PL213865B1 - The manner of obtaining of autogeneous explant of chondrocites in tissue glue based on fibrinogen - Google Patents
The manner of obtaining of autogeneous explant of chondrocites in tissue glue based on fibrinogenInfo
- Publication number
- PL213865B1 PL213865B1 PL383248A PL38324807A PL213865B1 PL 213865 B1 PL213865 B1 PL 213865B1 PL 383248 A PL383248 A PL 383248A PL 38324807 A PL38324807 A PL 38324807A PL 213865 B1 PL213865 B1 PL 213865B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cartilage
- cells
- fibrinogen
- blood
- collected
- Prior art date
Links
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania autologicznego przeszczepu chondrocytów w kleju tkankowym na bazie fibrynogenu.The subject of the invention is a method for obtaining an autologous chondrocyte transplant in a tissue glue based on fibrinogen.
Chrząstka szklista kolana jest dosyć prostej budowy, występuje jeden typ komórek, ale jest wysoko wyspecjalizowaną tkanką łączną odpowiedzialną za amortyzowanie (cushioning) i smarowanie (lubricating). Nie jest unaczyniona, unerwiona i nie zawiera naczyń limfatycznych. Chrząstka szklista jest zbudowana z komórek chrzęstnych, chondrocytów i wytwarzanej przez nie macierzy poza- komórkowej. Głównymi komponentami macierzy chrzęstnej są swoiste proteoglikany i kolagen typu II, oraz występujące w niewielkiej ilości inne rodzaje białek. W połączeniu ze sobą tworzą one uporządkowaną, trójwymiarową gęstą sieć warunkującą integralność chrząstki oraz decydującą o jej właściwościach mechanicznych i immunologicznych. Najważniejszymi proteoglikanami chrząstkowymi są agrekany tworzące wielocząsteczkowe agregaty z kwasem hialuronowym. Do cząsteczki kwasu hialuronowego może się przyłączyć 200 cząsteczek agrekanu tworząc agregat o masie 500 000 kDa. Zbudowane są one z rdzenia białkowego i bocznych łańcuchów glikozaminoglikanowych: siarczanu chondroityny i siarczanu keratanu. 70% suchej masy chrząstki stanowią białka kolagenowe. Dominującym typem kolagenu jest kolagen typu II zbudowany z łańcuchów tropokolagenu. Poza kolagenem typu II chrząstka zawiera również mniejszą ilość innych kolagenów między innymi kolagenu typu IX, XI i XIV.Vitreous cartilage in the knee is fairly simple, has one type of cell, but is a highly specialized connective tissue responsible for cushioning and lubricating. It is not vascularized, innervated and contains no lymphatic vessels. Vitreous cartilage is made up of cartilage cells, chondrocytes and the extracellular matrix they produce. The main components of the cartilage matrix are specific proteoglycans and type II collagen, as well as other types of proteins found in small amounts. When combined with each other, they form an ordered, three-dimensional dense network that determines the integrity of the cartilage and determines its mechanical and immunological properties. The most important cartilage proteoglycans are aggrecans forming multi-molecular aggregates with hyaluronic acid. 200 aggrecan molecules can bind to a hyaluronic acid molecule, creating an aggregate weighing 500,000 kDa. They are composed of a protein core and glycosaminoglycan side chains: chondroitin sulfate and keratan sulfate. 70% of cartilage dry matter consists of collagen proteins. The dominant type of collagen is type II collagen composed of tropocollagen chains. In addition to type II collagen, cartilage also contains a smaller amount of other collagens, including collagen types IX, XI and XIV.
Chrząstka stawowa ma budowę warstwową. Powierzchniowa, najcieńsza I warstwa zwana styczną (superficial tangential zone) jest najcieńsza i stanowi ona 10% grubości chrząstki stawowej. Utworzona jest przez małe komórki o charakterze zbliżonym do fibroblastów oraz liczne styczne do powierzchni stawowej włókna kolagenowe. W kolejnej II warstwie - przejściowej (stratum intermedium sive transitionale) chondrocyty są kuliste i występują w niewielkich grupach izogenicznych rozmieszczonych w przypadkowy sposób w macierzy, a włókna kolagenowe przebiegają skośnie. W strefie III warstwa promienista (stratum radiale) kuliste chondrocyty są ułożone w kolumny / pakiety biegnące prostopadle do powierzchni chrząstki i włókna kolagenowe przebiegają również prostopadle do powierzchni chrząstki. Najgłębszą warstwę stanowi warstwa zwapniałej chrząstki (calcified zone) stykająca się z warstwą podchrzęstną kości, dzieli się na dwie warstwy, górną w której chondrocyty są znacznie powiększone w porównaniu z chondrocytami warstwy III i dolną, w której macierz jest silnie zwapniała. Warstwy promienista i zwapniała stanowią razem 50% grubości chrząstki.Articular cartilage has a layered structure. The superficial, thinnest, first layer called the superficial tangential zone is the thinnest and constitutes 10% of the thickness of the articular cartilage. It is made up of small cells similar to fibroblasts and numerous collagen fibers tangent to the articular surface. In the next layer II - the transition (stratum intermedium sive transitionale), chondrocytes are spherical and occur in small isogenic groups randomly distributed in the matrix, and collagen fibers run diagonally. In zone III, the radial layer (stratum radiale) spherical chondrocytes are arranged in columns / bundles running perpendicular to the cartilage surface and collagen fibers also run perpendicular to the cartilage surface. The innermost layer is the calcified zone in contact with the bone subcartilage layer, it is divided into two layers, the upper layer in which the chondrocytes are significantly enlarged compared to the 3rd layer chondrocytes, and the lower layer, in which the matrix is highly calcified. The radial and calcified layers together make up 50% of the thickness of the cartilage.
Fenotyp chondrocytów przejawia się zdolnością do wytwarzania kolagenu typu II i agrekanów. Główną funkcją chondrocytów jest synteza specyficznych składników macierzy chrzęstnej: kolagenu typu II, IX, XI oraz agrekanów.The chondrocyte phenotype is manifested by the ability to produce type II collagen and aggrecans. The main function of chondrocytes is the synthesis of specific components of the cartilage matrix: collagen types II, IX, XI and aggrecans.
Chrząstka stawowa wykazuje wyspecjalizowane cechy biomechaniczne i ma podstawowe znaczenie dla prawidłowej funkcji narządu ruchu. Aktywnie uczestniczy w czynnościach mechanicznych stawu - poprzez amortyzację wstrząsów, dzięki pokryciu cienką warstwą płynu stawowego minimalizuje tarcie pomiędzy nasadami kości tworzących staw, podczas chodu przenosi obciążenia kilkakrotnie przekraczające masę człowieka. Te funkcje chrząstki wynikają z jej budowy. Uszkodzenia chrząstki spowodowane działaniem czynników fizycznych, zaburzeniami metabolizmu komórek chrzęstnych (chondrocytów) lub przewlekłymi reakcjami zapalnymi prowadzą do upośledzenia funkcji stawów i mogą być przyczyną trwałego kalectwa. Następstwem uszkodzeń chrząstki stawowej jest ograniczenie sprawności fizycznej. Chrząstka stawowa dorosłego człowieka ma niewielką zdolność do regeneracji, dlatego też uszkodzenia te są nieodwracalne i prowadzą do powstania zmian zwyrodnieniowych, a następnie do trwałego kalectwa.Articular cartilage exhibits specialized biomechanical features and is essential for the proper function of the musculoskeletal system. Actively participates in the mechanical activities of the joint - by absorbing shocks, thanks to the thin layer of the synovial fluid, it minimizes friction between the epiphyses of the bones forming the joint, while walking, it transfers loads that exceed a human weight several times. These functions of cartilage arise from its structure. Cartilage damage caused by physical factors, disturbances in the metabolism of cartilage cells (chondrocytes) or chronic inflammatory reactions lead to impaired joint function and may cause permanent disability. The consequence of damage to the articular cartilage is limited physical fitness. Adult human articular cartilage has little ability to regenerate, therefore the damage is irreversible and leads to degenerative changes and permanent disability.
Najczęściej występującymi chorobami prowadzącymi do uszkodzenia chrząstki są choroba zwyrodnieniowa stawów (osteoarthritis, OA), reumatoidalne zapalenie stawów (rzs), dna i kolagenozy. Etiologia tych schorzeń nie jest w pełni znana, ale najprawdopodobniej są związane z zaburzeniami metabolizmu chrząstki, co wpływa na zachwianie równowagi syntezy i degradacji macierzy chrzęstnej.The most common diseases leading to cartilage damage are osteoarthritis (OA), rheumatoid arthritis (rheumatoid arthritis), gout and collagenosis. The etiology of these diseases is not fully known, but they are most likely associated with disorders of cartilage metabolism, which results in an imbalance in the synthesis and degradation of the cartilage matrix.
Przyczyny uszkodzeń tkanki stawowej związane są często z wiekiem i poziomem aktywności fizycznej człowieka , z rozwojem komunikacji. Rosnąca aktywność sportowa społeczeństwa powoduje wzrost częstości uszkodzeń chrząstki stawowej, szczególnie u młodych amatorów piłki nożnej, osób w średnim wieku, kobiet i u amatorów koszykówki.The causes of joint tissue damage are often related to the age and level of human physical activity, as well as the development of communication. The growing sports activity of society causes an increase in the frequency of articular cartilage damage, especially among young football enthusiasts, middle-aged people, women and basketball enthusiasts.
Z publikacji. Piotr Strzelczyk, Grzegorz Benke, Andrzej Górecki pt. „Zasady izolacji i hodowli ludzkich chondrocytów - wstęp do autogennnych przeszczepów komórkowych” Ortopedia, Traumatologia, Rehabilitacja vol. 3 nr 2 2001 r., str. 213-215, znany jest zaproponowany przez szwedzkich baPL 213 865 B1 daczy autologiczny przeszczep chondrocytów ludzkich do wypełniania ubytku chrzęstnego w stawie kolanowym.From the publication. Piotr Strzelczyk, Grzegorz Benke, Andrzej Górecki Fri "Principles of isolation and cultivation of human chondrocytes - introduction to autogenous cell transplants" Orthopedics, Traumatology, Rehabilitation vol. 3 No. 2 2001, pp. 213-215, it is known that the autologous human chondrocyte transplant for filling cartilage defect in the knee joint.
Początkowo w Nowym Jorku w Hospital for Joint Disease a później na Uniwersytecie w Goetenburgu, Petersen, Lindahl i Brittberg opracowali metodę hodowli autologicznych chondrocytów pozyskiwanych z małych fragmentów zdrowej chrząstki. W 1987 roku rozpoczynają się pierwsze badania kliniczne nad leczeniem ubytków chrzęstnych pełnej grubości w stawie kolanowym u człowieka z wykorzystaniem autologicznych chondrocytów. Pierwszym chorym, u którego zastosowano leczenie jest pięćdziesięcioletni lekarz.Initially in New York at the Hospital for Joint Disease and later at the University of Goetenburg, Petersen, Lindahl and Brittberg developed a method of culturing autologous chondrocytes obtained from small fragments of healthy cartilage. In 1987, the first clinical trials begin to treat full-thickness cartilage defects in the human knee using autologous chondrocytes. The first patient to receive treatment is a 50-year-old doctor.
Pozyskany fragment zdrowej chrząstki ze stawu kolanowego u człowieka pod wyciągiem z pionowym przepływem laminarnym powietrza jest opłukiwany 10 ml DMEM w próbce Petri'ego oraz oczyszczany z pozostałości tkanki kostnej lub łącznej. Tak przygotowany materiał jest ważony w jałowym naczyniu a następnie rozdrabniany na kawałki poniżej 0,5 mm średnicy. Rozdrabnianie wykonuje się w roztworze 0,25% kolagenazy. Przy użyciu pipety komórki chrząstki wraz z roztworem są przenoszone do probówki wirowniczej. Probówka jest uzupełniana do 10 ml 0,25% roztworem kolagenozy i pozostawiona na noc (18-20 h) w inkubatorze pracującym w temperaturze 37°C. Kolageneza trawi włókna kolagenowe nie zabijając komórek. Przy delikatnym obchodzeniu się z trawioną próbką chrząstki znajdują się regularne pakiety komórek bez otaczającej je zwykle macierzy o żółtej barwie. Po potrząśnięciu naczyniem komórki „wysypują się” z macierzy.The obtained fragment of healthy cartilage from the human knee joint under the hood with vertical laminar air flow is rinsed with 10 ml of DMEM in a Petri sample and cleansed of remains of bone or connective tissue. The material prepared in this way is weighed in a sterile vessel and then crushed into pieces smaller than 0.5 mm in diameter. Grinding is performed in a 0.25% collagenase solution. Using a pipette, the cartilage cells with the solution are transferred to a centrifuge tube. The tube is filled up to 10 ml with 0.25% collagenose solution and left overnight (18-20 h) in an incubator operating at 37 ° C. Collagenesis digests collagen fibers without killing the cells. With gentle handling of the digested cartilage specimen, regular packets of cells will be found without the usual yellow matrix surrounding them. When the vessel is shaken, cells "spill out" from the matrix.
Po opadnięciu fragmentów niestrawionej chrząstki na dno, roztwór enzymów z uwolnionymi chondrocytami za pomocą pipety, przenoszony jest do drugiej probówki wirowniczej. Następnie po 5,6-krotnym wymieszaniu zawiesiny pipetą i rozbiciu agregatów komórek, określana jest liczba komórek w komorze Bϋrkera (hermocytometrze). Probówka z zawiesiną wirowana jest przez 5 minut, przy 1000 rpm. Odwirowana peletka (materiał zgromadzony na dnie w wyniku wirowania) zawieszana jest w odpowiedniej objętości roztworu DMEM/FBS (standardowa pożywka z cielęcą surowicą płodową, ALAB) do uzyskania stężenia 5,0 x 105 komórek/ml. Komórki wysiewane są do butelki hodowlanej (5 ml zawiesiny na 50 ml butelkę), która umieszczana jest w inkubatorze w atmosferze 5% CO2, w powietrzu nasyconym parą wodną o temperaturze 37°C.After the fragments of undigested cartilage fall to the bottom, the enzyme solution with released chondrocytes is transferred to the second centrifuge tube with the help of a pipette. Then, after the suspension has been mixed with a pipette 5.6 times and the cell aggregates have been broken down, the number of cells in the Bϋrker chamber (hermocytometer) is determined. The tube with the suspension is centrifuged for 5 minutes at 1000 rpm. The centrifuged pellet (material collected at the bottom by centrifugation) is suspended in the appropriate volume of DMEM / FBS solution (standard medium with fetal calf serum, ALAB) to obtain a concentration of 5.0 x 105 cells / ml. The cells are seeded in a culture bottle (5 ml of suspension per 50 ml bottle) which is placed in an incubator under 5% CO2, air saturated with water vapor at 37 ° C.
Chondrocyty, uwolnione z macierzy chrzęstnej, przyczepiają się do dna naczynia, rozpłaszczają się, mnożą i rozprzestrzeniając się pokrywają dno butelki hodowlanej jednolitą warstwą (z ang. monolayer). Hodowla jest prowadzona w inkubatorze w temperaturze 37°C. Izolowane, zdrowe chondrocyty wykazują zdolność do przyczepiania się do dna butelki w pierwszych godzinach po wysianiu. Pożywkę zmienia się co 2-3 dni. Gdy komórki mnożąc się i rozpełzając, pokrywają 80-90% pola, hodowlę trawi się roztworem trypsyny z wersenianem (TE) wiążącym jony wapnia. Komórki odklejają się od dna. Następnie, po 10 krotnym rozcieńczeniu w roztworze DMEM wzbogaconym 10% FBS, zawiesina przenoszona jest do kolejnych butelek hodowlanych. Ten proces nazywany jest pasażowaniem. Pozwala na swobodne mnożenie i ekspansję komórek w hodowli jednowarstwowej.Chondrocytes, released from the cartilage matrix, attach to the bottom of the vessel, flatten, multiply and spreading cover the bottom of the culture bottle with a monolayer. The cultivation is performed in an incubator at 37 ° C. Isolated, healthy chondrocytes show the ability to stick to the bottom of the bottle in the first hours after sowing. The medium is changed every 2-3 days. When cells cover 80-90% of the area by multiplying and spreading, the culture is digested with a trypsin solution with calcium ion-binding edetate (TE). Cells detach from the bottom. Then, after 10-fold dilution in DMEM solution supplemented with 10% FBS, the suspension is transferred to successive culture bottles. This process is called passaging. It allows for free multiplication and expansion of cells in a single-layer culture.
W czasie każdej inspekcji mikroskopowej, obok oceny morfologii i liczby hodowanych komórek, poszukuje się cech ewentualnej infekcji mikrobiologicznej. Zanieczyszczenie materiału śródoperacyjne czy laboratoryjne objawia się wzrostem kolonii grzybów szybko pokrywających pole widzenia. W przypadku bakterii, już makroskopowo widać zmętnienie pożywki. W laboratorium Fidia Advanced Biopolymers we Włoszech standardem jest ocena zawartości endotoksyn w teście LAL.During each microscopic inspection, apart from assessing the morphology and the number of cultured cells, the signs of a possible microbial infection are looked for. Intraoperative or laboratory contamination of the material is manifested by the growth of colonies of fungi quickly covering the field of view. In the case of bacteria, the turbidity of the medium is visible already macroscopically. In the Fidia Advanced Biopolymers laboratory in Italy, it is standard to assess the endotoxin content in the LAL test.
Przed wszczepieniem można ocenić czy hodowane komórki zachowały zdolność do odtworzenia prawidłowego fenotypu. Badana próbka komórek zawieszana jest w płynnym roztworze alginatu. Po dodaniu roztworu chlorku wapnia następuje polimeryzacja alginatu i komórki zostają uwięzione w półstałym środowisku. Pożywka penetruje swobodnie do alginatu i wymieniana jest co 2-3 dni. Fragmenty w alginacie mogą być okresowo pobierane do badania. Z próbek tych uwalniane są komórki buforem depolimeryzującym (cytrynian sodu) poprzez wiązanie jonów wapnia.Before implantation, it can be assessed whether the cultured cells have retained the ability to restore the normal phenotype. The test cell sample is suspended in a liquid alginate solution. When a calcium chloride solution is added, the alginate polymerizes and the cells become trapped in a semi-solid environment. The medium penetrates freely into the alginate and is changed every 2-3 days. The fragments in the alginate may be collected periodically for testing. Cells are released from these samples with depolymerization buffer (sodium citrate) by binding calcium ions.
Porównywane są próbki z hodowli jednowarstwowej i hodowli z alginatem. Metodą RT- PCR oceniane są próbki mRNA. Poszukiwane są transkrypty agrekanu, kolagenu typu I, kolagenu typu II oraz 18s RNA uznanego za kontrolny standard. Metodą immunohistochemiczną oceniane jest rozmieszczenie kolagenu typu I i II w obu badanych hodowlach.The samples from the single-layer culture and the alginate culture are compared. The mRNA samples are assessed by RT-PCR. We are looking for aggrecan, type I collagen, type II collagen and 18s RNA transcripts as the control standard. The distribution of type I and II collagen in both tested cultures is assessed by immunohistochemistry.
Polipeptydowe czynniki wzrostowe odgrywają ważną rolę w regulacji zachowania chondrocytów. IGF-1 pobudza produkcję macierzy oraz aktywność mitotyczną. Najsilniejszym mitogenem jest TGF-beta. BMP-2, należący do rodziny TGF, indukuje ekspresję prokolagenu typ II w hodowlach jednowarstwowych. IGF-1 pobudza syntezę proteoglikanów. IGF-1 i TGF-beta regulują ekspresję integryn - receptorów powierzchniowych dla fibronektyny, kolagenu II i IV, lamininy, vitronectyny i oste4Polypeptide growth factors play an important role in regulating the behavior of chondrocytes. IGF-1 stimulates matrix production and mitotic activity. The most potent mitogen is TGF-beta. BMP-2, belonging to the TGF family, induces the expression of type II procollagen in monolayer cultures. IGF-1 stimulates the synthesis of proteoglycans. IGF-1 and TGF-beta regulate the expression of integrins - surface receptors for fibronectin, collagen II and IV, laminin, vitronectin and oste4
PL 213 865 B1 opontiny. Integryny łączą macierz zewnątrzkomórkową (ECM) z cytoszkieletem, pośrednicząc w przenoszeniu, przez co wpływają na zmiany ekspresji genowej i funkcji chondrocytów.Of the opontins. Integrins link the extracellular matrix (ECM) to the cytoskeleton, mediating transport, thereby altering gene expression and chondrocyte function.
Świeżo izolowane chondrocyty są okrągłe. Po przytwierdzeniu się do podłoża zaczynają przypominać fibroblasty. Po zawieszeniu w półstałym alginacie ponownie odzyskują okrągły kształt. Zmianom morfotycznym towarzyszą zmiany fenotypu. Chondrocyty uwolnione są z macierzy, wzrastając w hodowli jednowarstwowej, tracą ekspresję genu dla kolagenu typu II i, upodabniając się do fibroblastów, zaczynają wytwarzać mRNA dla kolagenu typu I. Zawieszone w półstałym alginacie, w ciągu 1-2 tygodni rozpoczynają produkcję mRNA dla kolagenu typu II.Freshly isolated chondrocytes are round. After attaching to the substrate, they begin to resemble fibroblasts. After suspending in semi-solid alginate, they regain their round shape again. The morphotic changes are accompanied by changes in the phenotype. Chondrocytes are released from the matrix, growing in a monolayer culture, lose the expression of the gene for type II collagen and, by resembling fibroblasts, begin to produce mRNA for type I collagen. Suspended in semi-solid alginate, within 1-2 weeks they begin to produce mRNA for type II collagen II.
Uzyskanie takich wyników świadczy o zdrowym wzroście hodowli i o zachowaniu zdolności do ponownego przybrania cech fenotypowych chondrocytów, a uzyskana hodowla komórkowa to produkt inżynierii tkankowej o wysokiej jakości.Obtaining such results demonstrates healthy growth of the culture and the preservation of the ability to regain the phenotypic characteristics of chondrocytes, and the obtained cell culture is a product of high quality tissue engineering.
W metodzie szwedzkich autorów autologiczny przeszczep chondrocytów w zawiesinie wszczepia się w kłykciu udowym kolana pod łatę okostnej.In the method of the Swedish authors, an autologous suspension of chondrocytes is implanted in the femoral condyle of the knee under the periosteal patch.
Znane są procedury terapeutyczne z polskiego opisu zgłoszenia nr P-349595 z dziedziny naprawy tkanek, a w szczególności regeneracji funkcjonalnej chrząstki stawowej. Sposób regeneracji chrząstki stawowej obejmuje podawanie w miejsce wymagające regeneracji przynajmniej jednego oczyszczonego białka morfogenetycznego kości albo obejmuje podawanie w miejsce wymagające regeneracji odpowiedniego źródła tkanki w kombinacji z przynajmniej jednym oczyszczonym białkiem morfogenetycznym kości. Sposób regeneracji w odmianie obejmuje podawanie w miejsce wymagające regeneracji przynajmniej jednego oczyszczonego białka wybranego z grupy obejmującej Vgr-2, czynników wzrostu i różnicowania (GDF) i BIP.Therapeutic procedures are known from the Polish application No. P-349595 in the field of tissue repair, in particular the regeneration of functional articular cartilage. The method for regenerating articular cartilage comprises administering at least one purified bone morphogenetic protein to the site in need of regeneration, or comprises administering to the site in need of regeneration a suitable tissue source in combination with at least one purified bone morphogenetic protein. The method of regeneration in a variant comprises administering to the site in need of regeneration at least one purified protein selected from the group consisting of Vgr-2, growth and differentiation factors (GDF) and BIP.
Podobnie znana kompozycja do regeneracji chrząstki stawowej obejmuje przynajmniej jedno oczyszczone białko morfogenetyczne albo obejmuje odpowiednie źródło tkanki w kombinacji z przynajmniej jednym oczyszczonym białkiem morfogenetycznym kości. Odmiana kompozycji obejmuje jedno oczyszczone białko wybrane z grupy obejmującej Wgr-2, czynniki wzrostu i różnicowania (GDF) i BIP.Likewise, a known composition for regenerating articular cartilage comprises at least one purified morphogenetic protein or comprises a suitable tissue source in combination with at least one purified bone morphogenetic protein. The variation of the composition includes one purified protein selected from the group consisting of Wgr-2, Growth and Differentiation Factors (GDF), and BIP.
Zagadnieniem wymagającym rozwiązania jest ulepszenie sposobu otrzymywania autologicznego przeszczepu chondrocytów w kleju tkankowym na bazie fibrynogenu, który jest bezpieczny dla pacjenta ze względu na ograniczenie do minimum ryzyka zakażenia chorobami zakaźnymi w czasie prowadzenia procedury terapeutycznej przeszczepu chondrocytów - chrząstki stawowej w kolanie.An issue that requires a solution is the improvement of the method of obtaining an autologous chondrocyte transplant in a tissue glue based on fibrinogen, which is safe for the patient due to the minimization of the risk of infection with infectious diseases during the therapeutic procedure of chondrocyte transplantation - articular cartilage in the knee.
Wytyczone zagadnienie techniczne rozwiązuje sposób otrzymywania autologicznego przeszczepu chondrocytów w kleju tkankowym na bazie fibrynogenu, złożony z czynności pobrania chrząstki z nieobciążonej części stawu kolanowego oraz przeważnie pobrania krwi od pacjenta, wstępnej obróbki preparatu, rozdrabniania pobranej chrząstki na małe fragmenty, oddzielenia surowicy od pobranej krwi, trawienia chrząstki, wysiewania komórek chrząstki, namnażania hodowlanych komórek chondrocytów i pasażowania namnożonych komórek oraz dalszej obróbki uzyskiwanych komórek chondrocytów, charakteryzujący się tym, że pobrany artroskopowo fragment chrząstki stawowej transportuje się w sterylnej probówce w schłodzonej soli fizjologicznej w temperaturze od +2°C do +8°C a donację krwi w temperaturze pokojowej, otrzymane fragmenty chrząstki w laboratorium hodowli komórek płucze się kilkakrotnie w pożywce hodowlanej i przechowuje się w lodówce, donację krwi od pacjenta wiruje się a następnie surowicę ściąga się i zbiera się w probówce, po czym filtruje się, rozpipetowuje się do małych probówek i zamraża w temperaturze -20°C, strawioną chrząstkę przepuszcza się przez filtr nylonowy i płucze się komórki w odżywce, następnie wysiewa się w pożywce DMEM/Ham'sF12 a po osiągnięciu 80% konfluencji komórek przesiewa się je na butelkę hodowlaną i prowadzi się namnażanie w kolejnych butelkach hodowlanych, dalej przed zakończeniem hodowli chondrocytów pobiera się donację krwi, korzystnie od pacjenta, z której przygotowuje się autologiczny fibrynogen, po czym po dwukrotnym płukaniu chondrocytów w pożywce Ham'sF12 z 10% autologiczną surowicą komórki chondrocytów miesza się z fibrynogenem i aprotyniną w jednej probówce a w drugiej probówce przygotowuje się trombinę z 10% chlorkiem wapnia i w końcu w formie utworzonej z jednorazowej strzykawki nakłada się kolejno fibrynogen z komórkami chondrocytów i aprotyniną a następnie dodaje się trombiny z chlorkiem wapnia i zaciska się z dwóch stron tłokami do czasu zastygnięcia przeszczepu o grubości 2-3 mm i średnicy 20 mm. Wyhodowane chondrocyty zawiesza się w autologicznym fibrynogenie, który jest składnikiem kleju tkankowego. Pobraną chrząstkę płucze się w pożywce hodowlanej Ham'sF12 wzbogaconej o gentamycynę 50 μg/ml, amfoterycynę 2 μg/ml, kwas askorbinowy. Krew od pacjenta wiruje się przez 10 minut przy obrotach 2700 rpm, ściąga się pipetą pasterowską w postaci supernatantu i po zebraniu w probówce, dalej surowicę poddaje się filtrowaniuThe identified technical problem is solved by the method of obtaining an autologous chondrocyte transplant in a tissue glue based on fibrinogen, consisting of the collection of cartilage from the unloaded part of the knee joint and usually blood collection from the patient, preliminary treatment of the preparation, fragmentation of the collected cartilage into small fragments, separation of serum from the collected blood, digestion of cartilage, seeding of cartilage cells, multiplication of cultured chondrocyte cells and passage of the multiplied cells and further processing of the obtained chondrocyte cells, characterized by the fact that the arthroscopic fragment of articular cartilage is transported in a sterile tube in chilled saline at a temperature of + 2 ° C to + 8 ° C and blood donation at room temperature, the obtained cartilage fragments in the cell culture laboratory are rinsed several times in the culture medium and stored in the refrigerator, the blood donation from the patient is centrifuged, and then the serum is collected and collected is placed in a tube, then filtered, pipetted into small tubes and frozen at -20 ° C, the digested cartilage is passed through a nylon filter and cells are rinsed in nutrient, then plated in DMEM / Ham'sF12 and then reaching 80% confluency of cells, they are sifted into a culture bottle and multiplied in successive culture bottles, then before the end of chondrocyte culture, blood is donated, preferably from the patient, from which autologous fibrinogen is prepared, and then, after washing the chondrocytes twice in Ham's medium 'sF12 with 10% autologous chondrocyte serum is mixed with fibrinogen and aprotinin in one test tube, and in the other tube thrombin with 10% calcium chloride is prepared, and finally, in the form of a disposable syringe, fibrinogen with chondrocyte cells and aprotinin is successively added and then added thrombin with calcium chloride and squeezed on both sides with plungers until solid Graft opening with a thickness of 2-3 mm and a diameter of 20 mm. The cultured chondrocytes are suspended in autologous fibrinogen, which is a component of the tissue glue. The collected cartilage is washed in Ham'sF12 culture medium enriched with gentamicin 50 µg / ml, amphotericin 2 µg / ml, ascorbic acid. Blood from the patient is centrifuged for 10 minutes at 2700 rpm, pulled off with a Pasteur pipette in the form of a supernatant and after collecting in a test tube, the serum is then filtered
PL 213 865 B1 przez filtry strzykawkowe 0,22 mm. Autologiczną surowicę rozpipetowuje się do probówek po około 5 ml.PL 213 865 B1 through 0.22 mm syringe filters. Autologous serum is pipetted into approximately 5 ml tubes.
Pobrane fragmenty chrząstki stawowej dzieli się na porcje 100 mg a następnie porcje te dzieli się na 3 małe fragmenty - kostki 0,5 mm3 i przekłada się do dołków w płytce 24-dołkowej i do każdego dołka dodaje się 1 ml odżywki Ham’sF12 wzbogaconej o gentamycynę 50 μg/ml, amfoterycynę 2 μg/ml, kwas askorbinowy 50 μg/ml oraz dodaje się 300 U kolagenazy typu II. Zawiesinę trawienną pozostawia się na 6-7 godzin w inkubatorze do hodowli komórek z atmosferą CO2. Strawioną chrząstkę, przefiltrowaną przez filtr nylonowy o wielkości porów 70 μηι wiruje się w ciągu 5 minut z szybkością 1000 rpm. Od strawionej chrząstki odrzuca się supernatant, płucze peletkę komórek w odżywce Ham'SF12 wzbogaconej o gentamycynę 50 μg/ml, amfoterycynę 2 μg/ml, kwas askorbinowy 50 μg/ml i w końcu wiruje się przy obrotach 1000 rpm. Przefiltrowane komórki wysiewa się w medium złożonym z pożywek DMEM/Ham'sF12 w stosunku 1:1, suplementowanym 15% autologiczną surowicą, gentamycyną 50 μg/ml, amfoterycyną 2 μg/ml, kwasem askorbinowym. Każde przefiltrowane komórki ze 100 mg wysiewa się w jednym dołku płytki 24-dołkowej i hoduje się na pożywce DMEM/Ham'sF12 o stosunku 1:1 suplementowanej 10% autologiczną surowicą, gentamycyną 50 μg/ml, amfoterycyną 2 μg/ml, kwasem askorbinowym 50 μg/ml, które miesza się do 48 godzin. Donację krwi pobiera się do potrójnego worka, pobraną krew poddaje się wirowaniu w ciągu do 15 minut z szybkością 2300 x g, odwirowane osocze oddziela się od elementów komórkowych, następnie oddzielone osocze poddaje się dwukrotnemu zamrożeniu w temperaturze - 30°C i przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C a z kolei po zamrożeniu osocze poddaje się rozmrożeniu w łaźni wodnej w temperaturze +4°C, po powtórnym całkowitym rozmrożeniu osocza pojemnik osocza poddaje się wirowaniu, po czym usuwa się płyn znad osocza za pomocą prasy manualnej, którą schładza się w miarę potrzeb do temperatury +4°C a pojemnik z fibrynogenem przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C. Czynności związane z obróbką wstępną chrząstki, dalszą hodowlą chondrocytów oraz końcowym przygotowaniem przeszczepu przeprowadza się w warunkach i z zachowaniem zasad pełnej aseptyki pod nawiewem laminarnym, w przygotowanych do hodowli pomieszczeniach.The collected articular cartilage fragments are divided into 100 mg portions and then these portions are divided into 3 small fragments - 0.5 mm 3 cubes and transferred to the wells in a 24-well plate and 1 ml of Ham'sF12 supplement enriched with o gentamicin 50 μg / ml, amphotericin 2 μg / ml, ascorbic acid 50 μg / ml and 300 U of type II collagenase is added. The digestive suspension is left for 6-7 hours in a cell culture incubator with a CO2 atmosphere. The digested cartilage, filtered through a nylon filter with a pore size of 70 μηι, was centrifuged for 5 minutes at 1000 rpm. The supernatant is discarded from the digested cartilage, the cell pellet is washed in Ham'SF12 nutrient supplement enriched with 50 µg / ml gentamicin, 2 µg / ml amphotericin, 50 µg / ml ascorbic acid, and finally centrifuged at 1000 rpm. The filtered cells are plated in 1: 1 DMEM / Ham'sF12 media supplemented with 15% autologous serum, gentamicin 50 µg / ml, amphotericin 2 µg / ml, ascorbic acid. Each 100 mg filtered cells are plated in one well of a 24-well plate and grown in 1: 1 DMEM / Ham'sF12 medium supplemented with 10% autologous serum, gentamicin 50 μg / ml, amphotericin 2 μg / ml, ascorbic acid 50 μg / ml, which is mixed for up to 48 hours. The blood donation is collected in a triple bag, the collected blood is centrifuged for up to 15 minutes at 2300 xg, the centrifuged plasma is separated from the cellular elements, then the separated plasma is frozen twice at -30 ° C and stored below -25 ° C, and after freezing, the plasma is thawed in a water bath at a temperature of + 4 ° C, after complete thawing of the plasma again, the plasma container is centrifuged, and the liquid is removed from the plasma with a manual press, which is cooled down as needs to a temperature of + 4 ° C and the fibrinogen container is stored below -25 ° C. The activities related to the pre-treatment of cartilage, further cultivation of chondrocytes and final preparation of the graft are carried out under the conditions and following the principles of full aseptic under laminar airflow, in rooms prepared for cultivation.
Sposób otrzymywania autologicznego przeszczepu chondrocytów w kleju tkankowym na bazie fibrynogenu według wynalazku, dzięki żelowej strukturze zapewnia silną adhezyjność przeszczepu w miejscu ubytku chrząstki stawowej co daje, że lekarz ortopeda nie musi dodatkowo stosować kleju tkankowego ani przyszywać łatę okostną. Dzięki temu unika się okaleczenia pacjenta w porównaniu do metody z zastosowaniem łaty okostnej. Skraca to czas zabiegu. Tak przy pobraniu fragmentu chrząstki stawowej jak i wszczepieniu autologicznego przeszczepu jest małe pole operacyjne. Daje to łatwość wszczepienia oraz możliwość wszczepienia artroskopowego. Sposób postępowania według wynalazku daje możliwość uformowania każdego kształtu w zależności od ubytku chrzęstnego pacjenta. Ponadto nieoczekiwanie przeszczep ma postać żelowego płatka co sprawia, że jest plastyczny i łatwo się dostosowuje do powierzchni ubytku chrząstki stawowej. Autologiczny przeszczep chondrocytów przy zastosowaniu kleju tkankowego z autologicznego fibrynogenu ogranicza do minimum ryzyko zakażenia pacjenta w czasie prowadzenia procedury terapeutycznej.The method of obtaining an autologous chondrocyte transplant in a fibrinogen-based tissue glue according to the invention, thanks to its gel structure, ensures strong adhesiveness of the graft at the site of the articular cartilage defect, which means that the orthopedic surgeon does not need to additionally use tissue glue or suture the periosteum patch. This avoids injury to the patient compared to the periosteal patch method. This shortens the treatment time. There is a small operating area both for the collection of a piece of articular cartilage and for the implantation of an autologous transplant. This makes it easy to implant and the possibility of arthroscopic implantation. The method of the procedure according to the invention makes it possible to form any shape depending on the cartilage defect of the patient. Moreover, surprisingly, the graft is in the form of a gel flake, which makes it plastic and easily adapts to the surface of the articular cartilage defect. Autologous chondrocyte transplantation using autologous fibrinogen tissue glue minimizes the risk of patient infection during the therapeutic procedure.
W czasie badania lekarskiego ortopeda stwierdza ubytek chrząstki w stawie kolanowym.During the medical examination, the orthopedic surgeon finds a loss of cartilage in the knee joint.
Podczas pierwszego zabiegu chirurg ortopeda pobiera od pacjenta mały fragment chrząstki z nieobciążonej części kłykcia kości udowej stawu kolanowego. Chrząstkę pobiera się z trzech miejsc kłykcia: z części bocznej (Lateral Superior Ridge), części przyśrodkowej (Medial Superior Ridge) oraz wcięcia międzykłykciowego (lntercondyllar Notch). Pobiera się dwa fragmenty chrząstki pełnej grubości o wymiarach około 5x10 mm co stanowi około 400 mg. Pobraną chrząstkę niezwłocznie wkłada się do sterylnej probówki transportowej i zalewa się sterylną, schłodzoną solą fizjologiczną zawierającą 0,9% NaCl. Chrząstkę przechowuje się w lodówce w temperaturze od +2 do +8°C .During the first procedure, the orthopedic surgeon takes a small piece of cartilage from the patient from the unloaded part of the femoral condyle of the knee joint. Cartilage is collected from three places of the condyle: the Lateral Superior Ridge, the Medial Superior Ridge and the Intercondyllar Notch. Two pieces of full-thickness cartilage approximately 5x10 mm in size, which is approximately 400 mg, are collected. The removed cartilage is immediately placed in a sterile transport tube and flooded with sterile, chilled saline containing 0.9% NaCl. Cartilage is stored in a refrigerator at +2 to + 8 ° C.
Podczas zabiegu pobrania chrząstki od pacjenta pobiera się również krew w ilości 160 ml. Próbkę pobranej krwi bada się na obecność markerów wirusów metodą serologiczną przeciwciał antyHIV1, anty-HIV2, antygenu p24, antygenu HBs, przeciwciał anty-HCV oraz RNA-HIV, RNA-HCV, DNA-HIV, a także odczynu Wassermana i poziomu transaminazy ALT. Z pobranej krwi uzyskuje się autologiczną surowicę niezbędną do hodowli chondrocytów. Surowica zawiera składniki odżywcze konieczne do wzrostu komórek. Do pobrania krwi używa się probówki próżniowej na skrzep typu Serum Beads Clot Activator o pojemności 8 ml z odpowiednią igłą i holderem. Krew od pacjenta pobiera się w systemie zamkniętym przy użyciu probówek próżniowych. Fragmenty chrząstki oraz krew pacjenta kieruje się do laboratorium hodowli komórek. Chrząstkę transportuje się w temperaturze od 4°C do 8°C a natomiast krew w temperaturze pokojowej.During the cartilage collection procedure, blood is also collected from the patient in the amount of 160 ml. The blood sample is tested for the presence of viral markers by serological method of anti-HIV1, anti-HIV2 antibodies, p24 antigen, HBs antigen, anti-HCV and RNA-HIV antibodies, RNA-HCV, DNA-HIV, as well as Wasserman test and ALT transaminase level. Autologous serum necessary for chondrocyte culture is obtained from the collected blood. The serum contains the nutrients necessary for cell growth. For blood collection, a vacuum tube for a clot of the Serum Beads Clot Activator type with a capacity of 8 ml with an appropriate needle and holder is used. The patient's blood is collected in a closed system using vacuum tubes. The cartilage fragments and the patient's blood are sent to the cell culture laboratory. Cartilage is transported at 4 ° C to 8 ° C and blood is transported at room temperature.
PL 213 865 B1PL 213 865 B1
Po dostarczeniu fragmentów chrząstki do laboratorium przystępuje się do wstępnej obróbki preparatu. Fragmenty chrząstki przechowuje się do 48h w temperaturze +2°C do +8°C, bez konsekwencji dla żywotności i hodowli chondrocytów. Laboratorium hodowli komórek ocenia czy nie został przekroczony „czas krytyczny” od momentu pobrania fragmentów chrząstki do czasu rozpoczęcia preparatyki.After the cartilage fragments are delivered to the laboratory, the preparation is processed. Cartilage fragments are stored for up to 48h at + 2 ° C to + 8 ° C, with no consequences for the viability and cultivation of chondrocytes. The cell culture laboratory assesses whether the "critical time" from the collection of cartilage fragments to the start of preparation has not been exceeded.
W dniu przyjęcia materiału w laboratorium hodowli komórek pobiera się płyn transportowy stanowiący sól fizjologiczną do badania bakteriologicznego i następnie dwukrotnie płucze się w pożywce hodowlanej Ham’sF12 wzbogaconej o gentamycynę 50 μg/ml, amfoterycynę 2 μg/ml, kwas askorbinowy 50 μg/ml. Przepłukane chrząstki przechowuje się przez noc w lodówce.On the day of receipt of the material in the cell culture laboratory, the transport fluid, constituting saline for bacteriological examination, is collected and then rinsed twice in Ham'sF12 culture medium enriched with gentamicin 50 μg / ml, amphotericin 2 μg / ml, ascorbic acid 50 μg / ml. Rinsed cartilages are stored in the refrigerator overnight.
Krew pacjenta wiruje się 10 minut o obrotach 2700 rpm, a następnie ściąga pipetą pasterowską surowicę w postaci supernatantu, i zbiera się w probówce o pojemności 50 ml. Z 160 ml krwi uzyskuje się 45 ml surowicy. Dalej surowicę poddaje się filtrowaniu przez filtry strzykawkowe 0,22 μm i rozpipetowuje się do probówek po około 5 ml i zamraża w temperaturze -20°C. Surowica przez cały okres prowadzonej hodowli jest przechowywana w stanie zamrożonym, a rozmraża się tylko wymaganą porcję do zmiany medium hodowlanego.The patient's blood is centrifuged for 10 minutes at 2700 rpm, then the Pasteur serum is pipetted in the form of the supernatant and collected in a 50 ml tube. From 160 ml of blood, 45 ml of serum are obtained. The serum is then filtered through 0.22 μm syringe filters and pipetted into approximately 5 ml tubes and frozen at -20 ° C. The serum is stored frozen throughout the entire cultivation period, and only the required portion is thawed to change the culture medium.
W kolejnym dniu fragment chrząstki zostaje oczyszczony przy pomocy skalpela, zmierzony zważony a następnie podzielony na porcje 100 mg. Każdą porcję 100 mg chrząstki rozdrabnia się 3 przy użyciu skalpela na małe fragmenty - kostki 0,5 mm3. Każde 100 mg pokrojonej chrząstki przekłada się do dołka na płytce 24-dołkowej. Do każdego dołka dodajemy 1 ml Ham'sF12 wzbogaconej o gentamycynę 50 μg/ml, amfoterycynę 2 μg/ml, kwas askorbinowy 50 μg/ml i dodajemy 300 U kolagenazy typu II (Worthington). Mieszaninę trawienną pozostawia się na 6 - 7 godzin w inkubatorze do hodowli komórek z atmosferą CO2.On the next day, the piece of cartilage is cleaned with a scalpel, measured weighed and then divided into 100 mg portions. Each 100 mg portion of cartilage is ground 3 using a scalpel into small pieces - 0.5 mm cubes 3 . Each 100 mg of cut cartilage is translated into a well in a 24-well plate. To each well we add 1 ml of Ham'sF12 enriched with gentamicin 50 μg / ml, amphotericin 2 μg / ml, ascorbic acid 50 μg / ml and we add 300 U of type II collagenase (Worthington). The digestive mixture is left for 6-7 hours in a cell culture incubator with a CO 2 atmosphere.
Strawioną chrząstkę przepuszcza się przez filtr nylonowy o wielkości porów 70 μm i wiruje się w ciągu 5 minut z szybkością 1000 rpm. Po wirowaniu odrzuca się supernatant, płucze peletkę komórek w odżywce Ham’sF12 wzbogaconej o gentamycynę 50 μg/ml, amfoterycynę 2 μg/ml, kwas askorbinowy 50 μg/ml i wiruje się 5 minut przy obrotach 1000 rpm.The digested cartilage was passed through a 70 µm nylon filter and centrifuged for 5 minutes at 1000 rpm. After centrifugation, the supernatant is discarded, the cell pellet is washed in Ham'sF12 nutrient supplement enriched with 50 µg / ml gentamicin, 2 µg / ml amphotericin, 50 µg / ml ascorbic acid and centrifuged for 5 minutes at 1000 rpm.
Przefiltrowane i przepłukane komórki wysiewa się w medium złożone z pożywek DMEM/Ham’sF12 w stosunku 1:1, suplementowanym 15% autologiczną surowicą, gentamycyną - 50 μg/ml, amfoterycyną 2 μg/ml i kwasem askrobinowym. Każde przefiltrowane komórki ze 100 mg wysiewa się na 1 dołku płytki 24-dołkowej typu Falcon PRIMARIA. W ciągu kilku godzin od wysiania,komórki, zaczynają przylegać do dna, a po około 3 dniach zaczynają się dzielić, hodowane na pożywkach DMEM/Ham'sF12 o stosunku 1:1 suplementowane 10% autologiczną surowicą, gentamycyną - 50 μg/ml, amfoterycyną 2 μg/ml, kwasem askorbinowym - 50 μg/ml, zmienia się co 48 godzin. Kiedy komórki osiągną 80% 2 konfluencję można je przesiać na butelkę hodowlaną typu NUNC o pojemności 25 cm2. Kiedy komórki osiągną „monolayer” są pasażowane - trypsynizowane. Hodowlę chondrocytów prowadzi się kolejno wFiltered and washed cells are plated in 1: 1 DMEM / Ham'sF12 media supplemented with 15% autologous serum, 50 µg / ml gentamicin, 2 µg / ml amphotericin and ascrobic acid. Each 100 mg filtered cells are plated on 1 well of a 24-well Falcon PRIMARIA plate. Within a few hours of seeding, cells begin to stick to the fundus, and after about 3 days they begin to divide, grown on DMEM / Ham'sF12 at a ratio of 1: 1 supplemented with 10% autologous serum, gentamicin - 50 μg / ml, amphotericin 2 μg / ml, ascorbic acid - 50 μg / ml, changing every 48 hours. When the cells reached 80% confluency 2 can be screened for bottle type culture NUNC a capacity of 25 cm 2. When the cells reach the "monolayer" they are passaged - trypsinized. The chondrocyte culture is carried out sequentially in
2 2 butelkach typu NUNC o objętości 25 cm2, 75 cm2 i 175 cm2 około 3 tygodni w inkubatorze w warunkach: temperatura 37°C, wilgotność 100%, stężenie CO2 5,5%.2 2 NUNC bottles with a volume of 25 cm 2 , 75 cm 2 and 175 cm 2 approximately 3 weeks in an incubator under the following conditions: temperature 37 ° C, humidity 100%, CO2 concentration 5.5%.
Na tydzień przed zakończeniem hodowli chondrocytów pacjent oddaje jedną jednostkę krwi 450 ml, którą pobiera się do potrójnego worka - zestawu składającego się z pojemnika macierzystego, w którym jest płyn konserwujący CPD w ilości 63 ml, pojemnika transferowego i pojemnika z roztworem wzbogaconym. Od dawcy pobiera się próbkę krwi, którą bada się na obecność markerów wirusów metodą serologiczną przeciwciał anty-HIV1, anty-HIV2, antygenu p24, antygenu HBs, przeciwciał anty-HCV i RNA-HIV, RNA-MCV, DNA-HIV a także odczynu Wassermana i poziomu transaminazy ALT. Krew po pobraniu poddaje się wirowaniu z szybkością 2300 x g przez 13 minut. Po odwirowaniu osocze oddziela się od elementów komórkowych. Osocze jest przelewane do pojemnika transferowego pustego. Rozdzielenie osocza od reszty zestawu przeprowadza się za pomocą zgrzewarki dieektrycznej. Pojedynczą jednostkę osocza po oddzieleniu od krwinek czerwonych zamraża się w urządzeniu do szokowego mrożenia w temperaturze -30°C i przechowuje się w temperaturze poniżej 25°C w ciągu 12-24 godzin. Z zamrażarki pojemnik z osoczem przenosi się do łaźni wodnej o temperaturze 4°C i rozmraża w ciągu 1,5-2 godzin. W rozmrożonym całkowicie osoczu, bez wyczuwalnych kryształów lodu, pływają pasma nierozpuszczonego białka - precypitat I. Osocze ponownie zamraża się w urządzeniu do szokowego mrożenia osocza, po zamrożeniu osocze przenosi się do zamrażarki i przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C w ciągu 12-24 godzin. Po tym okresie pojemnik z osoczem wyciąga się z zamrażarki i łączy się z pustym pojemnikiem transferowym za pomocą zgrzewarki do jałowego łączenia drenów, dren zabezpiecza się zaciskiem plastikowym, a następnie zanurza się w łaźni wodnej o temperaturze +4°C. Osocze całkowicie rozmraża się bez wyczuwalnychOne week before the end of chondrocyte culture, the patient donates one blood unit of 450 ml which is collected in a triple bag - a set consisting of a master container containing 63 ml CPD preservative fluid, a transfer container and a container with a spiked solution. A blood sample is collected from the donor and tested for the presence of viral markers by serological method of anti-HIV1 antibodies, anti-HIV2 antibodies, p24 antigen, HBs antigen, anti-HCV and RNA-HIV antibodies, RNA-MCV, DNA-HIV as well as Wasserman and the level of ALT transaminase. After collection, the blood is centrifuged at 2,300 x g for 13 minutes. After centrifugation, the plasma is separated from the cellular elements. The plasma is transferred to an empty transfer container. The separation of the plasma from the rest of the set is performed using a dieectric sealer. A single unit of plasma after separation from the red blood cells is frozen in a shock freezer at -30 ° C and stored below 25 ° C for 12-24 hours. From the freezer, the container with plasma is transferred to a water bath at 4 ° C and thawed for 1.5-2 hours. Strands of undissolved protein - precipitate I float in the fully thawed plasma, without any noticeable ice crystals. The plasma is frozen again in a plasma shock freezer, after freezing, the plasma is transferred to a freezer and stored at a temperature below -25 ° C for 12- 24 hours. After this period, the container with plasma is removed from the freezer and connected to the empty transfer container by means of a sterile connection sealer, the tube is secured with a plastic clamp, and then immersed in a water bath at a temperature of + 4 ° C. The plasma is completely thawed without being felt
PL 213 865 B1 kryształów lodu. W osoczu pływają pasma nierozpuszczonego białka, co świadczy, że otrzymuje się precypitat II. Pojemnik z osoczem zawierającym precypitat poddaje się wirowaniu z szybkością 2300 x g w ciągu 13 minut w temperaturze +4°C.Ice crystals. Streaks of undissolved protein float in the plasma, indicating that precipitate II is obtained. The container with the plasma containing the precipitate is centrifuged at 2300 x g for 13 minutes at + 4 ° C.
Po odwirowaniu pojemnik z osoczem umieszcza się w prasie ręcznej i szybko oddziela się nasącz od osadu zwalniając zacisk plastikowy. Całkowicie usuwa się płyn znad osadu. W czasie preparatyki nie dopuszcza się do przeciśnięcia osadu do osocza lub do jego rozpuszczania. W przypadku wysokiej temperatury otoczenia powyżej +20°C prasę manualną schładza się do temperatury +4°C. Pojemnik z osadem - fibrynogenem przenosi się do zamrażarki.After centrifugation, the container with plasma is placed in a hand press and the impregnation is quickly separated from the sediment by releasing the plastic clamp. The supernatant fluid is completely removed. During the preparation, it is not allowed to squeeze the precipitate into the plasma or to dissolve it. In the event of high ambient temperatures above + 20 ° C, the manual press is cooled down to a temperature of + 4 ° C. Container with sediment - fibrinogen is transferred to the freezer.
Fibrynogen przechowuje się przez 24 miesiące w temperaturze poniżej -25°C. Otrzymany autologiczny fibrynogen w postaci zamrożonej, dla bieżącego użytkowania rozporcjowuje się w ampułkach po 4ml i przechowuje się w postaci zamrożonej.Fibrinogen is stored for 24 months at a temperature below -25 ° C. The obtained autologous fibrinogen in the frozen form, for the current use, is divided into 4 ml ampoules and stored in a frozen form.
W końcowym etapie sporządzania przeszczepu chondrocyty są trypsynizowane i płukane dwukrotnie w medium Ham'sF12 z 10% surowicą. Komórki są liczone, a żywotność ich określana barwieniem błękitem trypanu.In the final stage of grafting, the chondrocytes are trypsinized and washed twice in Ham'sF12 medium with 10% serum. Cells are counted and viability is determined by trypan blue staining.
Następnie komórki miesza się z fibrynogenem i aprotyniną w jednej probówce a w drugiej probówce trombinę z 10% chlorkiem wapna. Fibrynogen występuje w stężeniach od 40- 115 mg/ml a trombina w stężeniach 150-600 μΐ/ml. Do specjalnej formy utworzonej z jednorazowej strzykawki nakłada się kolejno fibrynogen z komórkami i aprotyniną, a następnie dodaje się trombiny z chlorkiem wapna. Produkt do czasu zastygnięcia zaciska się z dwóch stron tłokami, tak aby jego grubość wynosiła nie więcej niż 2-3 mm. Formuje się produkt o średnicy 20 mm i grubości 2-3 mm. Na utworzenie takiego produktu potrzeba ok. 600-700 μl mieszaniny komórek w kleju tkankowym. Na 1000 μl kleju tkankowego zużywa się 5 do 10 mln namnożonych komórek. Ilość namnożonych komórek i przygotowanych produktów komórek w kleju tkankowym zależy od wielkości ubytku chrzęstnego w kolanie pacjenta. Lekarz ortopeda identyfikuje jego wielkość i określa zapotrzebowanie / wielkość - grubość przeszczepów. Gotowy przeszczep nazywa się fibrograft. Ma on postać niewielkiego płatka o żelowej konsystencji. Po przygotowaniu fibrografty pakuje się w sterylne opakowanie składające się z pojemnika transportowego sterylnie opakowanego w dwóch woreczkach.Then the cells are mixed with fibrinogen and aprotinin in one tube and thrombin with 10% calcium chloride in the other tube. Fibrinogen is present in concentrations of 40-115 mg / ml and thrombin in concentrations of 150-600 μΐ / ml. Fibrinogen with cells and aprotinin are sequentially applied to a special form created from a disposable syringe, and then thrombin with calcium chloride is added. Until it solidifies, the product is pressed on both sides with pistons, so that its thickness is no more than 2-3 mm. A product with a diameter of 20 mm and a thickness of 2-3 mm is formed. To create such a product, approximately 600-700 μl of the mixture of cells in the tissue adhesive are needed. 5 to 10 million multiplied cells are used per 1000 μl of tissue glue. The amount of multiplied cells and prepared cell products in the tissue glue depends on the size of the cartilage defect in the patient's knee. The orthopedic doctor identifies its size and determines the need / size - thickness of the grafts. The finished transplant is called a fibrograft. It has the form of a small flake with a gel-like consistency. After preparation, the fibrographs are packed in a sterile package consisting of a transport container sterile packed in two bags.
Wszystkie czynności związane z obróbką wstępną chrząstki, dalszą hodowlą chondrocytów oraz końcowym przygotowaniem przeszczepu przeprowadza się w warunkach i z zachowaniem zasad pełnej aseptyki pod nawiewem laminarnym, w przygotowanych do hodowli komórek pomieszczeniach klasy czystości B.All activities related to the pre-treatment of the cartilage, further cultivation of chondrocytes and final preparation of the graft are carried out under the conditions and following the principles of full aseptic under laminar airflow, in clean B rooms prepared for cell culture.
Podczas drugiego zabiegu chirurg wszczepia chondrocyty w kleju tkankowym w miejsce ubytku chrząstki pacjenta. Po dokonaniu przeszczepu chondrocyty wytwarzają macierz chrzęstną, co prowadzi do odbudowy tkanki chrzęstnej w miejscu jej uszkodzenia.During the second procedure, the surgeon implants chondrocytes in a tissue glue into the patient's cartilage defect. After transplantation, chondrocytes produce cartilage matrix, which leads to the reconstruction of cartilage tissue at the site of its damage.
WYKAZ przebadanej literatury związanej ze stanem techniki w zakresie autologicznego przeszczepu chondrocytów w kleju tkankowymLIST of the researched literature related to the state of the art in the field of autologous chondrocyte transplantation in tissue glue
Claims (13)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL383248A PL213865B1 (en) | 2007-09-03 | 2007-09-03 | The manner of obtaining of autogeneous explant of chondrocites in tissue glue based on fibrinogen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL383248A PL213865B1 (en) | 2007-09-03 | 2007-09-03 | The manner of obtaining of autogeneous explant of chondrocites in tissue glue based on fibrinogen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL383248A1 PL383248A1 (en) | 2009-03-16 |
| PL213865B1 true PL213865B1 (en) | 2013-05-31 |
Family
ID=42984758
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL383248A PL213865B1 (en) | 2007-09-03 | 2007-09-03 | The manner of obtaining of autogeneous explant of chondrocites in tissue glue based on fibrinogen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL213865B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL425169A1 (en) * | 2018-04-10 | 2019-10-21 | Julia Bar | Method for obtaining biological implant for regeneration of cartilaginous tissue |
-
2007
- 2007-09-03 PL PL383248A patent/PL213865B1/en unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL425169A1 (en) * | 2018-04-10 | 2019-10-21 | Julia Bar | Method for obtaining biological implant for regeneration of cartilaginous tissue |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL383248A1 (en) | 2009-03-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5656183B2 (en) | Application of synovial mesenchymal stem cells (MSCs) to cartilage and meniscal regeneration | |
| AU2009354233B2 (en) | Composition for inducing tissue regeneration by activating platelet-rich plasma (PRP), and method for manufacturing same | |
| AU625913B2 (en) | Compositions and methods for repair of cartilage and bone | |
| CN101072572B (en) | Isolation of bone marrow fraction rich in connective tissue growth components and the use thereof to promote connective tissue formation | |
| JP6980004B2 (en) | Cartilage regeneration composition and its manufacturing method | |
| AU7429200A (en) | Methods and compositions for preserving chondrocytes and uses | |
| WO2014047067A1 (en) | Compositions and methods for treating and preventing tissue injury and disease | |
| US10645921B2 (en) | Viable disc regenerative composition and method of manufacture and use | |
| EP2644695B1 (en) | Cultured cartilage tissue material | |
| JP4958777B2 (en) | Amorphous cell delivery vehicle processed by physical / physicochemical stimulation | |
| Cugat et al. | Particulated autologous chondral− platelet-rich plasma matrix implantation (PACI) for treatment of full-thickness cartilage osteochondral defects | |
| Titan et al. | Growth factor delivery to a cartilage-cartilage interface using platelet-rich concentrates on a hyaluronic acid scaffold | |
| Munirah et al. | Autologous versus pooled human serum for articular chondrocyte growth | |
| CN106474156A (en) | Purposes in preparing medicine for the compositionss | |
| PL213865B1 (en) | The manner of obtaining of autogeneous explant of chondrocites in tissue glue based on fibrinogen | |
| Muench et al. | Concentrated Bone Marrow Aspirate and Subacromial Bursa-Derived Cells Demonstrate Similar Cellular Adhesion and Proliferation Potential on Demineralized Bone Matrix Scaffolds for Biologic Augmentation of Rotator Cuff Repair. | |
| US20210052661A1 (en) | Compositions and methods for repairing cartilage defects | |
| Yang et al. | Porcine fibrin sealant combined with autologous chondrocytes successfully promotes full‐thickness cartilage regeneration in a rabbit model | |
| CN106540326A (en) | Purposes of the chondrocyte composition in medicine is prepared | |
| Hofmann et al. | Tissue engineering of bone | |
| CN106552288A (en) | The method for preparing chondrocyte composition | |
| CN106421918A (en) | Chondrocyte composition | |
| RU2638796C1 (en) | Method for obtaining of two-component preparation for treatment of joints damage by low-invasive introduction into joint bag and preparation obtained by this method | |
| US11965179B1 (en) | Laser treated platelet product | |
| JP5373427B2 (en) | Use of synovial cells and minced cartilage fragments in cartilage repair |