PL214827B1 - Sposób otrzymywania immobilizowanych biokatalizatorów - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania immobilizowanych biokatalizatorów z użyciem celulozy bakteryjnej, która stanowi składnik nośnika do immobilizowania drożdży Saccharomyces cerevisiae. Immobilizowany biopreparat wykorzystywany jest w procesie hydrolizy sacharozy.

Możliwości wykorzystania celulozy bakteryjnej (BC) w medycynie, szczególnie jako materiału opatrunkowego oraz sztucznych organów, stwarzają takie jej właściwości, jak wysoka czystość, wytrzymałość mechaniczna, zdolność chłonięcia cieczy, bardzo dobra zgodność z żywą tkanką, a w szczególności z krwią. Właściwie oczyszczone błony celulozowe, wytworzone metodą hodowli stacjonarnej, mogą stanowić gotowy materiał opatrunkowy spełniający standardy przypisane nowoczesnym materiałom opatrunkowym [Kudlicka K. (1989) Terminalne kompleksy syntazy celulozowej. Postępy biologii komórki 16(2), 197-212, Fontana J. D., Franco V. C., de Sousa S. J., Lyra I. N., de Sousa A. M. (1991) Nature of plant stimulators in the production of Acetobacter xylinum (tea fungus) biofilm used in skin therapy. Applied Biochemistry and Biotechnology 28/29, 341-351]. Jest on biokompatybilny, porowaty, elastyczny, łatwy w zastosowaniu i przechowywaniu, zapewnia optymalną wilgotność sprzyjającą gojeniu się rany i może być sterylizowany termicznie. Błony celulozowe są również znakomitymi nośnikami służącymi do immobilizacji różnorodnych substancji bioaktywnych, przyspieszających proces gojenia. Z uwagi na występujące ostatnio problemy i kontrowersje związane ze stosowaniem produktów pochodzenia zwierzęcego, opatrunki kolagenowe mogą zostać zastąpione właśnie opatrunkami celulozowymi. Jak dotychczas zanotowano kilka doniesień mówiących o pozytywnych rezultatach badań klinicznych z wykorzystaniem BC jako opatrunku do leczenia ran oparzeniowych, owrzodzeń troficznych lub też jako biomateriału przy transplantacji skóry [Bungay H., Serafica G. (1997) Production of microbial cellulose using a rotating disc film bioreactor. Patent WO 97/05271; Kamide K., Matsuda Y., Iijima H., Okajima K. (1990) Effect of culture conditions of acetic acid bacteria on cellulose biosynthesis. British Polymer Journal 22, 167-171, Ross P., Weinhouse H., Aloni Y., Michaeli D., Ohana P., Mayer R., Braun S., de Vroom E., van der Marel G. A., van Boom J. H., Benziman M. (1987) Regulation of cellulose synthesis in Acetobacter xylinum by cyclic diguanylic acid. Nature 325, 279-281].

W opisie patentowym JP 54041321 przedstawiony jest sposób otrzymania opatrunku na choroby skórne, o właściwościach zapewniających wysoki stopień miejscowego przylegania i długotrwałe działanie, z wykorzystaniem hydroksypropylocelulozy, soli kwasu poliakrylowego oraz ich składnika aktywnego.

W opisie patentowym EP 0918548 przedstawione jest rozwiązanie dotyczące zastosowania utlenionej celulozy, korzystnie regenerowanej, utlenionej celulozy (ORC) oraz ich kompleksów z białkami takimi jak kolagen, w celu zapewnienia opatrunku ochronnego przy chronicznych ranach.

Opis patentowy WO 8602095 dotyczy sposobu wytwarzania filmu celulozowego jako sztucznej skóry stosowanej przy przeszczepach. Sposób ten obejmuje przygotowanie medium hodowlanego, w którym pożywkę stanowią źródło azotu oraz węglowodany, zaszczepienie hodowli bakteriami Acetobacter xylinum, inkubację hodowli w temperaturze, która zapewnia aktywność bakterii w czasie koniecznym do wytworzenia wymaganego filmu, usunięcie utworzonego filmu z pożywki w celu dehydratacji w stanie rozciągniętym.

Z opisów patentowych US 4788146 i US 4588400 jest znane zastosowanie błon celulozowych jako opatrunków do ran i skaleczeń, a także ran oparzeniowych. Błony te wytwarzane w hodowli Acetobacter xylinum, mają grubość 0,1-15 mm lub więcej i po usunięciu z nich pożywki, w stanie uwodnionym są sterylizowane.

Właściwości BC otwierają wiele możliwości jej praktycznego wykorzystania, uzasadnionych ekonomicznie, przy uwzględnieniu udoskonalenia metod hodowli i oparciu produkcji na ulepszonych szczepach Acetobacter, wykorzystujących tanie i łatwo dostępne surowce.

Celuloza jest nierozgałęzionym homopolisacharydem, zbudowanym z jednostek β-Dglukopiranozy, połączonych ze sobą wiązaniami β-1,4-glikozydowymi. Celuloza bakteryjna (BC) należy do wysokokrystalicznych celuloz, bogatych we frakcję !_α [Wong H. C., Fear A. L., Calhoon R. D., Eichinger G. H., Mayer R., Amikam D., Benziman M., Gelfand D. H., Meade J. H., Emerick A. W., Bruner R., Ben-Bassat A., Tal R. (1990) Genetic organization of the cellulose synthase operon in Acetobacter xylinum. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87, 8130-8134, Iguchi M., Yamanaka S., Budhiono A. (2000) Bacterial cellulose - a masterpiece of nature's arts. Journal of Materials Science 35, 261-270]. Syntetyzowane przez bakterie łańcuchy glukanowe łączą się i formują elementarne subfibryle celulozowe o szerokości 1,5 nm, należące do najcieńszych naturalnie występująPL 214 827 B1 cych włókien, porównywalnych jedynie do elementarnych włókien celulozy wykrytych w kambium niektórych roślin i śluzie pigwy [Masaoka S., Ohe T., Sakota N. (1993) Production of cellulose from glucose by Acetobacter xylinum. Journal of Fermentation and Bioengineering 75, 18-22].

BC jest syntetyzowana przez kilka rodzajów bakterii, spośród których do najlepiej poznanych należą szczepy bakterii octowych Acetobacter.

Synteza celulozy I przez Acetobacter xylinum, jak również przez inne organizmy wykazujące tę zdolność, obejmuje przynajmniej dwa etapy: 1) polimeryzację cząsteczek glukozy w liniowy β-1,4 glukan, 2) łączenie i krystalizację indywidualnych łańcuchów polimerowych w większe jednostki strukturalne.

Produkcja BC na skalę przemysłową jest jeszcze niewielka, głównie ze względu na trudności związane z wyselekcjonowaniem wysoko aktywnych szczepów, zdolnych do biosyntezy celulozy w warunkach hodowli wgłębnej i pozbawionych możliwości metabolizowania glukozy do kwasów glukonowych, a także ze względu na dość wysokie koszty składników podłoża hodowlanego.

Proces biosyntezy BC może być prowadzony zarówno w warunkach hodowli stacjonarnej jak i hodowli wgłębnej, która zapewnia pełną jego kontrolę. Wybór metody hodowli zależy ściśle od dalszego przeznaczenia syntetyzowanego polimeru [Krystynowicz A., Czaja W., Pomorski L., Kołodziejczyk M. and Bielecki S. (2000) The evaluation of usefulness of microbial cellulose as wound dressing material. 14^th Forum for Applied Biotechnology, Gent, Belgium, Proceedings Part I, Mededelingen Van De Faculteit Landbouwwetenschappen, Rijksuniversiteit Gent 65(3a), 213-220], Kontrola procesu biosyntezy BC w hodowli stacjonarnej jest znacznie utrudniona ze względu na gromadzącą się na powierzchni pożywki błonę, która ogranicza dostęp do cieczy hodowlanej. Synteza BC w warunkach stacjonarnych może być prowadzona przy wykorzystaniu jednoetapowej (pożywka szczepiona 5-10% inokulum) lub dwuetapowej procedury [Bielecki S., Krystynowicz A., Turkiewicz M., Kalinowska H. (2001) Bacterial cellulose. Biopolymers Polysaccharides I (Steinbuchel, Ed.) Munster, Germany, 37-90], Ta ostania obejmuje etap hodowli wgłębnej w celu namnożenia biomasy, a następnie kontynuację procesu w warunkach stacjonarnych [Ramana K. V., Tomar A., Singh L. (2000) Effect of various carbon and nitrogen sources on cellulose synthesis by Acetobacter xylinum. World Journal of Microbiology & Biotechnology 16, 245-248].

Wytwarzanie celulozy w dużej skali, w hodowlach z ciągłym mieszaniem, napotyka na szereg trudności, z których największą jest niestabilność kultury przejawiająca się tendencją do spontanicznej mutacji w kierunku szczepów nieaktywnych, tak zwanych Cel^- [Seto H., Tsuchida T., Yoshinaga F. (1997) Manufacture of bacterial cellulose by mixed culture of microorganisms. PN JP 97-21905], Szczep niestabilny może być z powodzeniem stosowany w hodowlach stacjonarnych, w których wzrost bakterii i synteza celulozy przebiega na granicy faz pożywka-powietrze. W warunkach hodowli wstrząsanej, w której wzrost bakterii Cel⁺ jest ograniczony szybkością rozpuszczania się tlenu oraz agregacją komórek przez syntetyzowaną celulozę (co utrudnia dostęp tlenu), faworyzowane są komórki nieaktywne Cel^-.

BC może być również produkowana w warunkach ciągłej hodowli stacjonarnej [Sattler K., Fiedler S. (1990) Production and application of bacterial cellulose. Zentralblatt fur Bakteriologie, Mikrobiologie, und Hygiene 145, 247-252], Acetobacter xylinum jest wówczas hodowany na tacach, na podłożu Schramma-Hestrina (SH) i po 2-3 dniach procesu wytworzona na powierzchni podłoża błona celulozowa jest w sposób ciągły wprowadzana do kąpieli w roztworze sodowego siarczanu dodecylu (SDS) w celu inaktywacji komórek, a następnie nawijana na specjalny wałek. Proces taki prowadzony był przez kilka tygodni, przy prędkości nawijania 35 mm/h i przy okresowym uzupełnianiu podłoża (co 8-12 h), w celu utrzymania optymalnych warunków hodowli.

Wyk o rzystując tę metodę uzyskano pas celulozowy o długości 5 m, co wskazuje na potencjalną możliwość jej wykorzystania na skalę przemysłową.

Innym, opisywanym sposobem syntezy celulozy jest hodowla bakterii Acetobacter w specjalnych bioreaktorach poziomych, wyposażonych w zestaw obracających się wałków, na których osadzał się wytwarzany polimer. W takich warunkach obserwowano przyspieszony wzrost komórek oraz prawie 2-krotny wzrost wydajności procesu biosyntezy celulozy w stosunku do hodowli kontrolnej, prowadzonej w warunkach stacjonarnych [Saxena I. M., Lin F. C., Brown Jr R. M. (1990) Cloning and sequencing of the cellulose synthase catalytic subunit gene of Acetobacter xylinum. Plant Molecular Biology 15, 673-683].

Z opisu patentowego PL 171952 i z opisu zgłoszenia patentowego P 317139 jest znany sposób wytwarzania BC w postaci błon na drodze hodowli powierzchniowej bakterii Acetobacter xylinum na podłożu opartym na glukozie. Stosowany w tym sposobie szczep bakterii Acetobacter xylinum P23 wykazuje optymalny wzrost w temperaturze 28-30°C przy pH 4,0-6,5. Na podłożach stałych zawierających glukozę, ekstrakt drożdżowy, pepton, agar tworzy galaretowate kolonie, zaś w hodowli na pod4

PL 214 827 B1 łożach płynnych tworzy śluzowatą, zwartą błonkę. Szczep Acetobacter xylinum P23 inkubuje się na podłożu płynnym. Sposobem według wynalazku otrzymuje się błony celulozowe o zawartości α-celulozy 90-97%, które mogą służyć jako środek opatrunkowy w chirurgii i dermatologii.

Z opisów patentowych US 5975095, US 5962278 i US 6110712 jest znany sposób syntezy celulozy przez bakterie Acetobacter xylinum subsp. nonaacetoxidans, nie utleniających lub bardzo słabo utleniających octany i mleczany.

W opisach patentowych US 6429002, US 6329192, US 5144021, US 5079162 i US 4863565 przedstawiono sposób wytwarzania BC w warunkach wstrząsania, w których w czasie 70 h uzyskano przynajmniej 0,1 g/l w czasie 1 godziny. Wytworzona celuloza była silnie usieciowana i wykazywała dużą wytrzymałość.

Z opisu patentowego US 5955325 jest znane wytwarzanie celulozy mikrobiologicznej o wysokiej zawartości wody w fermentorze dyskowym.

Opis patentowy EP 0792935 przedstawia proces wytwarzania celulozy w fermentorze, przy częściowym ciśnieniu CO2 w fazie gazowej w zbiorniku fermentacyjnym (10,13 kPa lub mniejszym).

Znany jest sposób otrzymywania BC w formie błon, w drodze hodowli bakterii Acetobacter xylinum, polegający na zaszczepieniu podłoża hodowlanego o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,5 części MgSO4 x7H2O, 2,7 części Na2HPO4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu, do 1000 części wody destylowanej, zawiesiną bakterii przechowywanych na podłożu o takim samym składzie w czasie nie dłuższym niż 7 dni, o gęstości 5x10⁷ jtk/ml (jtk/ml - liczba jednostek tworzących kolonie w jednym mililitrze), użytą w ilości 5% v/v i prowadzeniu hodowli produkcyjnej w bioreaktorach, w wyniku której otrzymuje się błony celulozowe, które poddaje się oczyszczeniu polegającemu na płukaniu w wodzie, gotowaniu w 1%-owym NaOH w czasie 0,5-2 godzin, ponownym płukaniu w wodzie do całkowitego usunięcia NaOH, działaniu 1%-owym kwasem octowym, przemyciu wodą i w końcu wodą destylowaną, odwodnieniu i ewentualnie sterylizacji [Krystynowicz A., Czaja W., Pomorski L., Kołodziejczyk M., Bielecki S. (2000) The evaluation of usefulness of microbial cellulose as wound dressing material. 14^th Forum for Applied Biotechnology, Gent, Belgium, Proceedings Part I,

Mededelingen Van De Faculteit Landbouwwetenschappen, Rijksuniversiteit Gent 65(3a), 213-220],

Pomimo opisanych powyżej sposobów otrzymywania celulozy bakteryjnej i jej zastosowania jako materiałów opatrunkowych, istnieje ciągła potrzeba doskonalenia procesów technologicznych, doskonalenia właściwości materiału finalnego, optymalizacji podłoża hodowlanego z uwzględnieniem aspektów ekonomicznych, co zwiększy możliwości jej zastosowania.

Znany jest sposób immobilizowania bakterii Bacillus subtilis syntetyzujących proteinazę, w którym nośnik do immobilizacji stanowi mieszanina alkoholu poliwinylowego o masie cząsteczkowej 72.000, stężeniu 10-12% i rozdrobnionej celulozy bakteryjnej w ilości 0,12 do 12%. Celuloza bakteryjna syntetyzowana jest przez wyodrębniony szczep bakterii należący do rodzaju Acetobacter [Szczesna-Antczak M., Galas E. (2001) Bacillus subtilis cells immobilised in PVA cryogels. Biomolecular Engineering 17(2), 55-63],

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie środków, które mogłyby być wykorzystane do syntezy celulozy bakteryjnej, pozyskania jej do otrzymywania materiałów opatrunkowych o określonych właściwościach, zależnie od celu wykorzystania, w tym jako nośnik dla immobilizowanych biokatalizatorów.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania immobilizowanych biokatalizatorów na nośniku z użyciem celulozy bakteryjnej charakteryzujący się tym, że na celulozie bakteryjnej immobilizuje się komórki drożdży Saccharomyces cerevisiae, którą po rozdrobnieniu w ilości 1 gram (g) suchej substancji (s. s.) na 100 ml podłoża wprowadza się do podłoża hodowlanego o składzie w częściach wagowych: 10 części sacharozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 0,5 części (NH4)2SO4, 0,7 części MgSO4x7H2O, 0,5 części KH2PO4, 0,5 części NaCl, woda destylowana do 1000 części i przy pH=4,8 przeprowadza hodowlę wstrząsaną drożdży Saccharomyees cerevisiae w czasie do 8 godzin. Po zakończeniu hodowli zawiesinę celulozy bakteryjnej wraz z zaadsorbowanymi komórkami drożdży Saccharomyees cerevisiae oddziela się od podłoża i przemywa wodą otrzymany immobilizowany biopreparat.

W odmianie drugiej według wynalazku sposób otrzymywania immobilizowanych biokatalizatorów na nośniku z użyciem celulozy bakteryjnej, charakteryzuje się tym, że na celulozie bakteryjnej, immobilizuje się drożdże Saccharomyces cerevisiae, którą po zmieleniu i homogenizowaniu przy szybkości 13.000 obrotów na minutę (revolutions per minute - rpm) w postaci wilgotnej masy dodaje w ilości 10% do 2%-owego roztworu alginianu sodu. Następnie do tak uzyskanego nośnika wprowadza się wilgotną ₃ masę drożdży Saccharomyces cerevisiae w ilości 1 gram (g) na 20 cm³ mieszaniny nośnika i po wymieszaniu dodaje się do schłodzonego roztworu chlorku wapnia (CaCl2) o stężeniu 2%, gdzie otrzymuje się

PL 214 827 B1 biokatalizator w postaci kulek. Biokatalizator przechowuje się w 2% roztworze chlorku wapnia w temperaturze 4°C w czasie 12 godz.

Korzystnie w odmianie pierwszej i w odmianie drugiej według wynalazku stosuje się celulozę bakteryjną, otrzymaną w drodze hodowli bakterii Acetobacter xylinum P30 polegającej na zaszczepieniu podłoża hodowlanego o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,5 części MgSO4x7H2O, 2,7 części Na2HPO4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu do 1000 części wody destylowanej, zawiesiną bakterii przechowywanych na podłożu o takim samym składzie w temperaturze 4°C czasie nie dłuższym niż 7 dni, o gęstości 5x10⁷ jednostek tworzących kolonie w jednym mililitrze (jtk/ml), użytą w ilości 5% v/v i przeprowadzeniu hodowli inokulum w temperaturze 30°C w czasie 2 dni, następnie wymieszaniu podłoża z otrzymanym inokulum i zaszczepieniu otrzymaną w ten sposób zawiesiną bakterii, podłoża produkcyjnego o składzie analogicznym jak podłoże do hodowli inokulum. Otrzymane inokulum stosuje się także do podłoża produkcyjnego o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 20 części namoku kukurydzianego, 2,5 części wagowych MgSO4x7H2O, 2,7 części wagowych Na2HPO4, 1,15 części wagowych kwasu cytrynowego, 10 części wagowych etanolu, do 1000 części wagowych wody destylowanej. Następnie po preinkubacji całej objętości 1 dobę w temperaturze 30°C, przelaniu do bioreaktorów w takich ilościach -1 aby stosunek powierzchni do objętości wynosił 0,7 cm^-1 i prowadzeniu hodowli produkcyjnej w warunkach stacjonarnych w czasie 7 dni, otrzymuje się błony celulozowe, które poddaje się oczyszczeniu polegającemu na płukaniu w wodzie, traktowaniu 1%-owym NaOH w temperaturze 100°C w czasie 1 godziny, ponownym płukaniu w wodzie, następnie w 1%-owym kwasie octowym, przemyciu wodą i w końcu wodą destylowaną oraz odwodnieniu i ewentualnie sterylizacji.

Sposób według wynalazku ilustrują poniższe przykłady:

Produkcja błon celulozowych z wykorzystaniem modyfikowanych podłoży hodowlanych (przykłady 1-2).

P r z y k ł a d 1.

Podłoże binokularne P1 o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,5 części MgSO4x7H2O, 2,7 części Na2HPO4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu, do 1000 części wody destylowanej, szczepiono 5% v/v zawiesiny bakterii Acetobacter 5x10⁷ jtk/ml (liczba jednostek tworzących kolonie w jednym mililitrze) przechowywanych na tymże podłożu nie dłużej niż 7 dni, w temperaturze 4°C i hodowano w czasie 2 dni w temperaturze 30°C, po czym po intensywnym mieszaniu zaszczepiono zawiesiną bakterii w ilości 5% objętości podłoża produkcyjnego o tym samym składzie i preinkubowano całą objętość jedną dobę w temperaturze 30°C, po czym przeniesiono je do bioreaktorów o wymaganej powierzchni, w takiej ilości aby stosunek S/V (po-1 wierzchnia/objętość) wynosił 0,7 cm^-1. Wytworzenie błon w tych warunkach wymagało przygotowania ₃ dm³ podłoża hodowlanego, które po zaszczepieniu i preinkubacji rozlano do bioreaktorów i prowadzono proces biosyntezy błon celulozowych w czasie 7 dni. Uformowane błony o grubości około 5 mm oczyszczano stosując płukanie w wodzie wodociągowej, następnie traktowano je 1%-owym NaOH w temperaturze 100°C w czasie 1 h, po czym ponownie płukano w wodzie wodociągowej, następnie w 1%-owym kwasie octowym, ponownie w wodzie i na końcu w wodzie destylowanej, a nadmiar wody (około 90%) usunięto stosując wyciskanie, po czym wilgotne błony pakowano do szczelnych woreczków foliowych i poddano sterylizacji radiacyjnej stosując dawkę promieniowania γ = 25 kGy.

Uzyskano około 3,5 g suchej, oczyszczonej masy celulozowej z 1 dm³ podłoża, w której zawartość białka nie przekraczała 3%.

P r z y k ł a d 2.

Inokulum otrzymanym jak w przykładzie 1 zaszczepiono sterylne podłoże produkcyjne, w którym 5 części ekstraktu drożdżowego i 5 części peptonu zastąpiono 20 częściami namoku kukurydzianego, nie zmieniając ilości pozostałych składników.

Dalej postępowano jak w przykładzie 1.

W rezultacie otrzymano o 10% więcej masy celulozowej w porównaniu z wynikiem przykładu 1.

Zastosowanie celulozy bakteryjnej do otrzymywania immobilizowanych biokatalizatorów (przykłady 3-4)

P r z y k ł a d 3.

Błonę celulozową z przykładu 2 poddano mieleniu otrzymując cząstki o średnicy 2-3 mm, które po sterylizacji (120°C, 20 min.) wprowadzono w ilości 1 g (gram) s. s. (suchej substancji) do 4-godzinnej hodowli wstrząsanej drożdży S. cerevisiae w 100 ml podłoża o składzie: 10 części sacharozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 0,5 części (NH4)2SO4, 0,7 części MgSO4x7H2O, 0,5 części

PL 214 827 B1

KH2PO4, 0,5 części NaCl, woda destylowana do 1000 części (pH=4,8) i kontynuowano hodowlę w czasie następnych 4 godzin, po czym zawiesinę celulozy wraz z zaadsorbowanymi komórkami drożdży oddzielano od podłoża i po dokładnym przemyciu wykorzystywano w procesie hydrolizy sacharozy, stosując 5%-owy roztwór sacharozy i biopreparat w stosunku wagowym do substratu równym 1:5. Czas trwania 1 cyklu wynosił 10 godzin. Ilość cykli wynosiła 10. Najwyższy stopień inwersji sacharozy, wynoszący około 97%, uzyskano w trzecim cyklu.

P r z y k ł a d 4.

Błonę celulozową otrzymaną jak w przykładzie 2 poddawano wstępnemu mieleniu, następnie cząstki o średnicy 2-3 mm homogenizowano przy szybkości 13.000 obrotów na minutę (revolutions per minute - rpm). Uzyskaną pulpę odwirowywano przy 5.000 obr/min i wilgotną masę w ilości 10% ₃ dodawano do 2%-owego roztworu alginianu sodu. Do 20 cm³ mieszaniny wprowadzano 1 g (gram) mokrej masy drożdżowej, dokładnie mieszano i wkraplano do schłodzonego w łaźni z lodem 2%-owego roztworu CaCl2, stosując ciągłe mieszanie. Uformowany w postaci kulek biopreparat przechowywano w 2%-owym roztworze CaCl2, w temperaturze 4°C, w czasie 12 godzin.

Otrzymany biopreparat wykorzystano w procesie ciągłej hydrolizy sacharozy, stosując jej

50%-owy roztwór i prowadząc proces w reaktorze pionowym w temperaturze 40°C, przy szybkości ₃ przepływu substratu 0,04 cm³/min. Po 30 dniach procesu stopień inwersji sacharozy osiągał wartość 80% w przypadku, gdy sporządzano nośnik z dodatkiem celulozy i 65% bez jej dodatku.

Biopreparat ten wykorzystano także w procesie hydrolizy sacharozy o stężeniu 50%, stosując metodę okresową obejmującą 6 cykli, z których każdy trwał 8 godzin, oraz preparat w ilości 1 g na 18 g substratu. W każdym cyklu stopień inwersji sacharozy przy wykorzystaniu biopreparatu z nośnikiem celulozowym był o 25-30% wyższy, w porównaniu z próbą, gdy stosowano nośnik nie zawierający celulozy.

Claims (4)

1. Sposób otrzymywania immobilizowanych biokatalizatorów na nośniku z użyciem celulozy bakteryjnej, znamienny tym, że na celulozie bakteryjnej immobilizuje się komórki drożdży Saccharomyces cerevisiae, którą po rozdrobnieniu w ilości 1 gram (g) suchej substancji (s. s.) na 100 ml podłoża wprowadza się do podłoża hodowlanego o składzie w częściach wagowych: 10 części sacharozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 0,5 części (NH4)2SO4, 0,7 części MgSO4x7H2O, 0,5 części KH2PO4, 0,5 części NaCl, woda destylowana do 1000 części i przy pH=4,8 przeprowadza hodowlę wstrząsaną drożdży Saccharomyees cerevisiae w czasie do 8 godzin, po czym zawiesinę celulozy bakteryjnej wraz z zaadsorbowanymi komórkami drożdży Saccharomyces cerevisiae oddziela się od podłoża i przemywa wodą otrzymany immobilizowany biopreparat.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się celulozę bakteryjną otrzymaną w drodze hodowli bakterii Acetobacter xylinum P30, polegającej na zaszczepieniu podłoża hodowlanego o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,5 części MgSO4x7H2O, 2,7 części Na2HPO4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu do 1000 części wody destylowanej, zawiesiną bakterii przechowywanych na podłożu o takim samym składzie w temperaturze 4°C czasie nie dłuższym niż 7 dni, o gęstości 5 x 10⁷ jednostek tworzących kolonie w jednym mililitrze (jtk/ml), użytą w ilości 5% v/v i przeprowadzeniu hodowli inokulum w temperaturze 30°C w czasie 2 dni, następnie wymieszaniu podłoża z otrzymanym inokulum i zaszczepieniu otrzymaną w ten sposób zawiesiną bakterii, podłoża produkcyjnego o składzie analogicznym jak podłoże do hodowli inokulum lub podłoża produkcyjnego o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 20 części namoku kukurydzianego, 2,5 części wagowych MgSO4 x 7H2O, 2,7 części wagowych Na2HPO4, 1,15 części wagowych kwasu cytrynowego, 10 części wagowych etanolu, do

1000 części wagowych wody destylowanej, preinkubacji całej objętości 1 dobę w temperaturze 30°C, -1 przelaniu do bioreaktorów w takich ilościach aby stosunek powierzchni do objętości wynosił 0,7 cm^-1 i prowadzeniu hodowli produkcyjnej w warunkach stacjonarnych w czasie 7 dni, w wyniku której otrzymuje się błony celulozowe, które poddaje się oczyszczeniu polegającemu na płukaniu w wodzie, traktowaniu 1%-owym NaOH w temperaturze 100°C w czasie 1 godziny, ponownym płukaniu w wodzie, następnie w 1%-owym kwasie octowym, przemyciu wodą i w końcu wodą destylowaną oraz odwodnieniu i ewentualnie sterylizacji.

PL 214 827 B1

3. Sposób otrzymywania immobilizowanych biokatalizatorów na nośniku z użyciem celulozy bakteryjnej, znamienny tym, że na celulozie bakteryjnej, immobilizuje się drożdże Saccharomyces cerevisiae, którą po zmieleniu i homogenizowaniu przy szybkości 13000 obrotów na minutę (revolutions per minute - rpm) w postaci wilgotnej masy dodaje w ilości 10% do 2%-owego roztworu alginianu sodu, a następnie do tak uzyskanego nośnika wprowadza się wilgotną masę drożdży Saccharomyces ₃ cerevisiae w ilości 1 gram (g) na 20 cm³ mieszaniny nośnika i po wymieszaniu dodaje się do schłodzonego roztworu chlorku wapnia (CaCl2) o stężeniu 2%, gdzie otrzymuje się biokatalizator w postaci kulek, który przechowuje się w 2% roztworze chlorku wapnia w temperaturze 4°C w czasie 12 godz.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się celulozę bakteryjną otrzymaną w drodze hodowli bakterii Acetobacter xylinum P30, polegającej na zaszczepieniu podłoża hodowlanego o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,5 części MgSO4x7H2O, 2,7 części Na2HPO4 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu do 1000 części wody destylowanej, zawiesiną bakterii przechowywanych na podłożu o takim samym składzie w temperaturze 4°C czasie nie dłuższym niż 7 dni, o gęstości 5 x 10⁷ jednostek tworzących kolonie w jednym mililitrze (jtk/ml), użytą w ilości 5% v/v i przeprowadzeniu hodowli inokulum w temperaturze 30°C w czasie 2 dni, następnie wymieszaniu podłoża z otrzymanym inokulum i zaszczepieniu otrzymaną w ten sposób zawiesiną bakterii, podłoża produkcyjnego o składzie analogicznym jak podłoże do hodowli inokulum lub podłoża produkcyjnego o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 20 części namoku kukurydzianego, 2,5 części wagowych MgSO4 x 7H2O, 2,7 części wagowych Na2HPO4, 1,15 części wagowych kwasu cytrynowego, 10 części wagowych etanolu, do

1000 części wagowych wody destylowanej, preinkubacji całej objętości 1 dobę w temperaturze 30°C, -1 przelaniu do bioreaktorów w takich ilościach aby stosunek powierzchni do objętości wynosił 0,7 cm^-1 i prowadzeniu hodowli produkcyjnej w warunkach stacjonarnych w czasie 7 dni, w wyniku której otrzymuje się błony celulozowe, które poddaje się oczyszczeniu polegającemu na płukaniu w wodzie, traktowaniu 1%-owym NaOH w temperaturze 100°C w czasie 1 godziny, ponownym płukaniu w wodzie, następnie w 1%-owym kwasie octowym, przemyciu wodą i w końcu wodą destylowaną oraz odwodnieniu i ewentualnie sterylizacji.