PL217628B1 - Zastosowanie resweratrolu do wytwarzania leku wywierającego działanie inhibitorowe na replikację wirusa grypy do zapobiegania i/lub leczenia infekcji wywołanej wirusem grypy - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek związany jest z zastosowaniem resweratrolu jako składnika aktywnego w preparacie leku do zapobiegania lub leczenia infekcji grypy.

Tło wynalazku

Znane, korzystne właściwości czerwonego wina, którego jednym z podstawowych składników jest resweratrol, tj., 3,4,5-trihydroksystylben, spowodowały, że związek ten stał się ostatnio przedmiotem intensywnych badań (Life Sci., 71, 2145-52, 2002).

Resweratrol znajduje się w skórce czarnych winogron w ilości od 50 do 100 ąg/g a jego stężenie w winie mieści się w zakresie od 1.5 do 3 mg/l. Liczne badania wykazały aktywność przeciwrakową resweratrolu, którego mechanizmy działania można podzielić w następujący sposób: inhibicja aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-kB, zdolnego do regulacji ekspresji różnych genów włączonych w procesy zapalne i kancerogenne (Lancet, 341, 1103-1104, 1993; Science, 275, 218-220, 1997; Proc. Natl. Acad. Sc., 94, 14138-14143, 1997; Life Science, 61, 2103-2110, 1997; Brit. J. Pharm., 126, 673-680, 1999; J. Imm., 164, 6509-6509, 2000); inhibicja różnych białek, włączając białko kinazy C (Bioch., 38, 13244-13251, 1999), reduktazę rybonukleotydową (FEBS Lett., 421, 277-279, 1998) i cyklookygenazę-2 (COX-2) w ssaczych komórkach nabłonka (Ann. N.Y. Acad. Sci., 889, 214-223, 1999; Carcinog., 21, 959-963, 2000); aktywacja kaspazy 2, 3, 6 i 9 (FASEB J., 1613-1615, 2000) i modulacja genu p53, który jest znanym supresorem rakowym (Cancer Research, 59, 5892-5895, 1999; Clin. Biotech., 34, 415-420, 2001).

Omawiając korzystne działanie resweratrolu należy również wspomnieć o jego aktywności przeciwutleniającej, o której świadczy wyżej wspomniana zdolność przeciwdziałania szkodliwym efektom wywołanym przez różne substancje i/lub warunki powodujące wewnątrzkomórkowy stres oksydacyjny (Free Radic. Res., 33, 105-114, 2000). Resweratrol może indukować relaksację naczyń poprzez produkcję tlenku azotu na poziomie naczyniowo - śródbłonkowym (Cancer Res., 59, 2596-01, 1999), inhibitować syntezę tromboksanu w płytkach (Clin. Chim. Acta, 235, 207-219, 1995; Int. J. Tissue React., 17, 1-3, 1995) i leukotrienów w neutrofilach oraz zapobiegać utlenianiu i agregacji lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) (Lancet, 341, 1103-1104, 1993; Life Sci., 64, 2511-2521, 1999).

Ostatnio, wykazano na podstawie eksperymentów in vitro aktywność inhibitorową resweratrolu przeciwko wirusowi DNA opryszczki zwykłej - Herpes Simplex (Antiv. Res., 43, 145-155, 1999).

Dane uzyskane przez twórców i przez inne zespoły badawcze ujawniły, że wiele przeciwutleniających substancji jest zdolnych do inhibicji in vitro replikacji wirusa paragrypy Sendai (SV) typu I, wirusa Herpes Simplex 1 (HSV-1) oraz wirusa nabytego niedoboru odporności (HIV) (AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1997: 1537-1541; Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992; 188, 1090-1096; Antivir. Res., 1995, 27, 237.253). Skuteczność przeciwwirusowa substancji przeciwutleniających została wykazana także na modelu mysim AIDS (MAIDS), jak również na modelu zapalenia rogówki HSV1 (AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1996: 12, 1373-1381: Exp. Eye. Res., 200: 70, 215-220).

Grypa stanowi problem epidemiologiczny w skali światowej wraz z powiązaną z nią serią problemów zdrowia publicznego i głównymi ekonomicznymi reperkusjami w sektorze ochrony zdrowia. Wirus odpowiedzialny za grypę jest szeroko rozpowszechniony i silnie zakaźny. Niestety, aktualnie dostępne terapie są wciąż nie w pełni skuteczne i prowadzą często do selekcji opornych szczepów wirusa (Fields, cap47, 1533-79, 2001) i, co więcej, akcje szczepień, oprócz niedogodności w zapobieganiu drogą szczepienia, nie zapewniły dotąd satysfakcjonującej ochrony przed bardzo silną antygenową zmiennością wirusa (Fields, cap47, 1533-79, 2001).

W stanie techniki znane jest zastosowanie resweratrolu do leczenia przeziębień i infekcji wywołanych wirusem grypy. W zgłoszeniu patentowym WO 9956737 ujawniono zastosowanie trihydroksylowanych stilbenów, w tym resweratrolu, do zapobiegania szerokiej grupie schorzeń, m.in. infekcjom grypy, poprzez efekt antagonistyczny wobec ligandów AHR, natomiast w opisie patentowym WO 0108671 ujawniono zastosowanie resweratrolu do zapobiegania i leczenia objawowego przeziębienia, objawów grypopodobnych i grypy. W żadnym z dokumentów nie ujawniono aktywności inhibitorowej resweratrolu i mechanizmu jego oddziaływania na replikację wirusa grypy.

W ramach różnych strategii zaatakowania replikacji wirusa, ostatnie badania (J. of Virol., 74, 1781-1786, 2000) wykazały istotną rolę białka M1 w transporcie specyficznych rybonukleoprotein wirusa do cytoplazmy. Transport ten okazał się być fundamentalnym etapem w cyklu replikacyjnym wirusa, do tego stopnia istotnym, że możliwa jest inhibicja replikacji wirusa poprzez zatrzymanie nukleoproteiny w jądrze zainfekowanej komórki w wyniku inhibicji syntezy białka M. Zjawisko to może być

PL 217 628 B1 związane z inhibicją białek komórkowych o funkcji kinazy. W istocie, wykazano ostatnio, że inhibicja kinaz powoduje zatrzymanie NP jądra komórkowego (Nature Cell. Biol., 3, 301-5, 2001; J. of Virol., 74, 1781-86, 2000) wraz z silnym działaniem inhibitorowym przeciwko replikacji wirusa grypy.

GSH znany jest jako główny przeciwutleniacz w układzie redoks i związek ten wiąże się z replikacją różnych wirusów. Rzeczywiście, wcześniejsze badania przeprowadzone przez twórców niniejszego wynalazku wykazały, że podczas infekcji wirusowej możliwe jest zaobserwowanie obniżenia poziomu GSH w wyniku samej infekcji (Rotilio i wsp., „Oxidative stress on cell activation in viral infection”, 143-53, 1993; Palamara i wsp., Antiviral Research, 27, 237-53, 1995). Zaburzona regulacja znanego mechanizmu apoptozy jest podstawowym czynnikiem odpowiedzialnym za liczne choroby ludzi, takie jak wiele chorób autoimmunologicznych, infekcji lub chorób neurologicznych, takich jak AIDS i rak.

Na podstawie wcześniejszych badań stwierdzono, że resweratrol pozwala na wyeliminowanie komórek rakowych poprzez indukcję apoptozy komórek. Ostatnio, badania przeprowadzone przez Tinhofer'a I. i wsp. (FASEB J., 18, 1613-15, 2001) ujawniły, że pierwszy etap przebiegu apoptozy indukowanej przez resweratrol charakteryzuje się zmianą potencjału membranowego mitochondrium (ΔΦγπ), poprzez uwolnienie cząsteczek reaktywnego tlenu (ROS) oraz w wyniku aktywacji kaspazy 2, 3, 6 i 9. Wiadomo również, że wirus grypy indukuje apoptozę procentowo na różnym poziomie, zależnie od szczepu wirusa i multiplikacji infekcji.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie resweratrolu do wytwarzania leku wywierającego działanie inhibitorowe na replikację wirusa grypy do zapobiegania i/lub leczenia infekcji wywołanej wirusem grypy.

Korzystnie, wspomniany wirus jest wirusem ludzkiej grypy.

W korzystnej realizacji wynalazku, wspomniany lek jest przeznaczony do leczenia infekcji wirusowych w dziedzinie weterynarii.

Stwierdzono, że resweratrol wywiera inhibitorowe działanie na replikację wirusa grypy. W zaskakujący sposób, odnotowano, że resweratrol wykazuje swoje inhibitorowe działanie na replikację wirusa grypy nie poprzez oczekiwaną aktywność przeciwutleniającą, ale poprzez szczególny mechanizm inhibicji białka kinazy C, enzymu komórkowego, który pełni główną rolę w procesie replikacji wirusa grypy. Główna zaleta uzyskana poprzez zastosowanie resweratrolu może zatem polegać na jego zdolności do zaatakowania wirusa niebezpośrednio, tj., poprzez zakłócenie funkcjonalnej struktury komórki wirusa, raczej niż oddziaływanie na samą cząsteczkę wirusa. Tego typu podejście może, zatem, prowadzić do inhibicji wirusa, pozwalając na uniknięcie zjawiska oporności na większość powszechnych leków przeciwwirusowych.

Niniejszy wynalazek zostanie szczegółowo zobrazowany również za pomocą przykładów i figur, gdzie:

na Figurze 1 przedstawiono wpływ resweratrolu na replikację wirusa grypy PR8 w komórkach MDCK i, uściślając, na Figurze 1A, w przypadku podania po infekcji, na Figurze 1B w przypadku podania przed infekcją a na Figurze 1C w przypadku podania przed i po infekcji;

na Figurze 2 przedstawiono wpływ resweratrolu na monowarstwy konfluentne niezainfekowanych komórek MDCK i, uściślając, na liczbę komórek żywych;

na Figurze 3 przedstawiono charakterystykę aktywności przeciwwirusowej resweratrolu, i, uściślając, na Figurze 3A skutek podania podczas adsorpcji wirusa a na Figurze 3B jego wpływ na cząstki wirusa;

na Figurze 4 przedstawiono charakterystykę aktywności przeciwwirusowej resweratrolu, i , uściślając, na Figurze 4A w przypadku podania natychmiast po infekcji i usunięciu po różnym czasie, i na

Figurze 4B, w przypadku dodania w różnych odstępach czasu od infekcji;

na Figurze 5 przedstawiono apoptozę w komórkach MDCK potraktowanych resweratrolem (romby: niezainfekowane, kwadraty: zainfekowane);

na Figurze 6 przedstawiono korelację pomiędzy efektem przeciwwirusowym resweratrolu a wewnątrzcząsteczkowym stanem redoks;

na Figurze 7 przedstawiono wpływ resweratrolu na syntezę białek wirusowych wirusa grypy PR8; na Figurze 8 przedstawiono wyniki PCR dla mRNA późnych białek wirusowych; na Figurze 9 przedstawiono wpływ resweratrolu in vivo po infekcji wirusem grypy PR8.

Szczegółowy opis wynalazku

W celu zobrazowania skuteczności niniejszego wynalazku, przeprowadzono badania in vitro z użyciem wirusa grypy A/PR8/34, podtypu H1N1 (w niniejszym tekście nazywany w skrócie wiru4

PL 217 628 B1 sem PR8). Szczep ten był stosowany jedynie przykładowo, należy rozumieć, że niniejszy wynalazek stosuje się do wirusa grypy w znaczeniu ogólnym.

Materiały i metody

Resweratrol jest produktem powszechnie dostępnym na rynku lub możliwym do otrzymania za pomocą znanych metod opisanych w literaturze. Zastosowaną substancję rozpuszczono w DMSO (80 mg/ml). Stężenia stosowane w eksperymentach uzyskano drogą kolejnych rozcieńczeń w RPMI 1640. Wszystkie próby kontrolne traktowano DMSO w takich samych dawkach, jakie użyto do rozpuszczenia resweratrolu. We wszystkich stężeniach, DMSO nie wywoływał efektów toksycznych na komórki.

Kultury komórkowe

W badaniach replikacji wirusa grypy zastosowano komórki MDCK (komórki nabłonka nerki psa). Komórki hodowano w fiolkach T-25 lub na 6- i 24-studzienkowych płytkach Libno w podłożu hodowlanym RPMI dodanym z L-glutaminą, penicylino-streptomycyną i 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i przechowywano w 37°C w atmosferze 5% CO2. Warstwy komórek konfluentnych były oddzielane, odrywane przy użyciu 0.25% roztworu trypsyny, wirowane i ponownie zaszczepiane w świeżym podłożu. Komórki zliczano stosując hemocytometr a żywotność komórek określano za pomocą barwienia wykluczającego Tryptanem Blue (0.02%).

Otrzymywanie wirusa

Wirus otrzymywano poprzez zaszczepianie odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny wirusowej w zagłębieniu omoczniopodobnym 10-dniowego, zawierającego zarodek jaja kurzego. Po inkubacji jaj w 37°C przez 72 godziny, płyn omoczniopodobny, zawierający nowo powstałe cząsteczki wirusa oczyszczano poprzez wirowanie w +4°C i przechowywano w -80°C.

Miareczkowanie wirusa

Miareczkowanie wirusa przeprowadzano stosując technikę hemaglutyniny, która opiera się na zdolności, w szczególności w przypadku tego wirusa, do aglutynacji komórek krwi. Nierozcieńczony wirus w płynie omoczniopodobnym miareczkowano poprzez stopniowe rozcieńczanie fosforanowym buforem soli fizjologicznej (PBS) na 96-studzienkowych płytkach, do których dodano następnie 0.5% zawiesiny komórek krwi ludzkiej grupy 0 Rh+. Płytki pozostawiano następnie w temperaturze pokojowej do czasu zajścia reakcji hemaglutynacji. Miano wirusa w próbce, wyrażone w jednostkach hemaglutynacji (HAU), określono na podstawie ostatniego rozcieńczenia powodującego całkowitą hemaglutynację. Uwolnienie wirusa z części zainfekowanych komórek oszacowywano za pomocą tej samej procedury w supernatantach zainfekowanych prób, 24 i 48 godzin po infekcji.

Infekcja wirusowa

Monowarstwy konfluentne komórek MDCK przemywano PBS i infekowano wirusem (0.2 multiplikacji infekcji [m.o.i.]). W szczególności, wirus odpowiednio rozcieńczano w RPMI bez FCS i dodawano do komórek w minimalnej objętości. Po godzinie inkubacji w 37°C (czas adsorpcji wirusa), usuwano inokulum a monowarstwy, po przemyciu PBS, w celu usunięcia nadmiaru niezaadsorbowanego wirusa, przetrzymywano w świeżym podłożu zawierającym 2% FCS. Resweratrol dodawano w różnych stężeniach (1, 5, 10, 15, 20 i 40 μg/ml), zgodnie z następującym schematem podawania: a) 24 godz. przed infekcją (przed-); b) natychmiast po adsorpcji wirusa na zainfekowanych komórkach (po-); i c) 24 godz. przed i natychmiast po adsorpcji wirusa na zainfekowanych komórkach (przed-po). We wszystkich przypadkach, substancję inkubowano przez cały czas trwania eksperymentu. 24 i 48 godz. po infekcji, miareczkowano wirus uwolniony do supernatantu poprzez ocenę jednostek hemaglutynacji. Jak przedstawiono na Figurze 1, resweratrol dodany po infekcji inhibitował replikację wirusa w sposób zależny od dawki. Przy stężeniu 20 μg/ml, miano wirusa uległo redukcji o 87% w porównaniu z zainfekowanymi i nietraktowanymi resweratrolem kontrolami, nie wykryto jakichkolwiek efektów toksycznych wobec niezainfekowanych komórek. W celu określenia możliwego stopnia toksyczności wobec komórek MDCK, były one traktowane resweratrolem po konfluencji monowarstwy, w różnych stężeniach (5, 10, 15, 20 i 40 μg/ml). Uzyskane wyniki wykazały, że przy różnych stężeniach, powodujących znaczną inhibicję wirusa grypy (10-20 μg/ml), odnotowano niewielką redukcję liczby komórek, prawdopodobnie w wyniku spowolnienia proliferacji komórki (Figura 2A). Przy tych dawkach, jednak, nie odnotowano żadnych zmian morfologicznych komórek. Jednakże, przy stężeniu 40 μg/ml, przy którym replikacja wirusa była całkowicie zablokowana, zaobserwowano efekty toksyc zne wraz ze wzrostem śmiertelności komórek (Figura 2B). Na podstawie tych wyników, w kolejnych eksperymentach, zastosowano dawkę 20 μg/ml, która pozwala na uzyskanie maksymalnej aktywności przeciwwirusowej, bez efektów ubocznych.

PL 217 628 B1

Charakterystyka aktywności przeciwwirusowej

W celu zidentyfikowania faz cyklu replikacji wirusa kontrolowanego przez resweratrol, substancję dodawano zgodnie z różnymi schematami podawania w odniesieniu do różnych faz cyklu życiowego wirusa. W fazie pierwszej, w celu oceny, czy resweratrol zakłóca wejście wirusa do komórek, substancję dodawano w stężeniu 20 ąg/ml wyłącznie podczas fazy adsorpcji wirusa (przez godzinę w 37°C), a następnie usuwano. Pomiar replikacji wirusa po 24 godz. wykazał wyniki porównywalne z replikacją uzyskaną dla komórek kontrolnych, zatem wykazano, że lek nie inhibitował wejścia wirusa (Figura 3). Ponadto, w celu oceny czy resweratrol był zdolny do bezpośredniej inaktywacji wirusa, wirus inkubowano wraz ze wspomnianą substancją w stężeniu 40 ąg/ml przez godzinę w 37°C. Następnie, w ten sposób potraktowany wirus rozcieńczano w stosunku 1:500 i stosowano do infekcji komórek. W takich warunkach nie odnotowano żadnej redukcji replikacji wirusa. Wyniki te sugerują, że resweratrol nie inaktywuje bezpośrednio cząsteczki wirusa. W drugiej fazie, komórki były infekowane i traktowane resweratrolem, ponownie przy użyciu takiego samego stężenia (20 ąg/ml), lecz substancja dodawana była w różnym czasie od infekcji (0, 3, 6 i 9 godz.). Odnotowano, że replikacja wirusa, mierzona jako HAU/ml, 24 godz. po infekcji ulegała znacznej inhibicji, jedynie, jeżeli resweratrol został dodany w ciągu 3 godz. infekcji (Figura 4B). W przypadku, jeżeli resweratrol, dodany natychmiast po infekcji, był usunięty w różnym czasie (0, 3, 6, 9 i 24 godz.), inhibicja replikacji obserwowana była jedynie, jeżeli działanie trwało przez przynajmniej 9 godzin. Ponadto, wyniki przedstawione na Figurze 4 również pokazują, że aktywność przeciwwirusowa, raz uzyskana, nie była odwracalna po przerwaniu procesu oddziaływania resweratrolu.

Replikację wirusa oceniano również za pomocą analizy występowania antygenów wirusa na powierzchni zainfekowanych komórek, przy użyciu immunofluorescencji. Immunofluorescencyjną analizę białek wirusowych przeprowadzono stosując mikroskop fluorescencyjny, przy użyciu filtra emisji zielonej (FITC) (soczewka 100x). Infekowano komórki MDCK, hodowane na szkiełkach nakrywkowych przez 24 godz. 18 godz. po infekcji, utrwalano je mieszaniną metanol-aceton 1:1 w 4°C przez 15 min. Następnie, komórki przemywano dwukrotnie w PBS i permeabilizowano 0.1% roztworem PBSTRITON przez 5 min. Blokadę niespecyficznych miejsc wykonano 1% mlekiem rozpuszczonym w PBS, przez 30 min w temperaturze otoczenia. Następnie, dodano swoiste wobec białek wirusa monoklonalne przeciwciała (mysie przeciwko NP wirusa grypy i mysie przeciwko M wirusa grypy), rozcieńczono 1:50 w PBS i inkubowano przez 30 min w temperaturze otoczenia. Pierwszorzędowe przeciwciało wykrywano za pomocą drugorzędowego przeciwciała sprzężonego z fluoresceiną (przeciw mysiemu FITC, Sigma).

Analiza syntezy białek wirusa i współzależność z aktywnością przeciwwirusową resweratrolu

Białka wirusa analizowano stosując technikę Western blotting. W różnych odstępach czasu po infekcji wirusa, komórki poddawano lizie stosując specjalne bufory do lizy. Następnie, nakładano równe ilości białek na żel poliakrylamidowy w SDS. Po elektroforezie, białka przenoszono na membranę nitrocelulozową i traktowano przeciwciałem poliklonalnym skierowanym przeciwko wirusowi grypy. Po inkubacji i odpowiednich przemywaniach, na filtry działano drugim przeciwciałem, sprzężonym z peroksydazą, po czym uwidaczniano białka wirusa za pomocą techniki chemiluminescencji (ECL), z użyciem substratu peroksydazy (luminol), który, w wyniku reakcji z enzymem, emituje światło i uwidacznia obraz na płytce do autoradiografii. Komórki poddawano działaniu resweratrolu w różnych stężeniach (5, 10, 15 i 20 ąg/ml). W celu uzyskania lepszego obrazu białek wirusowych, elektroforezę wykonano z użyciem 10% żelu poliakrylamidowego (Figura 7A) i w gradiencie żelu (Figura 7B). Resweratrol w stężeniu 15 i 20 ąg/ml niemal całkowicie inhibitował syntezę późnego białka hemaglutyniny wirusa grypy (H0-H1, H2) i białek matrycowych (M). Natomiast, w przypadku ekspresji wczesnych białek nukleokapsydu (nukleoproteina [NP] i białko polimerazy [P], ulegała ona inhibicji, jednak w mniejszym zakresie, niż późnych białek.

Analiza syntezy informacyjnego RNA

W celu zidentyfikowania mechanizmu inhibicji białek wirusowych, komórki MDCK, zainfekowane i poddane działaniu resweratrolu w różnych, opisanych wyżej stężeniach, analizowano stosując technikę PCR, opisaną przez Tobita i wsp. (J. General Virol., 78, 563-566, 1997). Komórki MCDK zainfekowane wirusem i/lub poddane działaniu resweratrolu homogenizowano wraz z odczynnikiem GIBCO BRL TRIZOL. Po 5 min. inkubacji w temperaturze otoczenia, dodano chloroform (0.2 ml na próbę), po czym inkubowano próby w 15-30°C przez 3 minuty. Następnie, próby wirowano przy 10,000 obr./min przez 15 min w +4°C i zbierano fazę wodną zawierającą RNA. Dodano 0.5 ml izopropanolu i inkubowano próby w 15-30°C przez 10 min, a następnie wirowano. Uzyskane supernatanty usuwano a osad

PL 217 628 B1

RNA poddawano działaniu 75% etanolu przy 8,000 obr./min przez 5 min w 2-8°C. Ostatecznie, osad suszono na powietrzu i rozpuszczano w 20 ąl wody-DEPC (pirowęglan dietylu). Uzyskany RNA poddano transkrypcji za pomocą odwrotnej transkryptazy. Retrotranskrypcję przeprowadzono na 5 ąl RNA każdej z prób w mieszaninie zawierającej losowo dobrane startery, cztery deoksynukleotydy (dNTP=dATP, dCTP, dGTP, dTTP), ditiotreitol (DTT) i bufor RT (Life Technologies). Syntezę komplementarnego DNA (cDNA) wykonano pozostawiając mieszaninę przez 10 min w 22°C, następnie przez 60 min w 42°C i ostatecznie, reakcję inaktywowano przez 10 min w 75°C. Tak uzyskany cDNA zastosowano następnie w PCR. W PCR zastosowano polimerazę Taq. PCR przeprowadzono w trzech fazach denaturacji, przyłączania starterów (annealingu) i elongacji w odpowiednich temperaturach 95, 48 i 72°C. Cykl powtórzono 20 razy. Oligonukleotydy zastosowane do amplifikacji wirusowego RNA były następujące: dla genu wirusowego kodującego białko hemaglutyniny (HA) 5' starter: 5'-ACCAAAATGAAGGCAAACC-3', 3' starter: 5'-TTACTGTTAGACGGGTGAT-3'; dla genu wirusowego kodującego białko matrycy (M) 5' starter: 5'-ATGAGTCTTCTAACCG-3', 3' starter: 5'-ACTGCTTTGTCCATGT-3'. Produkt PCR poddawano elektroforezie (100 woltów) w 1% żelu agarozowym, w buforze, do którego dodano bromek etydyny w celu uwidocznienia DNA w świetle UV (UV transiluminatorze). Uzyskane próby oceniano odpowiednio po 4, 8 i 20 godz. od infekcji wirusowej. Nie odnotowano obecności informacyjnego RNA dla wirusowych białek HA i M po 4 godz., ani w kontroli ani w grupie prób poddanych działaniu resweratrolu. Wyniki wykazują, że działanie resweratrolu nie ma wpływu na syntezę mRNA 20 godz. po infekcji. Obserwacja prób po 4 godz. wykazała, że resweratrol spowodował jedynie opóźnienie syntezy informacyjnego RNA tych białek (Figura 8). Wyniki sugerują, że resweratrol w dawkach 20 ąg/ml powoduje opóźnienie wydzielania informacyjnego RNA dla późnych białek wirusowych (HA i M), ocenianych 8 godz. po infekcji.

Umiejscowienie białka NP

Biorąc pod uwagę, że inhibicja białka kinazy C w komórkach zainfekowanych przez wirus grypy powoduje istotną redukcję ekspresji białka M, wraz z zatrzymaniem nukleoproteiny jądra zainfekowanych komórek (J. Virol., 74, 1781-86, 2000), komórki MDCK zainfekowane wirusem PR8 i poddane działaniu, lub nie, resweratrolu w stężeniu 20 ąg/ml były barwione swoistym przeciw-M i przeciw-NP przeciwciałem i obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym. Wyniki ujawniły, że w niezainfekowanych komórkach odnotowano NP zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie a M1 głównie w cytoplazmie, natomiast w komórkach traktowanych resweratrolem NP pozostało zatrzymywane w jądrze i M, silnie inhibitowane, mogło być równie dobrze obserwowane jedynie w jądrze. Zjawisko to może związane z inhibicją białek komórki o funkcji kinazy. Dane sugerują, ponadto, że mechanizm działania przeciwwirusowego może być związany z inhibicją białek o opisanej wyżej funkcji kinazy (FEBS Letters, 45, 63-7, 1999).

Analiza zredukowanego i utlenionego glutationu

Analizę glutationu przeprowadzono w oparciu o ilość utworzonych pochodnych S-karboksymetylowych wolnych tiolów z kwasem jodooctowym, po których następowała konwersja terminalnych grup NH2 do pochodnych 2,4-dinitrofenylowych po reakcji 1-fluoro-2,4-dinitrobenzenu (Anal. Biochem., 106, 55-62, 1980). Komórki MDCK były oddzielane za pomocą techniki zeskrobywania. Następnie, komórki wirowano przy 1,200 obr./min przez 5 minut. Komórki dwukrotnie przemywano w PBS a osad, uzyskany po wirowaniu, zawieszano ponownie w 200 ąl buforu. Lizaty komórkowe, otrzymane z powtarzanych cykli zamrażania i rozmrażania, były odbiałczane poprzez precypitację w 5% kwasie metafosforowym. Po wirowaniu przy 22,300 g, tiole o wadze niskocząsteczkowej, obecne w supernatancie były derywatyzowane z 10% kwasem jodooctowym v/v i neutralizowane za pomocą NaHCO3 w formie proszku. Po 1 godz. inkubacji w ciemności, dodano roztwór 1.5% 1-chloro-2.4-dinitrobenzenu v/v (1.5 ml/98.5 ml absolutnego etanolu). Po dodaniu odczynnika Sanger'a, próby inkubowano przez 12 godz. w ciemności i dokonano rozdzielenia na różne rodzaje glutationu za pomocą kolumny ąBondapak 3.9 x 300 mm (Millipore) NH2 HPLC. W celu określenia całkowitej zawartości GSH, odnoszono się do krzywej standardowej otrzymanej dla oczyszczonego GSH. Zawartość GSH wyrażono w GSH nmol/mg białek obecnych w próbie lizatu. Stężenie białka obliczano stosując metodę Lowry'ego (Biol. Chem., 193, 265-75, 1951). W metodzie tej wykorzystuje się zdolność białek do redukcji odczynnika Folin'a-Ciocalteau w zasadowym roztworze z jonami Cu²⁺, dzięki obecności grup fenolowych licznych aminokwasów, takich jak tryptofan, tyrozyna, cysteina i histydyna. Tryptofan i tyrozyna reagują poprzez ich szczególnie reaktywne grupy fenolowe, cysteina poprzez grupę -SH a histydyna przez pierścień imidazolowy. Produkt reakcji redukcji wykrywano poprzez utworzenie barwnych związków w wyniku reakcji z aminokwasami aromatycznymi białek. W istocie, roztwór przyPL 217 628 B1 biera szczególnie intensywny niebieski kolor o piku absorpcji przy 695 nm. Na podstawie proporcji absorpcji, uzyskiwane jest stężenie białek w odniesieniu do linii krzywej kalibracyjnej, otrzymanej przy użyciu różnych stężeń albuminy wołowej jako standardu. W celu określenia możliwej korelacji między aktywnością przeciwwirusową a zmianami stanu redoks, analizowano stężenie komórkowego GSH komórek MDCK, traktowanych różnymi stężeniami resweratrolu i zainfekowanych, lub nie, wirusem, stosowano analizę HPLC 24 godz. po infekcji. Zaskakująco, resweratrol dodany do niezainfekowanych komórek MDCK powodował obniżenie poziomu wewnątrzkomórkowego GSH w porównaniu z nietraktowanymi komórkami (Figura 6). Dodanie resweratrolu do zainfekowanych komórek, poprzez inhibicję replikacji wirusa, nie przywróciło obniżonego w wyniku infekcji poziomu GSH.

Analiza apoptozy

Jeżeli chodzi o analizę apoptozy, komórki MDCK infekowano wirusem PR8. Po adsorpcji wirusa, komórki poddawano działaniu resweratrolu w różnych stężeniach (5, 10, 15 i 20 μg/ml). Dwadzieścia cztery godziny po infekcji, komórki oddzielano stosując 0.25% roztwór trypsyny, a następnie wirowano przy 1,200 obr./min. przez 5 min. Tak uzyskany osad analizowano za pomocą techniki FACS po znakowaniu jodkiem propidionowym. W celu oceny, czy indukcja śmierci komórki poprzez apoptozę wynikała z przeciwwirusowego efektu resweratrolu, komórki MDCK infekowano, lub nie, wirusem i poddawano działaniu różnych stężeń substancji. Śmierć komórki poprzez apoptozę oceniano stosując FACS po znakowaniu jodkiem propidionowym. Jak przedstawiono na Figurze 5, resweratrol powodował pewien stopień śmierci komórek poprzez apoptozę w niezainfekowanych komórkach, zmieniający się od 8 do 32%, zależnie od dawki (odpowiednio 5 i 20 μg/ml). Sama infekcja indukowała apoptozę w 12% zainfekowanych komórek. Mimo że dodanie wzrastających dawek powodowało wzrost śmiertelności, nie zaobserwowano żadnej znaczącej różnicy pomiędzy zainfekowanymi komórkami a niezainfekowanymi komórkami poddanymi działaniu dawek przeciwwirusowych leku (odpowiednio 35 i 37% apoptozy).

W celu dalszego potwierdzenia wyników niniejszego wynalazku, dla przykładu, opisano następujące badania in vivo.

P r z y k ł a d

Zastosowano czterotygodniowe samice chowu wsobnego myszy Balb/c AnCrIBR. Resweratrol, rozpuszczony w PBS, podawano zwierzętom drogą wewnątrzotrzewnową, po upływie różnego czasu od infekcji wirusem grypy. Stężenia resweratrolu wybrano tak, by uzyskać zakres dawek w krwi zwierząt podobny do skutecznego zakresu in vitro (10 do 20 μg/ml). Myszy zaszczepiano wewnątrznosowo (i.n.) zawiesiną zawierającą wirus grypy A/PR o multiplikacji infekcji 2 HAU/myszę, po lekkim znieczuleniu eterem. Na podstawie wcześniejszych danych eksperymentalnych, wirus grypy o tej multiplikacji infekcji powoduje krwotoczne zapalenie płuc, które prowadzi do śmierci 80% zwierząt w ciągu jednego tygodnia od infekcji. W celu śledzenia tendencji infekcji, oprócz badania krzywych przeżywalności, monitorowano parametry zarówno wirologiczne, jak i immunologiczne. Jako parametr wirologiczny, określono obciążenie wirusa (ang. viral load). W różnych czasach od infekcji, jako próby pobierano płuca zainfekowanych i kontrolnych myszy, które ważono i homogenizowano w RPMI zawierającym antybiotyki. Po wirowaniu, supernatanty odpowiednio rozcieńczano i analizowano obciążenie wirusa za pomocą testu CPE-50%. Na podstawie tej metody, konfluentne komórki MDCK infekowano supernatantami seryjnie rozcieńczonymi w RPMI, dodanym z antybiotykami, wraz z 2% FCS i inkubowano przez trzy dni w 37°C w atmosferze 5% CO2. Ostatecznie, dla każdego rozcieńczenia, zliczano studzienki wykazujące pozytywny efekt i porównywano z tymi, które wykazywały negatywny efekt cytopatyczny, zgodnie ze wzorem Reed i Muench. Miano CCPE-50% obliczano w jednostkach/ml. Jako parametr immunologiczny, oceniano poziom cytokin zapalnych stosując test ELISA. Do eksperymentów zastosowano 96-studzienkową płytkę. Płytkę opłaszczano przeciwciałami monoklonalnymi, swoistymi wobec badanych cytokin, po czym inkubowano przez noc w 4°C. Następnie, dodano 200 gl//studzienkę 1% BSA w buforze węglanowym i inkubowano przez 30 min w 37°. W następnym etapie wykonano płukania 0.25% TBS + Tween 20 i dodano próby, pozostawiając na 4 godziny w 37°C. Jako krzywą odniesienia użyto krzywą dla rekombinowanych cytokin w skalarnym rozcieńczeniu. Następnie, wykonano płukania i dodano przeciw-cytokinowe, poliklonalne przeciwciało, różne od pierwszego, próby pozostawiono na noc w +4°C. Następnie, do płukania w 0.5% TBS+Tween 20, 2 nM MgCI2 dodano trzecie przeciwciało sprzężone z enzymem-alkaliczną fosfatazą i inkubowano przez 4 godz. w 37°C. W końcu, dodano substrat dla enzymu (100 μl/studzienkę) i dokonano odczytu stosując czytnik ELISA i filtr 405 nm. Analizowano następujące przeciwciała: 1) monoklonalne szczurze, skierowane przeciwko mysiemu TNF-alfa/rekombinowane mysie IL-6; 2) rekombinowane mysie TNF-alfa/8

PL 217 628 B1 /rekombinowane mysie IL-6; 3) poliklonalne królicze przeciw-mysie TNF-alfa/poliklonalne kozie przeciw-mysie IL-6; 4) kozie przeciw-królicze IgG-alkaliczna fosfataza/przeciw-kozie IgG alkaliczna fosfataza. Skuteczność resweratrolu badano w eksperymentalnym modelu infekcji wirusem grypy u myszy. W modelu tym, zaszczepienie wewnątrznosowe wirusem spowodowało poważne krwotoczne zapalenie płuc, które prowadziło do śmierci zwierząt w ciągu 7 do 10 dni infekcji. Plan eksperymentu przewidywał oszacowanie skuteczności terapeutycznej badanej substancji, którą oceniano na podstawie przeżywalności zainfekowanych zwierząt. W tym celu, resweratrol podawano zwierzętom w różnych dawkach, codziennie przez 7 dni, poczynając od kilku godzin po infekcji. Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, że gdy śmiertelność niepoddanych działaniu resweratrolu zwierząt była tak wysoka, jak 80%, podawanie resweratrolu (1 mg/kg) znacznie obniżyło śmiertelność - 60% zwierząt przeżyło infekcję (Figura 9).

Claims (3)

1. Zastosowanie resweratrolu do wytwarzania leku wywierającego działanie inhibitorowe na replikację wirusa grypy do zapobiegania i/lub leczenia infekcji wywołanej wirusem grypy.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniany wirus jest wirusem ludzkiej grypy.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniany lek jest przeznaczony do leczenia infekcji wirusowych w dziedzinie weterynarii.

Rysunki

Figura 1

Wpływ resweratrolu na replikację wirusa grypy pr8 w komórkach MDCK