PL214828B1 - Sposób immobilizowania bakterii Bacillus subtilis syntetyzujących proteinazę - Google Patents
Sposób immobilizowania bakterii Bacillus subtilis syntetyzujących proteinazęInfo
- Publication number
- PL214828B1 PL214828B1 PL392479A PL39247903A PL214828B1 PL 214828 B1 PL214828 B1 PL 214828B1 PL 392479 A PL392479 A PL 392479A PL 39247903 A PL39247903 A PL 39247903A PL 214828 B1 PL214828 B1 PL 214828B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- parts
- cellulose
- medium
- culture
- bacteria
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 title claims description 11
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 title claims description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 title description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title description 5
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 title description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 title description 2
- 229920002749 Bacterial cellulose Polymers 0.000 claims description 33
- 239000005016 bacterial cellulose Substances 0.000 claims description 33
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 30
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 29
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 244000235858 Acetobacter xylinum Species 0.000 claims description 16
- 235000002837 Acetobacter xylinum Nutrition 0.000 claims description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 11
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 8
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 7
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 6
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000013587 production medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 6
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 4
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 3
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 29
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical group OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 7
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001340 Microbial cellulose Polymers 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000008166 cellulose biosynthesis Effects 0.000 description 3
- 108010040093 cellulose synthase Proteins 0.000 description 3
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002201 Oxidized cellulose Polymers 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 229940107304 oxidized cellulose Drugs 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000017788 Cydonia oblonga Nutrition 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229920000869 Homopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940077731 carbohydrate nutrients Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000495 cryogel Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000003893 lactate salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób immobilizowania bakterii Bacillus subtilis syntetyzujących proteinazę z użyciem celulozy bakteryjnej, która stanowi składnik nośnika do immobilizowania bakterii Bacillus subtilis. Immobilizowany biopreparat stosuje się do biosyntezy enzymów proteolitycznych.
Możliwości wykorzystania celulozy bakteryjnej (BC) w medycynie, szczególnie jako materiału opatrunkowego oraz sztucznych organów, stwarzają takie jej właściwości, jak wysoka czystość, wytrzymałość mechaniczna, zdolność chłonięcia cieczy, bardzo dobra zgodność z żywą tkanką, a w szczególności z krwią. Właściwie oczyszczone błony celulozowe, wytworzone metodą hodowli stacjonarnej, mogą stanowić gotowy materiał opatrunkowy spełniający standardy przypisane nowoczesnym materiałom opatrunkowym [Kudlicka K. (1989) Terminalne kompleksy syntazy celulozowej. Postępy biologii komórki 16(2), 197-212; Fontana J. D., Franco V. C., de Sousa S. J., Lyra I. N., de Sousa A. M. (1991) Nature of plant stimulators in the production of Acetobacter xylinum (tea fungus) biofilm used in skin therapy. Applied Biochemistry and Biotechnology 28/29, 341-351], Jest on biokompatybilny, porowaty, elastyczny, łatwy w zastosowaniu i przechowywaniu, zapewnia optymalną wilgotność sprzyjającą gojeniu się rany i może być sterylizowany termicznie. Błony celulozowe są również znakomitymi nośnikami służącymi do immobilizacji różnorodnych substancji bioaktywnych, przyspieszających proces gojenia. Z uwagi na występujące ostatnio problemy i kontrowersje związane ze stosowaniem produktów pochodzenia zwierzęcego, opatrunki kolagenowe mogą zostać zastąpione właśnie opatrunkami celulozowymi. Jak dotychczas zanotowano kilka doniesień mówiących o pozytywnych rezultatach badań klinicznych z wykorzystaniem BC jako opatrunku do leczenia ran oparzeniowych, owrzodzeń troficznych lub też jako biomateriału przy transplantacji skóry [Bungay H., Serafica G. (1997) Production of microbial cellulose using a rotating disc film bioreactor Patent WO 97/05271; Kamide K., Matsuda Y., Iijima H., Okajima K. (1990) Effect of culture conditions of acetic acid bacteria on cellulose biosynthesis. British Polimer Journal 22, 167-171; Ross P., Weinhouse H., Aloni Y., Michaeli D., Ohana P., Mayer R., Braun S., de Vroom E., van der Marel G. A., van Boom J. H., Benziman M. (1987) Regulation of cellulose synthesis in Acetobacter xylinum by cyclic diguanylic acid. Nature 325, 279-281].
W opisie patentowym JP 54041321 przedstawiony jest sposób otrzymania opatrunku na choroby skórne, o właściwościach zapewniających wysoki stopień miejscowego przylegania i długotrwałe działanie, z wykorzystaniem hydroksypropylocelulozy, soli kwasu poliakrylowego oraz ich składnika aktywnego.
W opisie patentowym EP 0918548 przedstawione jest rozwiązanie dotyczące zastosowania utlenionej celulozy, korzystnie regenerowanej, utlenionej celulozy (ORC) oraz jej kompleksów z białkami takimi jak kolagen, w celu zapewnienia opatrunku ochronnego przy chronicznych ranach.
Opis patentowy WO 8602095 dotyczy sposobu wytwarzania filmu celulozowego jako sztucznej skóry stosowanej przy przeszczepach. Sposób ten obejmuje przygotowanie medium hodowlanego, zawierającego źródło azotu oraz węglowodany, zaszczepienie hodowli bakteriami Acetobacter xylinum, inkubację hodowli w temperaturze, która zapewnia aktywność bakterii w czasie koniecznym do wytworzenia wymaganego filmu, usunięcie utworzonego filmu z pożywki w celu dehydratacji w stanie rozciągniętym.
Z opisów patentowych US 4788146 i US 4588400 jest znane zastosowanie błon celulozowych jako opatrunków do ran i skaleczeń, a także ran oparzeniowych. Błony te wytwarzane w hodowli Acetobacter xylinum, mają grubość 0,1-15 mm lub więcej i po usunięciu z nich pożywki, w stanie uwodnionym są sterylizowane.
Właściwości BC otwierają wiele możliwości jej praktycznego wykorzystania, uzasadnionych ekonomicznie, przy uwzględnieniu udoskonalenia metod hodowli i oparciu produkcji na ulepszonych szczepach Acetobacter, wykorzystujących tanie i łatwo dostępne surowce.
Celuloza jest nierozgałęzionym homopolisacharydem, zbudowanym z jednostek β-D-glukopiranozy połączonych ze sobą wiązaniami e-1,4-glikozydowymi. Celuloza bakteryjna (BC) należy do wysokokrystalicznych celuloz, bogatych we frakcję Ic [Wong H. C., Fear A. L., Calhoon R. D., Eichinger G. H., Mayer R., Amikam D., Benziman M., Gelfand D. H., Meade J. H., Emerick A. W., Bruner R., Ben-Bassat A., Tal R. (1990) Genetic organization of the cellulose synthase operon in Acetobacter xylinum.. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87, 8130-8134; Iguchi M., Yamanaka S., Budhiono A. (2000) Bacterial cellulose - a masterpiece of nature's arts. Journal of Materials
Science 35, 261-270]. Syntetyzowane przez bakterie łańcuchy glukanowe łączą się i formują elemenPL 214 828 B1 tarne subfibryle celulozowe o szerokości 1,5 nm, należące do najcieńszych naturalnie występujących włókien, porównywalnych jedynie do elementarnych włókien celulozy wykrytych w kambium niektórych roślin i śluzie pigwy [Masaoka S., Ohe T., Sakota N. (1993) Production of cellulose from glucose by Acetobacter xylinum. Journal of Fermentation and Bioengineering 75, 18-22].
BC jest syntetyzowana przez kilka rodzajów bakterii, spośród których do najlepiej poznanych należą szczepy bakterii octowych Acetobacter.
Synteza celulozy I przez Acetobacter xylinum, jak również przez inne organizmy wykazujące tę zdolność, obejmuje przynajmniej dwa etapy: 1) polimeryzację cząsteczek glukozy w liniowy e-1,4-glukan, 2) łączenie i krystalizację indywidualnych łańcuchów polimerowych w większe jednostki strukturalne.
Produkcja BC na skalę przemysłową jest jeszcze niewielka, głównie ze względu na trudności związane z wyselekcjonowaniem wysoko aktywnych szczepów, zdolnych do biosyntezy celulozy w warunkach hodowli wgłębnej i pozbawionych możliwości metabolizowania glukozy do kwasów glukonowych, a także ze względu na dość wysokie koszty składników podłoża hodowlanego.
Proces biosyntezy BC może być prowadzony zarówno w warunkach hodowli stacjonarnej jak i hodowli wgłębnej, która zapewnia pełną jego kontrolę. Wybór metody hodowli zależy ściśle od dalszego przeznaczenia syntetyzowanego polimeru [Krystynowicz A., Czaja W., Pomorski L., Kołodziejczyk M., Bielecki S. (2000) The evaluation of usefulness of microbial cellulose as wound dressing material. 14th Forum for Applied Biotechnology, Gent, Belgium, Proceedings Part I, Mededelingen Van De Faculteit Landbouwwetenschappen, Rijksuniversiteit Gent 65(3a), 213-220]. Kontrola procesu biosyntezy BC w hodowli stacjonarnej jest znacznie utrudniona ze względu na gromadzącą się na powierzchni pożywki błonę, która ogranicza dostęp do cieczy hodowlanej. Synteza BC w warunkach stacjonarnych może być prowadzona przy wykorzystaniu jednoetapowej (pożywka szczepiona 5-10% inokulum) lub dwuetapowej procedury [Bielecki S., Krystynowicz A., Turkiewicz M., Kalinowska H. (2001) Bacterial cellulose. Biopolymers 7, Polysaccharides 1 (Steinbuchel, Ed.) Munster, Germany, 37-90]. Ta ostania obejmuje etap hodowli wgłębnej w celu namnożenia biomasy, a następnie kontynuację procesu w warunkach stacjonarnych [Ramana K. V., Tomar A., Singh L. (2000) Effect of various carbon and nitrogen sources on cellulose synthesis by Acetobacter xylinum. World Journal of Microbiology & Biotechnology 16, 245-248].
Wytwarzanie celulozy w dużej skali, w hodowlach z ciągłym mieszaniem, napotyka na szereg trudności, z których największą jest niestabilność kultury przejawiająca się tendencją do spontanicznej mutacji w kierunku szczepów nieaktywnych, tak zwanych Cel- [Seto H., Tsuchida T., Yoshinaga F. (1997) Manufacture of bacterial cellulose by mixed culture of microorganisms. PN JP 97- 21905].
Szczep niestabilny może być z powodzeniem stosowany w hodowlach stacjonarnych, w których wzrost bakterii i synteza celulozy przebiega na granicy faz pożywka-powietrze. W warunkach hodowli wstrząsanej, w której wzrost bakterii Cel+ jest ograniczony szybkością rozpuszczania się tlenu oraz agregacją komórek przez syntetyzowaną celulozę (co utrudnia dostęp tlenu), faworyzowane są komórki nieaktywne Cel-.
BC może być również produkowana w warunkach ciągłej hodowli stacjonarnej [Sattler K., Fiedler S. (1990) Production and application of bacterial cellulose. Zentralblatt fur Bakteriologie, Mikrobiologie und Hygiene 145, 247-252], Acetobacter xylinum jest wówczas hodowany na tacach, na podłożu Schramma-Hestrina (SH) i po 2- 3 dniach procesu wytworzona na powierzchni podłoża błona celulozowa jest w sposób ciągły wprowadzana do kąpieli w roztworze sodowego siarczanu dodecylu (SDS) w celu inaktywacji komórek, a następnie nawijana na specjalny wałek. Proces taki prowadzony był przez kilka tygodni, przy prędkości nawijania 35 mm/h i przy okresowym uzupełnianiu podłoża (co 8-12 h), w celu utrzymania optymalnych warunków hodowli. Wykorzystując tę metodę uzyskano pas celulozowy o długości 5 m, co wskazuje na potencjalną możliwość jej wykorzystania na skalę przemysłową.
Innym, opisywanym sposobem syntezy celulozy jest hodowla bakterii Acetobacter w specjalnych bioreaktorach poziomych, wyposażonych w zestaw obracających się wałków, na których osadzał się wytwarzany polimer. W takich warunkach obserwowano przyspieszony wzrost komórek oraz prawie 2-krotny wzrost wydajności procesu biosyntezy celulozy w stosunku do hodowli kontrolnej, prowadzonej w warunkach stacjonarnych [Saxena I. M., Lin F. C., Brown Jr R. M. (1990) Cloning and sequencing of the cellulose synthase catalytic subunit gene of Acetobacter xylinum. Plant Molecular Biology 15, 673-683].
Z opisu patentowego PL 171952 i z opisu zgłoszenia patentowego P 317139 jest znany sposób wytwarzania BC w postaci błon na drodze hodowli powierzchniowej bakterii Acetobacter xylinum na podłożu opartym na glukozie. Stosowany w tym sposobie szczep bakterii Acetobacter xylinum P23 wykazuje optymalny wzrost w temperaturze 28-30°C przy pH 4,0-6,5. Na podłożach stałych zawiera4
PL 214 828 B1 jących glukozę, ekstrakt drożdżowy, pepton, agar tworzy galaretowate kolonie, zaś w hodowli na podłożach płynnych tworzy śluzowatą, zwartą błonkę. Szczep Acetobacter xylinum P23 inkubuje się na podłożu płynnym. Sposobem według wynalazku otrzymuje się błony celulozowe o zawartości α-celulozy 90-97%, które mogą służyć jako środek opatrunkowy w chirurgii i dermatologii.
Z opisów patentowych US 5975095, US 5962278 i US 6110712 jest znany sposób syntezy celulozy przez bakterie Acetobacter xylinum subsp. Nonaacetoxidans, nie utleniających lub bardzo słabo utleniających octany i mleczany.
W opisach patentowych US 6429002, US 6329192, US 5144021, US 5079162 i US 4863565 przedstawiono sposób wytwarzania BC w warunkach wstrząsania, w których w czasie 70 h uzyskano przynajmniej 0,1 g/l w czasie 1 godziny.
Z opisu patentowego US 5955325 jest znane wytwarzanie celulozy mikrobiologicznej o wysokiej zawartości wody w fermentorze dyskowym.
Opis patentowy EP 0792935 przedstawia proces wytwarzania celulozy w fermentorze, przy częściowym ciśnieniu CO2 w fazie gazowej w zbiorniku fermentacyjnym (10,13 kPa lub mniejszym).
Znany jest sposób otrzymywania BC w formie błon, w drodze hodowli bakterii Acetobacter xylinum, polegający na zaszczepieniu podłoża hodowlanego o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,5 części MgSO4x7H2O, 2,7 części Na2HPO4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu, do 1000 części wody destylowanej, zawiesiną bakterii przechowywanych na podłożu o takim samym składzie w czasie nie dłuższym niż 7 dni, o gęstości 5x107 jednostek tworzących kolonie w jednym mililitrze (jtk/ml), użytą w ilości 5% v/v i prowadzeniu hodowli produkcyjnej w bioreaktorach, w wyniku której otrzymuje się błony celulozowe, które poddaje się oczyszczeniu polegającemu na płukaniu w wodzie, gotowaniu w 1%-owym NaOH w czasie 0,5-2 godzin, ponownym płukaniu w wodzie do całkowitego usunięcia NaOH, działaniu 1%-owym kwasem octowym, przemyciu wodą i w końcu wodą destylowaną, odwodnieniu i ewentualnie sterylizacji [Krystynowicz A., Czaja W., Pomorski L., Kołodziejczyk M., Bielecki S. (2000) The evaluation of usefulness of microbial cellulose as wound dressing material. 14th Forum for Applied Biotechnology, Gent, Belgium, Proceedings Part I, Mededelingen Van De Faculteit Landbouwwetenschappen, Rijksuniversiteit Gent 65(3a), 213-220].
Pomimo opisanych powyżej sposobów otrzymywania celulozy bakteryjnej i jej zastosowania jako materiałów opatrunkowych, istnieje ciągła potrzeba doskonalenia procesów technologicznych, doskonalenia właściwości materiału finalnego, optymalizacji podłoża hodowlanego z uwzględnieniem aspektów ekonomicznych, co zwiększy możliwości jej zastosowania.
Znany jest sposób immobilizowania bakterii Bacillus subtilis syntetyzujących proteinazę, w którym nośnik do immobilizacji stanowi mieszanina alkoholu poliwinylowego o masie cząsteczkowej 72.000, stężeniu 10-12% i rozdrobnionej celulozy bakteryjnej w ilości 0,12-12%. Celuloza bakteryjna syntetyzowana jest przez wyodrębniony szczep bakterii należący do rodzaju Acetobacter [SzczesnaAntczak M., Galas E. (2001) Bacillus subtilis cells immobilised in PVA cryogels. Biomolecular Engineering 17(2), 55-63],
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie środków, które mogłyby być wykorzystane do syntezy celulozy bakteryjnej, pozyskania jej do otrzymywania materiałów opatrunkowych o określonych właściwościach, zależnie od celu wykorzystania, w tym jako biopreparaty do biosyntezy enzymów proteolitycznych.
Przedmiotem wynalazku jest sposób immubilizowania bakterii Bacillus subtilis syntetyzujących proteinazę na nośniku stanowiącym mieszaninę alkoholu poliwinylowego (PVA) o masie cząsteczkowej 72.000, stężeniu 10-12% i rozdrobnionej celulozy bakteryjnej w ilości 0,12-12%, charakteryzujący się tym, że mieszaninę nośnika i komórek bakterii Bacillus subtilis, o stężeniu 7,6 x 109/ml kriożeluje się w postaci form sferycznych w drodze kilkukrotnego zamrażania w temperaturze -25°C i rozmrażania w temperaturze 20°C w oleju roślinnym. Do kriożelowania stosuje się celulozę bakteryjną, otrzymaną w drodze hodowli bakterii Acetobacter xylinum P30 na podłożu hodowlanym o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,5 części MgSO4 x 7H2O, 2,7 części Na2HPO4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu do 1000 części wody destylowanej, zaszczepionym zawiesiną bakterii przechowywanych na podłożu o takim samym składzie w czasie nie dłuższym niż 7 dni, o gęstości 5x107 jednostek tworzących kolonie w jednym mililitrze (jtk/ml), użytym w ilości 5% v/v i przeprowadzeniu hodowli inokulum w temperaturze 30°C w czasie 2 dni. Po wymieszaniu podłoża z otrzymanym inokulum i zaszczepieniu otrzymaną w ten sposób zawiesiną bakterii, podłoża produkcyjnego o składzie analogicznym jak podłoże do hoPL 214 828 B1 dowli inokulum lub podłoża produkcyjnego o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, części namoku kukurydzianego, 2,5 części MgSO4x7H2O, 2,7 części Na2HPO4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu, do 1000 części wody destylowanej, preinkubowano całą objętość dobę w temperaturze 30°C. Następnie po przelaniu do bioreaktorów w takich ilościach, aby stosu-1 nek powierzchni do objętości wynosił 0,7 cm-1 i prowadzeniu hodowli produkcyjnej w warunkach stacjonarnych w czasie 7 dni, otrzymuje się błony celulozowe, które poddaje się oczyszczeniu polegającemu na płukaniu w wodzie, traktowaniu 1%-owym NaOH w temperaturze 100°C w czasie 1 godziny, ponownym płukaniu w wodzie, następnie w 1%-owym kwasie octowym, przemyciu wodą i w końcu wodą destylowaną oraz odwodnieniu i ewentualnie sterylizacji.
Sposób według wynalazku ilustrują poniższe przykłady:
Produkcja błon celulozowych z wykorzystaniem modyfikowanych podłoży hodowlanych (przykłady 1-2).
P r z y k ł a d 1
Podłoże binokułame P1 o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,5 części MgSO4x7H2O, 2,7 części Na2HPO4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu, do 1000 części wody destylowanej, szczepiono 5% (v/v) zawiesiny bakterii Acetobacter 5x107 jtk/ml (jtk/ml - liczba jednostek tworzących kolonie w jednym mililitrze) przechowywanych na tymże podłożu nie dłużej niż 7 dni, w temperaturze 4°C i hodowano w czasie 2 dni w temperaturze 30°C, po czym po intensywnym mieszaniu zaszczepiono zawiesiną bakterii w ilości 5% objętości podłoża produkcyjnego o tym samym składzie i preinkubowano całą objętość jedną dobę w temperaturze 30°C, po czym przeniesiono je do bioreaktorów o wymaganej powierzchni, -1 w takiej ilości aby stosunek S/V (powierzchnia/objętość) wynosił 0,7 cm-1. Wytworzenie błon w tych 3 warunkach wymagało przygotowania 14 dm3 podłoża hodowlanego, które po zaszczepieniu i preinkubacji rozlano do bioreaktorów i prowadzono proces biosyntezy błon celulozowych w czasie 7 dni. Uformowane błony o grubości około 5 mm oczyszczano stosując płukanie w wodzie wodociągowej, następnie traktowano je 1%-owym NaOH w temperaturze 100°C w czasie 1 h, po czym ponownie płukano w wodzie wodociągowej, następnie w 1%-owym kwasie octowym, ponownie w wodzie i na końcu w wodzie destylowanej, a nadmiar wody (około 90%) usunięto stosując wyciskanie, po czym wilgotne błony pakowano do szczelnych woreczków foliowych i poddano sterylizacji radiacyjnej stosując dawkę promieniowania γ = 25 kGy.
Uzyskano około 3,5 g suchej, oczyszczonej masy celulozowej z 1 dm3 podłoża, w której zawartość białka nie przekraczała 3%.
P r z y k ł a d 2
Inokulum otrzymanym jak w przykładzie 1 zaszczepiono sterylne podłoże produkcyjne P1, w którym 5 części ekstraktu drożdżowego i 5 części peptonu zastąpiono 20 częściami namoku kukurydzianego, nie zmieniając ilości pozostałych składników.
Dalej postępowano jak w przykładzie 1.
W rezultacie otrzymano o 10% więcej masy celulozowej w porównaniu z wynikiem przykładu 1.
Zastosowanie celulozy bakteryjnej do otrzymywania immobilizowanych bakterii Bacillus subtilis syntetyzujących proteinazę.
P r z y k ł a d 3
Do 10%-owego roztworu alkoholu poliwinylowego o masie cząsteczkowej 72.000 i stopniu polimeryzacji 1600 dodano 0,12% proszku celulozy bakteryjnej i zawiesinę komórek Bacillus subtilis o stężeniu 7,6x109/ml. Otrzymaną mieszaninę kriożelowano w postaci form sferycznych stosując 5 etapów zamrażania w -20°C i rozmrażania w 20°C, w oleju roślinnym. Równolegle wykonano próbę kontrolną bez dodatku celulozy bakteryjnej.
W celu sprawdzenia mechanicznej wytrzymałości tak otrzymanych biopreparatów, zawieszono je w wodzie i poddano wstrząsaniu z szybkością 150 rpm (revolutions per minute) w temperaturze 55°C, mierząc czas ich rozpuszczenia. Czas rozpuszczenia próbki zawierającej celulozę bakteryjną wydłużył się do 45 minut, podczas gdy dla próby bez celulozy wynosił 10 minut.
W celu sprawdzenia stopnia uwolnienia bakterii z nośnika, próbki biopreparatów poddaje się 3-krotnemu płukaniu w czasie 30 minut, stosując 1 ml porcje soli fizjologicznej. Zawiesinę uwolnionych bakterii wysiewano na powierzchnię podłoża zestalonego agarem i określano ich ilość po 24 godzinach hodowli, w 37°C. Po trzecim cyklu wymywania z próby biopreparatu zawierającego celulozę uwalniało się 10-krotnie mniej bakterii w porównaniu z próbą bez dodatku celulozy.
PL 214 828 B1
Immobilizowane biopreparaty stosuje się do biosyntezy enzymów proteolitycznych, wprowadza3 jąc 4% biokatalizatora do 50 cm3 sterylnego podłoża hodowlanego i inkubując w 30°C w czasie 66 godzin, w warunkach mieszania przy 220 rpm (revolutions per minute). Cykl hodowlany powtarzano 3-krotnie z wykorzystaniem tych samych prób biopreparatów, po odmyciu solą fizjologiczną. W każdym przypadku aktywność proteinazy serynowej była o około 17% wyższa, gdy stosowano biopreparat zawierający celulozę bakteryjną.
Claims (1)
- Sposób immobilizowania bakterii Bacillus subtilis syntetyzujących proteinazę na nośniku stanowiącym mieszaninę alkoholu poliwinylowego (PVA) o masie cząsteczkowej 72.000, stężeniu 10-12% i rozdrobnionej celulozy bakteryjnej w ilości 0,12-12%, znamienny tym, że mieszaninę nośnika i komórek bakterii Bacillus subtilis, o stężeniu 7,6 x 109/ml kriożeluje się w postaci form sferycznych w drodze kilkukrotnego zamrażania w temperaturze -25°C i rozmrażania w temperaturze 20°C w oleju roślinnym, przy czym stosuje się celulozę bakteryjną, otrzymaną w drodze hodowli bakterii Acetobacter xylinum P30 na podłożu hodowlanym o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,5 części MgSO4 x 7H2O, 2,7 części Na2HPO4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu do 1000 części wody destylowanej, zaszczepionym zawiesiną bakterii przechowywanych na podłożu o takim samym składzie w czasie nie dłuższym niż 7 dni, o gęstości 5x107 jednostek tworzących kolonie w jednym mililitrze (jtk/ml), użytym w ilości 5% v/v i przeprowadzeniu hodowli inokulum w temperaturze 30°C w czasie 2 dni, następnie wymieszaniu podłoża z otrzymanym inokulum i zaszczepieniu otrzymaną w ten sposób zawiesiną bakterii, podłoża produkcyjnego o składzie analogicznym jak podłoże do hodowli inokulum lub podłoża produkcyjnego o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 20 części namoku kukurydzianego, 2,5 części MgSO4 x 7H2O, 2,7 części Na2HPO4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu, do 1000 części wody destylowanej, preinkubacji całej objętości 1 dobę w temperaturze 30°C, przelaniu do bio-1 reaktorów w takich ilościach, aby stosunek powierzchni do objętości wynosił 0,7 cm-1 i prowadzeniu hodowli produkcyjnej w warunkach stacjonarnych w czasie 7 dni, w wyniku której otrzymuje się błony celulozowe, które poddaje się oczyszczeniu polegającemu na płukaniu w wodzie, traktowaniu 1%-owym NaOH w temperaturze 100°C w czasie 1 godziny, ponownym płukaniu w wodzie, następnie w 1%-owym kwasie octowym, przemyciu wodą i w końcu wodą destylowaną oraz odwodnieniu i ewen-
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL392479A PL214828B1 (pl) | 2003-07-03 | 2003-07-03 | Sposób immobilizowania bakterii Bacillus subtilis syntetyzujących proteinazę |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL392479A PL214828B1 (pl) | 2003-07-03 | 2003-07-03 | Sposób immobilizowania bakterii Bacillus subtilis syntetyzujących proteinazę |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL392479A1 PL392479A1 (pl) | 2010-11-22 |
| PL214828B1 true PL214828B1 (pl) | 2013-09-30 |
Family
ID=43503261
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL392479A PL214828B1 (pl) | 2003-07-03 | 2003-07-03 | Sposób immobilizowania bakterii Bacillus subtilis syntetyzujących proteinazę |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL214828B1 (pl) |
-
2003
- 2003-07-03 PL PL392479A patent/PL214828B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL392479A1 (pl) | 2010-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL212003B1 (pl) | Sposób otrzymywania celulozy bakteryjnej | |
| Lin et al. | Biosynthesis, production and applications of bacterial cellulose | |
| EP3386554B1 (en) | Methods of producing biosynthetic bacterial cellulose membranes | |
| Loiselle et al. | The use of cellulase in inhibiting biofilm formation from organisms commonly found on medical implants | |
| Ha et al. | Bacterial cellulose production from a single sugar α-linked glucuronic acid-based oligosaccharide | |
| CN101914434B (zh) | 动态制备异型空腔细菌纤维素材料的装置及方法 | |
| US20230270799A1 (en) | Biomaterial comprising bacterial cellulose and probiotics and uses thereof | |
| Foresti et al. | Bacterial nanocellulose: Synthesis, properties and applications | |
| Park et al. | Bacterial cellulose | |
| CN201809342U (zh) | 动态制备异型空腔细菌纤维素材料的装置 | |
| RU2568605C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИИ Komagataeibacter xylinus - ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ | |
| Keshk et al. | Natural bacterial biodegradable medical polymers: Bacterial cellulose | |
| KR100423092B1 (ko) | 혼합배양에 의한 미생물 셀룰로오스의 생산방법 | |
| US5273891A (en) | Process for the production of microbial cellulose | |
| Abd Aziz et al. | Employed bacterial species and bacterial cellulose (BC) applications: the state of play | |
| PL214827B1 (pl) | Sposób otrzymywania immobilizowanych biokatalizatorów | |
| CN1850302A (zh) | 一种人造皮肤用细菌纤维素湿膜的制备方法 | |
| CA1327536C (en) | Process for the production of microbial cellulose | |
| JPH05252970A (ja) | 静菌作用を有するアルギン酸オリゴ糖の製造法及 びそれを有効成分として含む静菌剤 | |
| Holmes | Bacterial cellulose | |
| PL214844B1 (pl) | Sposób modyfikacji błon celulozowych | |
| Nasresfahani et al. | Recent research on economic production and water absorption improvement of bacterial cellulose: a review | |
| Quintana-Quirino et al. | Microbial cellulose: biosynthesis and textile applications | |
| RU2847016C1 (ru) | Способ получения биосовместимых трубчатых структур для сосудов и кондуитов из полисахаридных биокомпозитов бактериального происхождения | |
| Nicomrat | Silver nanoparticles impregnated biocellulose produced by sweet glutinous rice fermentation with the genus Acetobacter |