PL218071B1 - Produkująca L-treoninę bakteria z gatunku Escherichia coli, która jest oporna na kwas α-amino-β-hydroksywalerianowy, wykorzystujący ją sposób wytwarzania L-treoniny lub zawierających ją dodatków do żywności oraz szczep Escherichia coli - Google Patents

Produkująca L-treoninę bakteria z gatunku Escherichia coli, która jest oporna na kwas α-amino-β-hydroksywalerianowy, wykorzystujący ją sposób wytwarzania L-treoniny lub zawierających ją dodatków do żywności oraz szczep Escherichia coli

Info

Publication number
PL218071B1
PL218071B1 PL370660A PL37066003A PL218071B1 PL 218071 B1 PL218071 B1 PL 218071B1 PL 370660 A PL370660 A PL 370660A PL 37066003 A PL37066003 A PL 37066003A PL 218071 B1 PL218071 B1 PL 218071B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
gene
encoding
threonine
leu
glu
Prior art date
Application number
PL370660A
Other languages
English (en)
Other versions
PL370660A1 (pl
Inventor
Mechthild Rieping
Nicole Siebelt
Original Assignee
Degussa
Degussa Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10244581A external-priority patent/DE10244581A1/de
Application filed by Degussa, Degussa Ag filed Critical Degussa
Publication of PL370660A1 publication Critical patent/PL370660A1/pl
Publication of PL218071B1 publication Critical patent/PL218071B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy produkującej L-treoninę bakterii z gatunku Escherichia coli, która jest oporna na kwas α-amino-e-hydroksywalerianowy. Wynalazek ten dotyczy także sposobu wytwarzania L-treoniny lub zawierających ją dodatków do żywności, przy użyciu tych bakterii. Przedmiotem wynalazku jest również nowy szczep Escherichia coli.
L-aminokwasy, w szczególności L-treoninę, wykorzystuje się do leczenia ludzi i stosuje się ją zarówno w przemyśle farmaceutycznym jak i w przemyśle spożywczym, a zwłaszcza w składzie karmy dla zwierząt.
Powszechnie wiadomo, że L-aminokwasy wytwarza się metodą fermentacji szczepów Enterobacteriaceae, w szczególności Escherichia coli (E. coli) i Serratia marcescens. Z uwagi na wielkie znaczenie tego procesu ciągle poszukuje się ulepszeń metod wytwarzania. Ulepszenia procesu mogą dotyczyć technologicznych parametrów fermentacji, takich jak, na przykład, mieszanie i dostarczanie tlenu, albo składu podłoży odżywczych, na przykład stężenia cukru podczas fermentacji, albo końcowej obróbki produktu, na przykład przy stosowaniu chromatografii jonowymiennej, albo do naturalnej charakterystyki efektywności samego drobnoustroju.
Do polepszania charakterystyki efektywności tych drobnoustrojów stosuje się metody mutagenezy, selekcji i selekcji mutantów. Na tej drodze otrzymuje się szczepy, które są odporne na antymetablity, takie jak, na przykład, analog treoniny, a mianowicie kwas α-amino-e-hydroksywalerianowy (AHV), albo które są auksotrofowe w odniesieniu do ważnych metabolitów regulujących i produkują L-aminokwasy, takie jak, na przykład, L-treoninę.
Od szeregu już lat stosuje się także metody inżynierii genetycznej, a mianowicie metody rekombinacji DNA, w celu ulepszenia produkujących L-aminokwasy szczepów z rodziny Enterobacteriaceae, polegające na amplifikowaniu poszczególnych genów uczestniczących w biosyntezie aminokwasów i testowania wpływu takiego postępowania na produkcję.
Gen rpoS, znany także pod nazwą genu katF, koduje białko nazywane, czynnikiem σ38 lub o OQ OQ czynnikiem σ , białkiem σ lub podjednostką σ , albo inaczej białkiem RpoS. W piśmiennictwie znaleźć można, aczkolwiek rzadziej, także następujące nazwy genu rpoS: abrD, dpeB, appR, sigS, otsX S i anrA. Czynnik σ , jako podjednostka polimerazy RNA, kontroluje ekspresję szeregu różnych grup genów [Loewen i in., Canadian Journal of Microbiology, 44(8), 707-717 (1998)], przy czym mechanizm tej regulacji często pozostaje jeszcze niejasny.
Dane odnoszące się do sekwencji nukleotydów w genie rpoS lub KatF można znaleźć w: Mulvey i Loewen, Nucleic Acids Research, 17(23), 9979-9991 (1989) i Blattner i in., Science, 277, 1453-1462 (1997). Odpowiednie dane można znaleźć także w: National Center for Biotechnology Information (NCBl) w National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), pod numerami rejestracyjnymi X16400 i AE000358. Zapoczątkowanie translacji lub kodon inicjacji dla genu rpoS ustalili Loewen i in. [Journal of Bacteriology, 175(7), 2150-2153 (1993)].
Oprócz tego, w szczepach E. coli rozpoznano pewną ilość alleli rpoS, na przykład w szczepach typu W3110 [Ivanova i in., Nucleic Acids Research, 20(20), 5479-5480 (1992) oraz Jishage and Ishihama (Journal of Bacteriology, 179(3), 959-963 (1997)].
W dokumencie patentowym WO 01/05939 pokazano, że w wyniku całkowitego wyłączenia czynnika za pomocą wprowadzenia delecji do genu rpoS u producenta kwasu L-glutaminowego następuje polepszenie wytwarzania kwasu glutaminowego.
Nagano i in. [Bioscience Biotechnology and Biochemistry 64(9), 2012-2017 (2000) donoszą o szczepie Escherichia coli W3110 i produkujących L-lizynę mutantach W196 zawierających allel rpoS obejmujący kodon terminacyjny amber (TAG) w miejscu odpowiadającym pozycji 33 w sekwencji aminokwasów białka σ38. Szczep W196 zawiera także mutację występującą w genie serU kodującym tRNA L-seryny o nazwie supD.
Wszędzie tam, gdzie w dalszej części niniejszego tekstu wspomniane są L-aminowasy, określenie to zgodnie z poczynionym założeniem dotyczy wszystkich aminokwasów proteinogennych, z wyjątkiem L-lizyny. Odnosi się ono, w szczególności, do L-treoniny, L-izoleucyny, L-homoseryny, L-metioniny, kwasu L-glutaminowego, L-waliny i L-tryptofanu, przy czym korzystnie oznacza ono L-treoninę.
Przez określenie „aminokwasy proteinogenne” rozumie się te aminokwasy, które są składnikami białek. Należą do nich takie aminokwasy, jak L-glicyna, L-alanina, L-walina, L-leucyna, L-izoleucyna, L-seryna, L-treonina, L-cysteina, L-metionina, L-prolina, L-fenyloalanina, L-tyrozyna, L-tryptofan,
PL 218 071 B1
L-asparagina, L-glutamina, kwas L-asparaginowy, kwas L-glutaminowy, L-arginina, L-lizyna,
L-histydyna i L-selenocysteina.
Niniejszy wynalazek dotyczy produkującej L-treoninę bakterii z gatunku Escherichia coli, która jest oporna na kwas α-amino-e-hydroksywalerianowy, która: 1) w obrębie regionu kodującego gen rpoS zawiera co najmniej jeden (1) kodon terminacyjny typu amber oraz 2) zawiera odpowiedni supresor amber supE przy czym kodon terminacyjny typu amber znajduje się w regionie kodującym genu rpoS odpowiadającym pozycji 33 w sekwencji aminokwasów białka RpoS jak przedstawiono w SEKW. NR. ID. 2.
Bakteria według niniejszego wynalazku może produkować aminokwas z glukozy, sacharozy, laktozy, fruktozy, maltozy, melasu, ewentualnie skrobi, ewentualnie celulozy, oraz z gliceryny i etanolu. Są one przedstawicielami rodziny Enterobacteriaceae, rodzaju Escherichia, pośród których należy wymienić w szczególności gatunek Escherichia coli, a w przypadku rodzaju Serratia, gatunek Serratia marcescens.
Produkujące L-treoninę bakterie według niniejszego wynalazku mogą, ewentualnie, oprócz pożądanego L-aminokwasu wytwarzać jako produkt uboczny nie więcej niż 40% L-lizyny w odniesieniu do ilości pożądanej L-treoniny, korzystniej nie więcej niż 10% L-lizyny w odniesieniu do ilości pożądanej L-treoniny, jeszcze korzystniej nie więcej niż 5% L-Iizyny w odniesieniu do ilości pożądanej L-treoniny. Wymienione dane procentowe oznaczają procenty wagowe.
Korzystnie, w produkującej L-treoninę bakterii według wynalazku równocześnie jest obecny w zwiększonej ilości, w szczególności w wyniku nadekspresji, jeden lub większa ilość genów wybranych spośród wyszczególnionej poniżej grupy:
a. operon thrABC kodujący kinazę asparaginianową, dehydrogenazę homoserynową, kinazę homoserynową i syntazę treoninową,
b. gen pyc kodujący karboksylazę pirogronianową,
c. gen pps kodujący syntazę fosfoenolopirogronianową,
d. gen ppc kodujący karboksylazę fosfoenolopirogronianową,
e. geny pntA i pntB kodujące transhydrogenazę,
f. gen rhtB nadający odporność na homoserynę,
g. gen mqo kodujący oksydorefuktazę jabłczan:chinon,
h. gen rhtC nadający odporność na treoninę,
i. gen thrE z Corynebacterium glutamicum kodujący białko eksportujące treoninę,
j. gen gdhA kodujący dehydrogenazę glutaminianową,
k. gen hns kodujący białko wiążące DNA HLP-II,
l. gen pgm kodujący fosfoglukomutazę,
m. gen fba kodujący aldolazę fruktozobisfosforanową,
n. gen ptsi w operonie ptsHIcrr, kodujący enzym I w układzie fosfotransferazy (PTS),
o. gen ptsH w operonie ptsHIcrr, kodujący fosfotransferazę fosfohistydynobiałko-heksoza w układzie fosfotransferazy (PTS),
p. gen crr w operonie ptsHIcrr, kodujący specyficzny względem glukozy składnik IIA w układzie fosfotransferazy (PTS),
q. gen ptsG kodujący specyficzny względem glukozy składnik IIBC w układzie fosfotransferazy (PTS),
r. gen Ipr kodujący regulatora w regulonie leucyny,
s. gen csrA kodujący globalnego regulatora,
t. gen fadR kodujący regulatora w regulonie fad,
u. gen iclR kodujący regulatora w ośrodkowej przemianie materii pośredniej,
v. gen mopB kodujący fragment zabezpieczający o 10 Kd, znany także pod nazwą groES,
w. gen ahpC w operonie ahpCF, kodujący małą podjednostkę alkiloreduktazy nadtlenku wodoru,
x. gen ahpF w operonie ahpCF, kodujący dużą podjednostkę alkiloreduktazy nadtlenku wodoru,
y. gen cysK kodujący syntazę cysteinową A,
z. gen cysB kodujący regulatora w regulonie cys, aa. gen cysJ w operonie cysJIH, kodujący flawoproteinę w reduktazie NADPH-siarczynowej, bb. gen cysH w operonie cysJIH, kodujący reduktazę adenylilosiarczanową, oraz
PL 218 071 B1 cc. gen cysI w operonie cysJIH, kodujący hemoproteinę w reduktazie NADPH-siarczynowej.
Zgodnie ze szczególnie korzystną postacią wykonania wynalazku w produkującej L-treoninę bakterii geny inne od wskazanych powyżej genów są atenuowane.
Takie produkujące L-treoninę szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wykazują, między innymi, jedną lub większą ilość genetycznych lub fenotypowych cech znamiennych, wybranych z grupy obejmującej: odporność na kwas α-amino-e-hydroksywalerianowy, odporność na tializynę, odporność na etioninę, odporność na α-metyloserynę, odporność na kwas diaminobursztynowy, odporność na kwas α-aminomasłowy, odporność na borelidynę, odporność na ryfampicynę, odporność na analogi waliny, takie jak, na przykład, hydroksamian waliny, odporność na analogi puryny, takie jak, na przykład, 6-dimetyloaminopuryna, zapotrzebowanie na L-metioninę, ewentualnie częściowe lub dające się zrekompensować zapotrzebowanie na L-izoleucynę, zapotrzebowanie na kwas mezo-diaminopimelinowy, auksotrofię w odniesieniu do dipeptydów zawierających treoninę, odporność na L-treoninę, odporność na L-homoserynę, odporność na L-lizynę, odporność na L-metioninę, odporność na kwas L-glutaminowy, odporność na L-asparaginian, odporność na L-leucynę, odporność na L-fenyloalaninę, odporność na L-serynę, odporność na L-cysteinę, odporność na L-walinę, wrażliwość na fluoropirogronian, niepełną dehydrogenazę treoninową, ewentualnie zdolność do wykorzystania sacharozy, wzbogacenie w operon treoniny, wzbogacenie w kinazę dehydrogenazę homoserynową I-kinazę asparaginianową I, korzystnie postać o odporności typu sprzężenia zwrotnego, wzbogacenie w kinazę homoserynową, wzbogacenie w syntazę treoninową, wzbogacenie w kinazę asparaginianową, ewentualnie postać o odporności typu sprzężenia zwrotnego, wzbogacenie w dehydrogenazę semialdehydu asparaginianowego, wzbogacenie w syntazę fosfoenolopirogronianową, ewentualnie postać o odporności typu sprzężenia zwrotnego, wzbogacenie w transhydrogenazę, wzbogacenie w produkt genowy RhtB, wzbogacenie w produkt genowy RhtC, wzbogacenie w produkt genowy YfiK, wzbogacenie w karboksylazę pirogronianową i atenuację tworzenia kwasu octowego.
Przez określenie „kodon terminacyjny typu amber” rozumie się w niniejszym wynalazku kodon terminacyjny z sekwencją zasad TAG na nici kodującej w cząsteczce DNA, odpowiadającą UAG na mRNA odczytanym przez tę cząsteczkę DNA.
Przez określenie „kodon terminacyjny typu ochre” rozumie się w niniejszym wynalazku kodon terminacyjny z sekwencją zasad TAA na nici kodującej w cząsteczce DNA, odpowiadającą UAA na mRNA odczytanym przez tę cząsteczkę DNA.
Przez określenie „kodon terminacyjny typu opal” rozumie się w niniejszym wynalazku kodon terminacyjny z sekwencją zasad TGA na nici kodującej w cząsteczce DNA, odpowiadającą UGA na mRNA odczytanym przez tę cząsteczkę DNA.
Wspomniane powyżej kodony terminacyjne nazywane są także mutacjami nonsensownymi [Edward A. Birge: „Bacterial and Bacteriophage Genetics” (wydanie III), Springer Verlag, Berlin, Niemcy (1994)].
Dla uzyskania sekwencji nukleotydowej dla genu rpoS można wykorzystać dotychczasowy stan techniki. Sekwencję nukleotydową dla genu rpoS odpowiadającą numerowi rejestracyjnemu AE000358 przedstawiono jako SEK. NR ID. 1. Sekwencję aminokwasową odnośnego produktu genowego RpoS lub białka podano w SEK. NR ID. 2.
Sekwencję nukleotydową dla allelu rpoS, zawierającą kodon terminacyjny typu amber w miejscu sekwencji nukleotydów odpowiadającym pozycji 33 w sekwencji aminokwasów produktu genowego RpoS lub białka, zgadzającą się, odpowiednio, z SEK. NR ID. 1 i SEK. NR ID. 2, podano w SEK. NR ID. 3.
Stężenie czynnika można oznaczyć ilościową metodą „Western biot”, jak to opisali Jishage i Ishima [Journal of Bacteriology, 177(23), 6832-6835 (1995), Jishage i in. [Journal of Bacteriology, 178(18), 5447-5451 oraz Jishage i Ishima [Journal of Bacteriology, 179(3), 959-963 (1997)].
Przez określenie „supresja” rozumie się, na ogół, takie zjawisko, w którym efekty mutacji w „pierwszym” genie zostają zniesione lub stłumione mutacją w „drugim” genie. Zmutowany drugi gen, lub druga mutacja, nazywana jest ogólnie supresorem lub genem supresorowym.
Specjalny przypadek, jeśli chodzi o supresory, dotyczy alleli genów tRNA, które kodują nienormalne cząsteczki RNA, mogące rozpoznawać kodony terminacyjne tak, że w trakcie translacji zamiast zakończenia łańcucha zachodzi włączenie aminokwasu. Dokładne wyjaśnienie zjawiska supresji można znaleźć w podręcznikach genetyki, takich jak, na przykład, podręcznik Rolfa Knippersa:”Molekulare Genetik” (wydanie VI), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Niemcy (1995) lub
PL 218 071 B1 podręcznik Ernsta-L-Winnackera: „Gene und Klone, Eine Einfijhrung in die Gentechnologie” (trzeci przedruk poprawiony, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Niemcy, 1990), albo podręcznik F.C. Neidharda (red.): „Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology” (wydanie II, ASM
Press, Waszyngton, D.C., USA, 1996).
Supresory wyszczególnione w tabelach 1, 2 i 3 są to, między innymi, geny lub allele tRNA albo supresory tRNA znane w dotychczasowym stanie techniki, o zdolności tłumienia kodonów terminacyjnych tpu amber, ochre lub opal, a przez to zwane supresorami amber, supresorami ochrę lub supresorami opal. Nazwy poszczególnych genów lub alleli i supresorów zaczerpnięto z przytoczonych odnośników.
T a b e l a 1
Wykaz supresorów amber
Nazwa genu/allelu supresora Nazwa tRNA Aminokwas włączony Ref.
1 2 3 4
supD (= Su1) serynowy tRNA 2 Ser 1
supE (= Su2, supY) glutaminowy tRNA 2 Gln 1
supF tyrozynowy tRNA 1 Tyr 1
supP (= Su6) leucynowy tRNA 5 Leu 1
supU (= Su7) tryptofanowy tRNA Trp 1
supZ tyrozynowy tRNA 2 Tyr 1
tRNAASPCUA Asp tRNA (CUA) Lys, Ala, Gln, Arg 2
tRNAPheCUA fenyloalaninowy tRNA Phe 3
tRNACysCUA cysteinowy tRNA Cys 3
suIII+ amber tyrozynowy tRNA 1 Tyr 4
Su+271 Gln/Trp tRNA Gln 5
Arg argininowy tRNA Arg, Lys 6
ArgII argininowy tRNA Arg, Gln 6
LysA20 lizynowy tRNA Lys 6
trpT175 tryptofanowy tRNA Gln 7
Su79 (= trpT179) tryptofanowy tRNA Trp 8
tRNACysCUA cysteinowy tRNA Cys 9
tRNAAsnCUA asparaginowy tRNA Gln 10
Ala2 alaninowy tRNA Ala 11
Cys cysteinowy tRNA Lys 11
ProH prolinowy tRNA Pro 11
HisA histydynowy tRNA His 11
Gly2 glicynowy tRNA Gly, Gln 11
Gly1 glicynowy tRNA Gly 11
Ilel izoleucynowy tRNA Gin, Lys 11
Met(f) metioninowy tRNA Lys 11
Ile2 izoleucynowy tRNA Lys 11
AspM asparaginowy tRNA Lys 11
Arg argininowy tRNA Lys, Arg 11
PL 218 071 B1 cd. Tabeli 1
1 2 3 4
Thr2 treoninowy tRNA Lys, Thr 11
Val walinowy tRNA Lys, Val 11
GluA tRNA dla kwasu glutaminowego Glu, Gln, Tyr, Arg 11
ECF fenyloalaninowy tRNA Phe 12
ECF9 fenyloalaninowy tRNA Phe 12
ECF5-2 fenyloalaninowy tRNA Phe, Thr,Tyr 12
ECF10 fenyloalaninowy tRNA Phe 12
ECF602 fenyloalaninowy tRNA Phe,Lys,Thr,Val 12
ECF606 fenyloalaninowy tRNA Phe 12
ECF11 fenyloalaninowy tRNA Phe 12
ECF12 fenyloalaninowy tRNA Phe 12
ECF6 fenyloalaninowy tRNA Phe,Tyr 12
ECF401 fenyloalaninowy tRNA Phe 12
ECF402 fenyloalaninowy tRNA Phe 12
ECF403 fenyloalaninowy tRNA Phe 12
ECF403G45 fenyloalaninowy tRNA Phe 12
ECF5 fenyloalaninowy tRNA Phe 12
ECFG73 fenyloalaninowy tRNA Phe,Gln 12
Odnośniki (Ref.) dla tabeli 1:
1) Neidhard (red.): „Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology” (wyd. II, ASM Press, Waszyngton, D.C. USA (1996)];
2) Martin i in., RNA, 2(9), 919-927 (1995);
3) Normanly i in., Proceedings of the National Academy of Science USA,
83(17), 6548-6552 (1986);
4) Numer rejestracyjny K01197;
5) Yarys i in., Proceedings of the National Academy of Science USA,
77(9), 5092-5096 (1990);
5) McClain et in., Proceedings of the National Academy of Science USA,
87(23), 9260-9254 (1990);
7) Raftery i in., Journal of Bacteriology, 158(3), 849-859 (1984);
8) Raftery i in., Journal of Bacteriology, 190(3), 513-517 (1986);
9) Komatsoulis i Abelson, Biochemistry, 32(29), 7435-7444 (1993);
10) Martin i in., Nucleic Acids Research, 23(5), 779-784 (1995);
11) Normanly i in., Journal of Molecular Biology, 213(4), 719-726 (1990);
12) McClain i Foss, Journal of Molecular Biology, 202(4), 697-709 (1988).
PL 218 071 B1
T a b e l a 2
Wykaz supresorów ochre
Nazwa genu/allelu supresora Nazwa tRNA Aminokwas włączony Ref.
supB glutaminowy tRNA 1 Gln 1
supC tyrozynowy tRNA 1 Tyr 1
supD serynowy tRNA 3 Ser 1
supG (= supL, supN) lizynowy tRNA Lys 1
supM (= supB15) tyrozynowy tRNA 2 TYr 1
supU (= su8) tryptofanowy tRNA Trp 1
SupV tryptofanowy tRNA Trp 1
tRNAGluSuOC205 tRNA dla kwasu glutaminowego Glu 2
sulll+ ochre tyrozynowy tRNA 1 Tyr 3
trpT177 tryptofanowy tRNA Gln 4
Su79 (= trpT179) tryptofanowy tRNA Trp 5
Odnośniki (Ref.) dla tabeli 2:
1) Neidhard (red.): „Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology” (wyd. II, ASM Press, Waszyngton, D.C. USA (1996)];
2) Raftery i Yarus, EMBO Journal 6(5), 1499-1506 (1987);
3) Nr rejestracyjny K01197;
4) Raftery i in., Journal of Bacteriology, 158(3), 849-859 (1984);
5) Raftery i in., Journal of Molecular Biology, 190(3), 513-517 (1986).
T a b e l a 3 Wykaz supresorów opal
Nazwa genu/allelu supresora Nazwa tRNA Aminokwas włączony Ref.
supT glicynowy tRNA 1 Gly 1
sumA glicynowy tRNA 2 Gly 1
ims, mutA glicynowy tRNA 3 Gly 1
supU (= su9) tryptofanowy tRNA Trp 1
selC serynowy tRNA Selenocysteina 2
GLNA3U70 glutaminowy tRNA Gln 3
trpT176 tryptofanowy tRNA Trp 4
ARG argininowy tRNA Arg 5
ARGII argininowy tRNA Arg 5
LysA20 lizynowy tRNA Arg 5
Odnośniki (Ref.) dla tabeli 3:
1) Neidhard (red.): „Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology” (wyd. II, ASM Press, Waszyngton, D.C. USA (1996)];
2) Schon i in., Nucleic Acids Research, 17(18), 7159-7165 (1989);
3) Weygand-Durasevic i in., Journal of Molecular Biology, 240(2), 111-118 (1994);
4) Raftery i in., Journal of Bacteriology, 158(3), 849-859 (1984);
5) McClain i in., Proceedings of the National Academy of Science USA 87(23), 9260-9264 (1990).
PL 218 071 B1
Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że wydajność produkującej L-treoninę bakterii z gatunku Escherichia coli, która jest oporna na kwas α-amino-e-hydroksywalerianowy i która w obrębie regionu kodującego gen rpoS zawiera co najmniej jeden (1) kodon terminacyjny typu amber, który to kodon terminacyjny typu amber znajduje się w regionie kodującym genu rpoS odpowiadającym pozycji 33 w sekwencji aminokwasów białka RpoS jak przedstawiono w SEKW. NR.ID. 2. może być znacznie zwiększona dzięki obecności odpowiedniego supresora amber supE,
Wyniki badań przeprowadzonych zgodnie z wynalazkiem wykazały, że aktywność lub stężenie białka RpoS lub czynnika σ38 zostają zmniejszone, na ogół, do wartości mieszczących się w zakresie od >0 do 75%, na przykład w zakresie od 1 do 75%, do wartości mieszczących się w zakresie od >0 do 50%, na przykład w zakresie od 0,5 do 50%, do wartości mieszczących się w zakresie od >0 do 25%, na przykład w zakresie od 0,25 do 25%, do wartości mieszczących się w zakresie od >0 do 10%, na przykład w zakresie od 0,1 do 10%, albo do wartości mieszczących się w zakresie od >0 do 5%, na przykład w zakresie od 0,05 do 5% aktywności lub stężenia białka w pierwotnym drobnoustroju. Obecność wspomnianego supresora (wspomnianych supresorów) zapobiega spadkowi aktywności białka RpoS lub czynnika σ38 aż do zera.
Niniejszy wynalazek znajduje więc zastosowanie w sposobie obniżania wewnątrzkomórkowej aktywności lub stężenia białek RpoS lub czynnika σ38 u produkujących aminokwasy bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, w szczególności z gatunku Escherichia coli, polegający na tym, że do bakterii tych włącza się: 1) do regionu kodującego genu rpoS, co najmniej jeden kodon terminacyjny typu amber oraz 2) odpowiedni gen (geny) lub allel (allele) supresorowego tRNA kodujący (kodujące) supresorowy tRNA, wybrany (wybrane) z grupy supresor amber, supresor ochre i supresor opal. Sposób powyższy jest przedmiotem odrębnego zgłoszenia patentowego.
Jeśli chodzi o region kodujący genu rpoS, okazało się, że następujące fragmenty są szczególnie użyteczne pod względem włączania kodonu terminacyjnego wybranego z grupy amber, ochre i opal, korzystnie dla celu niniejszego wynalazku amber:
• segment regionu kodującego między pozycjami 2 i 95, na przykład pozycja 33, odpowiadający sekwencji aminokwasów białka RpoS, podanej w SEK. NR ID. 1 lub SEK. NR ID. 2;
• segment regionu kodującego między pozycjami 99 i 168, na przykład pozycja 148, odpowiadający sekwencji aminokwasów białka RpoS, podanej w SEK. NR ID. 1 lub SEK. NR ID. 2;
• segment regionu kodującego między pozycjami 190 i 245, odpowiadający sekwencji aminokwasów białka RpoS, podanej w SEK. NR ID. 1 Iub SEK. NR ID. 2;
• segment regionu kodującego między pozycjami 266 i 281, na przykład pozycja 270, odpowiadający sekwencji aminokwasów białka RpoS, podanej w SEK. NR ID. 1 Iub SEK. NR ID. 2;
• segment regionu kodującego między pozycjami 287 i 314, na przykład pozycja 304, odpowiadający sekwencji aminokwasów białka RpoS, podanej w SEK. NR ID. 1 lub SEK. NR ID. 2;
W przypadku, gdy region kodujący genu rpoS zawiera kodon terminacyjny typu amber, zazwyczaj używa się supresora amber wybranego z grupy podanej w tabeli 1.
W przypadku, gdy region kodujący genu rpoS zawiera kodon terminacyjny typu ochre, zazwyczaj używa się supresora ochre wybranego z grupy podanej w tabeli 2.
W przypadku, gdy region kodujący genu rpoS zawiera kodon terminacyjny typu opal, zazwyczaj używa się supresora opal wybranego z grupy podanej w tabeli 3.
Szczególnie użytecznymi i stanowiącymi przedmiot niniejszego wynalazku produkującymi L-treoninę bakteriami z gatunku Escherichia coli są te bakterie, które zawierają kodon terminacyjny typu amber w punkcie sekwencji nukleotydów odpowiadającym pozycji 33 w sekwencji aminokwasów produktu genowego RpoS, zgodnie z SEK. NR ID. 2.
Zgodnie z wynalazkiem zawierają one również supresor amber, taki jak na przykład przedstawiony w Tabeli 1 supresor supE i produkują L-lizynę w ilości porównywalnej z ilością pożądanego L-aminokwasu, jak wyżej podano.
W zależności od rodzaju użytego supresora, bakterie tworzą produkt genowy RpoS lub czynnik σ38 zawierający w pozycji 33 sekwencji aminokwasów zgodnie z SEK. NR ID. 2, zamiast L-glutaminy aminokwas wybrany z grupy obejmującej takie aminokwasy, jak L-seryna, L-tyrozyna, L-leucyna, L-tryptofan, L-lizyna, L-alanina, L-arginina, L-fenyloalanina, L-cysteina. L-prolina, L-histydyna, L-treonina i L-walina. I tak, przykładowo, w przypadku użycia supresora supD, zamiast L-glutaminy zostaje włączona L-seryna. W przypadku użycia supresorów włączających aminokwas L-glutaminę w pozycję 33 produktu genowego RpoS lub czynnika σ38 tak jak to się dzieje, na przykład, w przypadku supE, sekwencja aminokwasowa nie ulega zmianie.
PL 218 071 B1
Niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania aminokwasów lub zawierających aminokwasy dodatków do żywności, polegającego na przeprowadzeniu następujących etapów:
a) fermentacji z udziałem bakterii z gatunku Escherichia coli, która jest oporna na kwas α-amino-e-hydroksywalerianowy i która 1) w obrębie regionu kodującego gen rpoS odpowiadającym pozycji 33 w sekwencji aminokwasów białka RpoS jak przedstawiono w SEKW. NR. ID. 2 zawiera co najmniej jeden (1) kodon terminacyjny typu amber oraz 2) zawiera odpowiedni supresor amber supE przy czym kodon terminacyjny typu amber znajduje się w regionie kodującym genu rpoS;
b) wzbogacania podłoża lub komórki drobnoustrojów w L-treoninę, i
c) wyodrębniania L-treoniny, przy czym, ewentualnie, składniki brzeczki fermentacyjnej i/lub biomasy w całości lub w części (> 0 do 100) pozostają w produkcie.
Korzystnie, w praktycznej realizacji sposobu według wynalazku stosuje się szczep Escherichia coli DM1690 zdeponowany jako DSM 15189.
Dodatki do żywności otrzymane zgodnie ze sposobem według wynalazku można następnie poddawać dalszej obróbce, dokonywanej zarówno w stanie płynnym jak i stałym.
Mutacje, za pomocą których kodon terminacyjny wprowadza się do ramki odczytu genu rpoS można utworzyć bezpośrednio w odnośnym gospodarzu z wykorzystaniem klasycznych metod dokonywania mutagenezy, przy użyciu substancji mutagennych, takich jak, na przykład, N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna, lub z zastosowaniem promieniowania nadfioletowego.
Następnie, do przeprowadzenia mutagenezy można wykorzystać metody in vitro, przy użyciu wyizolowanego DNA rpoS, tak jak, na przykład, podziałanie hydroksyloaminą [J.H. Miller: A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1992)]. W końcu, można posłużyć się metodami mutagenezy zorientowanej pod względem miejsca, przy użyciu mutagennych oligonukleotydów [T.A. Brown: „Gentechnologie ^r Einsteiger”, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg (1993)], albo z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), jak to opisano w książce Newtona i Grahama [„PCR”, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg (1994). Utworzone mutacje można oznaczyć i przetestować metodą sekwencjonowania DNA, na przykład z zastosowaniem metody Sangera i in. [Proceedings of the National Academy od Science USA, 74(12), 5463-5467 (1977).
Stosowne mutacje można włączyć do pożądanych szczepów przy pomocy procesów rekombinacji, z zamianą genu lub allelu. Metodą zwykle stosowaną jest metoda zmiany genu przy użyciu replikującej w sposób uwarunkowany pochodnej pSC101 pMAK705, jak to opisali Hamilton i in. [Journal of Bacteriology, 171(9), 4617-4622 (1989)]. Można także posłużyć się innymi sposobami opisanymi w dotychczasowym stanie techniki, takimi jak, na przykład, metoda, którą opisali Martinez-Morales i in. [Journal of Bacteriology, 181(22), 7143-7148 (1999)] lub metoda Boyda i in. [Journal of Bacteriology, 182(3), 842-847 (2000)].
Możliwe jest także przeniesienie mutacji do pożądanych szczepów za pomocą koniugacji lub trandukcji.
Możliwe jest również użycie znanych z dotychczasowego stanu techniki alleli genu rpoS zawierających kodon terminacyjny w ramce odczytu i wprowadzenie ich do pożądanych szczepów metodami powyżej opisanymi.
Korzystnie, szczepy otrzymane sposobem opisanym powyżej są mutantami, transformantami, rekombinantami, transduktantami lub trankoniugantami.
Do utworzenia mutacji supresorowych w genach tRNA, można zastosować w zasadzie te same metody, jakie opisano w odniesieniu do genu rpoS. Można także posłużyć się metodami z użyciem inżynierii oligonukleotydowej, takimi jak, na przykład metoda, którą opisał Khorana [Science, 203(4381), 614-625 (1979). Następnie, w szczególności, można użyć genów supresorowych tRNA stosowanych w dotychczasowym stanie techniki.
Metody wyszukiwania, charakteryzowania i oznaczania efektywności supresorów tRNA opisano w dotychczasowym stanie techniki, na przykład w:
Miller i Albertini [Journal of Molecular Biology, 164(1), 59-71 (1983)], McClain i Foss [Journal of Molecular Biology, 202(4), 697-709 (1988)], Normanly i in. [Journal of Molecular Biology, 213(4), 719-726 (1990)], Kleina i in. [Journal of Molecular Biology 213, 705-717 (1990)], Lesley i in. [Promega Notes Magazine, 46, str. 02 (1994)] oraz Martin i in. [Nucleic Acids Research, 23(5), 779-784 (1995)].
W niniejszym opisie ujawniono także wariant białka RpoS przedstawionego w SEK. NR ID. 6. Region kodujący tego wariantu białka RpoS uwidoczniono na SEK. NR ID. 5.
PL 218 071 B1
Niniejszym opisano również stanowiące przedmiot odrębnego zgłoszenia Enterobacteriaceae, w szczególności te z nich, które produkują aminokwasy, a mianowicie zawierające lub tworzące białko
RpoS jak określone w SEK. NR ID. 6. Wiadomo także, że N-końcowa metionina obecna w utworzonych białkach może zostać odszczepiona przez enzymy występujące w organizmie gospodarza.
W niniejszym opisie odniesiono się również do sposobu wytwarzania aminokwasów lub zawierających aminokwasy dodatków do żywności, polegającego na przeprowadzeniu następujących etapów:
a) fermentacja z udziałem bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, zawierających białko RpoS o sekwencji aminokwasów podanej w SEK. NR ID. 6,
b) wzbogacenie brzeczki fermentacyjnej w aminokwas,
c) wyodrębnienie z brzeczki fermentacyjnej aminokwasu lub zawierającego aminokwas dodatku do żywności, ewentualnie
d) razem ze składnikami pochodzącymi z brzeczki fermentacyjnej i/lub biomasą (> 0 do 100%).
Powyższy sposób jest przedmiotem odrębnego zgłoszenia. W sposobie tym, dla wytwarzania L-treoniny z zastosowaniem bakterii z rodziny Enterobacteriaceae może okazać się korzystne, oprócz wprowadzenia kodonu terminacyjnego w region genu rpoS oraz odpowiedniego supresora dla kodonu terminacyjnego, albo oprócz ekspresji wariantu białka RpoS podanego w SEK. NR ID. 6, wzmocnienie jednego, lub większej ilości enzymów dla metabolizmu anaplerotycznego, lub enzymów związanych z wytwarzaniem zredukowanego fosforanu dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego, lub enzymów uczestniczących w glikolizie, lub enzymu (enzymów) związanych z metabolizmem siarki.
W związku z tym, wyrażenie „wzmocnienie” odnosi się do zwiększenia wewnątrzcząsteczkowej aktywności lub stężenia jednego, lub większej ilości enzymów w drobnoustroju, zakodowanych przez odpowiedni DNA przez, na przykład , zwiększenie liczby kopii genu lub genów przy użyciu silnego promotora lub genu kodującego odpowiedni enzym lub białko o wyższej aktywności, z ewentualną kombinacją tych sposobów.
Ogólnie, korzystnie używa się genów endogennych. Przez określenie „geny endogenne” lub „endogenne sekwencje nukleotydów” rozumie się geny lub sekwencje nukleotydowe obecne w populacji danego gatunku.
Dzięki zastosowaniu sposobów wzmacniania, w szczególności nadekspresji, aktywność lub stężenie odpowiedniego białka na ogół wzrasta o co najmniej o 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% lub 500%, w najlepszym przypadku do 1000% lub 2000% w odniesieniu do białka typu dzikiego albo aktywności lub stężenia białka w drobnoustroju wyjściowym.
I tak, na przykład, można wzmocnić, w szczególności sposobem nadekspresji, jeden, lub większą ilość genów wybranych z następujących grup:
• operon thrABC kodujący kinazę asparaginianową, dehydrogenazę homoserynową, kinazę homoserynową i syntazę treoninową (US-A-4278765), • gen pyc kodujący karboksylazę pirogronianową (DE-A-19 831609), • gen pps kodujący syntazę fosfoenolopirogronianową [Molecular and General Genetics,
231(2), 332-336 (1992)], • gen ppc kodujący karboksylazę fosfoenolopirogronianową [Gene, 31, 279-283 (1984)], • geny pntA i pntB kodujące transhydrogenazę [European Journal of Biochemistry, 158, 647-653 (1986)], • gen rhtB nadający odporność na homoserynę (EP-A-0 994190), • gen mqo kodujący oksydoreduktazę jabłczan:chinon (DE 100 348 33.5), • gen rhtC nadający odporność na treoninę (EP-A-1-013 765), • gen thrE z Corynebacterium glutamicum kodujący białko eksportujące treoninę (DE 100 264 94.8), • gen gdhA kodujący dehydrogenazę glutaminianową [Nucleic Acids Research, 11, 5257-5266 (983); Gene, 23, 199-209 (1983)], • gen hns kodujący białko wiążące DNA HLP-II (Molecular and General Genetics, 212, 199-202 (1988), • gen ppm kodujący fosfoglukomutazę [Journal of Bacteriology, 176, 5847-5851 (1994)], • gen fba kodujący aldolazę fruktozobifosforanową [Biochemical Journal, 257, 529-534 (1989)], • gen ptsI z operonu ptsHIcrr, kodujący enzym I w układzie fosfotransferazy (PTS) [Journal of Biological Chemistry, 262, 16241-16253 (1987),
PL 218 071 B1 • gen ptsH z operonu ptsHIcrr, kodujący fosfotransferazę fosfohistydyno-białko-heksoza [Journal of Biological Chemistry, 262, 16241-16253 (1987)], • gen crr z operonu ptsHIcrr, kodujący swoisty względem glukozy komponent IIA w układzie fosfotransferazy (PTS) [Journal of Biological Chemistry, 262, 16241-16253 (1987)], • gen ptsG kodujący swoisty względem glukozy komponent IIBC w układzie fosfotransferazy (PTS) [Journal of Biological Chemistry, 261, 16398-16403 (1986)], • gen Irp kodujący regulatora dla regulonu leucyny [Journal of Biological Chemistry, 266, 10768-10774 (1991)], • gen csrA kodujący regulatora globalnego [Journal of Bacteriology, 175, 4744-4755 (1993)], • gen fadR kodujący regulatora dla regulonu fad [Nucleic Acids Research, 16, 7995-8009 (1988), • gen ic1R kodujący regulatora dla ośrodkowej przemiany materii pośredniej [Journal of Bacteriology, 172, 2642-2649 (1990)], • gen mopB kodujący fragment zabezpieczający o 10 Kd [Journal od Biological Chemistry, 261, 12414-12419 (1986)], znany także pod nazwą groES, • gen ahpC z operonu ahpCF, kodujący małą podjednostkę w alkiloreduktazie nadtlenku wodoru [Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 92, 7617-7621 (1995)], • gen ahpF z operonu ahpCF, kodujący dużą podjednostkę w alkiloreduktazie nadtlenku wodoru [Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 92, 7617-7621 (1995)], • gen cysK kodujący syntazę cysteinową A [Journal of Bacteriology, 170, 3150-3157 (1988)], • gen cysB kodujący regulatora dla regulonu cys [Journal of Biological Chemistry, 262, 59996005 (1987)], • gen cysJ z operonu cysJIH, kodujący flawoproteinę w reduktazie siarczynowej (NADPH) [Journal of Biological Chemistry, 264, 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry, 264, 15726-15737 (1989)], • gen cysH z operonu cysJIH, kodujący reduktazę adenyIilosiarczanową [Journal of Biological Chemistry, 264, 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry, 264, 15726-15737 (1989)], oraz • gen cysl z operonu cysJIH, kodujący hemoproteinę w reduktazie siarczynowej (NADPH) [Journal of Biological Chemistry, 264, 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry, 264, 1572615737 (1989)].
Następnie, dla produkcji L-treoniny z zastosowaniem bakterii z rodziny Enterobacteriaceae może okazać się użytecznym, oprócz wprowadzenia kodonu terminacyjnego w region genu rpoS oraz odpowiedniego supresora dla kodonu terminacyjnego, albo też oprócz ekspresji wariantu białka RpoS podanego w SEK. NR ID. 6, atenuowanie, w szczególności wyłączenie lub zredukowanie ekspresji jednego, lub więcej niż jednego genu wybranego z następującycłi grup:
• gen tdh kodujący dehydrogenazę treoninową [Ravnikar i Somerville, Journal of Bacteriology, 169, 4716-4721 (1987)], • gen mdh kodujący dehydrogenazę jabłczanową (E.C. 1.1.1.37) [Vogel i in., Archives in Microbiology, 149, 36-42 (1987)], • produkt genowy z otwartej ramki odczytu (orf) yjfA [nr rejestracyjny AAC77180 dla National Center for Biotechnology Information (NCBl, Bethesda, MD, USA)], • produkt genowy z otwartej ramki odczytu (orf) ytfP [nr rejestracyjny AAC77179 dla National Center for Biotechnology Information (NCBl, Bethesda, MD, USA)], • gen pckA kodujący enzym karboksykinazę fosfoenolopirogronianową [Medina i in., Journal of Bacteriology, 172, 7151-7156 (1990)], • gen poxB kodujący oksydazę pirogronianową [Grabau i Cronan, Nucleic Acids Research, 14(13), 5449-5460 (1986)], • gen aceA kodujący enzym liazę cytiynianową [Matsuoko i McFadden, Journal of Bacteriology, 170, 4528-4536 (1988)], • gen dgsA kodujący regulatora DgsA w układzie fosfotransferazy [Hosono i in., Bioscence, Biotechnology and Biochemistry, 59, 256-261 (1995)], znany także pod nazwą „gen mlc”, oraz • gen fruR kodujący represora fruktozy [Jahreis i in., Molecular and General Genetics, 226, 332-336 (1991), znany także pod nazwą „gen cra”.
W tym aspekcie, wyrażenie „atenuacja” odnosi się do zmniejszenia lub wyłączenia aktywności lub stężenia wewnątrzkomórkowego jednego, lub większej ilości enzymów w drobnoustroju, zakodowanych przez odpowiedni DNA przez, na przykład, zwiększenie liczby kopii genu lub genów przy
PL 218 071 B1 użyciu słabego promotora albo genu lub allelu kodującego odpowiedni enzym o niskiej aktywności lub inaktywującego odpowiedni enzym, białko lub gen, z ewentualną kombinacją tych sposobów.
W wyniku zastosowania sposobów atenuacji, włącznie ze zmniejszeniem ekspresji, aktywność lub stężenie odpowiedniego białka ulega, ogólnie, zmniejszeniu do 0-75%, 0-50%, 0-25%, 0-10% lub 0-5% aktywności lub stężenia białka typu dzikiego, albo aktywności lub stężenia białka w drobnoustroju wyjściowym.
Wykazano również, że w przypadku wspomnianych powyżej genów tdh, mdh, pckA, poxB, aceA, dgsA i fruR oraz otwartych ramek odczytu (ORF) yjfA i ytfP, a także genów ugpB (gen kodujący periplazmatyczne białko wiążące w układzie transportowym sn-3-fosfoglicerynian), aspA (gen amoniakoliazy asparaginianowej (= gen aspartazy), aceB (gen kodujący enzym syntazę jabłczanową A) i aceK (gen kodujący enzym dehydrogenazę izocytrynianową kinazę/fosfatazę, atenuację można uzyskać przez 1) włączenie kodonu terminacyjnego, wybranego z grupy amber, ochre i opal, do regionu kodującego tych genów, oraz 2) jednoczesne użycie supresora dla odpowiedniego kodonu stop, wybranego z grupy obejmującej supresora amber, supresora ochre i supresora opal. Szczególnie korzystne okazało się użycie kodonu terminacyjnego typu amber i supresora amber supE. Opisaną w niniejszym opisie metodykę można zastosować do jakichkolwiek genów, w przypadku których zamierza się dokonać atenuacji lub wyłączenia.
Hodowlę drobnoustrojów według wynalazku można prowadzić stosując proces okresowy, proces okresowy z zasilaniem i proces okresowy z powtarzanym zasilaniem. Przegląd znanych metod hodowli podany jest w podręczniku Chmielą [„Bioprozesstechnik 1. Einfijhrung in die Bioverfahrenstechnik”, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1991)] Iub w podręczniku Storhasa [„Bioreaktoren und periphere Einrichtungen”, Vieweg Verlag, Brunszwik/Wiebaden (1994)].
Przewidziane do użycia podłoże hodowlane ma zaspakajać potrzeby poszczególnych szczepów. Opis podłoży hodowlanych dla rozmaitych drobnoustrojów podany jest w książce „Manual of Methods for General Bacteriology”, wydanej przez American Society for Bacteriology Waszyngton D.C., USA (1981)].
Źródłami węgla nadającymi się do zastosowania w praktycznej realizacji niniejszego wynalazku są: cukier i węglowodany, takie jak, na przykład, glukoza, sacharoza, laktoza, fruktoza, maltoza, melas, skrobia oraz, ewentualnie, celuloza, oleje i tłuszcze, takie jak, na przykład, olej sojowy, olej słonecznikowy, olej arachidowy i olej kokosowy, kwasy tłuszczowe, takie jak, na przykład, kwas palmitynowy, kwas stearynowy, kwas linolowy, alkohole, takie jak, na przykład, gliceryna i etanol, oraz kwasy organiczne, takie jak, na przykład, kwas octowy. Substancje te można stosować każdą z osobna lub jako mieszaniny.
Źródłami azotu nadającymi się do zastosowania w praktycznej realizacji niniejszego wynalazku są: zawierające azot związki organiczne, takie jak peptony, ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny, ekstrakt słodowy, namok kukurydziany, mąka sojowa i mocznik, oraz związki nieorganiczne, takie jak siarczan amonu, chlorek amonu, fosforan amonu, węglan amonu i azotan amonu. Źródła azotu można stosować każde z osobna lub jako mieszaniny.
Źródłami fosforu nadającymi się do zastosowania w praktycznej realizacji niniejszego wynalazku są: kwas fosforowy, diwodorofosforan potasu lub wodorofosforan potasu, albo odpowiednie sole zawierające sód.
Podłoże hodowlane musi także zawierać sole metali, takie jak, na przykład, siarczan magnezu lub siarczan żelaza, które są potrzebne do wzrostu. W końcu, oprócz substancji powyżej wspomnianych, należy użyć niezbędnych substancji wzrostowych, takich jak aminokwasy i witaminy. Do podłoża hodowlanego można dodać także odpowiednie prekursory. Wspomniane substancje zasilające można wprowadzić do hodowli w jednej porcji, lub można nimi zasilać podłoże w trakcie prowadzen ia hodowli.
Do kontrolowania pH hodowli, stosuje się, w odpowiedni sposób, związki zasadowe, takie jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, amoniak lub woda amoniakalna, albo związki kwaśne, takie jak kwas fosforowy lub kwas siarkowy. Do zwalczania tworzenia się piany, stosuje się środki przeciwpieniące, takie jak, na przykład, estry kwasów tłuszczowych i poliglikoli. W celu utrzymania stabilności plazmidów, do podłoża można dodać odpowiednie substancje działające wybiórczo, takie jak, na przykład antybiotyki. W celu utrzymania warunków aerobowych, do hodowli wprowadza się tlen lub mieszaniny gazów zawierające tlen, takie jak, na przykład, powietrze. Temperatura hodowli normalnie mieści się w zakresie od 25°C do 45°C, korzystnie w zakresie od 30°C do 40°C. Hodowlę kontynuuje
PL 218 071 B1 się do momentu utworzenia się maksymalnej ilości L-aminokwasów. Cel ten, normalnie, osiąga się w czasie od 10 do 160 godzin.
Analizę aminokwasów można przeprowadzić metodą chromatografii anionowymiennej z następującą po tym derywatyzacją przy użyciu ninhydryny, jak to opisali Spackman i in. [Analytical Chemistry, 30, 1190-1206 (1958)], albo metodą HPLC z odwróconymi fazami, jak to opisali Lindroth i in. [Analytical Chemistry, 51, 1167-1174 (1979)].
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również następujący drobnoustrój zdeponowany jako czysta kultura dnia 9 września 2002 w German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Brunszwik, Niemcy), zgodnie z Układem Budapeszteńskim:
• Escherichia coli szczep DM1690 jako DSM 15189.
Szczep DSM 15189 zawiera kodon terminacyjny typu amber w punkcie odpowiadającym pozycji 33 w sekwencji aminokwasów białka RpoS, oraz supresor amber, i wytwarza treoninę.
Sposób według wynalazku może być również użyteczny do wytwarzania, metodą fermentacyjną, obok L-treoniny, L-izoleucyny, L-metioniny, L-homoseryny, zwłaszcza L-treoniny.
Niniejszy wynalazek opisano bardziej szczegółowo w znajdujących się poniżej przykładach praktycznej realizacji wynalazku.
Podłoża minimalne (M9) i uniwersalne (LB) dla E. coli opisane są przez J.H. Millera w: „A Short Course in Bacterial Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992). Wyodrębnianie plazmidowego DNA z E. coli i wszelkie metody dotyczące restrykcji oraz Klenowa i obróbki z udziałem fosfatazy alkalicznej, wykonuje się zgodnie z opisem podanym przez Sambrooka i in. w „Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Transformację E. coli, jeżeli tego inaczej nie zaznaczono, przeprowadza się tak, jak to opisali Chung i in. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86, 2172-2175 (1989)]. Transdukcję P1 przeprowadza się sposobem opisanym przez Lengelera i in. [Journal of Bacteriology, 124, 26-38(1975)].
P r z y k ł a d 1
Transdukcja locus genu scr do E. coli K12 szczep MG1655
W występującym w sposób naturalny plazmidzie pUR400 [Schmid i in., Molecular Microbiology, 2, 1-8 (1988)] regulon scr stymuluje zdolność do wykorzystania sacharozy jako źródła węgla. Przy pomocy plazmidu pKJL710 [Ulmke i in., Journal of Bacteriology, 181, 1920-1923 (1999)], zawierającego regulon src między dwiema wstecznymi powtórkami sekwencji transpozonu Tn1721 [Ubben i Schnitt, Gene, 41, 154-152 (1986)], na drodze transformacji, transpozycji, koniugacji i transdukcji, regulon scr można przenieść do chromosomu Escherichia coli K12. Szczep nazwany LJ210 zawiera regulon scr zintegrowany w chromosomie w pozycji „6 minut” według mapy Berlyna. W szczepie tym namnaża się bakteriofag P1 i E. coli K12 szczep MG1655 [Guyer i in., Cold Spring Harbor Symp., Quant. Biology, 45, 135-140 (1981)] infekuje lizatem wyizolowanego faga. Metodą płytkową, z użyciem podłoża minimalnego zawierającego sacharozę (2 g/litr) otrzymuje się transduktanty MG1655 zdolne do wykorzystywania sacharozy jako źródła węgla. Wyselekcjonowanemu klonowi nadano nazwę MG1655scr.
P r z y k ł a d 2
In vivo mutageneza szczepu MG1655scr
Stosuje się szczep MG1655scr jako szczep wyjściowy. Po inkubacji w temperaturze 37°C w agarowym podłożu minimalnym, do którego dodano sacharozę w ilości 2 g/litr i DL-e-hydroksynorwalinę (Sigma, Deisenhofen, Niemcy), wyodrębnia się spontanicznie powstałe mutanty, które są odporne na analoga treoniny, a mianowicie kwas α-amino-e-hydroksywalerianowy (AHV). Wyselekcjonowanemu mutantowi nadano nazwę MG1655scrAHVR1.
P r z y k ł a d 3
Włączenie mutacji kodonu terminacyjnego w gen rpoS w MG1655scrAHVR1 na drodze mutagenezy ukierunkowanej pod względem miejsca
3.1 Klonowanie genu rpoS z MG1655.
Jako donora chromosomalnego DNA używa się Escherichia coli szczep MG 1655. Fragment DNA zawierający region genu rpoS przewidziany do zmutowania w części środkowej amplifikuje się na drodze reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i przy użyciu syntetycznych oligonukleotydów. Wychodząc ze znanej sekwencji genu rpoS (nr rejestracyjny AE000358, SEK. NR ID. 1) dla Escherichia coli K12, do PCR wybrano następujące oligonukleotydy starterowe (MWG Biotech, Ebersberg, Niemcy):
rpoS9 (SEK. NR ID. 7):
5' CAGTTATAGCGGCAGTACC 3'
PL 218 071 B1 rpoS4 (SEK. NR ID. 8):
5' GGACAGTGTTAACGACCATTCTC 3'
Chromosomowy DNA E. coli K12 wyodrębnia się zgodnie z instrukcją wytwórcy przy użyciu „Qiagen Genomic-tips 100/G” (Qiagen, Hilden Niemcy). Fragment DNA o długości w przybliżeniu 2 kpz można wyodrębnić przy użyciu swoistych starterów w typowych warunkach przeprowadzania PCR [Innis i in., „PCR Protocols. A Guide do Methods and Applications”, Academic Press (1990)] z użyciem polimerazy („vent polymerase” z firmy New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Niemcy).
Zamplifikowany fragment DNA identyfikuje się metodą elektroforezy żelowej w 0,8% żelu agarozowym i poddaje oczyszczaniu przy użyciu zestawu QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy). Oczyszczony produkt PCR poddaje się ligowaniu zgodnie z instrukcją wytwórcy przy użyciu wektora pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Cloning KIT, Invitrogen, Groningen, Holandia) i transformuje w E. coli szczep TOP10 (Invitrogen, Groningen, Holandia). Selekcji komórek zawierających plazmid dokonuje się na agarze LB, do którego została dodana kanamycyna w ilości 50 mg/litr. Po wyodrębnieniu plazmidu, wektor testuje się z zastosowaniem nacięcia restrykcyjnego i rozdziału w 0,8% żelu agarozowym. Zamplifikowany fragment DNA testuje się metodą analizy sekwencji. Sekwencja w produkcie PCR jest zgodna z sekwencją podaną w SEQ ID NO 9. Otrzymanemu plazmidowi nadano nazwę pCRBluntrpoS9-4.
3.2 Zastąpienie kodonu glutaminy kodonem terminacyjnym amber na drodze mutagenezy ukierunkowanej
Przeprowadza się mutagenezę ukierunkowaną przy użyciu zestawu QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (stratagene, La Jolla, USA). Do liniowej amplifikacji wybiera się następujące oligonukleotydy starterowe:
rpoSamber1 (SEK. NR ID. 10):
5' GGCCTTAGTAGAA (TAG) GAACCCAGTGATAACG 3' rpoSamber2 (SEK. NR ID. 11):
5' CGTTATCACTGGGTTC (CTA) TTCTACTAAGGCC 3'
Startery te syntetyzyje się z zastosowaniem MEG Biotech. Kodon terminacyjny amber, przeznaczony do zastąpienia glutaminy w pozycji 33 w sekwencji aminokwasów, oznaczony jest nawiasami w pokazanych powyżej sekwencjach nukleotydów. Plazmidu pCRBluntrpoS9-4 opisanego w przykładzie 3.1 używa się z każdym z obu starterów komplementarnych do nici w plazmidzie dla liniowej amplifikacji przy użyciu polimerazy DNA PfuTurbo. W trakcie tej elongacji startera otrzymuje się zmutowany plazmid z pękniętymi nićmi kolistymi. Produkt otrzymany w wyniku amplifikacji liniowej poddaje się działaniu Dpnl. Endonukleaza ta w sposób specyficzny przecina metylowaną i semimetylowaną matrycę DNA.
Nowo zsyntetyzowany pęknięty, zmutowany wektorowy DNA zostaje transformowany w E. coli szczep XL1 Blue [Bullock, Fernandez i Short, BioTechniques, 5(4), 376-379 (1987)]. Po transformacji, komórki XL1 Blue naprawiają pęknięcia w zmutowanych plazmidach. Selekcji transformantów dokonuje się na podłożu LB, do którego została dodana kanamycyna w ilości 50 mg/litr. Otrzymany plazmid testuje się po wyizolowaniu DNA z zastosowaniem nacięcia restrykcyjnego i rozdziału w 0,8% żelu agarozowym. Sekwencję DNA zmutowanego fragmentu DNA testuje się metodą analizy sekwencji. Sekwencja jest zgodna z sekwencją podaną w SEK. NR ID. 3 w regionie genu rpoS. Otrzymanemu plazmidowi nadano nazwę pCRBluntrpoSamber.
3.3 Konstrukcja wektora wymiany pMAK705rpoSamber.
Przy użyciu enzymów restrykcyjnych BamHI i XbaI (Gibco Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Niemcy) przecina się plamzid opisany w przykładzie 3.2. Po rozdzieleniu na 0,8% żelu agarozowym, zawierający mutację fragment rpoS o długości w przybliżeniu 2,1 kpz wyodrębnia się przy użyciu zestawu Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy). Plazmid pMAK705 opisany przez Hamiltona i in. [Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622 (1989)] przecina się przy użyciu enzymów restrykcyjnych BamHI i XbaI i liguje z wyizolowanym fragmentem rpoS (T4-DNA-ligase, Amersham-Pharmacia, Freiburg, Niemcy). Następnie, E. coli szczep DH5a [Grant i in., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87, 4645-4649 (1990)] transformuje się z udziałem produktu ligowania [Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach, tom I, ILR-Press, Cold Spring Habor, New York (1989)]. Selekcji komórek zawierających plazmid obecnych w produkcie transformacji dokonuje się metodą płytkową na agarze LB [Sambrook i in., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, wyd. II, Cold Springs Habor, Nowy Jork (1989)], uzupełnionym chloramfenikolem użytym w ilości 20 mg/litr.
PL 218 071 B1
Z transformanta plazmid wyodrębnia się przy użyciu zestawu QIAquick Spin Miniprep Kit z Qiagen i testuje z zastosowaniem rozszczepienia restrykcyjnego przy użyciu enzymów BamHI, EcoRI,
EcoRV, Stul i XbaI, z następującą po tym elektroforezą żelową. Otrzymanemu plazmidowi nadano nazwę pMAK705rpoSamber. Mapa plazmidu pokazana jest na fig. 1.
3.4 Specyficzna względem miejsca mutageneza genu rpoS E. coli szczep Mg1655scrAHVR1.
Dla przeprowadzenia specyficznej względem miejsca mutagenezy genu rpoS, opisany w przykładzie 2 szczep MG1655scrAHVR1 transformuje się plazmidem pMAK705rpoSamber. Wymiany genów dokonuje sie z zastosowaniem procesu selekcji opisanego przez Hamiltona i in. [Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622 (1989)]. Próbę wykonaną w celu zbadania, czy doszło do mutacji allelu rpoSamber przeprowadza się przy użyciu aparatu LightCycler z firmy Roche Diagnostics (Mannheim, Niemcy). LightCycler jest to złożony instument, obejmujący termocykler i fluorymetr.
W fazie pierwszej, zawierający miejsce mutacji odcinek DNA o długości w przybliżeniu 0,3 kpz amplifikuje się metodą PCR [Innis i in., „PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications”, Academic Press (1990)] przy użyciu następujących oligonukleotydów starterowych:
rpoSLC1 (SEK. NR ID. 12):
5' CGGAACCAGGCTTTTGCTTG 3' rpoSLC2 (SEK. NR ID. 13):
5' GCGCGACGCGCAAAATAAAC 3'
W fazie drugiej, sprawdza się obecność mutacji za pomocą analizy krzywej topnienia [Lay i in., Clinical Chemistry, 43, 2262-2267 (1997)] z udziałem dwóch dodatkowych oligonukleotydów o różnej długości, oznakowanych różnymi barwnikami fluorescencyjnymi [LightCycler(LC)Red640 i fluoresceina], hybrydyzujących w regionie miejsca mutacji, z wykorzystaniem metody „Fluorescence Resonance Energy Transfer” (FRET).
rpoSamberC (SEK. NR ID. 14):
5' LC-Red640 - CTTAGTAGAACAGGAACCCAGTG - (P) 3' rpoSamberA (SEK. NR ID. 15):
5' GATGAGAACGGAGTTGAGGTTTTTGACGAAAAGG - fluoresceina
Startery pokazane dla PCR zsyntetyzowano z zastosowaniem MWG Biotech (Ebersberg, Niemcy), a oligonukleotydy do hybrydyzacji zsyntetyzowano z zastosowaniem TIB MOLBIOL (Berlin, Niemcy).
W taki sposób zidentyfikowano klon, który zawiera zasadę tymidynę zamiast zasady cytozyny w pozycji 952 sekwencji DNA dla produktu PCR rpoS (SEK. NR ID. 9). Tryplet zasad: tymina adenina guanina występuje w pozycji 97-99 sekwencji kodującej allel rpoS (SEK. NR ID. 3) i koduje kodon terminacyjny amber, powodujący terminację translacji. Klonowi temu nadano nazwę MG1655scrAHVR1rpoS.
P r z y k ł a d 4
In vivo selekcja mutacji supresora amber w szczepie G1655scrAHVR1rpoS
4.1 Konstrukcja wektora z kodonem terminacyjnym amber w genie Cat.
Dla dokonania selekcji mutacji supresora, kodon terminacyjny amber włącza się do genu cat kodującego acetylotransferazę chloramfenikolową i nadającego odporność na antybiotyk chloramfenikol.
W tym celu, blok genu cat liguje się w wektorze pTrc99A linearyzowanym z udziałem HindIII (oba z firmy Pharmacia Biotech, Freiburg, Niemcy). E. coli szczep DH5a [Grant i in., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87, 4645-4649 (1990)] transformuje się z wykorzystaniem produktu ligacji [Hanahan, „In. DNA Cloning. A Practical Approach”, tom I, ILR-Press, Cold Spring Habor, Nowy Jork (1989)]. Selekcji zawierających plazmid komórek obecnych w produkcie transformacji dokonuje się metodą płytkową na agarze LB [Sambrook i in., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, wyd. II, Cold Springs Habor, Nowy Jork (1989)], uzupełnionym ampicyliną użytą w ilości 50 mg/litr. Z transformanta plazmid wyodrębnia się przy użyciu zestawu QIAquick Spin Miniprep Kit z Qiagen i testuje z zastosowaniem cięcia restrykcyjnego, z następującą po tym elektroforezą żelową. Otrzymanemu plazmidowi nadano nazwę pTrc99Acat.
Dla włączenia kodonu terminacyjnego amber do regionu kodującego genu cat, wychodząc z sekwencji dla genu cat, syntetyzuje się startery zawierające miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych AccIIl i MscI przy użyciu MWG Biotech, Ebersberg, Niemcy. Miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne zaznaczone są podkreśleniem w pokazanych poniżej sekwencjach nukleotydowych. W starterze catAccIII, oprócz miejsca nacięcia AccIII, dwa kodony ATG kodujące aminokwas metioninę
PL 218 071 B1 w pozycjach 75 i 77 w białku cat są zamienione na kodony TAG. Kodony amber pokazane są w nawiasach sekwencji nukleotydowych pokazanych poniżej:
catAccIII: 5' GCTCATCCGGAAATTCCGT(TAG)GCA(TAG)AAAG 3' (SEK. NR ID. 16) catMSCI: 5' GTCCATATTGGCCACGTTTAAATC 3' (SEK. NR ID. 17)
Do przeprowadzenia PCR używa się DNA plazmidu z wektora pTrc99Acat. Fragment DNA o długości w przybliżeniu 300 pz można amplifikować z udziałem swoistych starterów w typowych warunkach wykonywania PCR [Innis i in., „PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications”, Academic Press (1990)] przy użyciu polimerazy (DNA Pfu polymerase, Promega Corporation, Madison, USA). Produkt PCR przecina się przy użyciu enzymów restrykcyjnych AccIII i MscI. Wektor pTrc99Acat trawi się także przy użyciu enzymów AccIII i Mscl, oddziela w żelu i wyodrębnia fragment o długości 4,7 kpz przy użyciu zestawu QIAquick Gel Extraction Kit. Dwa fragmenty liguje się przy użyciu ligazy DNA T4 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Niemcy). E. coli szczep XL1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) transformuje się z wykorzystaniem produktu ligacji, po czym dokonuje się selekcji komórek z plazmidem na agarze LB, do którego dodano ampicylinę w ilości 50 μg/ml. Zakończone powodzeniem klonowanie można, po wyodrębnieniu DNA plazmidu, udowodnić nacięciami kontrolnymi przy użyciu enzymów EcoRI, PvuII, SspI i Styl.
Plazmidowi nadano nazwę pTrc99Acatamber. Mapa plazmidu pokazana jest na fig. 2.
4.2 Selekcja klonów z supresorem amber.
Opisany w przykładzie 3 szczep MG1655scrAHVR1rpoS transformuje się przy użyciu wektorów pTrc99Acat i pTrc99Acatamber. Selekcji dokonuje się na agarze LB uzupełnionym chloramfenikolem użytym w ilości albo 20 albo 50 μg/ml. Odporne na chloramfenikol klony transformowane wektorem pTrc99Acatamber przenosi się, przy użyciu wykałaczki, na agar LB, do którego została dodana ampicylina w ilości 50 pg/ml. Z klonów odpornych na chloramfenikol i ampicylinę wyodrębnia się DNA plazmidu. Wektor pTrc99Acatamber identyfikuje się metodą cięcia restrykcyjnego.
Odporny na chloramfenikol transformant Mg1655scrAHVRrpoS/pTrc99Acatamber naprawia się przy użyciu plazmidu pTrc99Acatamber metodą hiperinokulacji w podłożu LB. Nazwano go DM1690.
4.3 Identyfikacja mutacji supresora amber w DM1690.
4.3.1 Testowanie mutacji supD.
W genie serU, kodującym seiynowy tRNA-2, obecna jest znana mutacja powodująca supresję kodonów amber. Allel nazwany jest supD, tRNA rozpoznaje kodony amber i włącza serynę. W sekwencji dla genu supD60 (numer rejestracyjny M10746) antykodon cytozyna adenina adenina genu serU typu dzikiego jest zmodyfikowany przez zamianę zasad z otrzymaniem cytozyny tyminy adeniny, w wyniku czego rozpoznaje kodony uracyl adenina guanina.
Możliwą mutację w chromosomowym genie serU można wykryć przy użyciu aparatu LightCycler z firmy Roche Diagnostics (Mannheim, Niemcy). LightCycler jest to złożony instrument, obejmujący termocykler i fluorymetr.
W fazie pierwszej, zawierający miejsce mutacji odcinek DNA o długości w przybliżeniu 0,3 kpz, amplifikuje się metodą PCR [Innis i in., „PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications”, Academic Press (1990)] przy użyciu następujących oligonukleotydów starterowych:
serULC1 (SEK. NR ID. 18):
5' CTTGTACTTTCCAGGGCCAC 3' serULC2 (SEK. NR ID. 19):
5' TTTAGGAAAAGCAAGGCGGG 3'
W fazie drugiej, sprawdza się obecność mutacji za pomocą analizy krzywej topnienia [Lay i in., Clinical Chemistry, 43, 2262-2267 (1997)] z udziałem dwóch dodatkowych oligonukleotydów o różnej długości, oznakowanych różnymi barwnikami fluorescencyjnymi [LightCycler(LC)Red640 i fluoresceina], hybrydyzujących w regionie miejsca mutacji, z wykorzystaniem metody „Fluorescence Resonance Energy Transfer” (FRET).
serUC (SEQ IN NO. 20):
5' LC-Red640 - TCCGGTTTTCGAGACCGGTC - (P) 3' serUA (SEK. NR ID. 21):
5' GAGGGGGATTTGAACCCCCGGTAGAGTTGCCCCTA - fluoresceina 3'
Startery pokazane dla PCR zsyntetyzowano z zastosowaniem MWG Biotech (Ebersberg, Niemcy), a oligonukleotydy do hybrydyzacji zsyntetyzowano z zastosowaniem TIB MOLBIOL (Berlin, Niemcy).
PL 218 071 B1
Jak z tego widać, w DM1690 występuje gen serU typu dzikiego, a tym samym nie ma tam żadnej mutacji supD.
4.3.2 Analiza sekwencji allelu supE w DM1690.
Inna znana mutacja, powodująca supresję kodonów amber występuje w genie glnV, kodującym glutaminowy tRNA-2. Allel nazwany jest supE, tRNA rozpoznaje kodony amber i włącza glutaminę. W sekwencji dla genu glnV (numer rejestracyjny AE000170) antykodon cytozyna tymina guanina genu glnV typu dzikiego jest zmodyfikowany przez zamianę zasad z otrzymaniem cytozyny tyminy adeniny, w wyniku czego rozpoznaje kodony uracyl adenina guanina.
Wychodząc ze znanej sekwencji regionu glnV Escherichia coli K12 (nr rejestracyjny AE000170), do PCR wybrano następujące oligonukleotydy starterowe (MWG Biotech, Ebersberg, Niemcy):
glnX1 (SEK. NR ID. 22):
5' CTGGCGTGTTGAAACGTCAG 3' glnX2 (SEK. NR ID. 23):
5' CACGCTGTTCGCAACCTAACC 3'
Chromosomalny DNA z DM1690 z przeznaczeniem do PCR wyodrębnia się zgodnie z instrukcją wytwórcy przy użyciu „Qiagen Genomic-tips 100/G” (Qiagen, Hilden Niemcy). Fragment DNA o długości w przybliżeniu 1 kpz można wyodrębnić przy użyciu swoistych starterów w typowych warunkach przeprowadzania PCR [Innis i in., „PCR Protocols. A Guide do Methods and Applications”, Academic Press (1990)] przy użyciu polimerazy („vent polimerase” z firmy New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Niemcy). Produkt PCR poddaje się oczyszczaniu przy użyciu zestawu QIAquick PCR Purification Kit i sekwencjonuje z wykorzystaniem Qiagen Sequencing Services (Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy). Otrzymana sekwencja jest zgodna z SEK. NR ID. 4 w regionie genu glnV.
Szczep DM1690 ma allel supE i tłumi kodony amber przez włączenie glutaminy.
P r z y k ł a d 5
Wytwarzanie L-treoniny przy użyciu szczepów MG1655scrAHVR1, MG1655scrAHVR1rpoS i DM1690
Szczepy MG1655scrAHVR1, MG1655scrAHVR1rpoS i DM1690 namnaża się na podłożu minimalnym o podanym poniżej składzie: 3,5 g/litr Na2HPO4 · 2H2O, 1,5 g/litr KH2PO4, 1 g/litr NH4CI, 0,1 g/litr MgSO4 · 7H2O, 2 g/litr sacharozy i 20 g/litr agaru. Hodowle inkubuje się w ciągu 5 dni w temperaturze 37°C. Tworzenie się L-treoniny monitoruje się w hodowlach okresowych o objętości 10 ml, znajdujących się w 100 ml kolbach Erlenmeyera. W tym celu, zaszczepia się 10 ml podłoża do hodowli wstępnej o następującym składzie: 2 g/litr ekstraktu drożdżowego, 10 g/litr (NH4)2SO4, 1 g/litr KH2PO4, 0,5 g/litr MgSO4 · 7H2O, 15 g/litr CaCO3 i 20 g/litr sacharozy i powstałą mieszaninę inkubuje w ciągu 16 godzin w temperaturze 37°C, przy 180 obr/min w inkubatorze ESR (z firmy Kijhner AG, Birsfelden, Szwajcaria). Następnie, 250 μΐ porcje z każdej takiej hodowli wstępnej przenosi się do 10 ml podłoża produkcyjnego o następującym składzie: 25 g/litr (NH4)2SO4, 2 g/litr KH2PO4, 1 g/litr MgSO4 · 7H2O, 0,03 g/litr FeSO4 · 7H2O, 0,018 g/litr MnSO4 · 1H2O, 30g/litr CaCO3 i 20 g/litr sacharozy i przeprowadza inkubację w ciągu 48 godzin w temperaturze 37°C. Po inkubacji, oznacza się gęstość optyczną (OD) zawiesiny hodowli przy użyciu fotometru LP2W z firmy Dr Lange (Berlin, Niemcy), z pomiarem przy długości fali 660 nm.
Następnie, oznacza się stężenie utworzonej L-treoniny w supernatancie po przesączeniu w warunkach jałowych przy użyciu analizatora aminokwasów z firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Niemcy) metodą chromatografii jonowymiennej i z wykonaniem pokolumnowej reakcji z detekcją przy użyciu ninhydryny.
W poniższej tabeli 4 podano wyniki omawianej próby.
T a b e l a 4
Szczep OD (660 nm) L-treonina g/litr
MG1655scrAHVR1 5,6 2,15
MG1655scrAHVR1rpoS 5,3 2,34
DM1690 5,2 2,46
PL 218 071 B1
Krótki opis figur:
Fig. 1: pMAK705rpoSamber
Fig. 2: pTrc99Acatamber
Dane dotyczące długości należy uważać za wielkości przybliżone.
Stosowane skróty i nazwy mają następujące znaczenie:
cat: gen odporności na chloramfenikol;
rep-ts; wrażliwy na temperaturę region replikacji plazmidu pSC101;
rpoS: region kodujący genu rpoS;
Amp: gen odporności na ampicylinę;
lacI: gen dla genu represora w promotorach trc;
Ptrc: region promotora trc, indukowalny IPTG;
5S: region 5S rRNA;
rrnBT: region rRNA terminatora.
Skróty dotyczące enzymów restrykcyjnych mają następujące znaczenie:
• AccIII: endonukleaza restrykcyjna z Acinetobacter calcoaceticus;
• BamHI: endonukleaza retrykcyjna z Bacillus amyloliquefaciens;
• EcoRI: endonukleaza restrykcyjna z Escherichia coli;
• EcoRV: endonukleaza restrykcyjna z Escherichia coli;
• Mscl: endonukleaza restrykcyjna z Microcossus species;
• PvuII: endonukleaza restrykcyjna z Proteus vulgaris;
• Sspl: endonukleaza restrykcyjna z Sphaerotilus species;
• Stul: endonukleaza restrykcyjna z Streptomyces tubercidius;
• Styl: endonukleaza restrykcyjna z Salmonella typhi;
• XbaI: endonukleaza restrykcyjna z Xanthomonas badrii.
PL 218 071 B1
Wykaz sekwencji:
< 110> Degussa AG <120> Bakterie produkujące aminokwasy i sposób wytwarzania L aminokwasów <130> 010319 BT <160> 23 < 170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 993 <212> DNA <213> Escherichia coli <220>
<221> CDS <222> (1).-(990) <223>
<400> 1
atg agt cag aat acg ctg aaa gtt cat gat tta aat gaa gat gcg gaa 48
Met Ser Gin Asn Thr Leu Lys Val His Asp Leu Asn Glu Asp Ala Glu
1 5 10 15
ttt gat Phe Asp gag Glu aac Asn 20 gga Gly gtt Val gag gtt ttt gac gaa aag Phe Asp Glu Lys 25 gcc Ala tta Leu 30 gta Val gaa Glu 96
Glu Val
cag gaa ccc agt gat aac gat ttg gcc gaa gag gaa ctg tta tcg cag 144
Gin Glu Pro Ser Asp Asn Asp Leu Ala Glu Glu Glu Leu Leu Ser Gin
35 40 45
gga gcc aca cag cgt gtg ttg gac gcg act cag ctt tac ctt ggt gag 192
Gly Ala Thr Gin Arg Val Leu Asp Ala Thr Gin Leu Tyr Leu Gly Glu
50 55 60
att ggt tat tca cca ctg tta acg gcc gaa gaa gaa gtt tat ttt gcg 240
Ile Gly Tyr Ser Pro Leu Leu Thr Ala Glu Glu Glu Val Tyr Phe Ala
65 70 75 80
cgt cgc gca ctg cgt gga gat gtc gcc tct cgc cgc cgg atg atc gag 288
Arg Arg Ala Leu Arg Gly Asp Val Ala Ser Arg Arg Arg Met Ile Glu
85 90 95
agt aac ttg cgt ctg gtg gta aaa att gcc cgc cgt tat ggc aat cgt 336
Ser Asn Leu Arg Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr Gly Asn Arg
100 105 110
ggt ctg gcg ttg ctg gac ctt atc gaa gag ggc aac ctg ggg ctg atc 384
Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile
115 120 125
cgc gcg gta gag aag ttt gac ccg gaa cgt ggt ttc cgc ttc tca aca 432
PL 218 071 B1
Arg Ala 130 Val Glu Lys Phe Asp 135 Pro Glu Arg Gly Phe 140 Arg Phe Ser Thr
tac gca acc tgg tgg att ege cag acg att gaa cgg gcg att atg aac 480
Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Thr Ile Glu Arg Ala Ile Met Asn
145 150 155 160
caa acc cgt act att cgt ttg ccg att cac atc gta aag gag ctg aac 528
Gln Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys Glu Leu Asn
165 170 175
gtt tac ctg ega acc gca cgt gag ttg tcc cat aag ctg gac cat gaa 576
Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu Asp His Glu
180 185 190
cca agt gcg gaa gag atc gca gag caa ctg gat aag cca gtt gat gac 624
Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys Pro Val Asp Asp
195 200 205
gtc agc cgt atg ctt cgt ctt aac gag ege att acc teg gta gac acc 672
Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr
210 215 220
ccg ctg ggt ggt gat tcc gaa aaa gcg ttg ctg gac atc ctg gee gat 720
Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile Leu Ala Asp
225 230 235 240
gaa aaa gag aac ggt ccg gaa gat acc acg caa gat gac gat atg aag 768
Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gln Asp Asp Asp Met Lys
245 250 255
cag agc atc gtc aaa tgg ctg ttc gag ctg aac gee aaa cag cgt gaa 816
Gln Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys Gln Arg Glu
260 2 65 270
gtg ctg gca cgt ega ttc ggt ttg ctg ggg tac gaa gcg gca aca ctg 864
Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Thr Leu
275 280 285
gaa gat gta ggt cgt gaa att ggc ctc acc cgt gaa cgt gtt ege cag 912
Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg Val Arg Gln
290 2 95 300
att cag gtt gaa ggc ctg ege cgt ttg ege gaa atc ctg caa acg cag 960
Ile Gln Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu Gln Thr Gln
305 310 315 320
ggg ctg aat atc gaa gcg ctg ttc ege gag taa 993
Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu
325 330
<210> 2
<211> 330
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> :
Met Ser Gln Asn Thr Leu Lys Val His Asp Leu Asn Glu Asp Ala Glu
1 5 10 15
Phe Asp Glu Asn Gly Val Glu Val Phe Asp Glu Lys Ala Leu Val Glu
20 25 30
PL 218 071 B1
Gin Glu Pro Ser Asp Asn Asp Leu 40 Ala Glu Glu Glu Leu Leu Ser Gin 45
35
Gly Ala Thr Gin Arg Val Leu Asp Ala Thr Gin Leu Tyr Leu Gly Glu
50 55 60
Ile Gly Tyr Ser Pro Leu Leu Thr Ala Glu Glu Glu Val Tyr Phe Ala
65 70 75 80
Arg Arg Ala Leu Arg Gly Asp Val Ala Ser Arg Arg Arg Met Ile Glu
85 90 95
Ser Asn Leu Arg Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr Gly Asn Arg
100 105 110
Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile
115 120 125
Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg Phe Ser Thr
130 135 140
Tyr Ala Thr Trp Trp ile Arg Gin Thr Ile Glu Arg Ala Ile Met Asn
145 150 155 160
Gin Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys Glu Leu Asn
165 170 175
Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu Asp His Glu
180 185 190
Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gin Leu Asp Lys Pro Val Asp Asp
195 200 205
Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr
210 215 220
Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile Leu Ala Asp
225 230 235 240
Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gin Asp Asp Asp Met Lys
245 250 255
Gin Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys Gin Arg Glu
260 265 270
Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Thr Leu
275 280 285
Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg Val Arg Gin
290 295 300
Ile Gin Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu Gin Thr Gin
305 310 315 320
Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu
325 330
<210> 3
<211> 993
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> Allel
PL 218 071 B1 <222> (1)..(990) <223> rpoS-Allel <220>
< 221 > misc_feature <222> (97)..(99) <223> kodon amber <400> 3
atgagtcaga atacgctgaa agttcatgat ttaaatgaag atgcggaatt tgatgagaac 60
ggagttgagg tttttgacga aaaggcctta gtagaatagg aacccagtga taacgatttg 120
gccgaagagg aactgttatc gcagggagcc acacagcgtg tgttggacgc gactcagctt 180
taccttggtg agattggtta ttcaccactg ttaacggccg aagaagaagt ttattttgcg 240
cgtcgcgcac tgcgtggaga tgtcgcctct cgccgccgga tgatcgagag taacttgcgt 300
ctggtggtaa aaattgcccg ccgttatggc aatcgtggtc tggcgttgct ggaccttatc 360
gaagagggca acctggggct gatccgogcg gtagagaagt ttgacccgga acgtggtttc 420
cgcttctcaa catacgcaac ctggtggatt cgccagacga ttgaacgggc gattatgaac 480
caaacccgta ctattcgttt gccgattcac atcgtaaagg agctgaacgt ttacctgcga 540
accgcacgtg agttgtccca taagctggac catgaaccaa gtgcggaaga gatcgcagag 600
caactggata agccagttga tgacgtcagc cgtatgcttc gtottaacga gcgcattacc 660
tcggtagaca ccccgctggg tggtgattcc gaaaaagcgt tgctggacat cctggccgat 720
gaaaaagaga acggtccgga agataccacg caagatgacg atatgaagca gagcatcgtc 780
aaatggctgt tcgagctgaa cgccaaacag cgtgaagtgc tggcacgtcg attcggtttg 840
ctggggtacg aagcggcaac actggaagat gtaggtcgtg aaattggcct cacccgtgaa 900
cgtgttcgcc agattcaggt tgaaggcctg cgccgtttgc gcgaaatcct gcaaacgcag 960
gggctgaata tcgaagcgct gttccgcgag taa 993
<210> 4 <211> 75 <212> DNA <213> Escherichia coli <220>
<221> tRNA <222> (1)..(75) <223> supE-allel <400> 4 tggggtatcg ccaagcggta aggcaccgga ttctaattcc ggcattccga ggttcgaatc 50 ctcgtacccc agcca 75 <210> 5 <211> 714 <212> DNA
PL 218 071 B1 < 213 > Escherichia coli <220>
<221> CDS <222> (1)..(711) <223>
<400> 5
atg Met 1 atc ile gag Glu agt Ser aac Asn 5 ttg Leu cgt Arg ctg Leu gtg val gta Val 10 aaa Lys att Ile gcc Ala cgc Arg cgt Arg 15 tat Tyr 48
ggc aat cgt ggt ctg gcg ttg ctg gac ctt atc gaa gag ggc aac ctg 96
Gly Asn Arg Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu
20 25 30
ggg ctg atc cgc gcg gta gag aag ttt gac ccg gaa cgt ggt ttc cgc 144
Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg
35 40 45
ttc tca aca tac gca acc tgg tgg att cgc cag acg att gaa cgg gcg 192
Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Thr Ile Glu Arg Ala
50 55 60
att atg aac caa acc cgt act att cgt ttg ccg att cac atc gta aag 240
Ile Met Asn Gln Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys
65 70 75 80
gag ctg aac gtt tac ctg ega acc gca cgt gag ttg tcc cat aag ctg 288
Glu Leu Asn Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu
85 90 95
gac cat gaa cca agt gcg gaa gag atc gca gag caa ctg gat aag cca 336
Asp His Glu Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys Pro
100 105 110
gtt gat gac gtc agc cgt atg ctt cgt ctt aac gag cgc att acc teg 384
Val Asp Asp Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser
115 120 125
gta gac acc ccg ctg ggt ggt gat tcc gaa aaa gcg ttg ctg gac atc 432
Val Asp Thr Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile
130 135 140
ctg gcc gat gaa aaa gag aac ggt ccg gaa gat acc acg caa gat gac 480
Leu Ala Asp Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gln Asp Asp
145 150 155 160
gat atg a ag cag agc atc gtc aaa tgg ctg ttc gag ctg aac gcc aaa 528
Asp Met Lys Gln Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys
165 170 175
cag cgt gaa gtg ctg gca cgt ega ttc ggt ttg ctg ggg tac gaa gcg 576
Gln Arg Glu Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala
180 185 190
gca aca ctg gaa gat gta ggt cgt gaa att ggc ctc acc cgt gaa cgt 624
Ala Thr Leu Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg
195 200 205
gtt cgc cag att cag gtt gaa ggc ctg cgc cgt ttg cgc gaa atc ctg 672
Val Arg Gln Ile Gln Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu
210 215 220
ca a acg cag ggg ctg aat atc gaa gcg ctg ttc cgc gag taa 714
PL 218 071 B1
Gin Thr Gin Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu 225 230 235 <210> 6 <211> 237 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> e
Met 1 Ile Glu Ser Asn 5 Leu Arg Leu Val Val 10 Lys Ile Ala Arg Arg 15 Tyr
Gly Asn Arg Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu ety Asn Leu
20 25 30
Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg
35 40 45
Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gin Thr Ile Glu Arg Ala
50 55 60
Ile Met Asn Gin Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys
65 70 75 80
Glu Leu Asn Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu
85 90 95
Asp His Glu Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gin Leu Asp Lys Pro
100 105 110
Val Asp Asp Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser
115 120 125
Val Asp Thr Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile
130 135 140
Leu Ala Asp Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gin Asp Asp
145 150 155 160
Asp Met Lys Gin Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys
165 170 175
Gin Arg Glu Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala
180 185 190
Ala Thr Leu Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg
195 200 205
Val Arg Gin Ile Gin Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu
210 215 220
Gin Thr Gin Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu
225 230 235
<210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>
<221> Starter <222> (1)..(19) <223> rpoS9
PL 218 071 B1
<400> 7 cagttatagc ggcagtacc 19
<210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220> <221> Primer <222> (1)..(23) <223> rpoS4 <400> 8 ggacagtgtt aacgaccatt ctc 23
<210> 9 <211> 2012 <212> DNA <213> Escherichia coli <220>
<221> DNA <222> (1)..(2012) <223> rpoS9-4 <400> 9
cagttatagc ggcagtacct ataccgtgaa aaaaggcgac acacttttct atatcgcctg 60
gattactggc aacgatttcc gtgaccttgc tcagcgcaac aatattcagg caccatacgc 120
gctgaacgtt ggtcagacct tgcaggtggg taatgcttcc ggtacgccaa tcactggcgg 180
aaatgccatt acccaggccg acgcagcaga gcaaggagtt gtgatcaagc ctgcacaaaa 240
ttccaccgtt gctgttgcgt cgcaaccgac aattacgtat tctgagtctt cgggtgaaca 300
gagtgctaac aaaatgttgc cgaacaacaa gccaactgcg accacggtca cagcgcctgt 360
aacggtacca acagcaagca caaccgagcc gactgtcagc agtacatcaa ccagtacgcc 420
tatctccacc tggcgctggc cgactgaggg caaagtgatc gaaacctttg gcgcttctga 480
ggggggcaac aaggggattg atatcgcagg cagcaaagga caggcaatta tcgcgaccgc 540
agatggccgc gttgtttatg ctggtaacgc gctgcgcggc tacggtaatc tgattatcat 600
caaacataat gatgattacc tgagtgccta cgcccataac gacacaatgc tggtccggga 660
acaacaagaa gttaaggcgg ggcaaaaaat agcgaccatg ggtagcaccg gaaccagttc 720
aacacgcttg cattttgaaa ttcgttacaa ggggaaatcc gtaaacccgc tgcgttattt 780
gccgcagcga taaatcggcg gaaccaggct tttgcttgaa tgttccgtca agggatcacg 840
ggtaggagcc accttatgag tcagaatacg ctgaaagttc atgatttaaa tgaagatgcg 900
gaatttgatg agaacggagt tgaggttttt gacgaaaagg ccttagtaga acaggaaccc 960
agtgataacg atttggccga agaggaactg ttatcgcagg gagccacaca gcgtgtgttg 1020
PL 218 071 B1
gacgcgactc agctttacct tggtgagatt ggttattcac cactgttaac ggccgaagaa 1080
gaagtttatt ttgcgcgtcg cgcactgcgt ggagatgtcg cctctcgccg ccggatgatc 1140
gagagtaact tgcgtctggt ggtaaaaatt gcccgccgtt atggcaatcg tggtctggcg 1200
ttgctggacc ttatcgaaga gggcaacctg gggctgatcc gcgcggtaga gaagtttgac 1260
ccggaacgtg gtttccgctt ctcaacatac gcaacctggt ggattcgcca gacgattgaa 1320
cgggcgatta tgaaccaaac ccgtactatt cgtttgccga ttcacatcgt aaaggagctg 1380
aacgtttacc tgcgaaccgc acgtgagttg tcccataagc tggaccatga accaagtgcg 1440
gaagagatcg cagagcaact ggataagcca gttgatgacg tcagccgtat gcttcgtctt 1500
aacgagcgca ttacctcggt agacaccccg ctgggtggtg attccgaaaa agcgttgctg 1560
gacatcctgg ccgatgaaaa agagaacggt ccggaagata ccacgcaaga tgacgatatg 1620
aagcagagca tcgtcaaatg gctgttcgag ctgaacgcca aacagcgtga agtgctggca 1680
cgtcgattcg gtttgctggg gtacgaagcg gcaacactgg aagatgtagg tcgtgaaatt 1740
ggcctcaccc gtgaacgtgt tcgccagatt caggttgaag gcctgcgccg tttgcgcgaa 1800
atcctgcaaa cgcaggggct gaatatcgaa gcgctgttcc gcgagtaagt aagcatctgt 1860
cagaaaggcc agtctcaagc gaggctggcc ttttctgtgc acaataaaag gtccgatgcc 1920
catcggacct ttttattaag gtcaaattac cgcccatacg caccaggtaa ttaagaatcc 1980
ggtaaaaccg agaatggtcg ttaacactgt cc 2012
<210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>
<221> Starter <222> (1)..(31) <223> rpoSamberl
<400> 10
ggccttagta gaataggaac ccagtgataa c 31
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> sekwencja syntetyczna
<220>
<221> Starter
<222> (1)-(31)
<223> rpoSamber2
<400> 11 gttatcactg ggttcctatt ctactaaggc c 31
PL 218 071 B1 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>
<221> Starter <222> (1)..(20) <223> rpoSLCl <400> 12 cggaaccagg cttttgcttg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>
<221> Starter <222> (1)..(20) <223> rpoSLC2 <400> 13 gcgcgacgcg caaaataaac 20 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>
<221> Starter <222> (1)..(23) <223> rpoSamberC <400> 14 cttagtagaa caggaaccca gtg 23 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>
<221> Starter <222> (1)..(34) <223> rpoSamberA <400> 15 gatgagaacg gagttgaggt ttttgacgaa aagg 34 <210> 16 <211> 31 <212> DNA
PL 218 071 B1 <213> sekwencja syntetyczna <220>
<221> Starter <222> (1)..(31) <223> catAccIII <400> 16 gctcatccgg aattccgtta ggcatagaaa g 31 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>
<221> Starter <222> (1)..(24} <223> catMscI <400> 17 gtccatattg gccacgttta aatc 24 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>
<221> Starter <222> (1)..(20) <223> serULCl <400> 18 cttgtacttt ccagggccac 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>
<221> Starter <222> (1)..(20) <223> serULC2 <400> 19 tttaggaaaa gcaaggcggg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna
PL 218 071 B1 <220>
<221> Starter <222> (1)..(20) <223> serUC <400> 20 tccggttttc gagaccggtc 20 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>
<221> Starter <222> (1)..(35) <223> serUA <400> 21 gagggggatt tgaacccccg gtagagttgc cccta 35 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>
<221> Starter <222> (1)..(20) <223> glnXl <400> 22 ctggcgtgtt gaaacgtcag 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>
<221> Starter <222> (1)..(21) <223> glnX2 <400> 23 cacgctgttc gcaacctaac c 21

Claims (9)

1. Produkująca L-treoninę bakteria z gatunku Escherichia coli, która jest oporna na kwas α-amino-e-hydroksywalerianowy, znamienna tym, że 1) w obrębie regionu kodującego gen rpoS zawiera co najmniej jeden (1) kodon terminacyjny typu amber oraz 2) zawiera odpowiedni supresor amber supE przy czym kodon terminacyjny typu amber znajduje się w regionie kodującym genu rpoS odpowiadającym pozycji 33 w sekwencji aminokwasów białka RpoS jak przedstawiono w SEKW. NR. ID. 2.
2. Produkująca L-treoninę bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że wytwarza jako produkt uboczny nie więcej niż 40% L-lizyny w odniesieniu do ilości pożądanej L-treoniny.
3. Produkująca L-treoninę bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że wytwarza jako produkt uboczny nie więcej niż 10% L-lizyny w odniesieniu do ilości pożądanej L-treoniny.
4. Produkująca L-treoninę bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że wytwarza jako produkt uboczny nie więcej niż 5% L-lizyny w odniesieniu do ilości pożądanej L- treoniny.
5. Produkująca L-treoninę bakteria według dowolnego spośród zastrz. 1 do 4, znamienna tym, że równocześnie jest obecny w zwiększonej ilości, w szczególności w wyniku nadekspresji, jeden lub większa ilość genów wybranych spośród wyszczególnionej poniżej grupy:
a. operon thrABC kodujący kinazę asparaginianową, dehydrogenazę homoserynową, kinazę homoserynową i syntazę treoninową,
b. gen pyc kodujący karboksylazę pirogronianową,
c. gen pps kodujący syntazę fosfoenolopirogronianową,
d. gen ppc kodujący karboksylazę fosfoenolopirogronianową,
e. geny pntA i pntB kodujące transhydrogenazę.
f. gen rhtB nadający odporność na homoserynę,
g. gen mqo kodujący oksydorefuktazę jabłczan:chinon,
h. gen rhtC nadający odporność na treoninę,
i. gen thrE z Corynebacterium glutamicum kodujący białko eksportujące treoninę,
j. gen gdhA kodujący dehydrogenazę glutaminianową,
k. gen hns kodujący białko wiążące DNA HLP-II,
l. gen pgm kodujący fosfoglukomutazę,
m. gen fba kodujący aldolazę fruktozobisfosforanową,
n. gen ptsI w operonie ptsHIcrr, kodujący enzym I w układzie fosfotransferazy (PTS),
o. gen ptsH w operonie ptsHIcrr, kodujący fosfotransferazę fosfohistydynobiałko-heksoza w układzie fosfotransferazy (PTS),
p. gen crr w operonie ptsHIcrr, kodujący specyficzny względem glukozy składnik IIA w układzie fosfotransferazy (PTS),
q. gen ptsG kodujący specyficzny względem glukozy składnik IIBC w układzie fosfotransferazy (PTS),
r. gen Ipr kodujący regulatora w regulonie leucyny,
s. gen csrA kodujący globalnego regulatora,
t. gen fadR kodujący regulatora w regulonie fad,
u. gen iclR kodujący regulatora w ośrodkowej przemianie materii pośredniej,
v. gen mopB kodujący fragment zabezpieczający o 10 Kd, znany także pod nazwą groES,
w. gen ahpC w operonie ahpCF, kodujący małą podjednostkę alkiloreduktazy nadtlenku wodoru,
x. gen ahpF w operonie ahpCF, kodujący dużą podjednostkę alkiloreduktazy nadtlenku wodoru,
y. gen cysK kodujący syntazę cysteinową A,
z. gen cysB kodujący regulatora w regulonie cys, aa. gen cysJ w operonie cysJIH, kodujący flawoproteinę w reduktazie NADPH-siarczynowej, bb. gen cysH w operonie cysJIH, kodujący reduktazę adenylilosiarczanową, oraz cc. gen cysI w operonie cysJIH, kodujący hemoproteinę w reduktazie NADPH-siarczynowej.
6. Produkująca L-treoninę bakteria według dowolnego spośród zastrz. 1 do 5, znamienna tym, że inne geny są atenuowane.
PL 218 071 B1
7. Sposób wytwarzania L-treoniny lub zawierających ją dodatków do żywności, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
a) fermentacji z udziałem bakterii z gatunku Escherichia coli, która jest oporna na kwas α-amino-e-hydroksywalerianowy i która 1) w obrębie regionu kodującego gen rpoS odpowiadającym pozycji 33 w sekwencji aminokwasów białka RpoS jak przedstawiono w SEKW. NR. ID. 2 zawiera co najmniej jeden (1) kodon terminacyjny typu amber oraz 2) zawiera odpowiedni supresor amber supE, przy czym kodon terminacyjny typu amber znajduje się w regionie kodującym genu rpoS;
b) wzbogacania podłoża lub komórki drobnoustrojów w L-treoninę, i
c) wyodrębniania L-treoniny, przy czym, ewentualnie, składniki brzeczki fermentacyjnej i/lub biomasy w całości lub w części (> 0 do 100) pozostają w produkcie.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się szczep Escherichia coli DM1690 zdeponowany jako DSM15189.
9. Szczep E. coli DM1690 zdeponowany jako DSM15189 w German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Brunszwik, Niemcy).
PL370660A 2002-03-07 2003-02-28 Produkująca L-treoninę bakteria z gatunku Escherichia coli, która jest oporna na kwas α-amino-β-hydroksywalerianowy, wykorzystujący ją sposób wytwarzania L-treoniny lub zawierających ją dodatków do żywności oraz szczep Escherichia coli PL218071B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10210170 2002-03-07
DE10244581A DE10244581A1 (de) 2002-03-07 2002-09-25 Aminosäure produzierende Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL370660A1 PL370660A1 (pl) 2005-05-30
PL218071B1 true PL218071B1 (pl) 2014-10-31

Family

ID=27789738

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL370660A PL218071B1 (pl) 2002-03-07 2003-02-28 Produkująca L-treoninę bakteria z gatunku Escherichia coli, która jest oporna na kwas α-amino-β-hydroksywalerianowy, wykorzystujący ją sposób wytwarzania L-treoniny lub zawierających ją dodatków do żywności oraz szczep Escherichia coli

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7319026B2 (pl)
EP (1) EP1481075B1 (pl)
CN (1) CN100485028C (pl)
AU (1) AU2003215611A1 (pl)
CA (1) CA2478266A1 (pl)
PL (1) PL218071B1 (pl)
WO (1) WO2003074719A2 (pl)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030017554A1 (en) * 2000-11-15 2003-01-23 Mechthild Rieping Process for the fermentative preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
US20030054503A1 (en) * 2001-04-03 2003-03-20 Degussa Ag Process for the production of L-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae that contain an attenuated dgsA gene
DE102004029639A1 (de) * 2003-08-12 2005-03-24 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Threonin
WO2007037301A1 (ja) * 2005-09-29 2007-04-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 有用物質の製造法
EP1710317A3 (en) 2006-07-13 2007-02-21 Degussa AG Method for producing L-threonine and L-homoserine
JP5407124B2 (ja) * 2006-08-18 2014-02-05 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸生産細菌及びｌ−グルタミン酸の製造法
WO2008020654A2 (en) * 2006-08-18 2008-02-21 Ajinomoto Co., Inc. An l-glutamic acid producing bacterium and a method for producing l-glutamic acid
DE102007051024A1 (de) 2007-03-05 2008-09-11 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP1975241A1 (de) 2007-03-29 2008-10-01 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102007044134A1 (de) 2007-09-15 2009-03-19 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102007052270A1 (de) 2007-11-02 2009-05-07 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP2060636A1 (de) 2007-11-14 2009-05-20 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP2098597A1 (de) 2008-03-04 2009-09-09 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102008002309A1 (de) 2008-06-09 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102008040352A1 (de) 2008-07-11 2010-01-14 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102008044768A1 (de) 2008-08-28 2010-03-04 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP2267145A1 (de) 2009-06-24 2010-12-29 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
CN102041284A (zh) * 2010-11-05 2011-05-04 福建省麦丹生物集团有限公司 一种提高l-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法
PL2700715T3 (pl) 2012-08-20 2019-03-29 Evonik Degussa Gmbh Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów z zastosowaniem ulepszonych szczepów z rodziny Enterobacteriaceae
EP3143153A4 (en) * 2014-05-16 2018-01-03 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Microbial approach for the production of 5-hydroxytryptophan
GB201617548D0 (en) * 2016-10-17 2016-11-30 Linnane Pharma Ab Novel biological factor
US11053526B2 (en) 2018-08-09 2021-07-06 Evonik Operations Gmbh Process for preparing L amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
EP3608409A1 (en) 2018-08-09 2020-02-12 Evonik Operations GmbH Process for preparing l amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
CN109852572B (zh) * 2019-01-28 2021-05-28 江南大学 一种敲除大肠杆菌pts系统提高l-苏氨酸产量的方法
CN111286496B (zh) * 2020-01-19 2022-04-22 中国科学院天津工业生物技术研究所 异柠檬酸脱氢酶激酶突变体及其在制备芳香族氨基酸中的应用
KR20230123543A (ko) * 2022-02-16 2023-08-24 대상 주식회사 시그마 38 신규 변이체 및 이를 이용한 l-방향족 아미노산 생산 방법
CN121941773A (zh) * 2024-02-28 2026-04-28 Cj第一制糖株式会社 包含来源于迟缓爱德华氏菌的烟酰胺核苷酸转氢酶的微生物及使用其生产l-氨基酸或其衍生物的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1580549A (pl) * 1967-07-28 1969-09-05
JP2003204788A (ja) * 1999-07-19 2003-07-22 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1639350A (zh) 2005-07-13
EP1481075B1 (en) 2011-12-21
US7319026B2 (en) 2008-01-15
EP1481075A2 (en) 2004-12-01
CN100485028C (zh) 2009-05-06
CA2478266A1 (en) 2003-09-12
WO2003074719A3 (en) 2004-03-04
AU2003215611A1 (en) 2003-09-16
PL370660A1 (pl) 2005-05-30
US20040082040A1 (en) 2004-04-29
WO2003074719A2 (en) 2003-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7319026B2 (en) Amino acid-producing bacteria and a process for preparing L-amino acids
EP1407035B1 (en) Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an attenuated aspa gene
DE602004010896T2 (de) Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung von stämmen der enterobacteriaceae familie welche das galp gen, das für ein galaktose-proton-symporter kodiert, überexprimieren
EP1373541B1 (en) Process for the production of l-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae in which the frur gene is deleted
PL211169B1 (pl) Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, plazmid, wyizolowany polinukleotyd, szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, szczepy Escherichia coli
US20070141681A1 (en) Process for the production of L-amino acids using strains of the Enterobacteriaceae family
EP1706482B1 (en) Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
US7052883B2 (en) Process for the production of L-amino acids using strains of the family Enterobacteriaceae that contain an attenuated fruR gene
WO2006015669A1 (de) Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung von stämmen der familie enterobacteriaceae
ES2378985T3 (es) Bacterias productoras de L-treonina y un procedimiento para preparar L-treonina
EP1706493B1 (en) Process for producing l-threonine or l-lysine employing recombinant enterobacteriaceae with enhanced enolase activity
EP1711593B1 (en) Process for the preparation of l-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae
WO2003004662A2 (en) Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
US7553645B2 (en) Process for preparing L-amino acids using improved strains of the Enterobacteriaceae family
US20050221448A1 (en) Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an attenuated aceb gene
EP2267145A1 (de) Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP1483388A2 (en) Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family

Legal Events

Date Code Title Description
VDSO Invalidation of derivated patent or utility model

Ref document number: 394954

Country of ref document: PL

Kind code of ref document: A1