PL213865B1 - posób otrzymywania autologicznego przeszczepu chondrocytów w kleju tkankowym na bazie fibrynogenu - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania autologicznego przeszczepu chondrocytów w kleju tkankowym na bazie fibrynogenu.

Chrząstka szklista kolana jest dosyć prostej budowy, występuje jeden typ komórek, ale jest wysoko wyspecjalizowaną tkanką łączną odpowiedzialną za amortyzowanie (cushioning) i smarowanie (lubricating). Nie jest unaczyniona, unerwiona i nie zawiera naczyń limfatycznych. Chrząstka szklista jest zbudowana z komórek chrzęstnych, chondrocytów i wytwarzanej przez nie macierzy poza- komórkowej. Głównymi komponentami macierzy chrzęstnej są swoiste proteoglikany i kolagen typu II, oraz występujące w niewielkiej ilości inne rodzaje białek. W połączeniu ze sobą tworzą one uporządkowaną, trójwymiarową gęstą sieć warunkującą integralność chrząstki oraz decydującą o jej właściwościach mechanicznych i immunologicznych. Najważniejszymi proteoglikanami chrząstkowymi są agrekany tworzące wielocząsteczkowe agregaty z kwasem hialuronowym. Do cząsteczki kwasu hialuronowego może się przyłączyć 200 cząsteczek agrekanu tworząc agregat o masie 500 000 kDa. Zbudowane są one z rdzenia białkowego i bocznych łańcuchów glikozaminoglikanowych: siarczanu chondroityny i siarczanu keratanu. 70% suchej masy chrząstki stanowią białka kolagenowe. Dominującym typem kolagenu jest kolagen typu II zbudowany z łańcuchów tropokolagenu. Poza kolagenem typu II chrząstka zawiera również mniejszą ilość innych kolagenów między innymi kolagenu typu IX, XI i XIV.

Chrząstka stawowa ma budowę warstwową. Powierzchniowa, najcieńsza I warstwa zwana styczną (superficial tangential zone) jest najcieńsza i stanowi ona 10% grubości chrząstki stawowej. Utworzona jest przez małe komórki o charakterze zbliżonym do fibroblastów oraz liczne styczne do powierzchni stawowej włókna kolagenowe. W kolejnej II warstwie - przejściowej (stratum intermedium sive transitionale) chondrocyty są kuliste i występują w niewielkich grupach izogenicznych rozmieszczonych w przypadkowy sposób w macierzy, a włókna kolagenowe przebiegają skośnie. W strefie III warstwa promienista (stratum radiale) kuliste chondrocyty są ułożone w kolumny / pakiety biegnące prostopadle do powierzchni chrząstki i włókna kolagenowe przebiegają również prostopadle do powierzchni chrząstki. Najgłębszą warstwę stanowi warstwa zwapniałej chrząstki (calcified zone) stykająca się z warstwą podchrzęstną kości, dzieli się na dwie warstwy, górną w której chondrocyty są znacznie powiększone w porównaniu z chondrocytami warstwy III i dolną, w której macierz jest silnie zwapniała. Warstwy promienista i zwapniała stanowią razem 50% grubości chrząstki.

Fenotyp chondrocytów przejawia się zdolnością do wytwarzania kolagenu typu II i agrekanów. Główną funkcją chondrocytów jest synteza specyficznych składników macierzy chrzęstnej: kolagenu typu II, IX, XI oraz agrekanów.

Chrząstka stawowa wykazuje wyspecjalizowane cechy biomechaniczne i ma podstawowe znaczenie dla prawidłowej funkcji narządu ruchu. Aktywnie uczestniczy w czynnościach mechanicznych stawu - poprzez amortyzację wstrząsów, dzięki pokryciu cienką warstwą płynu stawowego minimalizuje tarcie pomiędzy nasadami kości tworzących staw, podczas chodu przenosi obciążenia kilkakrotnie przekraczające masę człowieka. Te funkcje chrząstki wynikają z jej budowy. Uszkodzenia chrząstki spowodowane działaniem czynników fizycznych, zaburzeniami metabolizmu komórek chrzęstnych (chondrocytów) lub przewlekłymi reakcjami zapalnymi prowadzą do upośledzenia funkcji stawów i mogą być przyczyną trwałego kalectwa. Następstwem uszkodzeń chrząstki stawowej jest ograniczenie sprawności fizycznej. Chrząstka stawowa dorosłego człowieka ma niewielką zdolność do regeneracji, dlatego też uszkodzenia te są nieodwracalne i prowadzą do powstania zmian zwyrodnieniowych, a następnie do trwałego kalectwa.

Najczęściej występującymi chorobami prowadzącymi do uszkodzenia chrząstki są choroba zwyrodnieniowa stawów (osteoarthritis, OA), reumatoidalne zapalenie stawów (rzs), dna i kolagenozy. Etiologia tych schorzeń nie jest w pełni znana, ale najprawdopodobniej są związane z zaburzeniami metabolizmu chrząstki, co wpływa na zachwianie równowagi syntezy i degradacji macierzy chrzęstnej.

Przyczyny uszkodzeń tkanki stawowej związane są często z wiekiem i poziomem aktywności fizycznej człowieka , z rozwojem komunikacji. Rosnąca aktywność sportowa społeczeństwa powoduje wzrost częstości uszkodzeń chrząstki stawowej, szczególnie u młodych amatorów piłki nożnej, osób w średnim wieku, kobiet i u amatorów koszykówki.

Z publikacji. Piotr Strzelczyk, Grzegorz Benke, Andrzej Górecki pt. „Zasady izolacji i hodowli ludzkich chondrocytów - wstęp do autogennnych przeszczepów komórkowych” Ortopedia, Traumatologia, Rehabilitacja vol. 3 nr 2 2001 r., str. 213-215, znany jest zaproponowany przez szwedzkich baPL 213 865 B1 daczy autologiczny przeszczep chondrocytów ludzkich do wypełniania ubytku chrzęstnego w stawie kolanowym.

Początkowo w Nowym Jorku w Hospital for Joint Disease a później na Uniwersytecie w Goetenburgu, Petersen, Lindahl i Brittberg opracowali metodę hodowli autologicznych chondrocytów pozyskiwanych z małych fragmentów zdrowej chrząstki. W 1987 roku rozpoczynają się pierwsze badania kliniczne nad leczeniem ubytków chrzęstnych pełnej grubości w stawie kolanowym u człowieka z wykorzystaniem autologicznych chondrocytów. Pierwszym chorym, u którego zastosowano leczenie jest pięćdziesięcioletni lekarz.

Pozyskany fragment zdrowej chrząstki ze stawu kolanowego u człowieka pod wyciągiem z pionowym przepływem laminarnym powietrza jest opłukiwany 10 ml DMEM w próbce Petri'ego oraz oczyszczany z pozostałości tkanki kostnej lub łącznej. Tak przygotowany materiał jest ważony w jałowym naczyniu a następnie rozdrabniany na kawałki poniżej 0,5 mm średnicy. Rozdrabnianie wykonuje się w roztworze 0,25% kolagenazy. Przy użyciu pipety komórki chrząstki wraz z roztworem są przenoszone do probówki wirowniczej. Probówka jest uzupełniana do 10 ml 0,25% roztworem kolagenozy i pozostawiona na noc (18-20 h) w inkubatorze pracującym w temperaturze 37°C. Kolageneza trawi włókna kolagenowe nie zabijając komórek. Przy delikatnym obchodzeniu się z trawioną próbką chrząstki znajdują się regularne pakiety komórek bez otaczającej je zwykle macierzy o żółtej barwie. Po potrząśnięciu naczyniem komórki „wysypują się” z macierzy.

Po opadnięciu fragmentów niestrawionej chrząstki na dno, roztwór enzymów z uwolnionymi chondrocytami za pomocą pipety, przenoszony jest do drugiej probówki wirowniczej. Następnie po 5,6-krotnym wymieszaniu zawiesiny pipetą i rozbiciu agregatów komórek, określana jest liczba komórek w komorze Bϋrkera (hermocytometrze). Probówka z zawiesiną wirowana jest przez 5 minut, przy 1000 rpm. Odwirowana peletka (materiał zgromadzony na dnie w wyniku wirowania) zawieszana jest w odpowiedniej objętości roztworu DMEM/FBS (standardowa pożywka z cielęcą surowicą płodową, ALAB) do uzyskania stężenia 5,0 x 105 komórek/ml. Komórki wysiewane są do butelki hodowlanej (5 ml zawiesiny na 50 ml butelkę), która umieszczana jest w inkubatorze w atmosferze 5% CO2, w powietrzu nasyconym parą wodną o temperaturze 37°C.

Chondrocyty, uwolnione z macierzy chrzęstnej, przyczepiają się do dna naczynia, rozpłaszczają się, mnożą i rozprzestrzeniając się pokrywają dno butelki hodowlanej jednolitą warstwą (z ang. monolayer). Hodowla jest prowadzona w inkubatorze w temperaturze 37°C. Izolowane, zdrowe chondrocyty wykazują zdolność do przyczepiania się do dna butelki w pierwszych godzinach po wysianiu. Pożywkę zmienia się co 2-3 dni. Gdy komórki mnożąc się i rozpełzając, pokrywają 80-90% pola, hodowlę trawi się roztworem trypsyny z wersenianem (TE) wiążącym jony wapnia. Komórki odklejają się od dna. Następnie, po 10 krotnym rozcieńczeniu w roztworze DMEM wzbogaconym 10% FBS, zawiesina przenoszona jest do kolejnych butelek hodowlanych. Ten proces nazywany jest pasażowaniem. Pozwala na swobodne mnożenie i ekspansję komórek w hodowli jednowarstwowej.

W czasie każdej inspekcji mikroskopowej, obok oceny morfologii i liczby hodowanych komórek, poszukuje się cech ewentualnej infekcji mikrobiologicznej. Zanieczyszczenie materiału śródoperacyjne czy laboratoryjne objawia się wzrostem kolonii grzybów szybko pokrywających pole widzenia. W przypadku bakterii, już makroskopowo widać zmętnienie pożywki. W laboratorium Fidia Advanced Biopolymers we Włoszech standardem jest ocena zawartości endotoksyn w teście LAL.

Przed wszczepieniem można ocenić czy hodowane komórki zachowały zdolność do odtworzenia prawidłowego fenotypu. Badana próbka komórek zawieszana jest w płynnym roztworze alginatu. Po dodaniu roztworu chlorku wapnia następuje polimeryzacja alginatu i komórki zostają uwięzione w półstałym środowisku. Pożywka penetruje swobodnie do alginatu i wymieniana jest co 2-3 dni. Fragmenty w alginacie mogą być okresowo pobierane do badania. Z próbek tych uwalniane są komórki buforem depolimeryzującym (cytrynian sodu) poprzez wiązanie jonów wapnia.

Porównywane są próbki z hodowli jednowarstwowej i hodowli z alginatem. Metodą RT- PCR oceniane są próbki mRNA. Poszukiwane są transkrypty agrekanu, kolagenu typu I, kolagenu typu II oraz 18s RNA uznanego za kontrolny standard. Metodą immunohistochemiczną oceniane jest rozmieszczenie kolagenu typu I i II w obu badanych hodowlach.

Polipeptydowe czynniki wzrostowe odgrywają ważną rolę w regulacji zachowania chondrocytów. IGF-1 pobudza produkcję macierzy oraz aktywność mitotyczną. Najsilniejszym mitogenem jest TGF-beta. BMP-2, należący do rodziny TGF, indukuje ekspresję prokolagenu typ II w hodowlach jednowarstwowych. IGF-1 pobudza syntezę proteoglikanów. IGF-1 i TGF-beta regulują ekspresję integryn - receptorów powierzchniowych dla fibronektyny, kolagenu II i IV, lamininy, vitronectyny i oste4

PL 213 865 B1 opontiny. Integryny łączą macierz zewnątrzkomórkową (ECM) z cytoszkieletem, pośrednicząc w przenoszeniu, przez co wpływają na zmiany ekspresji genowej i funkcji chondrocytów.

Świeżo izolowane chondrocyty są okrągłe. Po przytwierdzeniu się do podłoża zaczynają przypominać fibroblasty. Po zawieszeniu w półstałym alginacie ponownie odzyskują okrągły kształt. Zmianom morfotycznym towarzyszą zmiany fenotypu. Chondrocyty uwolnione są z macierzy, wzrastając w hodowli jednowarstwowej, tracą ekspresję genu dla kolagenu typu II i, upodabniając się do fibroblastów, zaczynają wytwarzać mRNA dla kolagenu typu I. Zawieszone w półstałym alginacie, w ciągu 1-2 tygodni rozpoczynają produkcję mRNA dla kolagenu typu II.

Uzyskanie takich wyników świadczy o zdrowym wzroście hodowli i o zachowaniu zdolności do ponownego przybrania cech fenotypowych chondrocytów, a uzyskana hodowla komórkowa to produkt inżynierii tkankowej o wysokiej jakości.

W metodzie szwedzkich autorów autologiczny przeszczep chondrocytów w zawiesinie wszczepia się w kłykciu udowym kolana pod łatę okostnej.

Znane są procedury terapeutyczne z polskiego opisu zgłoszenia nr P-349595 z dziedziny naprawy tkanek, a w szczególności regeneracji funkcjonalnej chrząstki stawowej. Sposób regeneracji chrząstki stawowej obejmuje podawanie w miejsce wymagające regeneracji przynajmniej jednego oczyszczonego białka morfogenetycznego kości albo obejmuje podawanie w miejsce wymagające regeneracji odpowiedniego źródła tkanki w kombinacji z przynajmniej jednym oczyszczonym białkiem morfogenetycznym kości. Sposób regeneracji w odmianie obejmuje podawanie w miejsce wymagające regeneracji przynajmniej jednego oczyszczonego białka wybranego z grupy obejmującej Vgr-2, czynników wzrostu i różnicowania (GDF) i BIP.

Podobnie znana kompozycja do regeneracji chrząstki stawowej obejmuje przynajmniej jedno oczyszczone białko morfogenetyczne albo obejmuje odpowiednie źródło tkanki w kombinacji z przynajmniej jednym oczyszczonym białkiem morfogenetycznym kości. Odmiana kompozycji obejmuje jedno oczyszczone białko wybrane z grupy obejmującej Wgr-2, czynniki wzrostu i różnicowania (GDF) i BIP.

Zagadnieniem wymagającym rozwiązania jest ulepszenie sposobu otrzymywania autologicznego przeszczepu chondrocytów w kleju tkankowym na bazie fibrynogenu, który jest bezpieczny dla pacjenta ze względu na ograniczenie do minimum ryzyka zakażenia chorobami zakaźnymi w czasie prowadzenia procedury terapeutycznej przeszczepu chondrocytów - chrząstki stawowej w kolanie.

Wytyczone zagadnienie techniczne rozwiązuje sposób otrzymywania autologicznego przeszczepu chondrocytów w kleju tkankowym na bazie fibrynogenu, złożony z czynności pobrania chrząstki z nieobciążonej części stawu kolanowego oraz przeważnie pobrania krwi od pacjenta, wstępnej obróbki preparatu, rozdrabniania pobranej chrząstki na małe fragmenty, oddzielenia surowicy od pobranej krwi, trawienia chrząstki, wysiewania komórek chrząstki, namnażania hodowlanych komórek chondrocytów i pasażowania namnożonych komórek oraz dalszej obróbki uzyskiwanych komórek chondrocytów, charakteryzujący się tym, że pobrany artroskopowo fragment chrząstki stawowej transportuje się w sterylnej probówce w schłodzonej soli fizjologicznej w temperaturze od +2°C do +8°C a donację krwi w temperaturze pokojowej, otrzymane fragmenty chrząstki w laboratorium hodowli komórek płucze się kilkakrotnie w pożywce hodowlanej i przechowuje się w lodówce, donację krwi od pacjenta wiruje się a następnie surowicę ściąga się i zbiera się w probówce, po czym filtruje się, rozpipetowuje się do małych probówek i zamraża w temperaturze -20°C, strawioną chrząstkę przepuszcza się przez filtr nylonowy i płucze się komórki w odżywce, następnie wysiewa się w pożywce DMEM/Ham'sF12 a po osiągnięciu 80% konfluencji komórek przesiewa się je na butelkę hodowlaną i prowadzi się namnażanie w kolejnych butelkach hodowlanych, dalej przed zakończeniem hodowli chondrocytów pobiera się donację krwi, korzystnie od pacjenta, z której przygotowuje się autologiczny fibrynogen, po czym po dwukrotnym płukaniu chondrocytów w pożywce Ham'sF12 z 10% autologiczną surowicą komórki chondrocytów miesza się z fibrynogenem i aprotyniną w jednej probówce a w drugiej probówce przygotowuje się trombinę z 10% chlorkiem wapnia i w końcu w formie utworzonej z jednorazowej strzykawki nakłada się kolejno fibrynogen z komórkami chondrocytów i aprotyniną a następnie dodaje się trombiny z chlorkiem wapnia i zaciska się z dwóch stron tłokami do czasu zastygnięcia przeszczepu o grubości 2-3 mm i średnicy 20 mm. Wyhodowane chondrocyty zawiesza się w autologicznym fibrynogenie, który jest składnikiem kleju tkankowego. Pobraną chrząstkę płucze się w pożywce hodowlanej Ham'sF12 wzbogaconej o gentamycynę 50 μg/ml, amfoterycynę 2 μg/ml, kwas askorbinowy. Krew od pacjenta wiruje się przez 10 minut przy obrotach 2700 rpm, ściąga się pipetą pasterowską w postaci supernatantu i po zebraniu w probówce, dalej surowicę poddaje się filtrowaniu

PL 213 865 B1 przez filtry strzykawkowe 0,22 mm. Autologiczną surowicę rozpipetowuje się do probówek po około 5 ml.

Pobrane fragmenty chrząstki stawowej dzieli się na porcje 100 mg a następnie porcje te dzieli się na ₃ małe fragmenty - kostki 0,5 mm³ i przekłada się do dołków w płytce 24-dołkowej i do każdego dołka dodaje się 1 ml odżywki Ham’sF12 wzbogaconej o gentamycynę 50 μg/ml, amfoterycynę 2 μg/ml, kwas askorbinowy 50 μg/ml oraz dodaje się 300 U kolagenazy typu II. Zawiesinę trawienną pozostawia się na 6-7 godzin w inkubatorze do hodowli komórek z atmosferą CO2. Strawioną chrząstkę, przefiltrowaną przez filtr nylonowy o wielkości porów 70 μηι wiruje się w ciągu 5 minut z szybkością 1000 rpm. Od strawionej chrząstki odrzuca się supernatant, płucze peletkę komórek w odżywce Ham'SF12 wzbogaconej o gentamycynę 50 μg/ml, amfoterycynę 2 μg/ml, kwas askorbinowy 50 μg/ml i w końcu wiruje się przy obrotach 1000 rpm. Przefiltrowane komórki wysiewa się w medium złożonym z pożywek DMEM/Ham'sF12 w stosunku 1:1, suplementowanym 15% autologiczną surowicą, gentamycyną 50 μg/ml, amfoterycyną 2 μg/ml, kwasem askorbinowym. Każde przefiltrowane komórki ze 100 mg wysiewa się w jednym dołku płytki 24-dołkowej i hoduje się na pożywce DMEM/Ham'sF12 o stosunku 1:1 suplementowanej 10% autologiczną surowicą, gentamycyną 50 μg/ml, amfoterycyną 2 μg/ml, kwasem askorbinowym 50 μg/ml, które miesza się do 48 godzin. Donację krwi pobiera się do potrójnego worka, pobraną krew poddaje się wirowaniu w ciągu do 15 minut z szybkością 2300 x g, odwirowane osocze oddziela się od elementów komórkowych, następnie oddzielone osocze poddaje się dwukrotnemu zamrożeniu w temperaturze - 30°C i przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C a z kolei po zamrożeniu osocze poddaje się rozmrożeniu w łaźni wodnej w temperaturze +4°C, po powtórnym całkowitym rozmrożeniu osocza pojemnik osocza poddaje się wirowaniu, po czym usuwa się płyn znad osocza za pomocą prasy manualnej, którą schładza się w miarę potrzeb do temperatury +4°C a pojemnik z fibrynogenem przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C. Czynności związane z obróbką wstępną chrząstki, dalszą hodowlą chondrocytów oraz końcowym przygotowaniem przeszczepu przeprowadza się w warunkach i z zachowaniem zasad pełnej aseptyki pod nawiewem laminarnym, w przygotowanych do hodowli pomieszczeniach.

Sposób otrzymywania autologicznego przeszczepu chondrocytów w kleju tkankowym na bazie fibrynogenu według wynalazku, dzięki żelowej strukturze zapewnia silną adhezyjność przeszczepu w miejscu ubytku chrząstki stawowej co daje, że lekarz ortopeda nie musi dodatkowo stosować kleju tkankowego ani przyszywać łatę okostną. Dzięki temu unika się okaleczenia pacjenta w porównaniu do metody z zastosowaniem łaty okostnej. Skraca to czas zabiegu. Tak przy pobraniu fragmentu chrząstki stawowej jak i wszczepieniu autologicznego przeszczepu jest małe pole operacyjne. Daje to łatwość wszczepienia oraz możliwość wszczepienia artroskopowego. Sposób postępowania według wynalazku daje możliwość uformowania każdego kształtu w zależności od ubytku chrzęstnego pacjenta. Ponadto nieoczekiwanie przeszczep ma postać żelowego płatka co sprawia, że jest plastyczny i łatwo się dostosowuje do powierzchni ubytku chrząstki stawowej. Autologiczny przeszczep chondrocytów przy zastosowaniu kleju tkankowego z autologicznego fibrynogenu ogranicza do minimum ryzyko zakażenia pacjenta w czasie prowadzenia procedury terapeutycznej.

W czasie badania lekarskiego ortopeda stwierdza ubytek chrząstki w stawie kolanowym.

Podczas pierwszego zabiegu chirurg ortopeda pobiera od pacjenta mały fragment chrząstki z nieobciążonej części kłykcia kości udowej stawu kolanowego. Chrząstkę pobiera się z trzech miejsc kłykcia: z części bocznej (Lateral Superior Ridge), części przyśrodkowej (Medial Superior Ridge) oraz wcięcia międzykłykciowego (lntercondyllar Notch). Pobiera się dwa fragmenty chrząstki pełnej grubości o wymiarach około 5x10 mm co stanowi około 400 mg. Pobraną chrząstkę niezwłocznie wkłada się do sterylnej probówki transportowej i zalewa się sterylną, schłodzoną solą fizjologiczną zawierającą 0,9% NaCl. Chrząstkę przechowuje się w lodówce w temperaturze od +2 do +8°C .

Podczas zabiegu pobrania chrząstki od pacjenta pobiera się również krew w ilości 160 ml. Próbkę pobranej krwi bada się na obecność markerów wirusów metodą serologiczną przeciwciał antyHIV1, anty-HIV2, antygenu p24, antygenu HBs, przeciwciał anty-HCV oraz RNA-HIV, RNA-HCV, DNA-HIV, a także odczynu Wassermana i poziomu transaminazy ALT. Z pobranej krwi uzyskuje się autologiczną surowicę niezbędną do hodowli chondrocytów. Surowica zawiera składniki odżywcze konieczne do wzrostu komórek. Do pobrania krwi używa się probówki próżniowej na skrzep typu Serum Beads Clot Activator o pojemności 8 ml z odpowiednią igłą i holderem. Krew od pacjenta pobiera się w systemie zamkniętym przy użyciu probówek próżniowych. Fragmenty chrząstki oraz krew pacjenta kieruje się do laboratorium hodowli komórek. Chrząstkę transportuje się w temperaturze od 4°C do 8°C a natomiast krew w temperaturze pokojowej.

PL 213 865 B1

Po dostarczeniu fragmentów chrząstki do laboratorium przystępuje się do wstępnej obróbki preparatu. Fragmenty chrząstki przechowuje się do 48h w temperaturze +2°C do +8°C, bez konsekwencji dla żywotności i hodowli chondrocytów. Laboratorium hodowli komórek ocenia czy nie został przekroczony „czas krytyczny” od momentu pobrania fragmentów chrząstki do czasu rozpoczęcia preparatyki.

W dniu przyjęcia materiału w laboratorium hodowli komórek pobiera się płyn transportowy stanowiący sól fizjologiczną do badania bakteriologicznego i następnie dwukrotnie płucze się w pożywce hodowlanej Ham’sF12 wzbogaconej o gentamycynę 50 μg/ml, amfoterycynę 2 μg/ml, kwas askorbinowy 50 μg/ml. Przepłukane chrząstki przechowuje się przez noc w lodówce.

Krew pacjenta wiruje się 10 minut o obrotach 2700 rpm, a następnie ściąga pipetą pasterowską surowicę w postaci supernatantu, i zbiera się w probówce o pojemności 50 ml. Z 160 ml krwi uzyskuje się 45 ml surowicy. Dalej surowicę poddaje się filtrowaniu przez filtry strzykawkowe 0,22 μm i rozpipetowuje się do probówek po około 5 ml i zamraża w temperaturze -20°C. Surowica przez cały okres prowadzonej hodowli jest przechowywana w stanie zamrożonym, a rozmraża się tylko wymaganą porcję do zmiany medium hodowlanego.

W kolejnym dniu fragment chrząstki zostaje oczyszczony przy pomocy skalpela, zmierzony zważony a następnie podzielony na porcje 100 mg. Każdą porcję 100 mg chrząstki rozdrabnia się ₃ przy użyciu skalpela na małe fragmenty - kostki 0,5 mm³. Każde 100 mg pokrojonej chrząstki przekłada się do dołka na płytce 24-dołkowej. Do każdego dołka dodajemy 1 ml Ham'sF12 wzbogaconej o gentamycynę 50 μg/ml, amfoterycynę 2 μg/ml, kwas askorbinowy 50 μg/ml i dodajemy 300 U kolagenazy typu II (Worthington). Mieszaninę trawienną pozostawia się na 6 - 7 godzin w inkubatorze do hodowli komórek z atmosferą CO2.

Strawioną chrząstkę przepuszcza się przez filtr nylonowy o wielkości porów 70 μm i wiruje się w ciągu 5 minut z szybkością 1000 rpm. Po wirowaniu odrzuca się supernatant, płucze peletkę komórek w odżywce Ham’sF12 wzbogaconej o gentamycynę 50 μg/ml, amfoterycynę 2 μg/ml, kwas askorbinowy 50 μg/ml i wiruje się 5 minut przy obrotach 1000 rpm.

Przefiltrowane i przepłukane komórki wysiewa się w medium złożone z pożywek DMEM/Ham’sF12 w stosunku 1:1, suplementowanym 15% autologiczną surowicą, gentamycyną - 50 μg/ml, amfoterycyną 2 μg/ml i kwasem askrobinowym. Każde przefiltrowane komórki ze 100 mg wysiewa się na 1 dołku płytki 24-dołkowej typu Falcon PRIMARIA. W ciągu kilku godzin od wysiania,komórki, zaczynają przylegać do dna, a po około 3 dniach zaczynają się dzielić, hodowane na pożywkach DMEM/Ham'sF12 o stosunku 1:1 suplementowane 10% autologiczną surowicą, gentamycyną - 50 μg/ml, amfoterycyną 2 μg/ml, kwasem askorbinowym - 50 μg/ml, zmienia się co 48 godzin. Kiedy komórki osiągną 80% ₂ konfluencję można je przesiać na butelkę hodowlaną typu NUNC o pojemności 25 cm². Kiedy komórki osiągną „monolayer” są pasażowane - trypsynizowane. Hodowlę chondrocytów prowadzi się kolejno w

2 2 butelkach typu NUNC o objętości 25 cm², 75 cm² i 175 cm² około 3 tygodni w inkubatorze w warunkach: temperatura 37°C, wilgotność 100%, stężenie CO2 5,5%.

Na tydzień przed zakończeniem hodowli chondrocytów pacjent oddaje jedną jednostkę krwi 450 ml, którą pobiera się do potrójnego worka - zestawu składającego się z pojemnika macierzystego, w którym jest płyn konserwujący CPD w ilości 63 ml, pojemnika transferowego i pojemnika z roztworem wzbogaconym. Od dawcy pobiera się próbkę krwi, którą bada się na obecność markerów wirusów metodą serologiczną przeciwciał anty-HIV1, anty-HIV2, antygenu p24, antygenu HBs, przeciwciał anty-HCV i RNA-HIV, RNA-MCV, DNA-HIV a także odczynu Wassermana i poziomu transaminazy ALT. Krew po pobraniu poddaje się wirowaniu z szybkością 2300 x g przez 13 minut. Po odwirowaniu osocze oddziela się od elementów komórkowych. Osocze jest przelewane do pojemnika transferowego pustego. Rozdzielenie osocza od reszty zestawu przeprowadza się za pomocą zgrzewarki dieektrycznej. Pojedynczą jednostkę osocza po oddzieleniu od krwinek czerwonych zamraża się w urządzeniu do szokowego mrożenia w temperaturze -30°C i przechowuje się w temperaturze poniżej 25°C w ciągu 12-24 godzin. Z zamrażarki pojemnik z osoczem przenosi się do łaźni wodnej o temperaturze 4°C i rozmraża w ciągu 1,5-2 godzin. W rozmrożonym całkowicie osoczu, bez wyczuwalnych kryształów lodu, pływają pasma nierozpuszczonego białka - precypitat I. Osocze ponownie zamraża się w urządzeniu do szokowego mrożenia osocza, po zamrożeniu osocze przenosi się do zamrażarki i przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C w ciągu 12-24 godzin. Po tym okresie pojemnik z osoczem wyciąga się z zamrażarki i łączy się z pustym pojemnikiem transferowym za pomocą zgrzewarki do jałowego łączenia drenów, dren zabezpiecza się zaciskiem plastikowym, a następnie zanurza się w łaźni wodnej o temperaturze +4°C. Osocze całkowicie rozmraża się bez wyczuwalnych

PL 213 865 B1 kryształów lodu. W osoczu pływają pasma nierozpuszczonego białka, co świadczy, że otrzymuje się precypitat II. Pojemnik z osoczem zawierającym precypitat poddaje się wirowaniu z szybkością 2300 x g w ciągu 13 minut w temperaturze +4°C.

Po odwirowaniu pojemnik z osoczem umieszcza się w prasie ręcznej i szybko oddziela się nasącz od osadu zwalniając zacisk plastikowy. Całkowicie usuwa się płyn znad osadu. W czasie preparatyki nie dopuszcza się do przeciśnięcia osadu do osocza lub do jego rozpuszczania. W przypadku wysokiej temperatury otoczenia powyżej +20°C prasę manualną schładza się do temperatury +4°C. Pojemnik z osadem - fibrynogenem przenosi się do zamrażarki.

Fibrynogen przechowuje się przez 24 miesiące w temperaturze poniżej -25°C. Otrzymany autologiczny fibrynogen w postaci zamrożonej, dla bieżącego użytkowania rozporcjowuje się w ampułkach po 4ml i przechowuje się w postaci zamrożonej.

W końcowym etapie sporządzania przeszczepu chondrocyty są trypsynizowane i płukane dwukrotnie w medium Ham'sF12 z 10% surowicą. Komórki są liczone, a żywotność ich określana barwieniem błękitem trypanu.

Następnie komórki miesza się z fibrynogenem i aprotyniną w jednej probówce a w drugiej probówce trombinę z 10% chlorkiem wapna. Fibrynogen występuje w stężeniach od 40- 115 mg/ml a trombina w stężeniach 150-600 μΐ/ml. Do specjalnej formy utworzonej z jednorazowej strzykawki nakłada się kolejno fibrynogen z komórkami i aprotyniną, a następnie dodaje się trombiny z chlorkiem wapna. Produkt do czasu zastygnięcia zaciska się z dwóch stron tłokami, tak aby jego grubość wynosiła nie więcej niż 2-3 mm. Formuje się produkt o średnicy 20 mm i grubości 2-3 mm. Na utworzenie takiego produktu potrzeba ok. 600-700 μl mieszaniny komórek w kleju tkankowym. Na 1000 μl kleju tkankowego zużywa się 5 do 10 mln namnożonych komórek. Ilość namnożonych komórek i przygotowanych produktów komórek w kleju tkankowym zależy od wielkości ubytku chrzęstnego w kolanie pacjenta. Lekarz ortopeda identyfikuje jego wielkość i określa zapotrzebowanie / wielkość - grubość przeszczepów. Gotowy przeszczep nazywa się fibrograft. Ma on postać niewielkiego płatka o żelowej konsystencji. Po przygotowaniu fibrografty pakuje się w sterylne opakowanie składające się z pojemnika transportowego sterylnie opakowanego w dwóch woreczkach.

Wszystkie czynności związane z obróbką wstępną chrząstki, dalszą hodowlą chondrocytów oraz końcowym przygotowaniem przeszczepu przeprowadza się w warunkach i z zachowaniem zasad pełnej aseptyki pod nawiewem laminarnym, w przygotowanych do hodowli komórek pomieszczeniach klasy czystości B.

Podczas drugiego zabiegu chirurg wszczepia chondrocyty w kleju tkankowym w miejsce ubytku chrząstki pacjenta. Po dokonaniu przeszczepu chondrocyty wytwarzają macierz chrzęstną, co prowadzi do odbudowy tkanki chrzęstnej w miejscu jej uszkodzenia.

WYKAZ przebadanej literatury związanej ze stanem techniki w zakresie autologicznego przeszczepu chondrocytów w kleju tkankowym

Claims (13)

1. Sposób otrzymywania autologicznego przeszczepu chondrocytów w kleju tkankowym na bazie fibrynogenu, złożony z czynności pobrania chrząstki z nieobciążonej części stawu kolanowego oraz przeważnie pobrania krwi od pacjenta, wstępnej obróbki preparatu, rozdrabniania pobranej chrząstki na małe fragmenty, oddzielenia surowicy od pobranej krwi, trawienia chrząstki, wysiewania komórek chrząstki, namnażania hodowlanych komórek chondrocytów i pasażowania namnożonych komórek oraz dalszej obróbki uzyskiwanych komórek chondrocytów, znamienny tym, że pobrany artroskopowo fragment chrząstki stawowej transportuje się w sterylnej probówce w schłodzonej soli fizjologicznej w temperaturze od +2°C do +8°C a donację krwi w temperaturze pokojowej, otrzymane fragmenty chrząstki w laboratorium hodowli komórek płucze się kilkakrotnie w pożywce hodowlanej

PL 213 865 B1 i przechowuje się w lodówce, donację krwi od pacjenta wiruje się a następnie surowicę ściąga się i zbiera się w probówce, po czym filtruje się, rozpipetowuje się do małych probówek i zamraża w temperaturze -20°C, strawioną chrząstkę przepuszcza się przez filtr nylonowy i płucze się komórki w odżywce, następnie wysiewa się w pożywce DMEM/Ham'sF12 a po osiągnięciu 80% konfluencji komórek przesiewa się je na butelkę hodowlaną i prowadzi się namnażanie w kolejnych butelkach hodowlanych, dalej przed zakończeniem hodowli chondrocytów pobiera się donację krwi, korzystnie od pacjenta, z której przygotowuje się autologiczny fibrynogen, po czym po dwukrotnym płukaniu chondrocytów w pożywce Ham'sF12 z 10% autologiczną surowicą komórki chondrocytów miesza się z fibrynogenem i aprotyniną w jednej probówce a w drugiej probówce przygotowuje się trombinę z 10% chlorkiem wapnia i w końcu w formie utworzonej z jednorazowej strzykawki nakłada się kolejno fibrynogen z komórkami chondrocytów i aprotyniną a następnie dodaje się trombiny z chlorkiem wapna i zaciska się z dwóch stron tłokami do czasu zastygnięcia przeszczepu o grubości 2-3 mm i średnicy 20 mm.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wyhodowane chondrocyty zawiesza się w autologicznym fibrynogenie, który jest składnikiem kleju tkankowego.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pobraną chrząstkę płucze się w pożywce hodowlanej Ham’sF12 wzbogaconej o gentamycynę 50 μg/ml, amfoterycynę 2 μg/ml, kwas askorbinowy.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że krew od pacjenta wiruje się przez 10 minut przy obrotach 2700 rpm, ściąga się pipetą pasterowską w postaci supernatantu i po zebraniu w probówce, dalej surowicę poddaje się filtrowaniu przez filtry strzykawkowe 0,22 mm.

5. Sposób według zastrz. 1 albo 4, znamienny tym, że autologiczną surowicę rozpipetowuje się do probówek po około 5 ml.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pobrane fragmenty chrząstki stawowej dzieli ₃ się na porcje 100 mg a następnie porcje te dzieli się na małe fragmenty - kostki 0,5 mm³ i przekłada się do dołków w płytce 24-dołkowej i do każdego dołka dodaje się 1 ml odżywki Ham’sF12 wzbogaconej o gentamycynę 50 μg/ml, amfoterycynę 2 μg/ml, kwas askorbinowy 50 μg/ml oraz dodaje się 300 U kolagenazy typu II.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiesinę trawienną pozostawia się na 6-7 godzin w inkubatorze do hodowli komórek z atmosferą CO2.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że strawioną chrząstkę, przefiltrowaną przez filtr nylonowy o wielkości porów 70 μm wiruje się w ciągu 5 minut z szybkością 1000 rpm.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że od strawionej chrząstki odrzuca się supernatant, płucze peletkę komórek w odżywce Ham'sF12 wzbogaconej o gentamycynę 50 μg/ml, amfoterycynę 2 μg/ml, kwas askorbinowy 50 μg/ml i w końcu wiruje się przy obrotach 1000 rpm.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przefiltrowane komórki wysiewa się w medium złożonym z pożywek DNEM/Ham’sF12 w stosunku 1:1, suplementowanym 15% autologiczną surowicą, gentamycyną 50 μg/ml, amfoterycyną 2 μg/ml, kwasem askorbinowym.

11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że każde przefiltrowane komórki ze 100 mg wysiewa się w jednym dołku płytki 24-dołkowej i hoduje się na pożywce DMEM Ham'sF12 o stosunku 1:1 suplementowanej 10% autologiczną surowicą, gentamycyną 50 μg/ml, amfoterycyną 2 μg/ml, kwasem askorbinowym 50 μg/ml, które miesza się do 48 godzin.

12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że donację krwi pobiera się do potrójnego worka, pobraną krew poddaje się wirowaniu w ciągu do 15 minut z szybkością 2300 x g, odwirowane osocze oddziela się od elementów komórkowych, następnie oddzielone osocze poddaje się dwukrotnemu zamrożeniu w temperaturze - 30°C i przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C a z kolei po zamrożeniu osocze poddaje się rozmrożeniu w łaźni wodnej w temperaturze +4°C, po powtórnym całkowitym rozmrożeniu osocza pojemnik osocza poddaje się wirowaniu, po czym usuwa się płyn znad osocza za pomocą prasy manualnej, którą schładza się w miarę potrzeb do temperatury +4°C a pojemnik z fibrynogenem przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C.

13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że czynności związane z obróbką wstępną chrząstki, dalszą hodowlą chondrocytów oraz końcowym przygotowaniem przeszczepu przeprowadza się w warunkach i z zachowaniem zasad pełnej aseptyki pod nawiewem laminarnym, w przygotowanych do hodowli pomieszczeniach.