej aktywności IL-18. Podane dawkowanie, jako pojedyncza lub wielokrotne dawki, osobnikowi będzie się różniło w zależności od wielu czynników, włączając właściwości farmakokinetyczne inhibitora IL-18, drogę podawania, stan i charakterystykę pacjenta (płeć, wiek, ciężar ciała, stan zdrowia, rozmiar), zakres objawów, współbieżne leczenia, częstość leczenia i pożądany efekt. Regulowanie oraz manipulacja ustalonymi zakresami dawek są w zasiągu możliwości specjalistów w dziedzinie, jak również in vitro i in vivo metody ustalania hamowania IL-18 u osobnika.

Zgodnie z wynalazkiem, inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości 0,001 do 100 mg/kg lub około 0,01 do 10 mg/kg masy ciała, lub około 0,1 do 5 mg/kg masy ciała lub około 1 do 3 mg/kg masy ciała, lub około 2 mg/kg masy ciała.

Korzystną drogą podawania według wynalazku jest podawanie droga podskórną. Podawanie domięśniowe jest kolejnym korzystnym według wynalazku. W celu podania inhibitora IL-18 bezpośrednio do miejsca jego działania, podawanie miejscowe jest również korzystne.

W kolejnych korzystnych wykonaniach wynalazku, inhibitor IL-18 jest podawany codziennie lub co drugi dzień.

Dzienne dawki są zwykle podawane w podzielonych dawkach lub w formie podtrzymywanego uwalniania skutecznej w otrzymywaniu pożądanych efektów. Drugie lub następne podanie może być przeprowadzane w dawce, która jest taka sama, mniejsza Iub większa niż pierwotna lub poprzednia dawka podana osobnikowi. Drugie lub następne podanie może być podane podczas lub przez początkiem choroby.

Zgodnie z wynalazkiem inhibitor IL-18 może być podawany profilaktycznie lub terapeutycznie osobnikowi, jednocześnie lub sekwencyjnie z innym trybem leczenia lub środkami (np. liczne tryby leczenia), w dawce skuteczniej terapeutycznie, w szczególności z inhibitorem TNF i/lub innym czynnikami chroniącymi serce. Aktywne czynniki podawane jednocześnie z innymi środkami mogą być podawane w tej samej lub w różnych kompozycjach.

Wynalazek dalej dotyczy sposobu wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, zwierającej zmieszaną skuteczną ilość inhibitora IL-18 i/lub antagonisty TNF z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem.

Przykłady

P r z y k ł a d 1. Hamowanie il-18 obniża niedokrwienną niewydolność mięśnia sercowego in vitro

Materiały i metody

Odczynniki. Izoformę IL-18BPa wyrażono z N-końcowym znacznikiem (His)₆ w komórkach jajnika chomika chińskiego i oczyszczono do homogenności. Zdolność IL-18BPa-(His)₆ do neutralizacji IL-18 opisano (Kim i wsp., 2000). Inhibitor ICE (ICEi) Ac-Try-Val-Ala-Asp-chlorometyloketon (YVAD) zakupiono od Alexis Biochemicals (San Diego) i rozpuszczono w DMSO w 10 mg/ml. ICEi przed użyciem rozcieńczono w roztworze Tyrodea. W ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej, ICEi obniża o 92% wywołane endotoksynami wydzielanie dojrzałej IL-1 β, zgodnie z pomiarem przez ELISA (Cistron Biotechnology, Pine Brook, NJ).

PL 213 568 B1

Izolowane beleczki przedsionka. Pacjenci poddawani planowanemu zabiegowi tworzenia przepływu omijającego tętnicy wieńcowej z pompą natleniającą wymagają wprowadzenia kaniuli do prawego przedsionka. W tym czasie, mały segment uszka prawego przedsionka jest rutynowo wycinany i usuwany. Beleczki otrzymano z tej usuniętej tkanki. Ludzką tkankę przedsionka umieszczono w natlenianym zmodyfikowanym roztworze buforu Tyrodea w 4°C. Zmodyfikowany roztwór Tyrodea przygotowywany tego samego dnia, przy użyciu destylowanej i dejonizowanej wody i zawierał D-glukozę w 5,0 mmol/litr,CaCl₂ w 2,0 mmol/litr, NaCl w 118,0 mmol/litr, KCI w 4,0 mmol/litr, MgSO₄ · 7H2O w 1,2 mmol/litr, NaHCO3 w 25,0 mmol/litr oraz NaH2PO4 w 1,2 mmol/litr. Roztwór Tyrodea pozbawiony substratu zawierał chlorek choliny w 7 mmol/litr w celu utrzymania osolarności. Jeżeli nie zaznaczono inaczej, związki chemiczne i odczynniki otrzymano z Sigma. Dwie do czterech beleczek (4-7 mm długości i < 1,0 mm średnicy) przyczepiono do przetwornika siły i zanurzono w podgrzanej (37°C) 30 ml łaźni ze zmodyfikowanym roztworem Tyrodea, podczas normoksji wpompowywano mieszaninę 92,5% O2/7,5% CO2. Ta mieszanina gazów wytwarzała częściowe ciśnienie O2 > 350 mm Hg (1 mm Hg = 133 Pa) i częściowe ciśnienie CO2 36-40 mm Hg oraz pH 7,35-7,45. Każdy parametr sprawdzano rutynowo automatycznym analizatorem gazów krwi. Temperaturę łaźni z organem utrzymywano na poziomie 37°C w czasie przeprowadzania eksperymentu. Podczas stymulowanego niedokrwienia, mieszanię gazów zmieniano na 92,5% N2/7,5% CO2. Mieszanina ta wytwarzała częściowe ciśnienie O2 < 50 mm Hg. Roztwór buforu zmieniano co 20 min z wyjątkiem 30-minutowego okresu stymulowanego niedokrwienia.

Plan eksperymentu. Beleczki wyrównano przez 90 min, w celu podniesienia siły napięcia w punkcie odniesienia do 1000 mg i aby umożliwić stabilizację siły rozwiniętej. Beleczki, które nie wygenerowały ponad 250 mg siły rozwiniętej, wykluczono z badań. Podczas 90 min. wyrównywania przeprowadzono rytmiczną impulsację elektrodami platynowymi (Radnoti Glass, Monrovia, CA) w celu stymulacji pola. Elektrody umieszczono po każdej stronie beleczek, stymulowano (Grass SD9 stymulator, Warwick, RI) 6 ms pulsami przy woltażu 20% ponad progiem i przeprowadzano rytmiczną impulsację przy 1 Hz podczas normoksji i 3 Hz podczas niedokrwienia. Skurcze monitorowano przetwornikami siły (Grass FT03) i nagrywano stosując skomputeryzowany przedwzmacniacz i przetwornik analogowo-cyfrowy (MacLab Quad Bridge, MacLab/8e, AD Instruments, Milord, MA) stale monitorując komputerem Macintosh.

Po wyrównaniu, beleczki z jednego pacjenta badano w trzech warunkach eksperymentalnych: warunkach kontrolnych składających się z 90 min suprafuzji normoksyjnej; I/R składających się z 30 min. stymulowanego niedokrwienia, po którym następowało 45 min. reperfuzja; oraz trzeciego warunku składającego się interwencji antycytokinowej. W ostatnim przypadku, antycytokinę dodawano do łaźni suprafuzyjnej tuż przed rozpoczęciem niedokrwienia i utrzymywano przez 45 min. reperfuzji.

Zachowana beleczkowa aktywność CK. Tkankową aktywność CK w końcu reperfuzji (90 min.) wyznaczono jak opisano (Kaplan i wsp., 1993). Tkanki homogenizowano w 100 vol. lodowatego izotonicznego buforu ekstrakcyjnego (Cleveland i wsp., 1997, Kaplan i wsp., 1993). Test przeprowadzono zestawem CK (Sigma), używając zautomatyzowanego spektrofotometru. Wyniki są przedstawione jako jednostki aktywności CK na mg (masy mokrej tkanki).

Izolacja RNA i PCR połączony z odwrotna transkrypcją. Świeże beleczki homogenizowano w Tri-Reagent (Molecular Research Center, Cinannati) i całkowity RNA izolowano przez ekstrakcję chloroformem i precypitację izopropanolem. RNA rozpuszczano w wodzie traktowanej dietylopirowęglanem oraz DNazą i oznaczano ilościowo używając GeneQuant (Amersham Pharmacia Biotech). Metody cDNA opisano (Reznikov i wsp., 2000). Dla każdej PCR, stosowano następująca sekwencję: wstępne podgrzewanie w 95°C przez 15 min., a następnie cykle 94°C przez 40 sek., 55°C przez 45 sek. oraz 72°C przez 1 min., z końcową fazą wydłużania w 72°C przez 10 min. Optymalną liczbę cykli określono jako 35. Startery dla dehydrogenazy trójfosforanu gliceraldehydu (GAPDH) i ludzkiej IL-18 Reznikov i wsp., 2000) oraz ludzkiego IL-18BPa (Kim i wsp., 2000) były opublikowane.

Produkty PCR rozdzielono w 1,5% żelu agarozowym zawierającym 0,5 x TBE (50 mM Tris/45 mM kwas borowy/0,5 mM EDTA, pH 8,3) z bromkiem etydyny 0,5 mg/ml, wizualizowano przez iluminację UV i fotografowano. Densytometrię przeprowadzono na obrazie negatywowym (IMAGEQUANT software, Molecular Dynamics), i względną absorbancję produktów PCR IL-18 i IL-18BP korygowano wobec absorbancji otrzymanej dla GAPDH.

Określanie IL-18. Świeże beleczki homogenizowano, tak jak opisano powyżej dla pomiarów aktywności CK. Analizowano IL-18 przez elektrochemiluminescencję w fazie płynnej (ECL, Igen, Gaithersburg, MD). Mysie mAb anty-ludzka IL-18 (R & D Systems) wyznakowano rutenem (Igen). Dodat16

PL 213 568 B1 kowo, oczyszczone przez powinowactwo kozie przeciwciało anty-ludzka IL-18 (R & D) wyznakowano biotyną (Ingen). Biotynylowane przeciwciało rozcieńczono do końcowego stężenia g/ml w PBS (pH 7,4), zawierającym 0,25% BSA, 0,5% Tweed-10 oraz 0,01%) azydek (bufor ECL). W probówce testowej w temperaturze pokojowej preinkubowano 25 μl bionytylowego przeciwciała z 25 μl kulek paramagnetycznych opłaszczonych streptawidyną (Dynal, Great Neck, NY), stężonych 1 μg/μl przez 30 min. z silnym wytrząsaniem. Próbki testowe (25 μθ lub standardy dodawano do probówek, po czym dodawano 25 μl rutynowanego przeciwciała (stężenie końcowe g/l rozcieńczone w buforze ECL). Następnie probówki wytrząsano przez 24 godziny. Reakcję wyciszano poprzez dodanie 200 μl PBS na probówkę i określano ilość chemiluminescencji analizatorem Origen (Igen). Limit detekcji IL-18 wynosi 16 pg/ml.

Mikroskopia konfokalna. Ludzką tkankę przedsionka otrzymaną podczas wprowadzania kanuli pompy natleniającej umieszczono w Icm plastikowym pojemniku (Meldrum i wsp., 1998), zatopiono oraz zamrożono w pożywce do zamrażania tkanek (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC) w izopentenie schładzanym suchym lodem. Zamrożone skrawki (5 μm) cięto na kriostacie Leica CM 1850 (Leica, Deerfield, IL). Preparaty utrwalono przez 10 minut w 4% paraformaldehydzie, wysuszono na powietrzu i inkubowano przez 20 minut w PBS z dodatkiem 10% prawidłowej surowicy koziej. Preparaty inkubowano w rozcieńczeniu 1:100 króliczego przeciwciała anty-ludzka ILl8 (Peprotech, Rocky Hill, NJ) lub 1 μg/ml IgG nie immunizowanego królika jako kontrolą negatywną. Przeciwciała rozcieńczono w PBS zawierającym 1% BSA. Po całonocnej inkubacji w 4°C preparaty płukano trzy razy 0,5% BSA w PBS. Następnie preparaty inkubowano z drugorzędowym kozim przeciwciałem anty-królik sprzężonym z Alexa 488 (Molecular Probes) przez 60 min. w temperaturze pokojowej w ciemności. Jądra barwiono na niebiesko 1 μg/100 ml bisbenzymidu (Sigma). Po barwieniu preparaty przepłukiwano, badano w konfokalnym laserowym systemie skaningowym Leica DM RXA (Leica) i analizowano stosując oprogramowanie SLIDEBOOK dla Macintosh (Intelligent Imaging Innovations, Denver).

Analiza statystyczna. Dane wyrażono jako średnią ± SEM. Średnie zmiany w sile rozwiniętej obliczano względem wartości kontrolnej w 90 min. dla tkanki każdego pacjenta. Istotność statystyczną różnic pomiędzy grupami oznaczano przez czynnikową ANOVA z analizą Bonferroni-Dunn post hoc. Analizy statystyczne przeprowadzano stosując oprogramowanie STAT-VIEW4. 51 (Abacus Concepts, Calabasas, CA).

Wyniki

Wpływ neutralizacji endogennej IL-18 przez IL-18BP na silę rozwiniętą po niedokrwieniu

Figura 1A przedstawia odpowiedź kinetyczną beleczek na uszkodzenie I/R. Przedstawione jest ostatnie 15 minut wyrównania, znormalizowane do 100% na początku okresu eksperymentalnego. Beleczki kontrolne są suprafuzowane w warunkach normoksywnych w czasie trwania eksperymentu. Jak przestawiono, w kontrolnych beleczkach wystąpiła redukcja (10%) siły rozwiniętej. Beleczki poddane niedokrwieniu wykazują gwałtowne obniżenie czynności kurczliwej; w czasie reperfuzji siła kurczliwa wraca do około 25% kontroli siły rozwiniętej. Przeciwnie, beleczki narażone na niedokrwienie, ale w obecności IL-18BP wracają do 55% kontroli siły rozwiniętej. Aby ocenić odpowiedź IR tkanki sercowej różnych pacjentów, poziom siły rozwiniętej w kontrolnych beleczkach w 90 min ustawiono jako 100% dla próbki każdego pacjenta i obliczono względny procent zmian w sile rozwiniętej w grupach eksperymentalnych.

Jak przedstawiono na fig. 1B, siła rozwinięta po niedokrwieniu w nie traktowanych beleczkach (I/R) była zredukowana do średnio 35% kontroli. Jednakże, w obecności IL- 18BP redukcja ta była osłabiona odpowiednio do średnio 6,2% kontroli przy 1 pg/ml i 76% kontroli przy 5 μg/ml. Wyniki te wskazują, że I/R powoduje uwalnianie biologicznie aktywnej IL-18 po obróbce endogennego prekursora IL-18 przez ICE. Zatem, IL-18 mierzono w świeżo-otrzymanej tkance przedsionka. Jak przedstawiono na fig. 2, IL-18 na podstawowym poziomie była obecna w beleczkach otrzymanych po wprowadzeniu kanuli pompy natleniającej do prawego przedsionka. Po 90 min. wyrównywania, 30 min., niedokrwienia i 45 min. ponownego natleniania, beleczki homogenizowano i oznaczano poziomy IL-18. W tkance po I/R występowało 4,5 krotne zwiększenie IL-18 (fig. 2)

W tych tkankach ustalono również poziomy mRNA dla IL-18 i IL-18BP w stanie ustalonym. Obserwowano podstawową ekspresję genów IL-18 i IL-18BP w świeżo- otrzymanych homogenatach przedsionków przed niedokrwieniem (fig. 3A, B). Podobnie jak w przypadku wzrostu białka IL-18, I/R wywołała dodatkowy wzrost w poziomach mRNA w stanie ustalonym (wzrost 4,7-krotny). W świeżo otrzymanej tkance przedsionka obserwowano również ekspresję genu IL-18BP, która wzrastała tylko w niewielkim stopniu (1,3 razy) po I/R.

PL 213 568 B1

Lokalizacja IL-18 w ludzkim mięśniu sercowym

Z uwagi na fakt, że białko IL-18, zgodnie z pomiarem przez ECL oraz mRNA występują w świeżo otrzymanych homogenatach mięśnia sercowego, zastosowano barwienie histochemiczne w celu określenia lokalizacji IL-18. Tkanki przedsionka otrzymano tuż przed wprowadzeniem kaniuli pompy natleniającej i natychmiast zamrożono (nie pokazano). IL-18 obserwowano w miejscowych makrofagach mięśnia sercowego oraz z naczyniowych komórkach nabłonka. IL-18 jest obecna w makrofagach i komórkach nabłonka przed wystąpieniem niedokrwienia związanego z operacją i występuje nie kontaktując się z obcymi powierzchniami. Lokalizacja IL-18 w miejscowych makrofagach i komórkach nabłonka jest zgodna z poprzednimi badaniami konstytutywnie wytworzonego pierwotnie prekursora IL-18 w świeżo otrzymanych ludzkich monocytach obwodowych zdrowych osobników (Puren i wsp., 1999). Zatem, można wyciągnąć wniosek, że wytworzony pierwotnie prekursor IL-18 występuje w mięśniu sercowym pacjentów, dla których planuje się tworzenie przepływu omijającego tętnicy wieńcowej w niedokrwiennej chorobie serca.

Wpływ inhibicji ICE na siłę rozwiniętą po niedokrwieniu

Ponieważ IL-I8BP skutecznie osłabiał zaburzenie mięśnia sercowego wywołane niedokrwieniem, postawiono hipotezę, że zahamowanie konwersji tworzonego pierwotnie prekursora IL-18 do dojrzałej IL-18 osłabi również zaburzenie mięśnia sercowego wywołane niedokrwieniem. Zatem, przed rozpoczęciem niedokrwienia, do łaźni suprafuzyjnej dodano specyficzny inhibitor ICE YVAD. Inhibicję ICE poprzez dodanie YVAD kontynuowano w trakcie okresu niedokrwienia i podczas reperfuzji. Inhibicja ICE za pośrednictwem YVAD spowodowała osłabienie zaburzenia mięśnia sercowego wywołanej niedokrwieniem, co pokazano przez poprawę czynności kurczliwej z 35% kontroli w I/R do 60% przy 10 μg/ml i 75,8% przy 20 μg/ml (fig. 4). Wyniki te potwierdzają, że w ludzkim mięśniu sercowym IL-18 aktywna biologicznie jest wynikiem cięcia wytworzonego pierwotnie prekursora IL-18 przez ICE. Dodatkowo, wyniki te wskazują, że niedokrwienie mięśnia sercowego może aktywować utajony ICE.

Zachowanie żywotności komórek

Wewnątrzkomórkowe poziomy CK użyto do oceny stopnia żywotności komórek po I/R. W tym teście, im większa jest wartość CK, tym wyższa jest liczba żywych komórek. Każda z interwencji antycytokinowych powodowała zachowanie żywotności komórek. Jak przedstawiono na fig. 5, inhibicja IL-18BP i ICE (10 i 20 pg/ml), podnosiła wewnątrzkomórkowe poziomy CK po I/R odpowiednio z 1399 do 5921, 5675, 6624 i 4662 jednostek aktywności CK na mg (mokrej tkanki). Te obserwacje wskazują, że zahamowanie aktywacji IL-18 wywołanej I/R zachowuje żywotność komórek mięśnia sercowego w tym modelu ex vivo.

Wpływ neutralizacji czynności mięśnia sercowego wywołanej TNFα

Jak przedstawiono na fig. 6, siła rozwinięta (DF) beleczek była obniżona o 18% po 90 min. ekspozycji na egzogenny TNFα. Neutralizacja endogennej IL-18 przy czynności kurczliwej w ludzkim mięśniu sercowym poddanym działaniu egzogennego TNFα przez inkubację z IL-18BP przez 10 min. przed dodaniem TNFα zmniejszyła wielkość spadku w sile rozwiniętej (DF), patrz fig. 6. Po 90 min. siła rozwinięta w grupie kontrolnej była zmniejszona o 18%, podczas gdy w beleczkach poddanych działaniu TNFα obniżyła się o 58% w porównaniu z kontrolą. Jednakże, w beleczkach z IL-18BP poddanych działaniu TNFα, siła rozwinięta tylko spadła o 30% w porównaniu z kontrolą. Dane te wskazują, że bezpośrednie efekty TNFα na obniżenie kurczliwości mięśnia sercowego zachodzą za pośrednictwem, przy najmniej w części, endogennej IL-18 aktywnej biologicznie.

Wpływ egzogennej IL-18 na siłę rozwiniętą

Następnie, oznaczono bezpośredni efekt egzogennej IL-18 na czynność kurczliwą mięśnia sercowego. IL-18 dodano do suprafuzowanych beleczek po 90 min. wyrównywania z każdą wymianą łaźni. Jak pokazano na fig 7, IL-18 prowadzi do powolnego lecz postępowego obniżenia w sile rozwiniętej w czasie trwania eksperymentu. Po 90 min. ciągłej ekspozycji na IL-18, siła rozwinięta była obniżona o 42%. Dane to pokazują, że egzogenna IL-18. podobnie do TNFα, działa jako depresator mięśnia sercowego.

Co interesujące, IL-18 nie jest tak silnym depresatorem mięśnia sercowego jak TNFα.

Zachowanie żywotności komórek

Kaspazy są często związane z apoptozą. W celu oceny żywotności komórek dla beleczek poddanych działaniu TNFα, mierzono wewnątrzkomórkową kinazę kreatyniny (CK) tkanki. W tym teście, wysokie poziomy CK, wskazują żywe komórki. Jak przedstawiono na fig. 8, kontrolne beleczki, które przeszły 90 min., suprafuzji normoksywnej, zawierały 6801 ± 276 jednostek aktywności CK na mili18

PL 213 568 B1 gram masy mokrej tkanki. Przeciwnie, beleczki poddane 30/45 min. uszkodzeniu I/R lub 90 min. ekspozycji na TNFα wykazywały obniżone poziomy zachowanej CK, odpowiednio 1774 ± 181 i 3246 ± 217 jednostek/mg. Beleczki podane ekspozycji na TNFα w obecności IL-18BP zawierały 5605 ± 212 jednostek/mg tkanki. Co interesujące, beleczki traktowane TNFα miały wyższe zachowane poziomy CK w porównaniu z beleczkami I/R. Było to nieoczekiwane ujawnienie, ponieważ wielkość siły rozwiniętej na koniec okresu eksperymentalnego była taka sama dla I/R i TNFα.

P r z y k ł a d 3/ IL-18BP chroni przez zawałem mięśnia sercowego in vivo

Metoda

Domięśniowy elektrotransfer mysiego plazmidu ekspresyjnego IL-18BP in vivo

W odstępach 3-tygodniowych, myszy C57BL/6 otrzymały 3 szczepienia plazmidem ekspresyjnym, zawierającym cDNA dla IL-18BP (zwanym pcDNA3-IL18BP, opisanym w WO 01/85201). Myszy kontrolne szczepiono pustym plazmidem kontrolnym. cDNA mysiej izoformy d IL-18BP (numer dostępu # Q9ZOM9) izolowano, jak opisano w (Kim i wsp., 2000) subklonowano w miejsca EcoRI/Notl ssaczego wektora ekspresyjnego pcDNA3 pod kontrolę promotora wirusa cytomegalii (Invitrogen). Kontrolnym plazmidem był ten sam konstrukt, pozbawiony terapeutycznego cDNA. Grupa kontrolna zawierała 31 myszy, grupa eksperymentalna, otrzymująca IL-18BP zawierała 27 myszy.

Wektor ekspresyjny IL-18BP i kontrolny (60 μg) wstrzyknięto w oba mięśnie piszczelowe znieczulonych myszy, jak opisano poprzednio (Mallat i wsp., 1999). W skrócie, przezskórne pulsy elektryczne (8 prostokątno falowych pulsów elektrycznych 200 V/cm, trwających 20 msec, przy 2 Hz) dostarczono przy pomocy elektropulsatora PS-15 (Genetronics, France), używając dwóch elektrod płytkowych ze stali nierdzewnej, umieszczonych 4,2 do 5,3 mm od siebie po każdej stronie nogi.

Wywołanie zawału w lewej komorze

Dwadzieścia cztery godziny po podaniu plazmidu IL-18BP lub pustego plazmidu, myszy usypiano przez śródotrzewnowe wstrzyknięcie ksylazyny i ketaminy, wentylowano, poddano torakotomii. Następnie lewą główną tętnicę podwiązano na stałe stosując 0-8 nić prolenową, w celu wywołania zawału mięśnia sercowego, po czym zamknięto klatkę piersiową i pozwolono zwierzętom odzyskać przytomność. Śmiertelność operacyjna wynosiła mniej niż 20%. Śmiertelność pooperacyjna wynosiła 48% w grupie kontrolnej i 26% w grupie eksperymentalnej i pojawiała się prawie wyłącznie 4-5 dni po podwiązaniu.

Siedem dni po podwiązaniu myszy ponownie usypiano i oceniano wymiary lewej komory (LV) echokardiograficznie w stanie zamkniętej klatki piersiowej, używając echokardiografu ATL HDI 5000. Wyliczono frakcjonalne skracanie LV ze zmierzonej średnicy końca skurczowego i końca rozkurczowego. Po zakończeniu pomiarów echokardiograficzych, serce usunięto, utrwalono, a później pocięto na skrawki. Następnie preparaty histologiczne zabarwiono czerwienią syriusową w celu określenia wielkości zawału.

Wyniki

Średnica rozkurczowa lewej komory w siedem dni po podwiązaniu u przeżytych myszy była następująca:

0,53 + 0,01 mm (n = 20) u myszy traktowanych IL-18BP versus 0,59 + 0,01 mm u myszy kontrolnych (n = 16), p < 0,01.

Średnica skurczowa lewej komory w siedem dni po podwiązaniu u przeżytych myszy była następująca:

0,45 + 0,02 u myszy traktowanych IL-18BP versus 0,52 + 0,02 u myszy kontrolnych, p < 0,01.

Frakcjonalne skracanie lewej komory: 15 + 1% u myszy traktowanych IL-18BP versus 11 + 1% u myszy kontrolnych, p < 0,01.

Podsumowując: IL-18BP obniża o 50% śmiertelność myszy po zawale mięśnia sercowego wywołanym przez całkowite podwiązanie lewej komory. Dodatkowo, czynność lewej komory była znacząco poprawiona, co wykazano przez obniżone średnice skurczowe i rozkurczowe lewej komory.

Literatura

1. Bolli, R. (1990) Circulation 82, 723-38.

2. Buggemann i wsp., Eur. J. Immunol. 21: 1323-1326 (1991).

3. Cain, B. S., Meldrum, D. R., Dinareilo, C. A., Meng, X., Banerjee, A. & Harken, A. H. (1998) J. Surg. Res. 76,117-23.

4. Cleveland, J. C. J., Meldrum, D. R., Cain, B. S., Banerjee, A. & Harken, A. H. (1997) Circulation 96, 29-32.

PL 213 568 B1

5. Daemen MA, van't Veer C, Wolfs TG, i wsp: Ischemia/reperfusion-induced IFN gamma upregulation : involvement of IL-12 and IL-18. J. Immunol. 162: 5506-5510,1999.

6. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E and Karin, M. (1997). Nature 388, 16514-16517.

7. Elliott, M. J., Maini, R. N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bill, H., and Woody, J. N., 1994, Lancet 344,1125-1127.

8. Engelmann, H., Novick, D., and Wallah, D., 1990, J. Biol. Chem. 265, 1531-1536.

9. Fantuzzi, G., A. J. Purenl M. W. Harding, D. J, Livingston, and C. A. Dinareilo. Blood 91: 2118-25, 1998.

10. Grantham (1974), Science, 185. 862-864.

11. Gurevitch, J., Frolkis, I., Yuhas, Y., Paz, Y., Matsa, M., Mohr, R. & Yakirevich, V. (1996) J. Am. Coll. Cardiol. 28, 247-52

12. Herskowitz, A., Choi, S., Ansari, A. A. & Wesselingh, S. (1995) Am. J. Pathol. 146, 419-28.

13. Hochholzer, 9., G. B. Lipford, H. Wagner, K. Pfeffer, and K. Heeg. Infect. Immun. 68: 3502

14. Kaplan, L. J., Blum, H., Banerjee, A. & Whitman, G. J. (1993) J. Surg. Res. 54, 31 1-5.

15. Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinareilo CA. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: 1190-1195.

16. Kim SH i wsp., J. Immuno. 2001,166, pp. 148-154.

17. Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, i wsp. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody. Mol. Immunol. 1993 Nov 30: 16 1443-53.

18. Maniatis i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982.

19. Meldrum, D. R., Cleveland, J. C., Jr., Cain, B. S., Meng, X. & Harken, A. H. (1998) Ann. Thorac Surg. 65, 439-43.

20. Mendez, M. M., Green, L. L., Corvalan, J. R. F., Jia X-C., Maynard-Currie, E. E., Yang, X-D., Gallo, M. L., Louie, D. M., Lee, D. V., Erickson, K. L., Luna, J., Roy, C. M- N., Abderrahim, H., Kirshenbaum, F., Noguchi, M., Smith, D. M., Fukushima, A., Hales, J. F., Finer, M. H., Davis, C. G., Zsebo, Κ. M. and Jakobovits, A. (1997). „Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice”. Nature Genetics, 15,146-56.

21. Nakamura, K, Okamura, H, Nagata, K and Tamura, T. (1989). Infect. Immun. 57, 590- 595.

22. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinareilo, C, and Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136.

23. Pamet, P, Garka, K E, Bonnet, T P, Dower, S K, and Sims, J E. (1996), J. Biol. Chem. 271, 3967-3970.

24. Puren, A. J., Fantuzzi, G. & Dinareilo, C. A. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2256-2261.

25. Raebum, C. D., C. M'Calkins, M. A. Zimmerman, Y. Song, L. Ao, A. Banerjee, X. Keng and A. H. Harken. Surgery 130: 319-25, 2001.

26. Reznikov, L. L., Kim, S. H., Westcott, J. Y., Frishman, J., Fantuzzi, G., Novick, D., Rubinstein, M. & Dinareilo, C. A. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2174-2179.

27. Torigoe, K., Ushio, S., Okura, T., Kobayashi, S., Taniai, M., Kunikate, T., Murakami, T., Sanou, O., Kojima, H., Fuji, M., Ohta, T., Ikeda, M., Ikegami, H. & Kurimoto, M.(1997) J. Biol. Chem. 272, 25737-25742.

28. Tomizuka i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727 (2000).

29. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J. Y., Dayer, J. M., and Zubler, R. H., 1992, J. Immunol. 148, 2778-2784.

30. Yoshimoto T, Takeda, K, Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashiwamura, S, Okamura, H, Akira, S and Nakanishi, K (1998). J. Immunol. 161, 3400-3407.

Claims

1. Zastosowanie inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania kardiomiopatii, przy czym inhibitor IL-18 jest wybrany spośród inhibitora kaspazy-1 (ICE), przeciwciał skierowanych przeciwko IL-18, przeciwciał skierowanych przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18

PL 213 568 B1 oraz białek wiążących IL-18 lub ich izoform, mutein, białek fuzyjnych, lub funkcjonalnych pochodnych hamujących biologiczną aktywność IL-18.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest przeciwciałem skierowanym przeciwko IL-18.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest przeciwciałem skierowanym przeciwko receptorowi α IL-18.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest przeciwciałem skierowanym przeciwko receptorowi β IL-18.

5. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 do 4, znamienne tym, że przeciwciało jest humanizowanym lub ludzkim przeciwciałem.

6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że inhibitorem ICE jest Ac-Try-Val-Ala-Asp-chlorometyloketon (YVAD).

7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest białkiem wiążącym IL-18 lub jego izoformą, muteiną, białkiem fuzyjnym, lub funkcjonalną pochodną hamującą biologiczną aktywność IL-18.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest glikozylowany w jednym lub większej liczbie miejsc.

9. Zastosowanie według zastrz. 7 albo 8, znamienne tym, że białko fuzyjne zawiera fuzję immunoglobuliny (Ig).

10. Zastosowanie według zastrz. 7 albo 8, albo 9, znamienne tym, że funkcjonalna pochodna zawiera przynajmniej jedną resztę przyłączoną do jednej lub większej liczby grup funkcyjnych, która występuje jako jeden lub więcej łańcuchów bocznych na resztach aminokwasowych.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że reszta jest resztą polietylenową.

12. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-11, znamienne tym, że lek dodatkowo zawiera antagonistę czynnika martwicy nowotworów (TNF).

13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany jednocześnie, kolejno lub oddzielnie względem antagonisty TNF.

14. Zastosowanie według zastrz. 12 albo 13, znamienne tym, że antagonistą TNF jest TBPI i/albo TBPII.

15. Zastosowanie według jednego zastrz. 1-14, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany w stężeniu w zakresie pomiędzy około 0,001 do 100 mg/kg albo około 1 do 10 mg/kg lub 2 do 5 mg/kg.

16. Zastosowanie wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania kardiomiopatii, przy czym inhibitor IL-18 jest wybrany spośród przeciwciał skierowanych przeciwko IL-18, przeciwciał skierowanych przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18 oraz białek wiążących IL-18 lub ich izoform, mutein, białek fuzyjnych, lub funkcjonalnych pochodnych hamujących biologiczną aktywność IL-18.

17. Zastosowanie wektora ekspresyjnego do indukowania i/lub wzmacniania endogennego wytwarzania inhibitora IL-18 w komórce do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania kardiomiopatii, przy czym inhibitor IL-18 jest wybrany spośród białek wiążących IL-18 lub ich izoform hamujących biologiczną aktywność IL-18.