ES2295660T3 - Uso de resveratrol en la preparacion de un medicamento util para el tratamiento de infecciones por el virus influenza. - Google Patents

Abstract

Uso de resveratrol como un principio activo en la preparación de un medicamento que ejerce una acción inhibidora sobre la replicación del virus influenza y es útil para la prevención y/o el tratamiento de infecciones por el virus influenza.

Description

Uso de resveratrol en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de infecciones por el virus influenza.

La invención descrita en el presente documento se refiere al uso de resveratrol como principio activo en la preparación de un medicamento que ejerce una acción inhibidora sobre la replicación del virus influenza y es útil para tratar infecciones por el virus influenza.

Antecedentes de la invención

Recientemente, se ha estudiado intensamente el resveratrol, es decir, 3,4,5-trihidroxiestilbeno, en relación con las conocidas propiedades beneficiosas del vino tinto, del que es uno de los componentes fundamentales (Life Sci., 71, 2145-52, 2002).

El resveratrol se localiza en los hollejos de las uvas tintas en cantidades que oscilan desde 50 hasta 100 \mug/gramo y su concentración en el vino tinto oscila desde 1,5 hasta 3 mg/l.

Numerosos estudios han demostrado una actividad anticarcinogénica del resveratrol, cuyos mecanismos de acción pueden subdividirse tal como sigue: inhibición de la activación del factor de transcripción NF-kB, que puede regular la expresión de diversos genes que participan en procesos inflamatorios y carcinogénicos (Lancet, 341, 1103-1104, 1993; Science, 275, 218-220, 1997; Proc. Natl. Acad. Sc., 94, 14138-14143, 1997; Life Science, 61, 2103-2110, 1997; Brit. J. Pharm., 126, 673-680, 1999; J. Imm., 164, 6509-6519, 2000); inhibición de diversas proteínas, incluyendo la proteína cinasa C (Bioch., 38, 13244-13251, 1999), ribonucleótido reductasa (FEBS Lett., 421, 277-279, 1998) y ciclooxigenasa 2 (COX-2) en células epiteliales de mamífero (Ann. N. Y. Acad. Sci, 889, 214-223, 1999; Carcinog., 21, 959-963, 2000); activación de las caspasas 2, 3, 6 y 9 (FASEB J., 1613-1615, 2000) y modulación del gen p53, que es un supresor tumoral conocido (Cancer Research, 59, 5892-5895, 1999; Clin. Bioch., 34, 415-420,
2001).

Entre las acciones beneficiosas de resveratrol, también deben mencionarse su actividad antioxidante, sugerida por la capacidad mencionada anteriormente para contrarrestar los efectos perjudiciales producidos por diversas sustancias y/o estados que provocan estrés oxidativo intracelular (Free Radic. Res., 33, 105-114, 2000).

El resveratrol puede inducir relajación vascular por medio de la producción de óxido nítrico a nivel endotelial vascular (Cancer Res., 59, 2596-01, 1999), inhibir la síntesis de tromboxano en las plaquetas (Clin. Chim. Acta, 235, 207-219, 1995; Int. J. Tissue React., 17, 1-3, 1995), y de leucotrienos en los neutrófilos y evitar la oxidación y agregación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) (Lancet, 341, 1103-1104, 1993; Life Sci., 64, 2511-2521, 1999).

Recientemente, se ha demostrado una actividad inhibidora de resveratrol frente al virus de ADN del herpes simple (Antiv. Res., 43, 145-155, 1999) basándose en sistemas experimentales in vitro.

Los datos obtenidos por los presentes autores y por otros equipos de investigación revelaron que muchas sustancias antioxidantes pueden inhibir in vitro la replicación del virus Sendai de la parainfluenza (VS) tipo 1, del virus del herpes simple 1 (VHS-1) y del virus de la inmunodeficiencia adquirida (VIH) (AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1997: 1537-1541; Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992; 188, 1090-1096; Antivir. Res., 1995, 27, 237.253). También se ha demostrado la eficacia antiviral de sustancias antioxidantes en un modelo de SIDA murino (SIDAM), así como en queratitits por VHS1 (AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1996: 12, 1373-1381: Exp. Eye. Res., 200: 70, 215-220).

La gripe es un problema epidemiológico de proporciones mundiales con graves problemas para la salud pública como resultado y con importantes repercusiones económicas en la atención sanitaria. El virus responsable de la gripe está extendido y es sumamente infeccioso. Desafortunadamente, los tratamientos disponibles actualmente no son todavía completamente eficaces y a menudo conducen a la selección de cepas virales resistentes (Fields, cap. 47, 1533-79, 2001) y, lo que es más, las campañas de vacunación, además de las desventajas inherentes en la prevención basada en vacunas, aún no proporcionan una cobertura satisfactoria debido a la enorme variabilidad antigénica del virus (Fields, cap. 47, 1533-79, 2001).

Entre las diversas estrategias para atacar la replicación viral, estudios recientes (J. of Virol., 74, 1781-1786, 2000) han notificado el importante papel de la proteína M1 en el transporte de ribonucleoproteínas virales específicas hasta el citoplasma. Esto parece ser una etapa fundamental en el ciclo de replicación del virus, tanto que puede buscarse la inhibición de la replicación viral a través de la retención de la nucleoproteína en el núcleo de la célula infectada debido a la inhibición de la síntesis de proteína M. Este fenómeno puede atribuirse a la inhibición de proteínas celulares con una función cinasa. De hecho, recientemente se ha demostrado que la inhibición de las cinasas provoca la retención de la NP del núcleo celular (Nature Cell. Biol., 3, 301-5, 2001; J. of Virol., 74, 1781-86, 2000), junto con una potente acción inhibidora frente a la replicación del virus influenza.

Se sabe que GSH es el principal antioxidante en el sistema redox celular y se ha asociado con la replicación de diversos virus. De hecho, estudios previos llevados a cabo por los presentes inventores han demostrado que durante la infección viral, es posible observar una reducción en los niveles de GSH como resultado de la propia infección (Rotilio et al., "Oxidative stress on cell activation in viral infection", 143-53, 1993; Palamara et al., Antiviral Research, 27, 237-53, 1995).

La regulación aberrante del conocido mecanismo de apoptosis es el factor subyacente responsable de numerosas enfermedades humanas, tales como varias enfermedades autoinmunitarias, infecciosas o neurológicas, tales como el SIDA y el cáncer.

En estudios previos, se ha descrito que resveratrol permite la eliminación de células tumorales a través de la inducción de apoptosis de las células. Recientemente, estudios realizados por Tinhofer I. et al. (FASEB J., 18, 1613-15, 2001) han revelado que los primeros acontecimientos de la apoptosis inducida por resveratrol se caracterizan por la alteración del potencial de membrana mitocondrial (\Delta\Phim), por la liberación de especies reactivas del oxígeno (ROS) y por la activación de las caspasas 2, 3, 6 y 9. También se sabe que el virus influenza induce apoptosis en diversos porcentajes, según la cepa viral y la multiplicidad de infección.

\vskip1.000000\baselineskip

Sumario de la invención

Se ha descubierto ahora que el resveratrol ejerce una acción inhibidora sobre la replicación del virus influenza. De manera totalmente sorprendente, también se ha descubierto que el resveratrol ejerce su acción inhibidora sobre la replicación del virus influenza no a través de la actividad antioxidante esperada, sino a través de un mecanismo particular de inhibición de la proteína cinasa C, una enzima celular que desempeña un papel principal en el proceso de replicación del virus influenza. Por tanto, la principal ventaja ofrecida por el uso de resveratrol consiste en su capacidad para atacar al virus indirectamente, es decir interfiriendo en una estructura celular funcional del virus, en lugar de en la propia partícula viral. Por tanto, este tipo de enfoque podría conducir a la inhibición del virus, evitando que se produzca el fenómeno de resistencia a los fármacos antivirales más comunes.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es el uso de resveratrol para la preparación de un medicamento útil para la prevención y/o el tratamiento de infecciones por el virus influenza. En una aplicación preferida de la presente invención, se usa resveratrol frente al virus influenza humano. En una aplicación más amplia de la invención, sus objetivos también incluyen el uso de resveratrol para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de infecciones por el virus influenza en el campo veterinario.

Ahora se ilustrará la presente invención en detalle, también con la ayuda de ejemplos y figuras, en las que:

la figura 1 ilustra el efecto del resveratrol sobre la replicación del virus influenza PR8 en células MDCK, y, para ser exacto, en la figura 1A en el caso de administración tras la infección, en la figura 1B en el caso de administración previa a la infección, y en la figura 1C en el caso de administración previa y tras la infección;

la figura 2 ilustra el efecto del resveratrol sobre monocapas confluentes de células MDCK no infectadas, y, para ser exacto, el número de células viables;

la figura 3 ilustra la caracterización de la actividad antiviral de resveratrol, y, para ser exacto, en la figura 3A el tratamiento durante la adsorción viral y en la figura 3B el efecto sobre las partículas virales;

la figura 4 ilustra la caracterización de la actividad antiviral de resveratrol, y, para ser exacto, en la figura 4A en el caso de administración inmediatamente después de la infección y retirada en diferentes momentos, y, en la figura 4B, en el caso de adición en diferentes momentos en relación con la infección;

la figura 5 ilustra la apoptosis en células MDCK tratadas con resveratrol (rombos: no infectadas, cuadrados: infectadas);

la figura 6 ilustra la correlación entre el efecto antiviral de resveratrol y el estado redox intracelular;

la figura 7 ilustra el efecto de resveratrol sobre la síntesis de proteínas virales del virus influenza PR8;

la figura 8 ilustra el resultado de la PCR para ARNm de proteínas virales de expresión tardía;

la figura 9 ilustra el efecto de resveratrol in vivo después de la infección con el virus influenza PR8.

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción detallada de la invención

Para los fines de ilustrar la eficacia de la presente invención, se han llevado a cabo estudios in vitro usando el virus influenza A/PR8/34, subtipo H1N1 (a continuación en el presente documento denominado brevemente virus PR8). Esta cepa se usó meramente a modo de ejemplo, entendiéndose que la presente invención es aplicable al virus influenza en el sentido general del término.

\newpage

Materiales y métodos

El resveratrol es un producto que está disponible comúnmente en el mercado o que puede obtenerse usando los métodos conocidos notificados en la bibliografía. Se usó la sustancia disuelta en DMSO (80 mg/ml). Se obtuvieron las concentraciones usadas para los experimentos por medio de diluciones sucesivas con RPMI 1640. Se trataron todas las muestras control con DMSO a las mismas dosis usadas para disolver el resveratrol. En estas concentraciones, el DMSO no produjo efectos tóxicos en las células.

Cultivos celulares

Para el estudio de la replicación del virus influenza, se usaron células MDCK (células epiteliales de riñón de perro). Se cultivaron las células en viales T-25 o en placas Libno de 6 y 24 pocillos en medio de cultivo RPMI al que se añadió L-glutamina, penicilina-estreptomicina y un 10% de suero de ternero fetal (FCS) y se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera con un 5% de CO_{2}. Se separaron las monocapas de células confluentes con una disolución de tripsina al 0,25%, se centrifugaron y volvieron a sembrarse en medio nuevo. Se realizó el recuento celular usando un hemocitómetro y se determinó la viabilidad celular por medio de exclusión con tinción para evaluar la viabilidad con azul trípano (al 0,02%).

Producción del virus

Se produjo el virus por medio de inoculación de una suspensión viral diluida de manera adecuada en la cavidad alantoidea de huevos de gallina embrionados de 10 días. Después de incubar los huevos a 37ºC durante 72 horas, se clarificó el líquido alantoideo que contenía las partículas virales recién formadas centrifugándolo a +4ºC y se almacenó a -80ºC.

Titulación del virus

Se realizó la titulación del virus usando la técnica de la hemaglutinina que se basa en la capacidad, peculiar de este virus, para aglutinar células sanguíneas.

Se tituló el virus no diluido en el líquido alantoideo mediante dilución escalar con solución salina tamponada con fosfato (PBS) en placas de 96 pocillos, a las que se añadió después una suspensión al 0,5% de células sanguíneas humanas del grupo 0 Rh+. Entonces se dejaron las placas a temperatura ambiente el tiempo necesario para que tenga lugar la reacción de hemaglutinación. Se representó el título viral de la muestra, expresado en unidades de hemaglutinación (UHA), mediante la última dilución que dio lugar a hemaglutinación completa. Se evaluó la liberación de virus en la parte de las células infectadas con el mismo procedimiento en los sobrenadantes de las muestras infectadas que se tomaron 24 y 48 h después de la infección.

Infección viral

Se lavaron las monocapas confluentes de células MDCK con PBS y se infectaron con el virus (multiplicidad de infección [m.o.i.] de 0,2). En particular, el virus se diluyó de manera adecuada con RPMI sin FCS y se añadió a la célula en el volumen mínimo. Después de 1 hora de incubación a 37ºC (periodo de adsorción del virus), se retiró el inóculo y se mantuvieron las monocapas, después de lavado con PBS para eliminar el virus no adsorbido en exceso, en medio nuevo que contenía un 2% de FCS. Se añadió resveratrol a diversas concentraciones (1, 5, 10, 15, 20 y 40 \mug/ml), según los siguientes programas de tratamiento: a) 24 h antes de la infección (previo); b) inmediatamente después de la adsorción del virus e las células de la infección (tras); y c) 24 h antes e inmediatamente después de la adsorción del virus a las células de la infección (previo-tras). En todos los casos, se dejó que la sustancia incubara en toda la duración del experimento. A las 24 y 48 h después de la infección, se tituló el virus liberado en el sobrenadante mediante la evaluación de las unidades de hemaglutinación. Tal como se muestra en la figura 1, el resveratrol añadido tras la infección inhibió la replicación viral de manera dependiente de la dosis. A la concentración de 20 \mug/ml, se redujo el título viral en un 87% en comparación con controles infectados y no tratados, sin ningún efecto tóxico sobre las células no infectadas que están detectándose. Para los fines de determinar el posible grado de toxicidad en las células MDCK, se trataron estas últimas con resveratrol después de la confluencia de la monocapa, a diversas concentraciones (5, 10, 15, 20 y 40 \mug/ml). Los resultados obtenidos demuestran que a las dosis que provocaron una inhibición significativa del virus influenza (10-20 \mug/ml), se observó una ligera reducción del número de células, probablemente debido a una ralentización de la proliferación celular (figura 2A). A estas dosis, sin embargo, no se observaron alteraciones morfológicas de las células. Sin embargo, a la concentración de 40 \mug/ml, a la que se bloqueó completamente la replicación viral, se observaron efectos tóxicos con un aumento de la mortalidad celular (figura 2B). Basándose en este resultado, en los siguientes experimentos se usó la dosis de 20 \mug/ml, que produjo una actividad antiviral máxima sin efectos secundarios.

Caracterización de la actividad antiviral

Con el objetivo de identificar las fases del ciclo de replicación viral controladas por resveratrol, se añadió la sustancia según diferentes programas de tratamiento en relación con las diversas fases del ciclo vital del virus. En la primera fase, para los fines de valorar si el resveratrol interfiere en la entrada del virus en las células, se añadió la sustancia a una concentración de 20 \mug/ml exclusivamente durante la fase de adsorción viral (durante una hora a 37ºC) y luego se retiró. Se mostró que la medición de la replicación viral después de 24 h era comparable a la replicación obtenida en las células control, demostrando así que el fármaco no inhibía la entrada del virus (figura 3). Además, para valorar si el resveratrol podía inactivar directamente el virus, se incubó este último con la sustancia a una concentración de 40 \mug/ml durante una hora a 37ºC. Posteriormente, el virus así tratado se diluyó 1:500 y se usó para infectar las células. En estas condiciones, no se observó reducción de la replicación viral. Estos resultados sugirieron que el resveratrol no inactiva directamente la partícula viral. En una segunda fase, se infectaron las células y se trataron con resveratrol, de nuevo usando la misma concentración (20 \mug/ml), pero se añadió la sustancia en diversos momentos después de la infección (0, 3, 6 y 9 h). La replicación viral, valorada como UHA/ml 24 h después de la infección, reveló que ésta se inhibía significativamente sólo si se añadía resveratrol en el plazo de 3 h desde la infección (figura 4B). Por el contrario, si se retiraba el resveratrol, añadido inmediatamente después de la infección, en diversos momentos (0, 3, 6, 9 y 24 h), se observaba inhibición de la replicación sólo si el tratamiento duraba al menos 9 horas. Además, los resultados presentados en la figura 4 también muestran que la actividad antiviral, una vez obtenida, no era reversible al suspender el tratamiento.

También se valoró la replicación viral con el análisis de la aparición de antígenos virales sobre la superficie de la célula infectada por medio de inmunofluorescencia. El análisis de las proteínas virales mediante inmunofluorescencia se realizó con un microscopio de fluorescencia usando un filtro que emite en el verde (FITC) (objetivo 100x). Se infectaron células MDCK, cultivadas sobre portaobjetos durante 24 h y, 18 h después de la infección, se fijaron con metanol-acetona 1:1 a 4ºC durante 15 min. Posteriormente, se lavaron las células dos veces con PBS y se permeabilizaron con una disolución al 0,1% de PBS-TRITON durante 5 min. Se realizó el bloqueo de los sitios no específicos con un 1% de leche disuelta en PBS durante 30 min. a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadieron anticuerpos monoclonales específicos (de ratón anti-NP de influenza y de ratón anti-M de influenza) frente a las proteínas virales, se diluyeron 1:50 con PBS durante 30 min. a temperatura ambiente. Se detectó el anticuerpo primario con un anticuerpo secundario conjugado con fluoresceína (anti-ratón-FITC, Sigma).

Análisis de la síntesis de proteínas virales y correlación con la actividad antiviral de resveratrol

Se analizaron las proteínas virales mediante inmunotransferencia de tipo Western. En diferentes momentos después de la infección viral, se lisaron las células usando tampones de lisis especiales.

Entonces se cargaron cantidades iguales de proteínas en un gel de poliacrilamida en SDS. Después de la electroforesis, se transfirieron las proteínas a una membrana de nitrocelulosa y se trataron con anticuerpo policlonal anti-influenza. Después de incubación y lavados adecuados, se trataron los filtros con un segundo anticuerpo conjugado con peroxidasa y se destacaron las proteínas virales por medio de la técnica de quimioluminiscencia (ECL), usando un sustrato de peroxidasa (luminol) que, al reaccionar con la enzima, emite una luz y produce una impresión sobre la placa de autorradiografía. Se trataron las células con resveratrol a diversas concentraciones (5, 10, 15 y 20 \mug/ml). Para permitir una mejor obtención de imágenes de las proteínas virales, la ejecución de la electroforesis se realizó usando un gel de poliacrilamida al 10% (figura 7A) y gel en gradiente (figura 7B). El resveratrol a concentraciones de 15 y 20 \mug/ml inhibió casi totalmente la síntesis de proteínas de la matriz (M) y la hemaglutinina (H0-H1, H2) del virus influenza de expresión tardía. Por el contrario, se inhibió la expresión de proteínas de la nucleocápside de expresión temprana (nucleoproteína [NP] y proteína polimerasa [P]), aunque en un grado menor que el de las proteínas de expresión tardía.

Análisis de la síntesis de ARN mensajeros

Para los fines de identificar el mecanismo de inhibición de las proteínas virales, se analizaron células MDCK, infectadas y tratadas con resveratrol en las diferentes concentraciones descritas anteriormente, por medio de la técnica de PCR descrita por Tobita et al. (J. General Virol., 78, 563-566, 1997). Se homogeneizaron células MDCK infectadas con el virus y/o tratadas con resveratrol, con el reactivo TRIZOL de GIBCO BRL. Después de incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos, se añadió cloroformo (0,2 ml por muestra) y se incubaron las muestras a 15-30ºC durante 3 minutos. Luego se centrifugaron a 10.000 rpm durante 15 min. a +4ºC y se recuperó la fase acuosa que contenía el ARN. Se añadieron 0,5 ml de isopropanolol y se incubaron las muestras a 15-30ºC durante 10 min. y luego se centrifugaron. Se retiraron los sobrenadantes obtenidos y se trató el precipitado de ARN con etanol al 75% a 8.000 rpm durante 5 min. a 2-8ºC. Por último, se secó al aire el precipitado y se disolvió en 20 \mul de agua-DEPC (pirocarbonato de dietilo).

Se transcribió el ARN obtenido usando la transcriptasa inversa. Se realizó la retrotranscripción con 5 \mul de ARN de cada muestra en una mezcla que consistía en cebadores aleatorios, los cuatro desoxinucleótidos (dNTP=dATP, dCTP, dGTP, dTTP), ditiotreitol (DTT) y tampón RT (Life Technologies). Se realizó la síntesis de ADN complementario (ADNc) dejando la mezcla durante 10 min. a 22ºC, luego durante 60 min. a 42ºC y finalmente se inactivó la reacción durante 10 min. a 75ºC. El ADNc así obtenido se usó luego en la PCR.

Se usó Taq polimerasa en la PCR. Se llevó a cabo la PCR en sus tres fases de desnaturalización, hibridación y extensión a las temperaturas respectivas de 95, 48 y 72ºC. Se repitió el ciclo 20 veces. Los oligonucleótidos usados para la amplificación del ARN viral fueron: para el gen viral que codifica para la proteína hemaglutinina (HA) cebador en 5': 5'-ACCAAAATGAAGGCAAACC-3', cebador en 3': 5'-TTACTGTTAGACGGGTGAT-3'; para el gen viral que codifica para la proteína de la matriz (M) cebador en 5': 5'-ATGAGTCTTCTAACCG-3', cebador en 3': 5'-ACTGCTTTGTCCATGT-3'. Se sometió a electroforesis (100 voltios) el producto de la PCR en un gel de agarosa al 1% en un tampón en el que se había puesto bromuro de etidio para visualizar el ADN con un transiluminador
UV.

Se evaluaron las muestras obtenidas a las 4, 8 y 20 h, respectivamente, después de la infección viral. No se observaron ARN mensajeros para las proteínas virales HA y M a las 4 h ni en el control ni en el grupo tratado con resveratrol. Los resultados muestran que la síntesis de los ARNm 20 h después de la infección no se ve afectada por el tratamiento con resveratrol. La observación a las 4 h muestra que el resveratrol sólo provoca un retraso en la síntesis de mensajeros para estas proteínas (figura 8). Estos resultados sugieren que el reservatrol a dosis de 20 \mug/ml provoca un retraso en la liberación de los ARN mensajeros para las proteínas virales de expresión tardía (HA y M), evaluado 8 horas después de la infección.

Ubicación de la proteína NP

Considerando que la inhibición de la proteína cinasa C en células infectadas por el virus influenza produce una reducción sustancial en la expresión de la proteína M, junto con la retención de la nucleoproteína del núcleo de la célula infectada (J. Virol., 74, 1781-86, 2000), se tiñeron células MDCK infectadas con el virus PR8 y tratadas o no con resveratrol a la concentración de 20 \mug/ml, con anticuerpos específicos anti-M y anti-NP y se observaron bajo el microscopio de fluorescencia. Los resultados revelaron que, mientras que en las células no infectadas se observa NP tanto en el núcleo como en el citoplasma y M1 de manera prevalente en el citoplasma, en células tratadas con resveratrol, la NP se retiene en el núcleo y M, que se inhibe significativamente, sólo puede observarse igualmente en el núcleo. Este fenómeno puede atribuirse a la inhibición de las proteínas celulares con una función cinasa. Entonces, los datos sugieren que el mecanismo de acción antiviral puede estar relacionado con la inhibición de proteínas con una función cinasa descrita anteriormente (FEBS Letters, 45, 63-7, 1999).

Ensayo de glutatión reducido y oxidado

Se ha realizado el ensayo de glutatión como resultado de la formación de derivados de S-carboximetilo de tioles libres con ácido yodoacético seguido por la conversión de los grupos terminales NH_{2} en derivados de 2,4-dinitrofenilo después de la reacción de 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (Anal. Biochem., 106, 55-62, 1980).

Se separaron las células MDCK por medio de la técnica de rascado. Posteriormente, se centrifugaron las células a 1.200 rpm durante 5 minutos. Se lavaron las células dos veces con PBS y se resuspendió el precipitado, obtenido después de centrifugación, en 200 \mul de tampón. Se desproteinizaron los lisados celulares, obtenidos con ciclos repetidos de congelación y descongelación, por medio de precipitación con ácido metafosfórico al 5%. Después de centrifugación a 22.300 g, se derivatizaron los tioles de bajo peso molecular presentes en el sobrenadante con ácido yodoacético al 10% v/v y se neutralizaron con NaHCO_{3} en forma de polvo. Después de 1 h de incubación en la oscuridad, se añadió una disolución de 1-cloro-2,4-dinitrobenceno al 1,5% v/v (1,5 ml/98,5 ml de etanol absoluto). Después de añadir el reactivo de Sanger, se incubaron las muestras durante 12 h en la oscuridad, y se realizó la separación de las diversas especies de glutatión por medio de una columna para HPLC de NH_{2} \muBondapak 3,9 x 300 mm (Millipore). Para medir el contenido de GSH total, se hizo referencia a una curva patrón obtenida con GSH purificado. Se expresa el contenido de GSH en nmol de GSH/mg de proteínas presentes en la muestra de lisado. Se calculó la concentración de proteínas usando el método de Lowry (Biol. Chem., 193, 265-75, 1951). Este método se aprovecha de la capacidad de las proteínas para reducir el reactivo de Folin-Ciocalteau en una disolución alcalina con iones Cu^{2+}, gracias a la presencia de los grupos fenol de varios aminoácidos tales como triptófano, tirosina, cisteína e histidina. El triptófano y la tirosina reaccionan por medio de sus grupos fenol particularmente reactivos, la cisteína a través del grupo -SH y la histidina con el anillo de imidazol. Se detecta el producto de la reacción de reducción por la formación de compuestos teñidos mediante la reacción con los aminoácidos aromáticos de las proteínas. De hecho, la disolución adopta un color azul particularmente intenso que tiene una absorción máxima a 695 nm. Basándose en las proporciones de la absorción, se obtiene por tanto la concentración de las proteínas en relación con una curva de calibración que es una línea recta obtenida usando diversas concentraciones de albúmina sérica bovina como patrón.

Para los fines de evaluar la posible correlación entre la actividad antiviral y la modulación del estado redox, se valoró la concentración del GSH celular de células MDCK, tratadas con diferentes concentraciones de reservatrol e infectadas o no con el virus, mediante análisis de HPLC 24 h después de la infección. Sorprendentemente, el resveratrol añadido a las células MDCK no infectadas produjo una reducción de los niveles de GSH intracelular en comparación con las células no tratadas (figura 6). La adición de resveratrol a células infectadas, aunque inhibió la replicación viral, no restableció los niveles de GSH reducidos por la infección.

Análisis de la apoptosis

En lo que respecta al análisis de la apoptosis, se infectaron células MDCK con el virus PR8. Después de la adsorción viral, se trataron las células con resveratrol a diversas concentraciones (5, 10, 15 y 20 \mug/ml). Veinticuatro horas después de la infección, se separaron las células usando una disolución de tripsina al 0,25% y luego se centrifugaron a 1.200 rpm durante 5 min. Se analizó el precipitado así obtenido por medio de la técnica FACS después de marcarlo con yoduro de propidio.

Para los fines de valorar si estaba implicada la inducción de muerte celular por apoptosis en el efecto antiviral de reservatrol, se infectaron o no células MDCK con el virus y se trataron con la sustancia a las diversas concentraciones. Se evaluó la muerte celular por apoptosis mediante FACS después de marcar con yoduro de propidio. Tal como se muestra en la figura 5, el reservatrol provocó un cierto grado de muerte celular por apoptosis en células no infectadas que osciló desde el 8 hasta el 32% según las dosis (5 y 20 \mug/ml, respectivamente). La infección en sí misma indujo apoptosis en el 12% de las células infectadas. Aunque la adición de dosis crecientes provocó un aumento de la mortalidad, no se observó una diferencia significativa entre las células infectadas y las células no infectadas tratadas con dosis antivirales del fármaco (apoptosis del 35 y el 37%, respectivamente).

A modo de confirmación adicional de los resultados de la presente invención, y a modo de ejemplos, se describen los siguientes estudios in vivo.

Ejemplo

Se usaron ratones Balb/c AnCrIBR consanguíneos hembra de cuatro semanas de edad. Se administró resveratrol, disuelto en PBS, a los animales a través de la vía intraperitoneal en diversos momentos después de la infección con el virus influenza. Se eligieron las concentraciones de reservatrol de modo que se obtuviera un intervalo de dosis en la sangre de los animales similar al intervalo eficaz in vitro (de 10 a 20 \mug/ml).

Se inoculó a los ratones por vía intranasal (i.n.) una suspensión que contenía el virus influenza A/PR a una multiplicidad de infección de 2 UHA/ratón, después de anestesia ligera con éter. Basándose en datos experimentales previos, el virus influenza a esta multiplicidad de infección produce neumonía hemorrágica que conduce a la muerte del 80% de los animales una semana después de la infección. Para los fines de monitorizar la tendencia de la infección, se monitorizaron tanto parámetros virológicos como inmunológicos además de estudiar las curvas de supervivencia.

Como parámetro virológico, se determinó la carga viral. En diferentes momentos después de la infección, se tomaron los pulmones de ratones infectados y control como muestras, se pesaron y se homogeneizaron en RPMI que contenía antibióticos. Después de la centrifugación, se diluyeron de manera adecuada los sobrenadantes y se analizó la carga viral por medio de la prueba del 50% de ECP. Basándose en este método, se infectaron células MDCK confluentes con los sobrenadantes diluidos en serie con RPMI al que se añadieron antibióticos en FCS al 2% y se incubaron durante tres días a 37ºC en una atmósfera con un 5% de CO_{2}. Por último, para cada dilución, se contaron los pocillos que mostraron efectos positivos y se compararon con aquellos que mostraron efectos citopáticos negativos según la fórmula de Reed y Muench. Se calculó el título del 50% de ECP en unidades/ml.

Como parámetro inmunológico, se evaluaron los niveles de citocinas inflamatorias usando el método de ELISA. Se usó una placa de 96 pocillos para el experimento. Se recubrió la placa con anticuerpos monoclonales frente a las citocinas que iban a estudiarse, se incubó durante la noche a 4ºC. Posteriormente, se añadieron 200 \mul/pocillo de BSA al 1% en tampón carbonato durante 30 min. a 37ºC. Luego se realizaron lavados con TBS al 0,25% + Tween 20 y se añadieron las muestras durante 4 horas a 37ºC. Como curva de referencia, se usaron citocinas recombinantes con dilución escalar. Luego se realizaron lavados y se añadió un anticuerpo policlonal anti-citocina, diferente del primero, y se dejó durante la noche a +4ºC. Posteriormente, a los lavados con TBS al 0,5% + Tween 20, MgCl_{2} 2 nM se añadió el tercer anticuerpo conjugado con la enzima fosfatasa alcalina durante 4 h a 37ºC. Por último, se añadió un sustrato para la enzima (100 \mul/pocillo) y se tomó la lectura usando el lector para ELISA y un filtro de 405 nm. Se analizaron los siguientes anticuerpos: 1) monoclonal de rata anti-TNF-alfa de ratón/IL-6 recombinante de ratón; 2) TNF-alfa recombinante de ratón/IL-6 recombinante de ratón; 3) policlonal de conejo anti-TNF-alfa de ratón/policlonal de cabra anti-IL-6 de ratón; 4) de cabra anti-IgG de conejo-fosfatasa alcalina/anti-IgG de cabra-fosfatasa alcalina.

Se estudió la eficacia de resveratrol en un modelo experimental de infección por el virus influenza en el ratón. En este modelo, la inoculación intranasal del virus provoca neumonía hemorrágica grave que conduce a la muerte de los animales en el plazo de 7 a 10 días desde la infección. El diseño experimental prevé la evaluación de la eficacia terapéutica de la sustancia en estudio, tal como se valora basándose en la supervivencia de los animales infectados. Con este fin, se administró resveratrol a los animales a diversas dosis, diariamente durante 7 días, empezando unas cuantas horas después de la infección. Los resultados obtenidos muestran que, mientras que la mortalidad de los animales no tratados fue de hasta el 80%, la administración de resveratrol (1 mg/kg) redujo significativamente la mortalidad y el 60% de los animales sobrevivió a la infección (figura 9).

Claims (3)

1. Uso de resveratrol como un principio activo en la preparación de un medicamento que ejerce una acción inhibidora sobre la replicación del virus influenza y es útil para la prevención y/o el tratamiento de infecciones por el virus influenza.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho virus es el virus influenza humano.

3. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho medicamento es útil para el tratamiento de infecciones víricas en el campo veterinario.