PL214193B1

PL214193B1 - Zastosowanie konglutyny gamma lubinu do wytwarzania leku do leczenia cukrzycy typu II, jako czynnika terapeutycznego i hipoglikemizujacego oraz farmaceutyczne lub zywieniowe kompozycje zawierajace konglutyne gamma lubinu

Info

Publication number: PL214193B1
Application number: PL377578A
Authority: PL
Inventors: Paolo Morazzoni; Marcello Duranti
Original assignee: Indena Spa
Priority date: 2003-02-11
Filing date: 2004-02-06
Publication date: 2013-06-28
Also published as: DE602004012984D1; HK1085927A1; ITMI20030237A1; CY1108138T1; NO20053788L; IL170200A; EP1605957B1; NO333224B1; PL377578A1; PT1605957E; CA2515607A1; DK1605957T3; EP1605957A1; CN1747739B; KR20110033312A; WO2004071521A1; KR20050106415A; CN1747739A; RU2339393C2; NO20053788D0

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie konglutyny gamma łubinu do wytwarzania leku do leczenia cukrzycy typu II. Przedmiotem wynalazku są również farmaceutyczne lub żywieniowe kompozycje zawierające konglutynę gamma łubinu i jej zastosowanie jako czynnika terapeutycznego i hipoglikemizującego.

Łubin (Lupinus albus), roślina jednoroczna, należąca do klasy roślin strączkowych, był uprawiany od czasów antycznych na obszarze Morza Śródziemnego i na Bliskim Wschodzie ze względu na jego nasiona, które są stosowane zarówno w celach żywieniowych (dzięki znacznej zawartości białka), jak i w medycynie konwencjonalnej jako środek przeciwko robakom i pasożytom.

Nasiona łubinu zawierają toksyczne pierścieniowe chinolizydynowe alkaloidy, takie jak lupanina, 13-oksy-lupanina, multiflorina i pochodne oraz metylo-albin, które są znane z tego, że wywierają działanie depresyjne i paraliżujące na ośrodkowy układ nerwowy. Alkaloidy, które są odpowiedzialne za gorzki smak nasion łubinu i występują w dużych ilościach w nasionach dzikiego łubinu, ale w niewielkiej ilości w tak zwanym słodkim łubinie (Lupinus albus), mogą zostać usunięte przez macerację w wodzie.

Przeważającą frakcją białek w nasionach łubinu są globuliny, które stanowią 87% całości. Frakcja ta składa się z białek nierozpuszczalnych w wodzie, które są rozpuszczalne w rozcieńczonych roztworach soli (Duranti i wsp. Phytochemistry, 20, 2071 - 2075, 1981). Konglutyna gamma stanowi około 6% wszystkich globulin. Pozorna masa cząsteczkowa białka, określona przez filtrację na żelu, wynosi około 199000 Da (Duranti i wsp. in: Lectins: Biology, Biochemistry, Clinical-Biochemistry-Vol. 11 (Van Driesche E, Rouge P, Beeckams S, Bog-Hansen TC eds.) 1997, Textop Publ., Hellerup, Denmark, str. 881 - 85, 1997). Konglutyna gamma składa się z monomeru o pozornej masie cząsteczkowej 47000 Da. Redukcja monomeru wykazuje, że składa się on z dwóch łańcuchów polipeptydowych, o pozornej masie cząsteczkowej odpowiednio 30000 Da i 17000 Da, połączonych mostkami dwusiarczkowymi (Restani i wsp. Phytochemistry, 20, 2077 - 2083, 1981).

Dla konglutyny gamma łubinu zasugerowano strukturę tetrameryczną, w oparciu o wartości masy cząsteczkowej otrzymane w warunkach natywnych i w warunkach denaturacji. Lekka podjednostka konglutyny gamma jest pozbawiona związanych kowalencyjnie węglowodanów, natomiast ciężka podjednostka jest glikozylowana.

Kompozycja aminokwasów konglutyny gamma różni się znacząco od większości zapasowych białek łubinu (Restani i wsp. 1981, supra). W rzeczywistości, konglutyna gamma zawiera dużą ilość aminokwasów siarczanowych i dość dużą ilość lizyny, treoniny oraz tryptofanu i jest bardzo odporna na proteolizę zarówno przez endogenne jak i egzogenne proteazy (Duranti, Narhung, 30, 271 - 274, 1986).

Wiedza na temat sekwencji aminokwasów w tym białku (Scarafoni i wsp., Biochim. Biophys. Acta 1519, 147 - 151, 2001) pozwala wykluczyć jakąkolwiek homologię sekwencji do białek zapasowych, białek katalitycznych lub strukturalnych, również z innych źródeł. Konglutyna gamma wykazuje homologię lub podobieństwa do innych białek, takich jak białko BG7S soi (70% homologia) (Kagawa i wsp., Febs Letters, 226, 145 - 149, 1987; Komatsu i wsp., Biosci. Biotech. Biochem. 58, 1705 - 1706, 1994) i EDGP, glikoproteina z nasion marchwi (homologia 58%) (Satoh i wsp., Planta, 188, 432 - 438, 1992), których funkcje muszą jeszcze zostać wyjaśnione.

Stosowanie całkowitego ekstraktu z łubinu jako środka wywołującego hipoglikemię zostało opisane przez Horvatha (J. Pharmacol. (Amer.), 38, 303, 1930), który zaproponował ten ekstrakt, jako substytut insuliny w łagodnej do umiarkowanej cukrzycy. Następnie, Clementi i Torrisi (Boli. Soc. It. Biol. Sper., 9, 1004, 1935 e Arch. Fisiol., 34, 290, 1935) zidentyfikowali aktywny, hipoglikemizujący składnik w alkaloidzie lupanina. Jednakże, jego efekt był krótkotrwały.

Ostatnio, opisano również (Mario Villaroel i wsp., Archivos Latinoamericanos de Nutrición, Vol. 46, N. 3, 1996, str. 234 - 237) hipoglikemizujące działanie mączki łubinu i zasugerowano stosowanie dżemu ze śliwek zawierającego mączkę łubinu, jako dietetycznego pokarmu dla diabetyków.

Jeśli chodzi o konglutynę gamma, Duranti i wsp., (Phytochem. 56(6), 529 - 533, 2001), opisali jej zdolność do wchodzenia w reakcję z różnymi metalami. W obojętnym pH, konglutyna gamma ma najwyższe powinowactwo do jonów Zn²⁺. Ponadto konglutyna gamma jest wiązana na kolumnie w chromatografii powinowactwa z Zn²⁺ i Ni²⁺; związane białko może być eluowane za pomocą buforujących odczynników w pH poniżej 6, lub zawierających EDTA lub imidazol. Krzywe retencji konglutyny

PL 214 193 Β1 gamma w kolumnie powinowactwa z jonami metalu są zgodne z krzywymi miareczkowania bocznej grupy histydynowej (pKa=6).

Jednakże stosowanie konglutyny gamma w leczeniu cukrzycy typu II, do dziś nie zostało ujawnione.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie konglutyny gamma łubinu do wytwarzania leku do leczenia cukrzycy typu II.

Korzystnie stosuje się mieszaninę białek łubinu lub ekstrakt zawierający konglutynę gamma łubinu.

Przedmiotem wynalazku są również farmaceutyczne lub żywieniowe kompozycje zawierające konglutynę gamma łubinu, jako składnik aktywny.

Korzystnie farmaceutyczne lub żywieniowe kompozycje zawierają mieszaninę białek łubinu lub ekstrakt zawierający konglutynę gamma łubinu.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie konglutyny gamma łubinu, jako czynnika terapeutycznego oraz jako czynnika hipoglikemizującego.

Stwierdzono, że konglutyna gamma łubinu, jak również białka wykazujące homologię wyższą niż 50% z konglutyną gamma łubinu mają znaczące działanie hipoglikemizujące.

Przykłady znanych białek wykazujących homologię wyższą niż 50% z konglutyną gamma łubinu, obejmują białko BG7S soi (homologia 70%) (Kagawa i wsp., Febs Letters, 226, 145 - 149, 1987; Komatsu i wsp., Biosci. Biotech. Biochem. 58, 1705 - 1706, 1994) i EDGP (homologia 58%) (Satoh i wsp., Planta, 188, 432 - 438, 1992).

Konglutyna gamma i białka homologiczne wykazały również bardzo silną redukcję krzywych w osoczu po podaniu glukozy szczurom.

Konglutyna gamma może być otrzymywana zgodnie z procesem przedstawionym na poniższym rysunku 3.

Zgodnie z tym procesem, łubin jest rozkruszany, nasiona są wyłuskiwane i tworzone są płatki, z których usuwa się następnie olej przez ekstrakcję rozpuszczalnikami. Następnie, pozbawione oleju płatki są poddawane procesowi ekstrakcji A w warunkach kwasowych z otrzymaniem rafinatu A i kwasowego ekstraktu A, które następnie poddaje się dalszym obróbkom.

Wychodząc z rafinatu A przeprowadza się następujące etapy:

B) dwie kolejne ekstrakcje rafinatu A w lekko zasadowych warunkach z otrzymaniem rafinatu B (który jest odrzucany) i ekstraktu B;

C) wytrącanie białek z ekstraktu B przez traktowanie kwasami;

D) frakcjonowanie białek, eliminacja białek stałych i klarowanie supernatantu (SP), który jest używany w późniejszym etapie.

W tym samym czasie, zaczynając od kwasowego ekstraktu A, uzyskanego w wyniku procesu kwasowej ekstrakcji A, przeprowadza się następujące etapy:

E) klarowanie ekstraktu A z otrzymaniem klarowanego ekstraktu (AEP);

F1) ultrafiltracja AEP z otrzymaniem retentatu F1;

F2) diafiltrację mieszaniny otrzymanej przez połączenie SP i retentatu F1 z otrzymaniem retentatu DFP i przesączu F2 (który jest odrzucany);

G) pasteryzację i suszenie przez rozpylanie DFP z otrzymaniem NCGP (natywna konglutyna gamma).

Wyniki badań farmakologicznych przeprowadzonych z konglutyną gamma są następujące.

Hipoglikemizującą aktywność konglutyny gamma łubinu w porównaniu do metforminy (wzorzec porównawczy) badano na szczurach.

Przykład 1

Stosowano samce szczurów, szczep CD, o wadze początkowej 275 - 300 g. Zwierzęta umieszczano w klatkach makrolon, w warunkach z automatyczną kontrolą światła (cykle po 12 godzin światła/12 godzin ciemności), temperatury (21 ± 1°C) i wilgotności (60 ± 5%).

Stosowano konglutynę gamma łubinu przygotowaną jak podano w Przykładzie 2. 100 szczurom (podzielonym na 5 grup po 30 zwierząt w każdej) podano wstępnie (czas: 30 min.):

Grupa 1: nośnik (1% karboksymetyloceluloza [CMC]; 2 ml/kg doustnie)

Grupa 2: konglutyna gamma łubinu (50 mg/kg doustnie w 1% CMC)

Grupa 3: konglutyna gamma łubinu (100 mg/kg doustnie w 1 % CMC)

Grupa 4: konglutyna gamma łubinu (200 mg/kg doustnie w 1% CMC)

Grupa 5: metformina (50 mg/kg doustnie w 1% CMC)

PL214 193 Β1

Aby podnieść poziom glukozy w osoczu, następnie wszystkim szczurom (czas: 0 min.) podawano doustnie glukozę (2 g/kg).

Tuż przed podaniem glukozy (czas: 0 min.) i 30, 60 i 90 min. po podaniu glukozy, wszystkie zwierzęta (n= 5 szczurów dla każdego punktu czasowego) znieczulano za pomocą tiopentalu sodowego (50 mg/kg dootrzewnowo) i pobierano 5 ml krwi z żyły głównej. Próbki krwi pobierano do strzykawek zawierających EDTA, jako antykoagulant (7,5 mM) i natychmiast poddawano wirowaniu (2000 g x 10 min. w 4°C), aby otrzymać osocze potrzebne do ilościowego oznaczenia glukozy metodą enzymatyczną.

Oznaczanie ilościowe glukozy w osoczu szczurów przeprowadzano w trzech egzemplarzach stosując test enzymatyczny (absorbancja przy 505 nm), a stężenie glukozy wyrażono w mg/dl.

Bardziej szczegółowo, zastosowano zestaw enzymatyczny (Glukose-Trinder z Sigma Aldrich, kat. 315 - 500), zawierający wszystkie odczynniki potrzebne dla reakcji Trinder (metoda oksydazy glukozy).

Ponadto, zarówno kalibrację spektrofotometru, jak i jakość odczytu różnych próbek osocza potwierdzano, przy użyciu standardowych odczynników z Sigma-Aldrich (Kalibrator, kat. A-2539; ACCUTROL Prawidłowy, kat. A-2034; ACCUTROL Nieprawidłowy, kat. A-3034). Stosowano konglutynę gamma łubinu z przykładu 2. Metforminę, karboksymetylocelulozę i różnorodne zestawy do ilościowego oznaczania glukozy, do kontroli jakości i do kalibracji aparatury pomiarowej zakupiono z SigmaAldrich (Mediolan, Włochy).

Wszystkie wartości przedstawione w tabelach są wyrażone, jako wartość średnia ± odchylenie standardowe (M.S.E.). Przeprowadzono analizę statystyczną dla porównania wartości powierzchni pod krzywą otrzymanych dla Grupy 1 (szczury, którym podawano nośnik) i Grupy 2, 3, 4 i 5 (zwierzęta, którym podawano konglutynę gamma łubinu w różnych stężeniach lub metforminę) (Rys. 2), najpierw za pomocą analizy wariancji (jednoczynnikowej) i później za pomocą testu Dunnetta (dwustronny) z wielokrotnym porównaniem. Różnice były statystycznie istotne przy P<0,05.

Wyniki

Rysunki 1 i 2 podsumowują wyniki eksperymentu.

Doustne podanie 2 g/kg glukozy podnosiło poziomy glukozy w osoczu 2,7 razy (85 ± 6 przy 232 ± 18 mg/dl; P<0,001) u szczurów kontrolnych (z podanym nośnikiem). Ten wzrost osiągał maksymalną wartość 30 min. po podaniu glukozy i następnie stopniowo obniżał się w czasie 90 min. (Rys. 1).

Wstępne podawanie szczurom konglutyny gamma łubinu, 30 min. przed glukozą, doustnie, w dawkach 50, 100 i 200 mg/kg wywoływało znaczne, zależne od dawki, zmniejszenie wzrostu poziomu glukozy w osoczu (Rys. 1 i 2).

Bardziej szczegółowo, biorąc pod uwagę przedstawione na Rys. 2 wartości powierzchni pod krzywą (AUC), efekt otrzymany przy podaniu doustnie 200 mg/kg konglutyny gamma łubinu (AUC = 2090 ± 238) był porównywalny i nie różnił się znacząco od tego obserwowanego w Grupie 5 (zwierzętom wstępnie podawano doustnie 50 mg/kg metforminy) (AUC = 1565 ± 201).

Otrzymane wyniki jasno wykazują, że wstępne podanie szczurom konglutyny gamma łubinu znacząco zmniejsza wzrost poziomu glukozy w osoczu, spowodowany doustnym podaniem glukozy w dawce 2 g/kg.

Przykład 2

Przygotowanie płatków łubinu

Około 4500 kg łubinu rozkruszono i łuski oddzielono od nasion; w ten sposób otrzymano 3440 kg nasion i 1060 kg łusek. Rozkruszone nasiona były przeprowadzane w postać płatków w młynie walcowym, którego walce utrzymywano w temperaturze poniżej 40°C, aby zapobiec denaturacji białka. Otrzymano żółte płatki w kształcie dysku, o gęstości nasypowej od 300 do 330 kg/m³.

Ekstrakcja oleju

Porcję 500 kg płatków z etapu a) wprowadzono do 2 m wysokości rurki pionowej o średnicy 900 mm i odolejono przez perkolację heksanem. Procedurę ekstrakcji powtórzono 4 razy i składała się ona z:

1) perkolacji białego heksanu do momentu, aż w naczyniu odzyskano 500 I mieszaniny,

2) recyrkulacji mieszaniny przez 15 min.

3) odprowadzania porcji cieczy przez 15 min. w etapach od 1 do 3 i przez 30 min. w końcowym etapie ekstrakcji.

PL 214 193 Β1

Heksan ciągle obecny w odolejonych płatkach usuwano pod próżnią (250 mbar), z mieszaniem przez 150 min. tak, że końcowa zawartość heksanu wynosiła 250 ppm, co zostało następnie zmniejszone do 50 ppm przez przedmuchiwanie powietrzem. Otrzymano około 430 kg białych płatków.

A) Ekstrakcja białek w warunkach kwasowych

Zawieszono 185 kg białych płatków w 1800 ml zimnej, zakwaszonej wody o pH 4,5 - 4,8 i w temperaturze od 13,5 do 15,2°C z mieszaniem mechanicznym ustalonym na 55 obrotów na minutę i ekstrahowano przez 1 godzinę. Zastosowano około 23,6 I 3M HCI, aby podczas ekstrakcji utrzymać kwaśne pH. 385 kg rafinatu A i 1600 I kwaśnego ekstraktu A otrzymano za pomocą wirowania.

B) Oddzielanie ekstraktu białka od rafinatu w lekko zasadowych warunkach

W pierwszym etapie, 385 kg rafinatu A ekstrahowano za pomocą 900 I wody o pH 7,2 - 7,4 w temperaturze 28,2 do 31,5°C z mechanicznym mieszaniem przy 60 obrotach na minutę przez 1 godzinę. Do roztworu dodano 50 ml czynnika przeciwko pienieniu się - Struktol SB 2010. Aby podczas ekstrakcji utrzymać zasadowe pH, zastosowano około 19,6 I 3M NaOH.

Oddzielono około 945 I ekstraktu białkowego od rafinatu za pomocą odwirowania.

W drugim etapie, rafinat otrzymany przez odwirowanie ekstrahowano 540 I wody w pH 7,3 - 7,4 w temperaturze 29,0 do 32,0°C przez 15 min. Zastosowano 0,3 I 3M NaOH, aby utrzymać zasadowe pH podczas ekstrakcji. Otrzymano około 595 I ekstraktu białkowego II i 242 kg rafinatu B.

Połączono białkowe ekstrakty I i II, z otrzymaniem 1450 I białkowego ekstraktu B.

C) Wytrącanie białek z białkowego ekstraktu w warunkach kwasowych

Do ekstraktu białkowego B (1540 I) dodano 16 I 3M HCI, aby doprowadzić pH do 4,6 - 4,5 i 50 ml powyższego czynnika przeciwko pienieniu, stosując mechaniczne mieszanie przy 85 obrotach na minutę. Białka wytrąciły się w punkcie izoelektrycznym (pH 4,5).

D) Oddzielenie wytrąconych białek od supernatantu

Oddzielono dyspersję białek z etapu C (około 1550 I), o zawartości części stałych w zakresie od 11,0 do 11,5% obj. za pomocą separatora w kształcie dysku przy 6830 obrotach na minutę. Zawartość części stałych w otrzymanym klarownym ekstrakcie wynosiła od 0,0 do 0,1% obj. Oddzielono około 1330 I klarownego supernatantu (SP) i 213 I osadu. Zawartość suchej substancji w klarownym supernatancie wynosiła 0,4 - 0,5%, a sucha substancja zawierała 70% wszystkich białek.

E) Klarowanie kwasowego ekstraktu A

Klarowano kwasowy ekstrakt A (1600 I) z kwasowej ekstrakcji A, w którym zawartość suchej substancji była w zakresie 2 do 2,5% obj., za pomocą separatora w kształcie dysku przy 7500 obrotach na minutę. Zawartość części stałych w otrzymanym klarownym ekstrakcie wynosiła od 0,1 do 0,15% obj. Oddzielono około 1500 I klarownego ekstraktu (AEP) i 100 I osadu. Zawartość części stałych w wyklarowanym ekstrakcie (AEP) wynosiła 2,2 - 2,5%, a sucha substancja zawierała 25% wszystkich białek.

F1) Ultrafiltracja wyklarowanego ekstraktu (AEP) pH 700 I AEP dostosowano od pH 4,5 do pH 6,0 - 7,0 i zatężono na membranie do ultrafiltracji pod ciśnieniem 3 barów i w 40°C, aż końcową objętość zmniejszono o współczynnik 10 w porównaniu z początkową objętością.

Zawartość suchej masy w retentacie F1 wynosiła około 7%, a sucha substancja zawierała 50% wszystkich białek. Przesącz F1 został odrzucony.

F2) Diafiltracja SP i AEP

233 I wyklarowanego supernatantu SP z etapu D) dodano krok po kroku do retentatu F1 i mieszaninę ponownie przepuszczano przez membranę, aż jej objętość została zredukowana do tej, jaką miał początkowy retentat. Po końcowym etapie rozcieńczania, recyrkulacja była kontynuowana aż zawartość suchej substancji w diafiltrowanym retentacie (DFP) osiągnęła maksymalny poziom, który wahał się od 14,5 do 15,0%, a sucha substancja zawierała około 84% wszystkich białek. Przesącz F2 został odrzucony.

G) Pasteryzacja i suszenie za pomocą rozpylania w celu otrzymania NCGP

Diafiltrowany retentat (DFP) dostosowano od pH 6,5 do około 5,2, ogrzano do 40 - 65°C w wymienniku ciepła składającym się z osłoniętej rurki o wewnętrznej średnicy 6 mm i wprowadzono do suszarki rozpyłowej. Temperaturę na wlocie powietrza doprowadzono do 195°C i prędkość zasilania DFP wynosiła 8 do 10 I na godzinę. Suchy proszek oddzielono od strumienia powietrza za pomocą separatora cyklonowego. Zawartość suchej masy wahała się od 94,0 do 95,2%. Z 40 I DFP otrzymano około 45 kg natywnej konglutyny gamma (NCGP).

PL214 193 Β1

Konglutyna gamma wytworzona zgodnie z tym procesem zawiera 84,7% białek, 0,6% oleju i 6,4% suchej masy. Sucha masa zawiera obliczoną ilość 8,3% wolnych od azotu substancji (NFE).

Indeks rozpuszczalności azotu NCGP przy pH 7 w 1% wodnym roztworze wynosi 72,5%.

Konglutyna gamma może być podawana doustnie, sama albo w kombinacji z innymi substancjami o przydatnym lub komplementarnym działaniu, w postaci tabletek, kapsułek, granulek, proszku, syropu i tym podobnej. Farmaceutyczny preparat może być wytworzony zgodnie z konwencjonalnymi procedurami, z zastosowaniem składników znanych w tej dziedzinie, takich jak zarobki, ligandy, substancje rozdrabniające, smary, środki stabilizujące i podobne. Dawkowanie może się różnić, zależnie od objawów, wagi pacjenta, ciężkości choroby i podobnych czynników. W przypadku dorosłego człowieka, dzienna dawka konglutyny gamma łubinu będzie w zakresie od 150 do 750 mg, korzystnie od 50 do 250 przy podawaniu pojedynczej dawki lub wielokrotnych dawek, na przykład jeden do trzech razy dziennie.

Claims

1. Zastosowanie konglutyny gamma łubinu do wytwarzania leku do leczenia cukrzycy typu II.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosuje się mieszaninę białek łubinu lub ekstrakt zawierający konglutynę gamma łubinu.

3. Farmaceutyczne lub żywieniowe kompozycje, znamienne tym, że zawierają konglutynę gamma łubinu, jako składnik aktywny.

4. Farmaceutyczne lub żywieniowe kompozycje, według zastrz. 3, znamienne tym, że zawierają mieszaninę białek łubinu lub ekstrakt zawierający konglutynę gamma łubinu.

5. Zastosowanie konglutyny gamma łubinu, jako czynnika terapeutycznego.

6. Zastosowanie konglutyny gamma łubinu, jako czynnika hipoglikemizującego.