PL219355B1 - Modyfikowany deoksyrybozym 10-23 o ustabilizowanej odporności na hydrolizę oraz podwyższonej aktywności katalitycznej i sposób jego wytwarzania - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest modyfikowany deoksyrybozym 10-23 (DNAzym 10-23) o ogólnym wzorze 1, zawierający, co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie tiofosforanowe znajdujące się w wybranych pozycjach P domeny katalitycznej P1 do P15, zwłaszcza w pozycji P1, P7, P8, P14 i/lub P15, korzystnie o określonej konfiguracji absolutnej na chiralnych atomach fosforu i/lub co najmniej jedną modyfikowaną resztę nukleozydową w pozycji N przedstawioną ogólnym wzorem 2, w którym B oznacza resztę uracylu modyfikowaną w pozycji 5 lub resztę adeniny modyfikowaną w pozycji 6, przedstawione wzorem 2' lub 2, gdzie R2 oznacza resztę alkiloaminy lub aminokwasu, korzystnie przedstawioną wzorem 2a, 2b, 2c i/lub 2d, i/lub co najmniej jedną modyfikowaną resztę nukleozydową w pozycji N przedstawioną wzorem ogólnym 3, w którym B1 stanowi resztę tyminy, cytozyny, adeniny lub guaniny, a R1 w pozycji 2'-deoksyrybozy oznacza atom -F lub grupę O-alkilo, najkorzystniej grupę OMe, znajdującą się w wybranych pozycjach N deoksyrybozymu, zwłaszcza w pozycjach N2, N7, N8, N11, N14 i/lub N15 domeny katalitycznej, oraz w terminalnych pozycjach ramion rozpoznania substratu (na 3' i 5'-końcu oligonukleotydu), o ustabilizowanej odporności na hydrolizę przez nukleazy komórkowe oraz podwyższonej aktywności katalitycznej.

Niemodyfikowany deoksyrybozym 10-23 (DNAzym 10-23) przedstawiony jest wzorem 1, w którym zasady nukleinowe wszystkich nukleozydów N od 1 do 15 domeny katalitycznej są identyczne z jednostkami zawartymi w oryginalnie wyselekcjonowanym in vitro DNAzymie 10-23 (według S.W. Santoro, G.F. Joyce, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4262), i mają następującą sekwencję:

5'-G1G2C3T4A5G6C7T8A9C10A11A12C13G14A15-3' przy czym deoksyrybozym ten jest zaprojektowany na wybraną sekwencję mRNA białka BACE1, co oznacza, że ramiona rozpoznania enzymu są komplementarne według zasad parowania Watsona-Cricka do wybranej sekwencji mRNA białka BACE1.

Modyfikowany deoksyrybozym, według wynalazku, posiada korzystne właściwości biologiczne, wykazując zwiększoną aktywność katalityczną oraz zauważalnie wyższą stabilność na hydrolizę nukleazami w środowisku ekstraktu komórkowego z komórek HeLa.

Stan techniki

Fragmenty kwasów nukleinowych, które w odpowiednich warunkach wykazują zdolność do katalizy reakcji chemicznych bez czynników białkowych zaliczane są do tzw. katalitycznych kwasów nukleinowych, lub inaczej, do kwasów nukleinowych o właściwościach katalitycznych. Jeśli kataliza dotyczy sekwencyjnie specyficznej hydrolizy wiązania fosfodiestrowego w RNA, katalityczne kwasy nukleinowe mogą stanowić leki nowej generacji. Mechanizm działania tej grupy leków opiera się na modulowaniu procesu ekspresji genów wirusowych i hamowaniu biosyntezy chorobotwórczych białek.

Opracowano kilka możliwych strategii wykorzystania syntetycznych oligonukleotydów dla celów terapeutycznych. Według strategii antysensowej komplementarne (zgodnie z regułami Watsona-Cricka) oligonukleotydy oddziaływują z jednoniciowym mRNA lub pre-mRNA tworząc heterodupleksy rozpoznawane przez białkowe enzymy degradujące (E. Uhlmann, A. Peyman, 1990, Chem. Rev. 90, 544). Strategia rozpoznania sekwencyjnego typu antysensowego wykorzystywana jest również w degradacji mRNA za pomocą enzymów oligonukleotydowych - zidentyfikowanych naturalnych rybozymów (O. C. Uhlenbeck, 1987, Nature 328, 596) oraz wyselekcjonowanych in vitro deoksyrybozymów (S.W. Santoro, G.F. Joyce, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4262; T. Kuwabara, M. Warashina, T. Tanabe, K. Tani, S. Asano, K. Taira, 1997, Nucleic Acids Res. 25, 3074). Innym podejściem jest tzw. terapia antygenowa, w której syntetyczne oligonukleotydy rozpoznają zgodnie z regułami Hoogsteena dwuniciowe sekwencje DNA i wpływają na proces transkrypcji genów (C. Giovannangeli, C. Helene 1997, Antisense Nucleic Acids Drug Dev., 7, 413). Kolejną strategią hamowania aktywności białek jest zastosowanie tzw. aptamerów białek - oligonukleotydów wyselekcjonowanych w procesie selekcji in vitro i tworzących z białkami trwałe kompleksy (C. Tuerk, L. Gold, 1990, Science, 249, 505). Poznany niedawno efekt interferencji RNA (A. Fire, S. Xu, M.K. Montgomery, S.A. Kostas, S.E., Driver, C.C. Mello 1998, Nature 391, 806) pozwala na wyciszanie ekspresji niepożądanych genów poprzez zastosowanie krótkich interferujących RNA - siRNA (S. Elbashir, T.TuschI 2001, Nature 411, 494). Dwuniciowe RNA o długości 21-23 nt są obiecującymi narzędziami o szczególnie istotnym znaczeniu terapeutycznym (M. Miyagishi, K. Taira 2002, Nat. Biotech. 19, 497; H. Xia, Q. Mao, H.L. Paulson, B.L. Davidson 2002, Nat. Biotech. 20, 1006).

Poszukiwania nowych terapeutyków skupione są na badaniach analogów oligonukleotydów wykazujących zwiększony potencjał do modulacji ekspresji genów, zwiększone powinowactwo do cząPL 219 355 B1 steczek docelowych, bądź charakteryzujących się zwiększoną odpornością na działanie enzymów nukleolitycznych uczestniczących w procesach in vivo.

Syntetyczne oligonukleotydy stanowiące potencjalne terapeutyki są analogami oligonukleotydowymi zawierającymi różnorodnie modyfikowane elementy struktury naturalnych kwasów nukleinowych. Grupę analogów oligonukleotydowych zawierających modyfikowany szkielet fosforanowy stanowią oligonukleotydowe tiofosforany (W.J. Stec, G. Zon, W. Egan, B. Stec 1984, J. Am. Chem. Soc., 106, 6077), metylofosfoniany (P.S. Miller, N.D. Annan, S.M. McParland 1980, J. Biol. Chem., 255, 9659; P.S. Miller, N.D. Annan, S.M. McParland, K.B. Pulford 1982, Biochemistry, 21, 2507), amidofosforany (S.M. Gryaznov, T. Skorski, C. Cucco, M. Nieborowska-Skorska, C.Y. Chiu, D.H. Lloyd, J. Chen, M. Koziołkiewicz, B. Calabretta, 1996, Nucleic Acids Res., 24, 1508), boranofosforany (B.R. Shaw 2007, Nucleic Acids Symp. Series (Oxf). 51, 117), oraz ditiofosforany (Y. Xianbin 2008, Nucleic Acids Symp.Series, (Oxf.) 52(1), 341).

Oligonukleotydowe tiofosforany jako pierwsze zostały wdrożone do terapii. Jednym z nich jest Fomivirsen, oligonukleotyd antysensowy skierowany na gen wirusa cytomegalii. Lek ten stosowany jest w postaci iniekcji do oka u pacjentów z syndromem AIDS. Innym lekiem o strukturze oligonukleotydowych tiofosforanów zatwierdzonym do sprzedaży zarówno na rynku amerykańskim, jak i europejskim jest Macugen - aptamer dla białka VEGF, którego deaktywacja jest istotna w leczeniu związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej (AMD).

Deoksyrybozymy są jednoniciowymi oligodeoksyrybonukleotydami wykazującymi aktywność katalityczną w stosunku do cząsteczek RNA. Jest ona analogiczna do aktywności nukleaz białkowych, katalizujących hydrolizę wiązania fosfodiestrowego w RNA i do aktywności naturalnych rybozymów, katalizujących hydrolizę wiązania fosfodiestrowego w RNA. Deoksyrybozymy wiążą się w sekwencyjnie-zależny sposób do komplementarnej nici RNA i katalizują reakcję hydrolizy wiązania internukleotydowego w obecności jonów dwuwartościowych, najczęściej jonu magnezu(II). Ta właściwość decyduje o zastosowaniu deoksyrybozymów jako molekularnych narzędzi do manipulacji z RNA oraz jako związków o działaniu terapeutycznym (C. Hobartner, S. K. Silverman 2007, Biopolymers, 87, 279; S.K. Silverman 2005, Nucleic Acids Res., 33, 6151; S.K. Silverman, 2004, Org. Biomol. Chem., 2, 2701; R.R. Breaker, G.M. Emilsson, D. Lazarev, S. Nakamura, I.J. Puskarz, A. Roth, N. Sudarsan 2003, RNA, 9, 949; Y. Isaka 2007, Curr. Opin. Mol. Ther., 9, 132; R. Bhindi, R.G. Fahmy, H.C. Lowe, C.N. Chesterman, C.R. Dass, MJ. Cairns, E.G. Saravolac, L.Q. Sun, L.M. Khachigian 2007, Am. J. Pathol., 171, 1079).

Najlepiej scharakteryzowanym jest deoksyrybozym 10-23, wyselekcjonowany przez Joyce'a (R.R Breaker, G.F. Joyce 1994, Chem. Biol., 1, 223; S.W. Santoro, G.F. Joyce 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4262) w reakcji selekcji in vitro (C. Tuerk, L. Gold, Science, 1990, 249, 505-510; A. D. Ellington, J. W. Szostak 1990, Nature, 346, 818; D.S. Wilson, J.W. Szostak, 1999, Annu. Rev. Biochem., 68, 611). Deoksyrybozym 10-23 zawiera 15-nukleotydową (nt) konserwatywną (niezmienną) domenę katalityczną i ramiona rozpoznania substratu o długości od 6 do 12 nt i zmiennej sekwencji, zaprojektowanej w ten sposób, aby były komplementarne do docelowej cząsteczki RNA. Hydroliza wiązania fosfodiestrowego zachodzi pomiędzy niesparowanym nukleozydem purynowym zaangażowanym w parę Watsona-Cricka nukleozydem pirymidynowym według reakcji transestryfikacji zachodzącej w obecności jonu metalu dwuwartościowego. Produktami reakcji są dwa fragmenty RNA: 5'-terminalny zawierający na 3'-końcu nukleotyd z 2',3'-cykliczną grupą fosforanową oraz 3'-terminalny z wolną grupą 5'-OH (S.W. Santoro, G.F. Joyce 1998, Biochemistry, 37, 13330; G.F. Joyce, 2001, Methods Enzymol. 341, 503). Mechanizm działania deoksyrybozymu nie został do końca poznany, nie jest znana także struktura przestrzenna tego katalizatora. Dotychczas podejmowane próby uzyskania takiej struktury doprowadziły do otrzymania kryształu kompleksu dwóch cząsteczek deoksyrybozymu 10-23 i dwóch cząsteczek niehydrolizowalnego substratu RNA, w którym komponenty nie utworzyły funkcjonalnie aktywnej domeny katalitycznej (J. Nowakowski, P.J. Shim, G.F. Joyce, C.D. Stout, 1999, Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. D55, 1885; J. Nowakowski, P.J. Shim, G.C. Prasad, C.D. Stout, G.F. Joyce 1999, Nat. Struct. Biol., 6, 151). Przeprowadzono liczne badania mające na celu określenie zależności aktywności deoksyrybozymu 10-23 od jego struktury i wykazano, że nukleozydy w pozycjach 1-6 i 13-14 są niezbędne dla aktywności enzymatycznej, zaś nukleozyd w pozycji 8 (tymidyna) może być usunięty z domeny katalitycznej lub podstawiony przez inny nukleozyd, bez utraty aktywności katalitycznej enzymu (S.W. Santoro, G.F. Joyce 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 94, 4262; S.W. Santoro, G. F. Joyce Biochemistry 1998, 37, 13330; G.F. Joyce 2001, Methods Enzymol. 341, 503; Z. Zaborowska, V.A. Erdmann, J. Kurreck 2002, J. Biol. Chem., 277, 40617; Z. Zaborowska,

PL 219 355 B1

S. Schubert, J. Kurreck, V.A. Erdmann 2005, FEBS Lett. 579, 554). Podstawienie pozycji 8 resztą tymidyny zawierającą fotolabilny podstawnik 6-nitropiperonyloksymetylowy (NPOM) na atomie azotu w pozycji 3 (N3) tyminy pozwoliło na uzyskanie enzymu o aktywności niezależnej od naświetlania promieniowaniem UV, przeciwnie do sytuacji, gdy tak modyfikowana jednostka została wprowadzona w pozycję 4 domeny katalitycznej enzymu (H. Lusic, D.D. Young, M.O. Lively, A. Deiters 2007, Organic Lett., 9, 1903). W celu podwyższenia stabilności w obecności nukleaz komórkowych deoksyrybozym 10-23 modyfikowano zarówno w obrębie domeny katalitycznej, jak i w ramionach rozpoznania substratu. Wprowadzenie w pozycje 2, 7, 8, 11, 14 i 15 domeny katalitycznej 6-ciu reszt nukleozydów zawierających grupę 2'-OMe podwyższyło stabilność nukleolityczną enzymu przy jedynie nieznacznym obniżeniu jego aktywności katalitycznej (S. Schubert, D. GOl, H-P. Grunert, H. Zeichhardt, V.A. Erdmann, J. Kurreck 2003, Nucleic Acids Res. 31, 5882). Modyfikowane w części cukrowej nukleozydy typu 2'-OMe i LNA (locked nucleic acids) oraz modyfikowane wiązania takie jak: tiofosforanowe czy też odwrócone 3'-3' są stosowane dla zwiększenia odporności enzymu na działanie 3'- i 5'-egzonukleaz (S. Schubert, D. GOl, H-P. Grunert, H. Zeichhardt, V. A. Erdmann, J. Kurreck 2003, Nucleic Acids Res. 31, 5882; B. Vester, L.B. Lundberg, M.D. Sorensen, B.R. Babu, S. Douthwaite, J. Wengel 2002, J. Am. Chem. Soc., 124, 13682; B. Vester, L.H. Hansen, L.B. Lundberg, B. R. Babu,

M.D. Sorensen, J. Wengel, S. Douthwaite 2006, BMC Mol. Biol., 7, 19; C.R. Dass, E.G. Saravolac, Y. U and L-Q Sun 2002, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 12, 289).

Dotychczas opisano zastosowanie deoksyrybozymów 10-23 modyfikowanych w obrębie wiązań internukleotydowych grupą tiofosforanową w celu określenia architektury domeny katalitycznej oraz sposobu chelatowania jonu metalu (B. Nawrot, K. Widera, M. Wójcik, B. Rebowska, G. Nowak, W.J. Stec 2007, FEBS J., 274, 1062). W badaniach tych wykazano, że obecność pojedynczego wiązania tiofosforanowego (w formie mieszaniny P-epimerów) w niektórych pozycjach domeny katalitycznej (szczególnie P1 i P8) podwyższa aktywność enzymu zarówno w obecności jonów magnezu(II), jak i manganu(II). Natomiast nie wykazano zróżnicowania aktywności katalitycznej pomiędzy poszczególnymi diastereomerycznymi enzymami tiofosforanowymi zawierającymi wiązania tiofosforanowe w pozycjach P1 i P8, oraz nie zbadano enzymów zawierających więcej niż jedno (oprócz enzymu P1/8) wiązanie tiofosforanowe w domenie katalitycznej.

Przedmiotem wynalazku są deoksyrybozymy modyfikowane w obrębie domeny katalitycznej resztami aminokwasowymi, wykazujące podwyższone właściwości katalityczne w porównaniu do niemodyfikowanego deoksyrybozymu 10-23. Tego typu związki o wzorze ogólnym 1, gdzie jednostki w wybranych pozycjach domeny katalitycznej stanowią nukleozydy o ogólnym wzorze według wynalazku, nie były dotychczas opisane w literaturze, aczkolwiek znanych jest szereg innych deoksyrybozymów zawierających w swojej domenie katalitycznej reszty aminokwasowe, zwykle o charakterze zasadowym (M. Hollenstein, Ch.J. Hipolito, C.H. Lam, D. M. Perrin 2009, Nucleic Acids Res., 37, 1; R. Ting, R.M. Thomas, L. Lermer, D.M. Perrin 2004, Nucleic Acids Res., 32, 6660; D.M. Perrin, T. Garestier, C. Helene 2001, J. Am. Chem. Soc., 123, 1556; M. Hollenstein, C. Hipolito, C. Lam, D.M. Perrin 2009, Chembiochem, 10, 1988; A. Sidorov, J.A. Grasby, D.M. Williams 2004, Nucleic Acids Res., 32, 1591). Niektóre z nowych deoksyrybozymów wykazują aktywność bez udziału jonu metalu, jednak zmiana aktywności jest niewysoka w porównaniu do niemodyfikowanego deoksyrybozymu 10-23. I tak deoksyrybozym 925-11 zawierający 31 nt, w tym 18 tworzących domenę katalityczną, w tym cztery reszty 8-histaminylo-2'-deoksyadenozyny i sześć reszt 5-alliloamino-2'-deoksyurydyny wykazuje wysoką aktywność w warunkach pojedynczego i wielokrotnego obrotu bez obecności jonów metali dwuwartościowych (L. Lermer, Y. Roupioz, R. Ting, D.M. Perrin 2002, J. Am. Chem. Soc. 124, 9960), podczas gdy deoksyrybozym 9-33 uzyskany w wyniku selekcji in vitro z użyciem trzech jednostek modyfikowanych: 8-histaminylo-2'-deoksyadenozyny, 5-alliloamino-2'-deoksycytydyny i 5-guanidyno-allilo-2'-deoksyurydyny hydrolizuje wiązanie sąsiednie do jednostki cytydyny w substracie RNA bez udziału jonów dwuwartościowych ze stałą katalizy k=0,05 min^-1 (M. Hollenstein, C. Hipolito, C. Lam, Perrin, D., 2008, Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 52, 73). Najwyższą aktywność katalityczną bez udziału jonów metalu w hydrolizie wiązanie fosfodiestrowego w DNA osiąga deoksyrybozym 9-86 zawierający trzy jednostki: 5-guanidyno-allilo-2'-deoksyurydynę, 8-histaminylo-2'-deoksyadenozynę i 5-alliloamino-2'-deoksyurydynę (M. Hollenstein, C. Hipolito, C. Lam, D.M. Perrin 2009, Nucleic Acids Res. 37, 1). Enzym ten jest deaktywowany obecnością jonów metali w stężeniu powyżej 0,5 mM. Podobnie modyfikowany deoksyrybozym 10-66 wyselekcjonowany przeciwko substratowi RNA jest aktywny bez udziału jonów metalu dwuwartościowego, natomiast wykazuje wysoką aktywność w obecności milimolowych stężeń jonów metali jednowartościowych i jest 1000-krotnie bardziej aktywny niż

PL 219 355 B1 enzym niemodyfikowany (M. Hollenstein, C. Hipolito, C. Lam, D.M. Perrin 2009, ChemBioChem, 10, 1988).

Dotychczas znane i opisywane deoksyrybozymy zawierające modyfikacje resztami aminokwasów, a wykazujące aktywność bez udziału jonów metali dwuwartościowych, otrzymywano jedynie metodą selekcji in vitro, a nie otrzymywano metodą chemicznej modyfikacji deoksyrybozymu 10-23.

Istota wynalazku

Modyfikowany deoksyrybozym 10-23 o ogólnym wzorze 1, zawierający, co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie tiofosforanowe o wzorze 4a i/lub 4b, znajdujące się w wybranych pozycjach domeny katalitycznej P1 do P15, zwłaszcza w pozycji P1, P7, P8, P14 i/lub P15, korzystnie o określonej konfiguracji absolutnej na chiralnych atomach fosforu, i/lub co najmniej jedną resztę nukleozydową o ogólnym wzorze 2, w którym B oznacza resztę uracylu modyfikowaną w pozycji 5 lub resztę adeniny modyfikowaną w pozycji 6, przedstawione wzorem 2' lub 2'', gdzie R2 oznacza resztę alkiloaminy lub aminokwasu, korzystnie resztę histaminy lub glicyny, i/lub co najmniej jedną resztę nukleozydową o wzorze 3, w którym B1 oznacza resztę tyminy, uracylu, cytozyny, adeniny i/lub guaniny, a R1 oznacza atom F lub grupę alkoksylową -OR, gdzie R oznacza grupę o wzorze -CnH2n+1, a n oznacza liczbę naturalną od 1 do 5, korzystnie -OR oznacza grupę metoksylową, przy czym wymienione reszty nukleozydowe znajdują się w pozycji wybranej z grupy obejmującej N2, N7, N8, N11, N14 i N15.

Modyfikowany deoksyrybozym 10-23 o wzorze ogólnym 1, według wynalazku zawiera, co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie tiofosforanowe o wzorze 4a i/lub 4b, znajdujące się w wybranych pozycjach domeny katalitycznej P1 do P15, zwłaszcza w pozycji P1, P7, P8, P14 i/lub P15, korzystnie o określonej konfiguracji absolutnej na chiralnych atomach fosforu, i/lub co najmniej jedną resztę nukleozydową o wzorze 2a, 2b, 2c i/lub 2d, i/lub co najmniej jedną resztę nukleozydową o wzorze 3a, 3b, 3c i/lub 3d, w którym R1 oznacza atom fluoru lub grupę alkoksylową o wzorze -OR, gdzie R oznacza grupę o wzorze -CnH2n+1, a n oznacza liczbę naturalną od 1 do 5, korzystnie -OR oznacza grupę metoksylową, przy czym wymienione reszty nukleozydowe znajdują się w pozycji wybranej z grupy obejmującej N2, N7, N8, N11, N14 i N15 deoksyrybozymu o ogólnym wzorze 1.

Będące przedmiotem niniejszego wynalazku deoksyrybozymy z modyfikacjami mają ustabilizowaną odporność na hydrolizę przez nukleazy komórkowe, w których wybrane jednostki deoksyrybozymu o strukturze domeny katalitycznej znanego i wyselekcjonowanego wcześniej deoksyrybozymu 10-23, otrzymuje się metodą chemicznej syntezy, polegającej na zamianie, co najmniej jednej reszty nukleozydowej w określonej pozycji domeny katalitycznej na inną, zawierającą w obrębie zasady nukleinowej resztę aminokwasu i/lub co najmniej jednego wiązania internukleotydowego na wiązanie tiofosforanowe o konfiguracji stereozdefiniowanej lub jako mieszaniny P-epimerów.

Deoksyrybozym o wzorze ogólnym 1, według wynalazku, stanowi oligonukleotyd o długości od 27 do 39 nt i konserwatywnej 15-nt domenie katalitycznej opisanej w literaturze jako domena 10-23, z tym, że w wybranych pozycjach domeny katalitycznej znajdują się zasady nukleinowe wszystkich nukleozydów domeny katalitycznej identyczne z jednostkami zawartymi w oryginalnie wyselekcjonowanym deoksyrybozymie 10-23 (Santoro i Joyce, 1997), oprócz nukleozydów w wybranych pozycjach, w których znajduje się jednostka o wzorze ogólnym 2, korzystnie wzorze 2a, 2b, 2c lub 2d, gdzie B oznacza resztę uracylu modyfikowaną w pozycji 5 lub resztę adeniny modyfikowaną w pozycji 6 pierścienia nukleozasady podstawnikiem R2 stanowiącym resztę aminokwasu o charakterze zasadowym lub alkiloaminy, najkorzystniej resztę wybraną z grupy obejmującej histydynę lub glicynę.

Deoksyrybozymy o wzorze 1 i jednostkach o wzorze 2, znajdujących się w wybranej pozycji domeny katalitycznej, najkorzystniej w pozycji 8, gdy B stanowi resztę uracylu zawierającą podstawnik histaminowy lub alkilo-glicyloamidowy w położeniu C-5 pierścienia nukleozasady, wykazują korzystne właściwości inhibitorów ekspresji genów, to jest są kilkukrotnie bardziej aktywne niż deoksyrybozym wyjściowy (niemodyfikowany), dla reakcji prowadzonych w pojedynczym obrocie przy 100-krotnym nadmiarze deoksyrybozymu w stosunku do substratu RNA lub jego chimerycznego analogu, zawierającego jedynie w miejscu hydrolizy dimer RNA, a pozostałe fragmenty są zbudowane w reszt 2'-deoksyrybonukleotydowych, oraz w obecności jonów metali dwuwartościowych, najkorzystniej jonu magnezu(II) użytych w stężeniach milimolowych.

Deoksyrybozymy o wzorze 1 i jednostkach o wzorze 2 znajdujących się w wybranej pozycji domeny katalitycznej, najkorzystniej w pozycji 8, gdy B stanowi resztę uracylu zawierającą podstawnik histaminowy lub alkiloglicyloamidowy w położeniu C-5 pierścienia nukleozasady, wykazują aktywność katalityczną w warunkach pojedynczego obrotu tj. przy 100-krotnym nadmiarze enzymu wobec substratu i bez udziału jonów metali dwuwartościowych. Według wynalazku najbardziej korzystnie w bufo6

PL 219 355 B1 rach TRIS i PIPES o pH powyżej 7, użytych w stężeniach do molowych, najkorzystniej w stężeniach od 20 do 50 mM, dla reakcji prowadzonych w zakresie od 25 do 43°C, najkorzystniej w temp. 37°C.

Deoksyrybozymy o wzorze ogólnym 1, w których znajduje się jednostka o wzorze ogólnym 2, gdzie łańcuch boczny wywodzi się z reszty aminokwasów, najkorzystniej według wynalazku, takich jak histydyna, glicyna lub innych aminokwasów o charakterze zasadowym bądź alkiloamin w nieobecności jonów metali dwuwartościowych są aktywne tylko w stosunku do określonych substratów. Z badań własnych wynika, że enzymy te są specyficzne wyłącznie w stosunku do substratu posiadającego w miejscu hydrolizy dimer 5'-GpU-3', a więc hydroliza zachodzi pomiędzy 5'-flankującą jednostką guanozyny i 3'-flankującą jednostką urydyny. Specyficzność substratowa deoksyrybozymów 1 według wynalazku jest poszerzona w stosunku do specyficzności substratowej deoksyrybozymu niemodyfikowanego.

Sposób wytwarzania deoksyrybozymów o ustabilizowanej odporności na hydrolizę oraz podwyższonej aktywności katalitycznej, przedstawionych wzorem 1, zawierającego w wybranych pozycjach P domeny katalitycznej, co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie tiofosforanowe o wzorze 4a lub 4b, i/lub w wybranych pozycjach N, co najmniej jedną resztę nukleozydową o ogólnym wzorze 2, w którym B oznacza resztę uracylu ewentualnie modyfikowaną w pozycji 5 lub resztę adeniny modyfikowaną w pozycji 6, przedstawione wzorem 2' lub 2, gdzie R2 oznacza resztę alkiloaminy lub aminokwasu, korzystnie resztę histaminy lub glicyny, i/lub co najmniej jedną resztę nukleozydową o wzorze 3, w którym B1 oznacza resztę tyminy, uracylu, cytozyny, adeniny i/lub guaniny, a R1 oznacza atom F lub grupę alkoksylową -OR, gdzie R oznacza grupę o wzorze -C_nH_2n+i, a n oznacza liczbę naturalną od 1 do 5, korzystnie -OR oznacza grupę metoksylową, według wynalazku, polega na tym, że wiązanie tiofosforanowe, korzystnie stereozdefiniowane wprowadza się do oligonukleotydu poprzez zastosowanie procedury pozwalającej na syntezę stereozdefiniowanego tiofosforanu dinukleozydu, z wykorzystaniem stereokontrolowanego otwarcia pierścienia chiralnego oksatiafosfolanu 3'-nukleozydu za pomocą grupy 5'-hydroksylowej drugiego komponenta nukleozydowego, a następnie po usunięciu zasadowo-labilnej grupy ochronnej z funkcji 3'-hydroksylowej dimeru i ochrony funkcji tiofosforanowej za pomocą grupy alkiloarylowej, prowadzi się aktywację grupy 3'-hydroksylowej dinukleozydotiofosforanu za pomocą reszty amidofosforynowej do otrzymania monomeru, który wykorzystuje się następnie, obok amidofosforynów jednostek kanonicznych oraz/lub jednostek mod yfikowanych 2 i/lub 3, do syntezy oligonukleotydu o sekwencji deoksyrybozymu 10-23 poprzez zastosowanie standardowej procedury amidofosforynowej, z wydłużonym czasem kondensacji i zwiększonym nadmiarem amidofosofrynów modyfikowanych jednostek w porównaniu do monomerów jednostek kanonicznych oraz zastosowaniu odpowiedniej procedury usuwania oligonukleotydu od złoża stałego i usuwania grup ochronnych, w tym usuwania grupy ochronnej z funkcji tiofosforanowej, które prowadzi się za pomocą układu rozpuszczalników zawierających tiofenol.

Sposób wytwarzania deoksyrybozymów o ustabilizowanej odporności na hydrolizę oraz podwyższonej aktywności katalitycznej, przedstawionych wzorem 1, zawierającego w wybranych pozycjach P domeny katalitycznej, co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie tiofosforanowe o wzorze 4a lub 4b, i/lub w wybranych pozycjach N, co najmniej jedną resztę nukleozydową o ogólnym wzorze 2, w którym B oznacza resztę uracylu modyfikowaną w pozycji 5 lub resztę adeniny modyfikowaną w pozycji 6, przedstawione wzorem 2' lub 2, gdzie R2 oznacza resztę alkiloaminy lub aminokwasu, korzystnie resztę histaminy lub glicyny, według wynalazku, polega na tym, że odpowiednio modyfikowane jednostki nukleozydowe o ogólnym wzorze 2, przygotowuje się w reakcji aktywacji funkcji egzaminowej adeniny i kondensacji z aktywnym odczynnikiem niosącym w swojej strukturze resztę aminokwasu lub alkiloaminy, bądź poprzez aktywację pozycji 5 pierścienia tyminy i następujące po niej przyłączenie reszty niosącej ugrupowanie aminokwasowe lub grupę alkiloaminową, a następnie wbudowanie tak modyfikowanej jednostki do łańcucha oligonukleotydu z wykorzystaniem zaktywowanych funkcją amidofosforynową modyfikowanych jednostek N oraz jednostek o wzorze ogólnym 25 niosących stereozdefiniowane funkcje tiofosforanowe o wzorze 4a lub 4b.

Do wytwarzania deoksyrybozymów o wzorze 1 zawierających jednostki o wzorze 2 w wybranej pozycji domeny katalitycznej, gdzie B jest resztą nukleozasady modyfikowanej grupą stanowiącą resztę aminokwasu lub inną grupą alkiloaminową stosuje się procedurę syntezy według metody opisanej w literaturze a opartej na syntezie oligodeoksyrybonukleotydów na podłożu polimerowym LCA CPG z wykorzystaniem standardowych monomerów nukleotydowych w postaci 3'-O-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloamido)fosforynów 5'-DMTr chronionych nukleozydów oraz 3'-O-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloamido)fosforynu jednostki modyfikowanej 2, otrzymywanej według schematu I w reakcji

PL 219 355 B1 aktywacji funkcji egzaminowej za pomocą grupy arylooksykarbonylowej, najkorzystniej fenoksykarbonylowej, gdy nukleozydem jest 2'-deoksyadenozyna, a następnie wymianie podstawnika na resztę aminokwasu według opisanej wcześniej procedury (R.W Adamiak, E. Biała, K. Grześkowiak, R. Kierzek, A. Kraszewski, W.T Markiewicz, J. Okupniak, J. Stawiński, M. Wiewiórowski 1978, Nucleic Acids Res. 5, 1889), bądź według schematu II w reakcji utleniania grupy 5-metylowej, gdy resztą nukleozydu jest tymidyna, a następnie reakcji reduktywnego aminowania 5-formylo-tymidyny za pomocą reagentów o charakterze amin pierwszorzędowych zawierających podstawnik aminokwasowy według wcześniej opracowanej procedury (E. Sochacka, D. Smuga 2007, Tetrahedron Lett., 48, 1363; E. Sochacka, D. Smuga, 2008, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 27, 1045). Otrzymane jednostki 10 i 18, chronione na funkcji 5'-hydroksylowej za pomocą reszty 4,4'-dimetoksytrytylowej (DMTr) poddane są reakcji fosfitylacji za pomocą chloro-2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloamidofosforynu i w tej formie (jako związki 11 i 19) użyte do syntezy oligonukleotydów o sekwencji deoksyrybozymu 10-23, inkorporowane w ściśle zaprojektowaną pozycję domeny katalitycznej. Przebieg syntezy monomerów o wzorze 2 pokazany jest na schemacie I i schemacie II, zaś przykładowe procedury syntezy podane są w przykładach wykonania wynalazku. Syntezę oligonukleotydów zawierających jednostki 2 według wynalazku prowadzi się w sposób opisany w ogólnie dostępnej literaturze (M. H. Caruthers, 1985, Science, 230, 281), dobierając, według wynalazku, odpowiednio łącznik złoża LCA CPG (bursztynylowy, oksalilowy lub sarkozynylowy), czas kondensacji monomerów (od 60 do 600 s) oraz odpowiednie warunki usuwania grup ochronnych (przykładowo 28% wodny roztwór amoniaku, czas od 2 do 16 godzin, temperatury 25-55°C) i usuwania oligomeru ze złoża LCA CPG (przykładowo 28% wodny roztwór amoniaku, czas 30-120 minut), a także dwuetapowy sposób oczyszczania oligomeru według sposobu Zona i Steca metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej na odwróconej fazie (G. Zon, W.J. Stec Phosphorothioate oligonucleotides. In: Oligonucleotides and Analogues; A practical Approach. Eckstein, F. (editor). Oxford; IRL Press, 1991, p. 87-108)).

Masy cząsteczkowe oligonukleotydów są potwierdzone za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF, a czystość określona jako >95% za pomocą elektroforezy na żelu poliakryloamidowym z dodatkiem 7M mocznika.

Deoksyrybozymy o wzorze ogólnym 1 zawierające jednostki o wzorze 2 w wybranej pozycji domeny katalitycznej, gdzie B jest resztą nukleozasady modyfikowanej grupą stanowiącą resztę aminokwasu lub inną grupą alkiloaminową według wzoru 2, są poddawane hybrydyzacji z komplementarnym oligonukleotydem o sekwencji homologicznej do mRNA beta-sekretazy (BACE1), białka zaangażowanego w patogenezę choroby Alzheimera (B. Nawrot, S. Antoszczyk, M. Maszewska, T. Kuwabara, M. Warashina, K. Taira, W.J. Stec, 2003, Eur. J. Biochem. 270, 3962; B. Nawrot, 2004, Acta Biochim. Pol. 51 (2), 431; M. Sierant, K. Kubiak, J. Kazmierczak-Baranska, M. Warashina, T. Kuwabara, B. Nawrot, 2009, International Journal of Alzheimer's Disease Article ID 257403) i badane pod względem ich właściwości fizyko-chemicznych i biologicznych.

Deoksyrybozymy o wzorze ogólnym 1 mogą być projektowane jako inhibitory ekspresji genów wybranych celów molekularnych, takich jak mRNA białek człowieka, odpowiedzialnych za patogenezę chorób lub jako inhibitory replikacji wirusów, skierowane na wirusowe RNA. Deoksyrybozymy mogą być także projektowane jako nukleazy RNA dla dowolnie wybranych sekwencji. W takich przypadkach zmianie ulega sekwencja domen rozpoznania substratu, natomiast część katalityczna tj. sekwencja domeny 10-23 z modyfikacjami według wynalazku pozostaje niezmieniona.

Przedmiotem wynalazku są także deoksyrybozymy o wzorze ogólnym 1, które według zastrzeżenia w wybranych pozycjach domeny katalitycznej zawierają zasady nukleinowe wszystkich nukleozydów domeny katalitycznej identyczne z jednostkami zawartymi w oryginalnie wyselekcjonowanym deoksyrybozymie 10-23 (S.W. Santoro, G.F. Joyce 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4262), lub wszystkie oprócz przypadku, gdzie w wybranych pozycjach według wynalazku znajduje się jednostka o wzorze ogólnym 3, w której reszta 2'-deoksyrybozy zastąpiona jest resztą 2'-podstawionej rybozy, według wynalazku podstawnikiem R1 takim jak: F lub O-alkilo, najkorzystniej grupą OMe, które według wynalazku posiadają modyfikacje wiązań internukleotydowych w wybranych pozycjach domeny katalitycznej polegające na zamianie jednego lub kilku wiązań fosforanowych na wiązania tiofosforanowe, to jest takie, w którym jeden z niemostkowych atomów tlenu jest zastąpiony atomem siarki, a konfiguracja centrum chiralnego jest określona jako R_p lub S_p o wzorze 4 lub deoksyrybozym stanowi mieszaninę P-epimerów Rp+Sp (mix) na wybranym chiralnym atomie fosforu, najkorzystniej, gdy deoksyrybozym 1 zawiera pojedyncze wiązanie tiofosforanowe o konfiguracji R_p w pozycji P1 lub dwa wiązania tiofosforanowe, w pozycji P1 o konfiguracji R_p i w pozycji P8 o konfiguracji S_p, zaś wszystkie jed8

PL 219 355 B1 nostki nukleozydowe domeny katalitycznej są identyczne z niemodyfikowanym enzymem 10-23, lub deoksyrybozymy o wzorze ogólnym 1, które posiadają jedno lub więcej wiązań tiofosforanowych o konfiguracji mix, najkorzystniej dwa wiązania tiofosforanowe w pozycjach P1 i P8 lub pięć wiązań tiofosforanowych w pozycjach P1, P7, P8, P14 i P15 oraz wszystkie jednostki nukleozydowe domeny katalitycznej identyczne z niemodyfikowanym enzymem 10-23, lub niektóre jednostki domeny katalitycznej zamienione na jednostki o wzorze ogólnym 3, w której reszta R1 2'-deoksyrybozy zastąpiona jest resztą 2'-podstawionej rybozy, według wynalazku z podstawnikami 2'-R1 takimi jak: F lub -OR gdzie R jest podstawnikiem alkilowym C_nH_2n+₁, a n=1 do 5, najkorzystniej grupą OMe w pozycjach N2, N7, N8, N11, N14 i N15.

Związki o wzorze ogólnym 1, zawierające w swej strukturze wiązania tiofosforanowe posiadają korzystne właściwości biofizyczne i biologiczne, w tym zwiększoną odporność na hydrolizę pod wpływem nukleaz komórkowych oraz zróżnicowaną aktywność hydrolityczną w stosunku do komplementarnych fragmentów RNA. W najbardziej korzystnej sytuacji deoksyrybozym 1, w którym znajduje się jedno wiązanie tiofosforanowe o konfiguracji Rp (IC50=0,008 pM) jest ponad 60-krotnie bardziej aktywny jako katalizator reakcji hydrolizy wiązania fosfodiestrowego w komplementarnym substracie RNA niż jego P-epimer, deoksyrybozym 1, w którym znajduje się jedno wiązanie tiofosforanowe o konfiguracji S_p (IC₅₀=0,530 pM) oraz deoksyrybozym 1 zawierający dwa wiązania tiofosforanowe o konfiguracji Rp w pozycji P1 i o konfiguracji Sp w pozycji P8 wykazujący aktywność kilkukrotnie wyższą niż pozostałe P-diastereomery i niemodyfikowany deoksyrybozym 10-23.

Związki o wzorze ogólnym 1, które posiadają jedno lub więcej wiązań tiofosforanowych o konfiguracji mix, najkorzystniej dwa wiązania tiofosforanowe w pozycjach P1 i P8 lub pięć wiązań tiofosforanowych w pozycjach P1, P7, P8, P14 i P15 oraz wszystkie jednostki nukleozydowe domeny katalitycznej identyczne z niemodyfikowanym enzymem 10-23, lub niektóre jednostki zamienione na jednostki o wzorze ogólnym 3, w której reszta 2'-deoksyrybozy zastąpiona jest resztą 2'-podstawionej rybozy z grupą R1, najkorzystniej grupą 2'-OMe w pozycjach N2, N7, N8, N11, N14 i N15 domeny katalitycznej oraz na 3'- i 5'-końcu oligonukleotydu posiadają korzystne właściwości biologiczne, wykazując zauważalnie wyższą stabilność na hydrolizę nukleazami w środowisku ekstraktu komórkowego z komórek HeLa (np. czas połowicznego rozkładu deoksyrybozymu 1 zawierającego pięć wiązań tiofosforanowych w pozycjach P1, P7, P8, P14 i P15 oraz jednostki o wzorze ogólnym 3, w której reszta 2'-deoksyrybozy zastąpiona jest resztą 2'-podstawionej rybozy z grupą R1, najkorzystniej grupą 2'-OMe w pozycjach N2, N7, N8, N11, N14 i N15 wynosi 4,6 h w porównaniu do 2,5 h dla niemodyfikowanego enzymu) oraz podwyższoną efektywność w warunkach in vitro w hydrolizie wiązania fosfodiestrowego w komplementarnym substracie RNA znakowanym radioaktywnie o sekwencji homologicznej do mRNA białka BACE1 (B. Nawrot, K. Widera, M. Wojcik, B. Rebowska, G. Nowak, WJ. Stec, 2007, FEBS J., 274, 1062) (2 do 3 razy wyższa efektywność określanej jako stosunek stabilności do aktywności katalitycznej w porównaniu do niemodyfikowanego enzymu) oraz w systemie komórkowym (50% zahamowania ekspresji genu białka BACE1 w porównaniu do jedynie 20% aktywności niemodyfikowanego enzymu użytych w stężeniu 50 nM dla doświadczenia przeprowadzonego w komórkach HeLa z nadekspresją genu białka fuzyjnego BACE/GFP, zachodzącą z plazmidu p-BACE/GFP (K. Sipa, E. Sochacka, J. Kazmierczak-Baranska, M. Maszewska, M. Janicka, G. Nowak, B. Nawrot, 2007, RNA 13(8): 1301).

Sposób wytwarzania deoksyrybozymów o wzorze 1, o stabilnej odporności na hydrolizę przez nukleazy komórkowe, zawierających co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie tiofosforanowe o wzorze 4a lub 4b, korzystnie o określonej konfiguracji absolutnej na chiralnych atomach fosforu, znajdujące się w wybranych pozycjach P domeny katalitycznej, zwłaszcza w pozycji P1, P7, P8, P14 i/lub P15, i ewentualnie co najmniej jedną modyfikowaną resztę nukleozydową N przedstawioną wzorem ogólnym 3, w którym B1 oznacza resztę uracylu, cytozyny, adeniny i/lub guaniny, a R1 oznacza atom fluoru lub alkoksyl, korzystnie metoksyl, zwłaszcza w pozycjach N2, N7, N8, N11, N14 i/lub N15 domeny katalitycznej, lub co najmniej jedną, modyfikowaną resztę nukleozydową N przedstawioną wzorem 2, w którym B oznacza ewentualnie podstawioną resztę uracylu lub adeniny, korzystnie przedstawioną wzorem 2a, 2b, 2c i/lub 2d, według wynalazku, polega na tym, że stereozdefiniowane wiązanie tiofosforanowe wprowadza się do oligonukleotydu poprzez zastosowanie procedury pokazanej na schemacie III pozwalającej na syntezę stereozdefiniowanego tiofosforanu dinukleozydu 22, utworzonego korzystnie z 5'-O-DMTr i N-chronionego 2'-deoksyrybonukleozydo-3'-O-(2'-tio-spiro-pentametyleno-1,3,2-oksatiafosfolanu) o wzorze 20, w którym B3 oznacza grupę o wzorze a, b, c lub d, a PG oznacza acylową grupę ochronną stosowaną rutynowo w syntezie oligonukleotydów metodą

PL 219 355 B1 amidofosforynową, najkorzystniej benzoilową, izobutyrylową, fenoksyacetylową (P. Guga, and W.J. Stec, 2003. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry; editors: S.L. Beaucage, D.E. Bergstrom, G.D. Glick, R.A. Jones, pp. 4.17.1-4.17.28. John Wiley & Sons, Hoboken: B. Nawrot, B. Rębowska, K. Cieślińska, W.J. Stec. 2005, Tetrahedron Lett. 46, 6641; B. Nawrot, B. Rębowska, 2009; Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Chapter 4: Unit 4.34),) w reakcji otwarcia pierścienia oksatiafosfolanowego za pomocą 3'-chronionego resztą arylową, korzystnie resztą izopropoksyacetylową, nukleozydu o wzorze 21, w którym B4 oznacza grupę o wzorze a, b, c lub d, a PG oznacza acylową grupę ochronną, z zablokowanymi resztami egzaminowymi (w przypadku dA, dC i dG) w bezwodnym acetonitrylu w obecności DBU (schemat III). Otrzymany dimer o wzorze 22 jest poddawany działaniu słabego środowiska alkalicznego, korzystnie wodnego roztworu amoniaku (28%) w dioksanie (1:1) w czasie 25-30 min w celu usunięcia ochronnej grupy izopropoksyacetylowej z funkcji 3'-hydroksylowej, a następnie związek o wzorze 23 jest poddany reakcji z halogenkiem aryloalkilowym, korzystnie bromkiem 2-nitrobenzylowym w celu przeprowadzenia reakcji S-alkilowania. Po aktywacji grupy 3'-hydroksylowej w związku o wzorze 24 za pomocą 2-cyjanoetylo-bis-(N,N-diizopropylo)-amidofosforynu w obecności S-etylotiotetrazolu w bezwodnym acetonitrylu zsyntetyzowany monomer o wzorze 25 wykorzystuje się następnie do syntezy oligonukleotydu o sekwencji deoksyrybozymu 10-23 z wiązaniem tiofosforanowym o wzorze 4a lub 4b, poprzez zastosowanie procedury typowej dla syntezy oligonukleotydów metodą amidofosforynową (M. H. Caruthers, 1985, Science, 230, 281), z tym, że amidofosforyn o wzorze 25 podawany jest do syntezy w nadmiarze w stosunku do monomerów jednostek kanonicznych, reakcje kondensacji prowadzi się w czasie wydłużonym do 600 s, a syntezę oligonukleotydu wykonuje się z pozostawieniem 5'-terminalnej grupy DMTr.

Procedura deblokowania musi być bezpieczna dla zachowania funkcji tiofosforanowych w oligonukleotydzie. Dlatego też w pierwszym etapie oligonukleotyd jest traktowany 1 M roztworem piperydyny w acetonitrylu, w czasie którego następuje usunięcie grup 2-cyjanoetylowych z reszt fosforanowych, a wydzielający się akrylonitryl jest usuwany z mieszaniny reakcyjnej. Według tej procedury nie zachodzi reakcja następcza t.j. addycja Michaela akrylonitrylu do grupy tiofosforanowej (S., Alefelder, B.K., Patel, and F. Eckstein, 1998. Nucleic Acid Res. 26:4983-4988). W kolejnym etapie oligonukleotyd jest traktowany przez 5-7 min roztworem dioksanu, triethylaminy i tiofenolu (1/2/2, v/v/v) w celu usunięcia grupy ochronnej z funkcji PS, a następnie 20% etanolowym roztworem amoniaku w celu usunięcia grup zasadowo-labilnych. Po oczyszczeniu oligonukleotydu metodą HPLC na odwrotnej fazie oligomer jest traktowany 50% roztworem kwasu octowego i po zatężeniu roztworu pod zmniejszonym ciśnieniem ponownie poddany oczyszczaniu metodą RP-HPLC. Masa cząsteczkowa oligonukleotydów była potwierdzona metodą MALDI-TOF, zaś czystość metodą elektroforezy w 20% żelu poliakryloamidowym z dodatkiem 7 M mocznika. Konfigurację absolutną potwierdzono enzymatycznie stosując do hydrolizy oligonukleotydów fosfodiesterazę z jadu węża (PDE I) i 3'-endonukleazę P1 (nP1) w znany sposób (P.MJ., Burgers, F., Eckstein, and D.HJ. Hunneman, 1979. J. Biol. Chem. 254:7476-7478; B. V. Potter, and F. Eckstein, 1984. J. Biol. Chem. 259:14243-14248; B.V., Potter, B.A., Connolly, and F. Eckstein, 1983, Biochemistry 22:1369-1377). Produkty hydrolizy analizowano metodą HPLC i porównywano z handlowymi wzorcami.

Sposób wytwarzania deoksyrybozymów o wzorze 1, o podwyższonej aktywności katalitycznej, zawierających co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie tiofosforanowe o wzorze 4a lub 4b, korzystnie o określonej konfiguracji absolutnej na chiralnych atomach fosforu, znajdujące się w wybranych pozycjach P domeny katalitycznej, zwłaszcza w pozycji P1, P7, P8, P14 i/lub P15, i ewentualnie co najmniej jedną modyfikowaną resztę nukleozydową N przedstawioną wzorem 2, zwłaszcza wzorem 2a, 2b, 2c i/lub 2d, według wynalazku, polega na tym, że odpowiednio modyfikowane jednostki nukleozydowe przygotowuje się w reakcji aktywacji funkcji egzaminowej adeniny i kondensacji z aktywnym odczynnikiem niosącym w swojej strukturze resztę aminokwasu lub alkiloaminy, bądź poprzez aktywację pozycji 5 pierścienia tyminy i następujące po niej przyłączenie reszty niosącej ugrupowanie aminokwasowe lub grupę alkiloaminową, a następnie wbudowuje się tak modyfikowane jednostki do łańcucha oligonukleotydu z wykorzystaniem zaktywowanych funkcją amidofosforynową modyfikowanych jednostek N oraz jednostek o wzorze ogólnym 25 niosących stereozdefinowaną funkcję tiofosforanową o wzorze 4a lub 4b.

Do wytwarzania związków o wzorze ogólnym 1 wykorzystuje się znaną i opisaną metodę syntezy oligodeoksyrybonukleotydów na podłożu polimerowym LCA CPG i standardowe monomery w postaci 3'-O-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloamido)fosforynów 5'-DMTr chronionych nukleozydów oraz, w przypadku syntezy stereozdefiniowanych analogów oligonukleotydów tiofosforanowych używa się

PL 219 355 B1 dodatkowo przygotowanego według znanej procedury odpowiednio chronionego 3'-O-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloamido)fosforynu dinukleozydo-tiofosforanu (B. Nawrot, B. Rębowska, K. Cieślińska, W.J. Stec. 2005, Tetrahedron Lett. 46, 6641; B. Nawrot, B. Rębowska, 2009; Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Chapter 4: Unit 4.34), zaś w syntezie oligonukleotydów tiofosforanowych o konfiguracji mix zamiast procesu utleniania funkcji fosforynowej w danym wiązaniu internukleotydowym prowadzonego rutynowo w obecności I2/H2O/Py stosuje się usiarczanie, w znany sposób, za pomocą handlowo dostępnych odczynników usiarczających (np. odczynnik Beaucage'a). Usunięcie oligonukleotydów ze złoża stałego oraz usunięcie wszystkich grup protekcyjnych prowadzi się w znany sposób.

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku.

P r z y k ł a d I

Synteza 3',5'-di-O-acetylo-N⁶-fenoksykarbonylo-2'-deoksyadenozyny o wzorze 7 metodą z zastosowaniem 1-fenoksykarbonylotetrazolu (schemat I)

3',5'-di-O-Acetylo-2'-deoksyadenozyna (o wzorze 6) otrzymana według ogólnego przepisu (W. Andersen, D.H. Hayes, A.M. Michelson, A.R. Todd 1954, J. Chem. Soc. (Resumed), 1882) (1,16 g, 3,5 mmol) została rozpuszczona w bezwodnym dioksanie (35 mL) i poddana reakcji z 1-fenoksykarbonylotetrazolem (2,0 g, 10,5 mmol) w temp. 35°C. Po 24 godz., gdy kontrola TLC wykazała całkowite przereagowanie substratu, rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a surowy produkt oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: 0-1% MeOH w CHCI₃ v/v). Nukleozyd o wzorze 7 został otrzymany w postaci białej piany z wyd. 75% (1,20 g).

P r z y k ł a d II

Synteza 3',5'-di-O-acetylo-N⁶-fenoksykarbonylo-2'-deoksyadenozyny o wzorze 7 metodą ₁ z zastosowaniem chlorku 1-fenoksykarbonylo-N¹-metyloimidazoliowego

3',5'-di-O-Acetylo-2'-deoksyadenozynę (6) (1,68 g, 5,0 mmol) rozpuszczono w bezwodnym ₁

CH₂CI₂ (50 mL) a następnie dodano chlorek 1-fenoksykarbonyloW -metyloimidazoliowy (3,6 g, 15,0 mmol). Zawiesina była mieszana przez 2 godz. w temp. pokojowej w atmosferze argonu. Po tym czasie osad częściowo rozpuścił się, a kontrola postępu reakcji za pomocą TLC wykazała przereagowanie substratu. Osad odsączono i przemyto bezwodnym CH₂CI₂ (2x5 mL). Przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a surowy produkt oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym stosując octan etylu jako eluent. Otrzymano nukleozyd o wzorze 7 (1,71 g, Wyd. 75%).

TLC Rf: 0.63 (CHCl3/MeOH 90:10 v/v), 0.42 (AcOEt);

¹H NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 2.07 (s, 3H, CH3COO), 2.14 (s, 3H, CH3COO), 2.67 (ddd, 1H, JH2',H3' = 2.5 Hz, JH2',H1' = 6.0 Hz, Jgem = 14.2 Hz, H2'), 2.98 (ddd, 1H, JH2',H3' = 6.5 Hz, JH2'',H1' = 7.7 Hz, Jgem = 14.2 Hz, H2''), 4.27 - 4.49 (m, 3H, H4', H5', H5''), 5.44 (m, 1H, H3'), 6.49 (dd, 1H, JH1',H2' = 6.1 Hz, JH1',H2'' = 7.7 Hz, H1'), 6.80 - 7.47 (m, 5H, PhO), 8.26 (s, 1H, H2), 8.81 (s, 1H, H8), 9.34 (bs, 1H, CONH);

P r z y k ł a d III

Synteza 3',5'-di-O-acetylo-N⁶-[(1S,2R)-1-{{2-(trimetylosililo)etoksy]karbonylo}-2{[(tert-butylo)dimetylosililo]oksy}propyloaminokarbonylo]-2'-deoksyadenozyny o wzorze 8a

3',5'-Di-O-acetylo-Ń⁶-fenoksykarbonylo-2'-deoksyadenozynę (o wzorze 7) (650 mg, 1,4 mmol), po osuszeniu przez dwukrotne odparowanie z bezwodną pirydyną (2x10 mL), rozpuszczono w tym samym rozpuszczalniku (10 mL), a następnie potraktowano trifluorooctanem estru trimetylosililoetylowego O-tert-butylodimetylosililo-L-treoniny (1,25 g, 2,8 mmol). Po 72 godz. mieszania w temp. 35°C, gdy kontrola postępu reakcji za pomocą TLC wykazała całkowite przereagowanie substratu, roztwór odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie trzykrotnie z bezwodnym toluenem (3x5 mL). Surowy produkt oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: 0-2% MeOH w CHCI₃ v/v). Nukleozyd 8a otrzymano w postaci białej piany (689 mg, Wyd. 69%).

TLC Rf: 0.09 (CHCl3/MeOH 98:2 v/v), 0.40 (AcOEt/MeOH 98:2 v/v);

m/z (MS, FAB) 695.4 [M+H]⁺, 693.4 [M-H]^-; (694.3 oblicz. dla C30H50Si2N6O9) m/z (HRMS, FAB) 695.3233 ([M+H]+ C^^i^Og obliczone 695.3256);

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 0.03 (s, 9H, (CH3)3Si), 0.04 (s, 3H, CH3Si), 0.09 (s, 3H, CH3Si),

0.94 (s, 9H, (CH3)₃CSi), 0.96 - 1.06 (m, 2H, SiCH₂CH₂), 1.27 (d, 3H, J_Ch_y,ch_p = 6.3 Hz, CH₃-_y), 2.09 (s, 3H, CH3COO), 2.15 (s, 3H, CH3COO), 2.65 (ddd, 1H, JH2',H3' = 2.6 Hz, JH2',H1' = 6.0 Hz, Jgem = 14.2 Hz, H2'), 3.02 (ddd, 1H, JH2'',H3' = 6.3 Hz, JH2'',H1' = 7.9 Hz, Jgem = 14.0 Hz, H2''), 4.10 - 4.64 (m, 7H, CH₂CH₂O, H4', H5', H5'', CH-a.CH-β), 5.45 (m, 1H, H3'), 6.45 (dd, 1H, Jhi'H2' = 6.1 Hz, Jhi'H2' = 7.7 Hz, H1'), 8.17 (s, 1H, H2), 8.22 (bs, 1H, NHCO), 8.54 (s, 1H, H8), 10.04 (d, 1H, ^HaCHa = 9.3 Hz, NH-a);

PL 219 355 B1 ¹³C NMR (63 MHz, CDCis) δ -5.19 (CH₃Si), -4.10 (CH₃Si), -1.44 ((CH₃)₃Si), 17.45 ((CH₃)₃CSi),

17.99 (SiCH₂CH₂), 20.86 (CH3COO), 21.04 (CH3COO), 21.28 (Ογ), 25.72 <(CH3)3CSi), 37.40 (C2'),

59.70 (Ca), 63.77 (CH₂CH₂O), 63.86 (C5'), 68.98 (Cp), 74.69 (C3'), 82.83 (C4'), 84.92 (Cl'), 121.17 (C5), 141.84 (C8), 150.77 (C4), 151.23 (NHCONH), 151.39 (C2), 154.76 (C6), 170.37 (CH3COO),

170.57 (CH3COO), 171.20 (COOCH2);

P r z y k ł a d IV

Synteza N⁶-[(1S,2R)-1-{{2-(trimetylosililo)etoksy]karbonylo}-2{[(tert-butylo)dimetylosililo]oksy}propyloaminokarbonylo]-2'-deoksyadenozyny 9a

Blokowany nukleozyd 8a (556 mg, 0,8 mmol) potraktowano metanolem nasyconym NH₃ (~10M, 17 mL) przez 24 godz. w temp. pokojowej. Następnie rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymany surowy produkt oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: 0-10% MeOH w CHCI₃ v/v). Deacetylowany nukleozyd 9a został otrzymany w postaci białej piany (366 mg, Wyd. 75%).

TLC R_f: 0.34 (CHCfe/MeOH 90:10 v/v), 0.36 (AcOEt/MeOH 90:10 v/v);

MS CI m/z: 611.3 [M+H]+ (oblicz. 611.30 dla C^y^OySh);

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 0.00 (s, 9H, (CH3)3Si), 0.01 (s, 3H, CH3Si), 0.07 (s, 3H, CH3Si), 0.90 (s, 9H, (C^^CSi), 0.92-1.02 (m, 2H, SiCH₂CH₂), 1.25 (d, 3H, Jch^ch_p = 6.2 Hz, CHs-γ), 2.37 (m, 1H, H2'), 3.02 (m, 1H, H2''), 3.80-4.56 (m, 7H, CH₂CH₂O, H4', H5', H5'', CH-a,CH-p), 4.79 (m, 1H, H3'), 6.44 (dd, 1H, JH1',H2' = 5.6 Hz, JH1,H2' = 9.0 Hz, H1'), 8.17 (s, 1H, H2), 8.47 (s, 1H, H8), 8.64 (bs, 1H, NHCO), 10.00 (d, 1h, JNHa,CHa = 9.1 Hz, NH-α);

P r z y k ł a d V

Synteza 3',5'-di-O-acetylo-N⁶-{2-[N¹-(4-metoksytrytylo)imidazolo-4-ylo]etyloaminokarbonylo}-2'-deoksyadenozyny o wzorze 8b

3',5'-Di-O-acetylo-W⁶-fenoksykarbonylo-2'-deoksyadenozynę (7) (271 mg, 0,60 mmol) osuszono przez dwukrotne odparowanie z bezwodną pirydyną (2x5 mL) i rozpuszczono w tym samym rozpuszczalniku (4 mL). Następnie dodano N^m-(4-metoksytrytylo)histaminę (596 mg, 1,20 mmol, 2 eq.), również osuszoną uprzednio przez dwukrotne odparowanie z bezwodną pirydyną (2x5 mL). Po 24 godz. mieszania w temp. 35°C, kontrola postępu reakcji za pomocą TLC wykazała przereagowanie substratu. Mieszanina reakcyjna została odparowana pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie trzykrotnie z toluenem (3x5 mL) w celu usunięcia śladowych ilości pirydyny. Surowy produkt został oczyszczony za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: 0-5% MeOH w CHCI₃ v/v). Nukleozyd 8b został otrzymany w postaci kremowej piany (352 mg, Wyd. 78%).

TLC Rf: 0.44 (CHCl3/MeOH 90:10 v/v), 0.28 (AcOEt/MeOH 90:10 v/v); m/z (MS, FAB) 745.3 [M+H]⁺, 743.1 [M-H]^- (C40H40N8O7 obliczone 744.3)

HRMS FAB m/z: 745.3078 ([M+H]⁺ C40H41N8O7 oblicz. 745.3098);

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 2.08 (s, 3H, CH3COO), 2.14 (s, 3H, CH3COO), 2.63 (ddd, 1H, JH2',H3' = 2.5 Hz, JH2',H1' = 6.0 Hz, Jgem = 14.2 Hz, H2'), 2.90 (t, 2H, J = 6.7 Hz, CH2-p), 3.02 (ddd, 1H, Jh2’’H3' = 6.3 Hz, Jh2'',h1' = 8.0 Hz, J₉em = 14.2 Hz, H2''), 3.66 - 3.76 (m, 2H, CH₂-a), 3.77 (s, 3H, OCH3), 4.31 - 4.47 (m, 3H, H4', H5', H5''), 5.46 (dt, 1H, JH3',H2' = JH3',H4' = 2.3 Hz, JH3',H2'' = 6.1 Hz, H3'), 6.46 (dd, 1H, JH1',H2' = 5.9 Hz, JH1',H2'' = 8.0 Hz, H1'), 6.66 (d, 1H, ⁴JH5,H2 = 1.4 Hz, Im-CH-5), 6.73 - 7.35 (m, 14H, MMTr), 7.39 (d, 1H, ⁴JH2,H5 = 1.4 Hz, Im-CH-2), 8.27 (s, 1H, H2), 8.31 (bs, 1H, NHCO), 8.34 (s, 1H, H8), 9.56 (t, 1H, Jnh<^ch<x = 5.6 Hz, NH-α);

¹³C NMR (63 MHz, CDCl3) δ 20.97 (CH3COO), 21.13 (CH3COO), 28.89 (Cp), 37.57 (C2'), 40.17 (Ca), 55.44 (OCH3), 63.91 (C5'), 74.71 (C3'), 75.00 (MMTr-CPh3), 82.90 (C4'), 84.92 (Cl'), 113.38 (MMTr-o'), 118.92 (Im-CH-5), 121.02 (C5), 128.13 (MMTR-o,p), 129.82 (MMTr-m), 131.29 (MMTr-m'), 134.69 (Im-CH-4), 138.64 (Im-CH-2), 138.75 (MMTr-i'), 141.22 (C8), 142.93 (MMTr-i), 150.13 (C4), 150.64 (NHCONH), 151.43 (C2), 154.01 (C6), 159.23 (MMTr-p'), 170.47 (CH3COO), 170.62 (CH3COO);

P r z y k ł a d VI

Synteza N⁶-{2-[N¹-(4-metoksytrytylo)imidazolo-4-ylo]etyloaminokarbonylo}-2'-deoksyadenozyny o wzorze 9b

Acetylowany nukleozyd 8b (335 mg, 0,45 mmol) rozpuszczono w MeOH nasyconym NH₃ (~10M, 9.5 mL). Po 24 godz. w temp. pokojowej, kontrola postępu reakcji (TLC) wykazała przereagowanie substratu. Po odparowaniu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem, surowy produkt został oczyszczony za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: 0-15% MeOH w CHCl₃ v/v). Nukleozyd 9b otrzymano w postaci kremowej piany (230 mg, Wyd. 78%).

PL 219 355 B1

TLC Rf: 0.45 (CHCh/MeOH 85:15 v/v), 0.25 (AcOEt/MeOH 80:20 v/v);

MS FAB m/z: 663.5 [M+3H]⁺ (oblicz. 663.30 dla C36H39N8O5);

¹H NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 2.42 (ddd, 1H, Jh2',h3' = 1.9 Hz, Jh2',hi' = 5.7 Hz, Jgem = 13.5 Hz,

H2'), 2.91 (ddd, 1H, JH2'',H3' = 5.2 Hz, JH2'',H1' = 7.7 Hz, Jgem = 13.5 Hz, H2''), 3.05 (t, 2H, J = 6.5 Hz,

CH2-P), 3.77 (s, 3H, OCH3), 3.78 - 4.03 (m, 4H, CH₂-a, H5'. H5”). 4.19 (m, 1H. H4'), 4.84 (m. 1H. H3'),

6.42 (dd, 1H, JH1',H2' = 5.9 Hz, JH1',H2'' = 7.7 Hz, H1'), 6.75 (d, 1H, ⁴JH5,H2 = 0.7 Hz, Im-CH-5), 6.76 - 7.38 (m, 15H, MMTr, Im-CH-2), 8.32 (s, 1H, H2), 8.40 (s, 1H, H8), 8.55 (bs, 1H, NHCO), 9.58 (t, 1H, dNHa,CHa = 5.5 Hz, NH-a);

P r z y k ł a d VII ₁

Synteza 3',5'-di-O-acetylo-5-{2-[N¹-(4-metoksytrytylo)imidazolo-4-ylo]aminometylo}-2'-deoksyurydyny o wzorze 15^a (schemat II)

3',5'-Di-O-acetylo-5-formylo-2'-deoksyurydynę (14) (340 mg, 1,0 mmol) osuszono przez odparowanie z bezwodnym CH₂CI₂ (2x10 mL), a następnie nukleozyd rozpuszczono w tym samym rozpuszczalniku (7 mL). Dodano kolejno W^m-4-metoksytrytylo)-histaminę (596 mg, 1,2 mmol), Et₃N (167 μί, 1,2 mmol) oraz NaBH(OAc)₃ (254 mg, 1,2 mmol). Po 2 godz. mieszania w temp. pokojowej, gdy przeprowadzona kontrola TLC wykazała obecność niewielkich ilości wyjściowego nukleozydu, dodano kolejną porcję NaBH(OAc)₃ (106 mg, 0.50 mmol). Po następnych 2 godz., gdy stwierdzono całkowite przereagowanie substratu (TLC), do mieszaniny reakcyjnej dodano CH₂CI₂ (20 mL) i przemyto 5% wodnym roztworem NaHCO₃ (10 mL). Następnie warstwę wodną wyekstrahowano 3x CH₂CI₂ (20 mL) i połączone frakcje organiczne osuszono za pomocą MgSO₄. Po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu rozpuszczalnika, z surowej mieszaniny wydzielono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: 0-25% MeOH w CHCI₃) dwa produkty w postaci żółtej piany: o wzorze 15a (390 mg, Wyd. 55%) i o wzorze 16a w postaci mieszaniny izomerów Z i E(290 mg, Wyd. 41%)

Dane dla 15a

TLC Rf: 0.32 (CHCI3/MeOH 90:10 v/v), 0.11 (AcOEt/MeOH 90:10 v/v);

HRMS FAB m/z. 708.3052 ([M+H]+ C3gH4₂N₅O₈ oblicz. 708.3033);

UV (CHCl₃): X_max = 266.0 nm (ε = 7 700 M^-1 cm^-1), X_min = 251.5 nm;

¹H NMR (250 MHz, CDCh) δ 2.10 (s, 3H, CH3COO), 2.11 (s, 3H, CH3COO), 2.30 (ddd, 1H, Jh2',hs' = 6.4 Hz, Jh2',hi· = 8.4 Hz, Jgem = 14.5 Hz, H2'), 2.43 (ddd, 1H, Jh2'',h3' = 1.8 Hz, Jh2”,hi· = 5.7 Hz, Jgem = 14.3 Hz, H2”), 2.80 (t, 2H, J = 7.0 Hz, CH₂-3), 2.99 (t, 2H, J = 7.0 Hz, CH₂-a), 3.57 (d, 1H, Jgem = 13.7 Hz, jeden z CH₂-7), 3.66 (d, 1H, Jgem = 13.8 Hz, jeden z CH₂-7), 3.81 (s, 3H, OCH3), 4.21 (m, 1H, H4'), 4.28 (dd, 1H, Jh₅-,h4' = 3.5 Hz, Jgem = 12.0 Hz, H5''), 4.39 (dd, 1H, Jh5',h4' = 4.7 Hz, Jgem = 12.0 Hz, H5'), 5.22 (dt, 1H, Jh3',h2'' = Jh3',h4' = 2.0 Hz, Jh3',h2' = 6.3 Hz, H3'), 5.77 Hz, Jhi',h2' = 8.6 Hz, HI'), 6.59 (d, 1H, ⁴Jh5,h2 = 1.2 Hz, Im-CH-5), 6.77 - 7.37 (m, 14H, MMTr), 7.38 (d, 1H, ⁴Jh2,h5 = 1.4 Hz, Im-CH-2), 7.66 (s, 1H, H6);

¹³C NMR (63 MHz, CDCis), δ 21.08 (2xCH3COO), 27.56 (Οβ). 37.34 (C2'), 45.52 (C7), 48.85 (Ca), 55.47 (OCH3), 64.03 (C5'), 74.58 (C3'), 7505 (MMTr-CPh3), 82.52 (C4'), 85.30 (Cl'), 111.73 (C5), 113.45 (MMTr-o'), 118.74 (Im-CH-5), 128.19 (MMTr-o,p), 129.82 (MMTr-m), 131.30 (MMTr-m'), 134.64 (Im-CH-4), 138.13 (MMTr-I'), 138.64 (C6), 138.71 (Im-CH-2), 142.88 (MMTr-I), 150.43 (C2), 159.25 (MMTr-p'), 163.47 (C4), 170.51 (CH3COO), 170.65 (CH3COO);

Dane dla mieszaniny izomerów 16a (Z i E)

TLC Rf: 0.48, 0.63 (CHC^/MeOH 90:10 v/v), 0.23, 0.41 (AcOEt/MeOH 90:10 v/v);

HRMS FAB m/z: 708.3048 ([M+H]+ C39H42N5O8 oblicz. 708.3033);

UV (CHCl₃): X_max = 305.0 nm (ε = 12 600 M^-1 cm^-1): X_min = 258.5 nm;

¹H NMR (250 MHz, CDCh) δ 2.08 (s, 3H, CH3COO od Z), 2.09 (s, 3H, CH3COO od Z), 2.03 2.19 (m, 10H, 2xCH3COO od E, H2'. H2” od Z i E), 2.77 (t, 2H, J = 6.7 Hz, CH^-β od Z), 2.79 - 2.88 (m, 2H, CHz-β od E), 3.48 - 3.60 (m, 4H, CH2-a od Z i E), 3.81 (s, 3H, OCH3 od Z), 3.82 (s, 3H, OCH3 od E), 3.68 - 3.98 (m, 4H, CH2-6 od Z i E), 3.99 - 4.39 (m, 6H, H4'. H5'. H5” od Z i E), 5.06 - 5.19 (m, 3H, H3' od Z i E, NH-a od E), 6.30 (dd, 1H, Jhi',h2'' = 5.9 Hz, Jhi',h2' = 8.9 Hz, HI' od Z), 6.41 (dd, 1H, Jhi',h2'' = 5.9 Hz, Jhi',h2' = 8.8 Hz, HI' od E), 6.60 (d, 1H, ⁴Jh5,h2 = 1.0 Hz, Im-CH-5 od Z), 6.61 (d, 1H, ⁴JH5,H2 = 1.0 Hz, Im-CH-5 od E), 6.70 (d, 1H, JH7,NHa = 13.1 Hz, H7 od Z), 6.79 - 7.41 (m, 31H, MMTr, NH-3 od Z i E, Im-CH-2 od E), 7.43 (d, 1H, ⁴Jh2,h5 = 1.3 Hz, Im-CH-2 od Z), 7.46 (m, 1H, H7 od E),

8.43 (m, 1H, NH-a od Z);

¹³C NMR (63 MHz, CDCh) δ 21.00 (CH3COO od E i Z), 21.06 (CH3COO od E i Z), 28.90 ^β od E), 30.09 ^β od Z), 32.69 (C2' od E), 33.30 (C2' od Z), 36.84 (C6 od E), 40.32 (C6 od Z), 48.75 (Ca od Z), 49.34 (Ca od Z), 49.34 (Ca od E), 55.42 (OCH3 od Z i E), 63.94 (C5' od E), 64.16 (C5' od Z),

PL 219 355 B1

74.34 (C3' od E), 74.46 (C3' od Z), 75.10 (MMTr-CPh₃ od Z), 75.22 (MMTr-CPh₃ od E), 80.44 (C4' od Z), 80.66 (C4' od E), 84.20 (C1' od Z), 84.59 (C1' od E), 85.00 (C5 od Z), 87.43 (C5 od Z), 113.44 (MMTr-o' od Z i E), 118.91 (Im-CH-5 od E), 119.60 (Im-CH-5 od Z), 128.17 (MMTr-o od Z i E, MMTr-p od Z), 128.44 (MMTr-p od E), 129.74 (MMTr-m od Z i E), 131.23 131.30 (MMTr-m' od Z i E), 134.31 (Im-CH-4 od E), 134.43 (Im-CH-4 od Z), 137.18 (MMTr-i' od Z), 137.75 (MMTr-i' od E), 138.57 (Im-CH-2 od E), 138.83 (Im-CH-2 od Z), 142.61 (MMTr-i od E), 142.70 (MMTr-i od Z), 146.72 (C7 od E), 150.15 (C7 od Z), 153.09 (C2 od E), 153.81 (C2 od Z), 159.25 (MMTr-p' od Z i E), 164.91 (C4 od E), 166.71 (C4 od Z), 170.63 (CH3COO od Z i E), 171.09 (CH3COO od Z i E);

P r z y k ł a d VIII ₁

Synteza 5-{2-[N¹-(4-metoksytrytylo)imidazol-4-ylo]etyloaminometylo}-2'-deoksyurydyny o wzorze 17a

Acetylowany nukleozyd 15a (354 mg, 0.50 mmol) potraktowano roztworem Et₃N w MeOH (1:9 v/v, 4 ml) w temp. pokojowej przez 24 godz. Po tym czasie kontrola postępu reakcji (TLC) wykazała całkowite przereagowanie substratu. Do mieszaniny reakcyjnej dodano toluen (4 mL) i odparowano rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: 0-15% MeOH w CHCl₃), otrzymując związek 17a w postaci żółtej piany (224 mg, Wyd. 72%).

TLC Rf: 0.24 (CHCl3/MeOH 85:15 v/v), 0.05 (AcOEt/MeOH 80:20 v/v);

MS FAB m/z: 624.3 [M+H]⁺ (oblicz. 624.27 dla C35H38N5O6);

¹H NMR (250 MHz, CDCfe) δ 2.24 (m, 1H, H2'), 2.43 (ddd, 1H, Jh2”,h3’ = 1.4 Hz, Jh2”,h1 = 5.5 Hz, J_gem = 14.0 Hz, H2''), 2.75 (t, 2H, J = 6.7 Hz, CH₂-3), 2.93 (t, 2H, J = 6.8 Hz, CH₂-a), 3.52 ' (d, 1H, Jgem = 14.1 Hz, jeden z CH2-7), 3.60 (d, 1H, Jgem = 14.1 Hz, jeden z CH2-7), 3.81 (s, 3H, OCH3), 4.19 - 4.32 (m, 2H, H4', H5''), 4.37 (dd, 1H, JH5',H4' = 4.4 Hz, Jgem = 12.0 Hz, H5'), 5.21 (dt, 1H, JH3',H2'' = JH3',H4' = 2.0 Hz, JH3',H2' = 6.5 Hz, H3'), 6.30 (dd, 1H, JH1',H2' = 5.6 Hz, JH1',H2' = 8.7 Hz, H1'), 6.58 (d, 1H, ⁴JH5,H2 = 1.2 Hz, Im-CH-5), 6.77 - 7.34 (m, 14H, MMTr), 7.35 (d, 1H, ⁴JH5,H2 = 1.2 Hz, Im-CH-2), 7.56 (s, 1H, H6);

P r z y k ł a d IX

Synteza 3',5'-di-O-acetylo-5-metoksykarbonyloaminometylo-2'-deoksyurydyny 15b w reakcji bezpośredniego redukcyjnego aminowania 3',5'-di-O-acetylo-5-formylo-2'-deoksyurydyny z chlorowodorkiem estru metylowego glicyny

3',5'-Di-O-acetylo-5-formylo-2'-deoksyurydynę (o wzorze 14) (340 mg, 1,0 mmol) osuszono przez odparowanie z bezwodnym CH2Cl2 (2x10 mL), a następnie nukleozyd rozpuszczono w tym samym rozpuszczalniku (7 mL). Dodano kolejno chlorowodorek estru metylowego glicyny (180 mg, 1,5 mmol), Et₃N (210 gL, 1,5 mmol) oraz NaBH(OAc)₃ (254 mg, 1.2 mmol). Po 2 godz. mieszania w temp. pokojowej, gdy przeprowadzona kontrola TLC (CHCI3/MeOH 90:10 v/v), wykazała obecność niewielkich ilości wyjściowego nukleozydu, dodano kolejną porcję NaBH(OAc)₃ (106 mg, 0.50 mmol). Po następnych 2 godz. stwierdzono całkowite przereagowanie substratu (TLC) i w celu zakończenia reakcji do mieszaniny reakcyjnej dodano 5% wodnego roztworu NaHCO3 (10 mL), a następnie warstwę wodną wyekstrahowano 3 x CH₂CI₂ (20 mL). Połączone frakcje organiczne osuszono za pomocą MgSO₄. Po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu rozpuszczalnika, z surowej mieszaniny w ydzielono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent; 0-5% MeOH w CHCI₃) wydzielono dwa produkty: 15b (339 mg, Wyd. 82%) oraz 16b w postaci mieszaniny izomerów E i Z (33 mg, Wyd. 8%).

Dane dla 15b

TLC R_f: 0.45 (CHCfe/MeOH 90:10 v/v), 0.22 (AcOEt/MeOH 95:5 v/v); m/z: (MS, FAB) 414.2 [M+H]⁺, 412.2 [M-H] (obliczone dla C17H23N3O9 413.1) m/z: (HRMS, FAB) 414.1513 (obliczone [M+H]⁺ C17H24N3O7 414.1507);

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 2.12 (s, 3H, CH3COO), 2.14 (s, 3H, CH3COO), 2.20 (m, 1H, H2'), 2.47 (ddd, 1H, J.. ..3 = 1.6 Hz, Jh-,h1· = 5.5 Hz, Jgem = 14.2 Hz, H2''), 3.42 (s, 2H, CH₂-a), 3.56 (s, 2H, CH2-7), 3.72 (s, 3H, OCH3), 4.22 - 4.35 (m, 2H, H4', H5''), 4.40 (dd, 1H, JH5',H4' = 4.4 Hz, Jgem = 12.1 Hz, H5'), 5.23 (dt, 1H, JH3',H2'' = JH3',H4' = 1.9 Hz, JH3',H2' = 6.6 Hz, H3'), 6.34 (dd, 1H, JH1',H2'' = 5.5 Hz, JH1',H2' = 8.8 Hz, H1'), 7.53 (s, 1H, H6);

¹³C NMR (63 MHz, CDCl3), δ 20.60 (CH3COO), 20.72 (CH3COO), 37.12 (C2'), 45.27 (C7), 49.67 (Ca), 51.66 (OCH3), 63.80 (C5'), 74.29 (C3'), 82.09 (C4'), 84.88 (C1'), 112.77 (C5), 136.52 (C6), 150.41 (C2), 163.43 (C4), 170.25 (CH3COO), 172.27 (COOCH3);

Dane dla 16b

PL 219 355 B1

TLC Rf: 0.50, 0.60 (CHCl3/MeOH 90:10 v/v), 0.32, 0.50 (AcOEt/MeOH 95:5 v/v); m/z: (MS, FAB) 414.3 [M+H]⁺, 412.2 [M-H]^- (obliczone dla C17H23N3O9 413.14) ¹H NMR (250 MHz, CDCfe) δ 2.07 - 2.22 (m, 16H, 2xCH₃COO, H2', H2'' od Z i E), 3.63 - 3.88 (m, 2H, jeden z CH2-6 od Z i E), 3.77 (s, 3H, OCH3 od E), 3.78 (s, 3H, OCH3 od Z), 3.90 - 4.40 (m, 11H, jeden z CH₂-6, CH₂-a, H4' od Z i E, H5', H5'' od Z, H5'' od E), 4.47 (dd, 1H, Jh5w = 7.0 Hz, Jgem = 11.1 Hz, H5' od E), 5.06 - 5.19 (m, 2H, H3' od Z i E), 5.61 (m, 1H, NH-a od E), 6.31 (dd, 1H, Jhi',h2” = 6.1 Hz, Jhi',h2· = 8.6 Hz, H1' od Z), 6.40 (m, 1H, H1' od E), 6.65 (d, 1H, Jh7,nho, = 12.8 Hz, H7 od Z), 7.38 (dt, 1H, ⁴Jh7,h6 = 1.4 Hz, J.. = 14.4 Hz, H7 od E), 7.45 (s, 1H, NH-3 od Z), 7.47 (s, 1H, NH-3 od E), 8.48 (M, 1H, NH-a od Z);

¹³C NMR (63 MHz, CDCl3) δ 21.04 (CH3COO od Z i E), 21.10 (CH3COO od Z i E), 33.40 (C2' od Z i E), 36.35 (C6 od E), 40.25 (C6 od Z), 49.40 (Ca od Z), 49.50 (Ca od E), 52.52 (OCH3 od E), 52.68 (OCH3 od Z), 64.12 (C5' od E), 64.17 (C5' od Z), 74.37 (C3' od Z), 74.42 (C3' od E), 80.50 (C4' od Z), 81.18 (C4' od E), 84.26 (C1' od Z), 84.54 (C1' od E), 88.19 (C5 od Z), 90.52 (C5 od E), 145.68 (C7 od E), 149.18 (C7 od Z), 152.60 (C2 od E), 153.37 (C2 od Z), 164.88 (C4 od E), 166.93 (C4 od Z), 170.70 (CH3COO od Z i E), 170.77 (CH3COO od Z i E), 171.81 (COOCH3 od Z i E);

P r z y k ł a d X

Synteza 5-metoksykarbonyloaminometylo-2'-deoksyurydyny o wzorze 17b

Nukleozyd 11b (320 mg, 0,77 mmol) został potraktowany roztworem Et₃N w MeOH (1:9 v/v, 6 ml) w temp, pokojowej przez 24 godz. Po tym czasie, kontrola postępu reakcji (TLC) wykazała całkowite przereagowanie substratu. Do mieszaniny reakcyjnej dodano toluen (6 mL) i odparowano rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: 0-20% MeOH w CHCI₃), otrzymując związek 17b w postaci białej piany (167 mg, Wyd. 66%).

TLC Rf: 0.21 (CHCl3/MeOH 85:15 v/v), 0.13 (AcOEt/MeOH 85:15 v/v);

MS FAB m/z: 330.2 [M+H]⁺ (oblicz. 330.12 dla C13H20N3O7);

¹H NMR (250 MHz, D2O) δ 2.28 - 2.48 (m, 2H, H2', H2''), 3.50 (s, 2H, CH2-a), 3.57 (s, 2H, CH2-7), 3.73 (s, 3H, OCH3), 3.76 (m, 1H, H5''), 3.85 (dd, 1H, JH5',H4' = 3.2 Hz, Jgem = 12.5 Hz, H5'), 4.04 (m, 1H, H4'), 4.47 (m, 1H, H3'), 6.27 (t, 1H, JH1',H2'' = 6.6 Hz, H1'), 7.86 (s, 1H, H6);

P r z y k ł a d XI

Ogólna procedura 5'-O-dimetoksytrytylowania nukleozydów

Wyjściowy nukleozyd (0,35 mmol) w celu usunięcia śladów wody odparowano dwukrotnie z bezwodną pirydyną (2x4 mL), następnie rozpuszczono w tym samym rozpuszczalniku (4 mL) i dodano chlorek 4,4'-dimetoksytrytylu (124 mg, 0,39 mmol). Mieszanina reakcyjna była mieszana przez 16 godz. w temp. pokojowej. Po tym czasie, gdy kontrola TLC wykazała obecność niewielkich ilości wyjściowego nukleozydu, dodano kolejną porcję chlorku 4,4'-dimetoksytrytylu (11 mg, 0,035 mmol). Po kolejnych 4 godzinach, gdy stwierdzono całkowite przereagowanie substratu (TLC), do mieszaniny reakcyjnej dodano wodę (7 mL) oraz CHCI₃ (15 mL), a następnie frakcję wodną ekstrahowano trzykrotnie CHCI₃ (3x15 mL), po czym połączone frakcje organiczne osuszono za pomocą MgSO₄. Po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu rozpuszczalnika surowy produkt odparowano trzykrotnie z bezwodnym toluenem (3x10 mL), a następnie poddano oczyszczaniu za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: 0-10% MeOH w CHCI₃) otrzymując odpowiednie 5'-O-dimetoksytrytylowe pochodne w postaci jasnożółtej piany.

5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)-N6-[(1S,2R)-1-{{2-trimetylosililo)etoksy]karbonylo}-2-{[(tert-butylo)dimetylosililo}propyloaminokarbonylo]-2'-deoksyadenozyny 10a

225 mg, wydajność 71%; TLC Rf: 0.64 (CHCl3/MeOH 90:10 v/v), 0.54 (AcOEt/MeOH 95:5 v/v);

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 0.03 (s, 9H, CH3)3Si), 0.05 (s, 3H, CH3Si), 0.10 (s, 3H, CH3Si), 0.95 (s, 9H, (CH3)3CSi), 1.01 (t, 2H, J = 8.5 Hz, SiCH₂CH₂), 1.28 (d, 3H, J_Ch_y,ch_p = 6.2, CHs-γ), 2.57 (m, 1H, H2'), 2.85 (m, 1H, H2''), 3.35 (dd, 1H, JH5'',H4' = 3.3 Hz, Jgem = 10.4 Hz, H5''), 3.42 (dd, 1H, JH5',H4' =

5.3 Hz, Jgem = 10.3 Hz, H5'), 3.79 (s, 6H, 2xOCH3), 4.12 - 4.62 (m, 5H, CH₂CH₂O, CH-β, CH-a, H4'), 4.69 (m, 1H, H3'), 6.46 (t, 1H, JH1',H2' = JH1',H2'' = 6.5 Hz, H1'), 6.79-7.41 (m, 13H, DMTr), 7.96 (bs, 1H, NHCO), 8.07 (s, 1H, H2), 8.48 (s, 1H, H8), 10.03 (d, 1H, JNHa,CHa = 9.4 Hz, NH-a);

5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)-N⁶-{2-[N1-(4-metoksytrytylo)imidazolo-4-ylo]etyloaminokarbonylo}-2'-deoksyadenozyna o wzorze 10b

212 mg, wydajność 63%; TLC Rf: 0.45 (CHCl3/MeOH 90:10 v/v), 0.41 (AcOEt/MeOH 85:15 v/v);

¹H NMR (250 MHz, CDCfe) δ 2.56 (m, 1H, H2'), 2.91 (m, 1H, H2''), 3.05 (t, 2H, J = 6.5 Hz, CH₂-3), 3.40 - 3.43 (m, 2H, CH2-a), 3.76 (s, 9H, 3xOCH3), 3.64 - 3.84 (m, 2H, H5', H5''), 4.13 (m, 1H, H4'),

PL 219 355 B1

4.72 (m, 1H, H3'), 6.47 (m, 1H, H1'), 6.75 (s, 1H, Im-CH-5), 6.74 - 7.40 (m, 28H, DMTr, MMTr, Im-CH-2),

7.91 (bs, 1H, NHCO), 8.10 (s, 1H, H2), 8.28 (s, 1H, H8), 9.50 (t, 1H, ^NHaCHa = 5.7 Hz, NH-a);

₁

5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)-5-{2-[N¹-(4-metoksytrytylo)imidazol-4-ylo]etyloaminometylo}-2'-deoksyurydyny o wzorze 18a

197 mg, wydajność 61%; TLC Rf: 0.53 (cHcl3/MeOH 85:10 v/v), 0.32 (AcOEt/MeOH 80:20 v/v);

¹H NMR (250 MHz, CDCis) δ 2.19 - 2.42 (m, 2H, H2', H2”), 2.48 - 2.67 (m, 4H, C^-β, CH2-a), 3.05 (d, 1H, Jgem = 14.0 Hz, jeden z cH2-7), 3.11 (d, 1H, Jgem = 14.0 Hz, jeden z cH2-7), 3.35 (dd, 1H, JH5'',H4' = 3.8 Hz, Jgem = 10.6 Hz), 3.42 (dd, 1H, JH5',H4' = 3.8 Hz, Jgem = 10.7 Hz), 3.74 (s, 6H, 2xOCH3), 3.80 (s, 3H, OCH3), 3.99 (q, 1H, JH4',H5' = JH4',H5'' = 3.5 Hz, H4'), 4.50 (m, 1H, H3'), 6.31 (t, 1H, JH1',H2'' = JH1',H2' = 6.5 Hz, H1'), 6.52 (d, 1H, ⁴JH5,H2 = 1.0 Hz, Im-CH-5), 6.75 - 7.43 (m, 28H, DMTr, MMTr, ImCH-2), 7.57 (s, 1H, H6);

5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)-5-metoksykarbonyloaminometylo-2'-deoksyurydyna o wzorze

18b

150 mg, wydajność 68%; TLC Rf: 0.32 (CHCl3/MeOH 90:10 v/v), 0.22 (AcOEt/MeOH 95:5 v/v);

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 2.29 (m, 1H, H2'), 2.40 (ddd, 1H, JH2'',H3' = 4.1 Hz, JH2'',H1' = 6.4 Hz, Jgem = 14.4 Hz, H2''), 2.93 - 3.15 (m, 4H, CH2-a, CH2-7), 3.37 (dd, 1H, JH5',H4'' = 3.4 Hz, Jgem = 10.5 Hz, H5''), 3.47 (dd, 1H, JH5',H4' = 3.6 Hz, Jgem = 10.6 Hz, H5'), 3.65 (s, 3H, OCH3), 3.79 (s, 6H, 2xOCH3), 4.02 (m, 1H, H4'), 4.55 (m, 1H, H3'), 6.36 (t, 1H, JH1',H2'' = JH1',H2' = 6.7 Hz, H1'), 6.79 - 7.44 (m, 13H, DMTr), 7.66 (s, 1H, H6);

P r z y k ł a d XII

Ogólna procedura 3'-O-fosfitylacji 5'-blokowanych modyfikowanych nukleozydów

Wyjściowy 5'-O-dimetoksytrytylowany nukleozyd (0,20 mmol) był suszony pod zmniejszonym ciśnieniem przez 12 godzin, a następnie rozpuszczony bezwodnym CH2Cl2 (2 mL). Roztwór umieszczono w atmosferze argonu i dodano bezwodną diizopropyloetyloaminę (140 gL, 0,80 mmol), a następnie wkroplono 2-cyjanoetoksy-H,H-diizopropyloaminochlorofosfinę (67 gL, 0,3 mmol). Po 1 godz. w temp. pokojowej stwierdzono całkowite przereagowanie substratu (TLC) i dodano niewielką ilość MeOH (150 gL). Po 2 min. dodano CH2Cl2 (15 mL) i mieszaninę reakcyjną przemyto 5% roztworem NaHCO3 (5 mL). Frakcję organiczną osuszono za pomocą MgSO4, odsączono środek suszący i odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej „flash” na żelu krzemionkowym stosując odpowiednie układy wymywając (wymienione poniżej). Odpowiednie frakcje zawierające czysty produkt połączono, odparowano do suchej pozostałości, otrzymując odpowiednie 3'-O-amidofosforyny w postaci białej piany.

3'-O-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylaminofosfinoksy)-5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)-N⁶-[(1S,2R)-1-{[2-(trimetylosililo)etoksy]karbonylo}-2-{[(tert-butylo)dimetylosilylo]oksy}propyloaminokarbonylo]-2'-deoksyadenozyna o wzorze 11a

Mieszanina eluująca CH2Cl2:octan etylu:trietylamina (10:10:1);

127 mg, wydajność 57%;

TLC Rf: 0.32 (CH2Cl2/AcOEt/Et3N 10:10:1 v/v);

HRMS FAB m/z: 113.5402 ([M+H]⁺ C56H82Si2PN8O10 oblicz. 113.5430);

³¹P NMR (101 MHz, C6D6) δ 148.9, 149.2;

3'-O-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylaminofosfinoksy)-5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)-N⁶-{2-[N¹-(4-metoksytrytylo)imidazolo-4-ylo]etyloaminokarbonylo}-2'-deoksyadenozyna o wzorze 11b

Mieszanina eluująca: Eter naftowy:aceton 3:1, 2:1, 1:1, 2:1 v/v (po 100 mL);

137 mg, wydajność 59%;

TLC Rf: 0.15 (CH2Cl2/AcOEt/Et3N 10:10:1 v/v);

HRMS FAB m/z: 1163.5235 ([M+H]⁺ C66H72PN10O8 oblicz. 1163.5272);

³¹P NMR (101 MHz, C6D6) δ 149.2, 149.3;

₁

3'-O-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloaminofosfinoksy)-5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)-5-{2-[N¹-(4-metoksytrytylo)imidazolo-4-ylo]etyloaminometylo}-2'-deoksyurydyna o wzorze 19a

Przed oczyszczaniem chromatograficznym surowy produkt wytrącono z eteru naftowego w temp. -78°C. Układ eluujący: CH2Cl2/MeOH/Et3N 93:5:2 v/v; 126 mg, wydajność 56%;

TLC Rf: 0.09 (benzen/CH2Cl2/Et3N 7:2:1 v/v);

HRMS FAB m/z: 1126.5172 ([M+H]⁺ C65H73PN7O9 oblicz. 1126.5207);

³¹P NMR (101 MHz, C6D6) δ 148.0, 148.8;

3'-O-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloaminofosfinoksy)-5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)-5-metoksykarbonyloaminometylo-2'-deoksyurydyna o wzorze 19b

PL 219 355 B1

Mieszanina eluująca: Eter naftowy: aceton 3:1, 2:1, 1:1, 2:1 v/v (po 100 mL);

mg, wydajność 56%;

TLC Rf: 0.29 (benzen/CH2Cl2/Et3N 7:2:1 v/v);

HRMS FAB m/z: 832.3655 ([M+H]⁺ C43H55PN5O10 oblicz. 832.3687);

³¹P NMR (101 MHz, C6D6) δ 149.1, 149.2;

P r z y k ł a d XIII

Synteza oligonukleotydów o sekwencji deoksyrybozymu 1 modyfikowanego jednostką typu 2

Oligonukleotydy były syntetyzowane w skali 1 mikromola na aparacie Applied Biosystems 394 według standardowej procedury producenta. Do syntezy wykorzystano 0,10 M roztwory amidofosforynów kanonicznych nukleozydów (Glen Research, Sterling, VA) oraz 0,15 M roztwory w amidofosforynów chronionych jednostek 2 (związków 11a, 11b, 19a lub 19b według schematów I i II) w bezwodnym acetonitrylu. Po syntezie grupy ochronne z niemodyfikowanych oligonukleotydów były usuwane za pomocą mieszaniny 3:1 (v/v) wodnego roztworu amoniaku i etanolu w czasie 4 godz. w temperaturze 55°C, natomiast z oligonukleotydów modyfikowanych przez noc w temperaturze pokojowej. Wszystkie oligonukleotydy zawierające grupy DMTr na 5'-końcu oczyszczano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej na odwrotnej fazie (RP-HPLC) w gradiencie 0-40% acetonitrylu w 0,10 M wodorowęglanie trietyloamoniowym o pH 7,0. Oczyszczone oligonukieotydy były traktowane 50% wodnym roztworem kwasu octowego w czasie 0,5 godz. w temp. pokojowej celem usunięcia grup DMTr, a następnie, po odparowaniu reagentów, poddawane kolejnemu oczyszczaniu za pomocą PRHPLC. Masa cząsteczkowa oligonukleotydów była potwierdzana za pomocą MALDI-TOF MS, zaś czystość za pomocą elektroforezy na denaturującym żelu poliakryloamidowym (20%, 7 M mocznik). Charakterystyka przykładowych oligonukleotydów o sekwencji deoksyrybozymu 1 modyfikowanego jednostkami typu 2 otrzymanych według w/w procedury zamieszczona jest w tabeli 1.

P r z y k ł a d XIV

Synteza oligonukleotydów o sekwencji deoksyrybozymu 1 zawierających wiązania tiofosforanowe typu mix oraz ewentualnie zawierających jednostki typu 3

Oligonukieotydy były syntetyzowane w skali 1 mikromola na aparacie Applied Biosystems 394 według procedury producenta. Do syntezy wykorzystano 0,10 M roztwory amidofosforynów kanonicznych nukleozydów i nukleozydów 2'-OMe (jednostki 2) (Glen Research, Sterling, VA) w bezwodnym acetonitrylu. Podczas syntezy w miejscu zaplanowanego wiązania tiofosforanowego o konfiguracji mix utlenianie funkcji fosforynowej prowadzono za pomocą handlowo dostępnych odczynników usiarczających (np. odczynnik Beaucage'a) w znany sposób. Pozostałe funkcje fosforynowe utleniano rutynowo w obecności l2/H2O/Py. Usunięcie oligonukleotydów ze złoża stałego oraz usunięcie wszystkich grup protekcyjnych prowadzono w znany sposób. Masa cząsteczkowa oligonukleotydów była potwierdzana za pomocą MALDI-TOF MS, zaś czystość za pomocą elektroforezy na denaturującym żelu poliakryloamidowym (20%, 7 M mocznik).

Charakterystyka przykładowych oligonukleotydów o sekwencji deoksyrybozymu 1 modyfikowanego jednostkami 2 i/lub zawierających wiązania tiofosforanowe o konfiguracji mix zamieszczona jest w Tabeli 2.

P r z y k ł a d XV

Synteza 2'-deoksyrybonukleozydo-3'-O-(2'-tio-spiro-4,4-pentametyleno-1,3,2-oksatiafosfolanu) o wzorze 20

Syntezę przeprowadza się według znanej procedury (W.J., Stec B., Karwowski, P., Guga, M., Koziołkiewicz M., Boczkowska, M.W., Wieczorek, J., Błaszczyk, M., Sochacki. 1998, J. Am. Chem. Soc. 120, 7156). 1 mmol 5'-DMTr-pochodnej N-chronionego nukleozydu wysuszono na linii próżniowej przez 12 godz. Po usunięciu śladowych ilości wody do kolby z nukleozydem wtłoczono argon a następnie substrat rozpuszczono w 3 mL bezwodnego CH₂CI₂, po czym dodano 1,1 mmola diizopropyloetyloaminy. Następnie wkroplono z mieszaniem 1,1 mmola 2-chloro-4,4-spiro-pentametyleno-1,3,2-oksatiafosfolanu. Reakcja fosfitylacji trwała 4 godz. Po tym czasie dodano 2 mmole siarki elementarnej. Reakcję kontynuowano przez następne 8 godz. Po zakończeniu reakcji fosfitylacji odsączono nadmiar odczynnika usiarczającego i odparowano rozpuszczalnik. Otrzymany produkt oczyszczono na żelu krzemionkowym 60, stosując jako eluent CHCI₃ destylowany z pirydyną.

Dane dla 20c

5'-DMTr-dA-N-chronionego-3'-O-(2'-tio-spiro-4,4-pentametyleno-1,3,2-oksatiafosfolanu) ³¹P NMR 104,7 ppm i 105,1 ppm w CD3CN

PL 219 355 B1

Dane dla 20b

5'-DMTr-dC-N-chronionego-3'-O-(2'-tio-spiro-4,4-pentametyleno-1,3,2-oksatiafosfolanu) ³¹P NMR 105,3 ppm i 105,6 ppm w CD3CN.

Oczyszczone oraz scharakteryzowane mieszaniny diastereomeryczne związków 20 zostały podzielone na diastereoizomery techniką chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym 60H. Największe wydajności podziału zostały uzyskane jeśli jako eluenta użyto:

dla pochodnej 20c octan etylu/octan butylu=2/1 gdzie

Rf dla izomeru Rp=0,54; ³¹P NMR 104,7 ppm

Rf dla izomeru Sp=0,46; ³¹P NMR 105,1 ppm dla pochodnej 20b octan etylu/octan butylu=2/1 gdzie Rf dla izomeru Rp=0,6; ³¹P NMR 105,3 ppm Rf dla izomeru Sp=0,4; ³¹P NMR 105,6 ppm

P r z y k ł a d XVI

Synteza 3'-izopropoksyacetylowej pochodnej 2'-deoksyrybonukleozydów (związków o wzorze 21) mmol 5'-DMTr pochodnej N-chronionego nukleozydu dC, dA, dG lub tymidyny rozpuszcza się w 25 mL bezwodnej pirydyny i dodaje w dwóch porcjach 1,3 mmola bezwodnika izopropoksyacetylu (SinoChemexper). Po 2 godz. mieszania rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość poddaje chromatografii na żelu krzemionkowym, eluując kolumnę chloroformem. Otrzymany produkt poddaje się działaniu roztworu kwasu para-toluenosulfonowego (3 mmole) w chlorku metylenu (30 mL) przez 30 min. w temp. pokojowej, a następnie dodaje 10 mL THF zawierającego 1% wody. Po zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem pozostałość poddaje się oczyszczaniu na kolumnie chromatograficznej z żelem krzemionkowym w gradiencie do 10% metanolu w chloroformie. Otrzymany produkt 21 poddaje się analizie chromatograficznej i spektralnej.

Dane dla 21a: wydajność 65%, R_f=0,4 (9:1, v/v, CHCl₃/MeOH), FAB MS: m/z 343 (masa cząsteczkowa 342,2)

Dane dla 21d: wydajność 65%, R_f=0,5 (9:1, v/v, CHCl₃/MeOH), FAB MS: m/z 438 (masa cząsteczkowa 437,7)

P r z y k ł a d XVII

Synteza dinukleozydo-tiofosforanu o stereozdefiniowanej konfiguracji Rp lub Sp na chiralnym atomie fosforu (związku o wzorze 22) (schemat III) mmol 5'-DMTr pochodnej diastereomerycznie czystego 3'-oksatiafosfolanu nukleozydu (N-chronionej dC, dA, dG lub tymidyny) 20 i 1,5 mmola związku 21 rozpuszczono w 3 mL bezwodnego acetonitrylu w atmosferze argonu i dodano 50 μΜ (0.33 mmola) DBU. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temp. pokojowej przez 2 godz. po czym odparowano rozpuszczalnik a pozostałość poddano chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Produkt eluowano za pomocą mieszaniny CHCl3/MeOH/pirydyna (94:5:1, v/v/v) i po odparowaniu otrzymano białą pianę.

Dane dla związku 22 B3=b, B4=a, izomer R_p: wydajność 72%, (³¹P NMR 54,19 ppm w CD₃CN, MALDITOF MS m/z=1052,4; Masa cząsteczkowa obliczona 1052,4)

Dane dla związku 22 B3=b, B4=a, izomer S_p: wydajność 41% (³¹P NMR 55,64 ppm w CD₃CN, MALDI TOF MS m/z=1052,4; Masa cząsteczkowa obliczona 1052,4)

Dane dla związku 22 B3=c, B4=d, izomer R_p: wydajność 68%, (³¹P NMR 55,71 ppm w CD₃CN, MALDI TOF m/z=1171,4; Masa cząsteczkowa obliczona 1172)

Dane dla związku 22 B3=c, B4=d, izomer S_p: wydajność 49% (³¹P NMR 55,35 ppm w CD₃CN, MALDI TOF m/z=1171,7; Masa cząsteczkowa obliczona 1172)

P r z y k ł a d XVIII

Usuwanie ochronnej grupy 3'-izopropoksyacetylowej ze związku 22

Pochodną 22 (0,5 mmola) rozpuszcza się w dioksanie (1 mL) a następnie dodaje 28% roztwór wodnego amoniaku w ilości 1 mL. Otrzymany roztwór miesza się przez 25-30 min. Po tym czasie mieszaninę zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem i poddaje chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, eluując czysty produkt o wzorze 23 mieszaniną rozpuszczalników CHCl₃/MeOH/pirydyna (94:5:1, v/v/v). Produkt 23 po odparowaniu jest białą pianą.

Dane dla związku 23 B3=b, B4=a, izomer R_p: wydajność 82%, (MALDI TOF MS m/z=952,4; Masa cząsteczkowa obliczona 952)

Dane dla związku 23 B3=b, B4=a, izomer S_p: wydajność 80%, (MALDI TOF MS m/z=952,4; Masa cząsteczkowa obliczona 952)

PL 219 355 B1

Dane dla związku 23 B3=c, B4=d, izomer R_p: wydajność 78%, (MALDI TOF MS m/z=1071,4;

Masa cząsteczkowa obliczona 1072)

Dane dla związku 23 B3=c, B4=d, izomer S_p: wydajność 77%, (MALDI TOF MS m/z=1071,4;

Masa cząsteczkowa obliczona 1072)

P r z y k ł a d XIX

Blokowanie funkcji tiofosforanoowej za pomocą bromku 2-nitrobenzylowego

Substrat 23 (1 mmol) oraz bromek 2-nitrobenzylowy (2 mmole) wysuszono na pompie próżniowej przez 12 godz. Po usunięciu śladowych ilości wilgoci do kolby wtłoczono suchy argon a następnie dodano 1 mL bezwodnego CH3CN i Et₃N (2 mmole). Kolbę zabezpieczono przed dostępem światła za pomocą folii aluminiowej. Reakcję mieszano przez 8 godz. w temperaturze pokojowej. Produkt reakcji oczyszczono techniką chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym stosując CHCI₃ jako eluent.

Dane dla związku 24 B3=b, B4=a

Wydajność >98% dla izomerów Rp i Sp

Izomer Rp ³¹P NMR 27,67 ppm w CD₃CN

Izomer Sp ³¹P NMR 26,72 ppm w CD₃CN

Dane dla związku 24 B3=c, B4=d

Wydajność >97% dla izomerów Rp i Sp

Izomer Rp ³¹P NMR 28,18 ppm w CD₃CN

Izomer Sp ³¹P NMR 28,47 ppm w CD₃CN

P r z y k ł a d XX

Fosfitylacja dinukleozydo-tiofosforanów o wzorze 24 w warunkach „in situ”

Substrat 24 (20 μmol) suszono na linii próżniowej przez 12 godz. i rozpuszczono w 40 μL bezwodnego CH₃CN. Do kolbki wkroplono 42 μL 0,5 M roztworu S-etylotiotetrazolu w CH₃CN oraz 6,3 μL 2-cyjanoetylo-bis-(N,N-diizopropylo)amidofosforynu. Reakcję przeprowadzono przez 35 min. aż do momentu wytrącenia się białych kryształków soli tetrazoliowej. Po tym czasie dodano 90 μL roztworu 0,5 M S-etylotiotetrazolu w CH₃CN i całość użyto do kolejnego etapu syntezy oligonukleotydu.

P r z y k ł a d XXI

Synteza oligonukleotydów o sekwencji deoksyrybozymu 1 zawierających stereozdefiniowane wiązania tiofosforanowe o konfiguracji Rp lub Sp

Oligonukieotydy były syntetyzowane w skali 0,5 μmola według znanej procedury (B. Nawrot, B. Rębowska, K. Cieślińska, W.J. Stec. 2005, Tetrahedron Lett. 46, 6641; B. Nawrot, B. Rębowska, 2009; Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Chapter 4:Unit 4.34) na aparacie Applied Biosystems 394. Do syntezy wykorzystano 0,10 M roztwory amidofosforynów kanonicznych nukleozydów (Glen Research, Sterling, VA) oraz 0,15 M roztwory amidofosforynów dinukleozydo-tiofosforanów w bezwodnym acetonitrylu.

Otrzymane oligonukleotydy chimeryczne zawieszone na złożu LCA CPG poddano kolejnym etapom deprotekcji według następującego schematu: przez kolumienkę reakcyjną przepuszczano 2 mL roztworu piperydyny w CH₃CN, 2 mL CH₃CN, 2 mL mieszaniny dioksan/tiofenol/trietyloamina w stosunku 2/1/2 (v/v/v) i finalnie 2 mL dioksanu. W ten sposób usunięte zostały grupy ochronne z funkcji fosforanowych i tiofosforanowych. Pozostałe grupy ochronne były usuwane w znany sposób, a oligonukleotydy czyszczone dwustopniowo za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej na odwrotnej fazie (RP HPLC) w gradiencie 0-40% acetonitrylu w 0,10 M wodoro-węglanie trietyloamoniowym o pH 7,0. Oczyszczone oligonukieotydy były traktowane 50% wodnym roztworem kwasu octowego w czasie 0,5 h w temp. pokojowej celem usunięcia grup DMTr, a następnie, po odparowaniu reagentów, poddawane kolejnemu oczyszczaniu za pomocą RP HPLC. Masa cząsteczkowa oligonukleotydów była potwierdzana za pomocą MALDI TOF MS, zaś czystość za pomocą elektroforezy w denaturującym żelu poliakryloamidowym (20%, 7 M mocznik). Charakterystykę przykładowych oligonukleotydów o sekwencji deoksyrybozymu 1 zawierającego wiązania tiofosforanowe o konfiguracji Rp lub Sp zamieszczono w Tabeli 3.

P r z y k ł a d XXII

Fosforylacja grupy 5'-hydroksylowej oligonukleotydu substratowego za pomocą [γ- P] ATP i kinazy polinukleotydowej

Mieszaninę o objętości 20 μL zawierającą 2 μL stężonego buforu dla PNK T4, 0,1 OD (30 μM) oligonukieotydu substratowego o przykładowej sekwencji: 5'-d(ACAGATGA) G U d(CAACCCT)-3', 15 uCi

[γ- P] ATP (2 (uL) oraz 5 jednostek kinazy polinukleotydowej z faga T4 inkubowano przez 0,5 h

PL 219 355 B1 w temp. 37°C, a następnie denaturowano termicznie w temp. 95°C przez 5 minut. Próbki przechowano w temp. -20°C przez maksymalnie 7 dni.

P r z y k ł a d XXIII

Hydroliza oligonukleotydu substratowego za pomocą deoksyrybozymów o ogólnym wzorze 1 w obecności lub bez udziału jonów metalu dwuwartościowego

Reakcje hydrolizy substratu prowadzi się w warunkach pojedynczego obrotu stosując 100-krotny molowy nadmiar enzymu w stosunku do substratu. Radioaktywnie znakowany oligonukleotyd substratowy (0,1 gM) jest inkubowany z deoksyrybozymem 1 w buforze PBS o pH 7,0 lub w buforze TRIS lub PIPES (najkorzystniej 20 lub 50 mM) zawierającym 100 mM NaCI i jony magnezu w stężeniu 10, 3,0 lub 1,0 mM lub bez jonów magnezu, ale z dodatkiem 4 mM EDTA, w ciągu 24 h i temperaturze 37°C. Reakcja prowadzona w obecności jonów metalu jest zatrzymywana przez dodanie EDTA (33 mM) i oziębienie mieszaniny reakcyjnej. Próbka (10 gL) po zmieszaniu z 8 gL barwnika obciążającego: 0,05% cyjanoksylen i 0,05% błękit bromofenolowy w formamidzie, jest nanoszona na denaturujący 20% żel poliakryloamidowy z 7M mocznikiem i prowadzona jest elektroforeza, a następnie za pomocą Phosphorlmagera oceniany jest procent hydrolizy substratu.

Na fig. 1 pokazano przykładowy wykres hydrolizy substratu w obecności deoksyrybozymów 1 modyfikowanych jednostkami o wzorze 2 dla reakcji prowadzonej w roztworze PBS z dodatkiem 10 i 3 mM jonów magnezu.

P r z y k ł a d XXIV

Analiza kinetyki reakcji hydrolizy oligonukleotydu substratowego za pomocą deoksyrybozymów o ogólnym wzorze 1

Reakcję hydrolizy substratu katalizowaną za pomocą deoksyrybozymu o wzorze ogólnym 1 przeprowadzano w warunkach pojedynczego obrotu, przy 10-krotnym lub 100-krotnym nadmiarze enzymu w stosunku do substratu. Radioaktywnie wyznakowany substrat (0,1 gM) inkubowano z deoksyrybozymem 1 (1 gM) w 20 mM Tris-HCI lub PIPES (pH 7,5 lub 8,0) zawierającym 100 mM NaCI, 1 mM MgCl2 (lub bez jonów metalu dwuwartościowego i wtedy z dodatkiem 4 mM EDTA) w temp. 37°C. W poszczególnych odstępach czasu pobierano po 10 gL mieszaniny reakcyjnej, do tej próbki dodawano 1,2 gL 50 mM EDTA. Wszystkie próbki trzymano w łaźni z lodem. Po rozpuszczeniu w roztworze barwników (barwnik obciążający: 0,05% cyjanoksylen i 0,05% błękit bromofenolowy w formamidzie), próbki nanoszono na denaturujący 20% żel poliakryloamidowy z 7M mocznikiem i przeprowadzano elektroforezę. Analizę ilościową produktów hydrolizy przeprowadzano za pomocą czytnika Phosphorlmager z wykorzystaniem programu ImageQuant. Wartość kobs obliczano w programie Graph Pad Prism i wyznaczano ze wzoru:

Y = [EP] (1 - exp(-kobs x t) gdzie:

Y - procent uzyskanego produktu w czasie t

EP - końcowy punkt, przy którym uzyskano 80%-90% produktu hydrolizy

Przykładowe wartości kobs wyznaczone dla reakcji hydrolizy chimerycznych substratów RNA/DNA katalizowanych za pomocą deoksyrybozymów o wzorze ogólnym 1 modyfikowanych jednostkami X, Y, lub grupami tiofosforanowymi (PS) podano w Tabeli 4.

Deoksyrybozym 1 scharakteryzowany w punktach 1 - 11 odnosi się do następującej sekwencji docelowej substratu;

5'-d(ACAGATGA) G U d(CAACCCT)-3'

Deoksyrybozym 1 scharakteryzowany w punktach 12 - 17 i 24 - 32 odnosi się do następującej sekwencji docelowej substratu;

5'-d(CTGTACACAG) G C d(AGTCTCTGG)-3'

Deoksyrybozym 1 scharakteryzowany w punktach 18 - 23 odnosi się do następującej sekwencji docelowej substratu;

5'-d(TCTTTTCTTA) G U d(TTCAGAAGT)-3'

P r z y k ł a d XXV

Wyznaczenie stabilności deoksyrybozymów 1 w ekstrakcie z komórek HeLa

Deoksyrybozymy znakuje się radioaktywnie na 5'- końcu za pomocą kinazy T4 w obecności

[γ- P]ATP i podaje do ekstraktu komórkowego zawierającego odpowiednio 2,5, 5 i 10 gg białka w obecności inhibitora fosfataz Phos Stop w PBS. Reakcje prowadzi się w odstępach czasu: 0, 15, 30, 60, 120, 240, 360 i 1440 min. w 37°C. Pobrane w poszczególnych odstępach czasu próbki zawierające po 10 gL mieszaniny reakcyjnej rozpuszcza się w roztworze barwników (barwnik obciążający:

PL 219 355 B1

0,05% cyjanoksylen i 0,05% błękit bromofenolowy w formamidzie) i nanosi na denaturujący 20% żel poliakrylamidowy z 7M mocznikiem i przeprowadza elektroforezę. Analizę ilościową produktów przeprowadza się za pomocą czytnika PhosphorImager z wykorzystaniem programu ImageQuant.

Analiza elektroforetyczna przykładowych oligonukleotydów wykazała, że największe różnice w stabilności pomiędzy deoksyrybozymem niemodyfikowanym a posiadającym najwięcej modyfikacji PS i 2'-OMe w domenie katalitycznej zachodzą w stosunku do ekstraktu zawierającego 10 pg białka (fig. 2). Tak zoptymalizowane warunki reakcji są stosowane do badań stabilności deoksyrybozymów o wzorze 1. Spośród serii DNAzymów Dz2 (numery od 12 do 17 z Tabeli 4) i Dz4 (numery od 18 do 23) największą aktywność posiadają deoksyrybozymy Dz2(2) (w Tabeli 4 nr 14) i Dz4(2) (w Tabeli 4 nr. 20). Są to enzymy posiadające pięć modyfikacji PSmix w domenie katalitycznej. Dodatkowe wprowadzenie sześciu modyfikacji 2-OMe do domeny katalitycznej tych deoksyrybozymów wykazało ich najwyższą stabilność w ekstrakcie komórkowym (odpowiednio nr 17 i 23 w Tabeli 4).

P r z y k ł a d XXVI

Aktywność deoksyrybozymów 1 modyfikowanych tak jak w Tabeli 2 w komórkach HeLa z nadekspresją genu białka fuzyjnego BACE1/GFP

W eksperymentach wykorzystano komórki HeLa oraz dwa plazmidy kodujące białka fluorescencyjne. Plazmidem kodującym białko referencyjne RFP był pDsRed2-N1, natomiast plazmidem kodującym białko fuzyjne BACE-GFP był pBACE-GFP.

godziny przed transfekcją komórki HeLa były wysiewane (15000/studzienkę) do 96-dołkowych płytek o przezroczystym dnie i czarnych ściankach (Perkin Elmer). Komórki HeLa były hodowane w podłożu RPMI 1640 (Gibco) z 10% dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej, FBS oraz antybiotyków w stężeniach: penicylina (Polfa Tarchomin) 100 U/L i streptomycyna 100 pg/mL. Godzinę przed przeprowadzeniem transfekcji podłoże było wymieniane na pożywkę bez antybiotyków (60 pL/dołek).

Komórki były transfekowane jednocześnie plazmidami i deoksyrybozymami z użyciem lipofektaminy (Invitrogen) w proporcji 1 pL odczynnika transfekcyjnego na 1 pg kwasów nukleinowych. Mieszaniny transfekcyjne były sporządzane w zredukowanym podłożu OPTT-MEM (Gibco). Przygotowywano oddzielnie (po 20 pL OPTI-MEM/dołek) odpowiednie rozcieńczenia odczynnika transfekcyjnego oraz DNA plazmidowego (dDsRed2-N1, 15 ng/dołek i p-BACE-GFP, 70 ng/dołek) i DNAzymów (w ilości odpowiedniej do osiągnięcia stężeń 10-50 nM). Po 5 min. inkubacji roztwory łączono i pozostawiano do dalszej inkubacji przez 20 min. w temperaturze pokojowej. Dodawano po 40 pL/dołek powstałych mieszanin transfekcyjnych do 60 pL podłoża. Transfekcję prowadzono przez 6 godzin w 37°C, 5% CO₂.

Po upływie czasu transfekcji podłoże nad komórkami zastępowano podłożem hodowlanym zawierającym antybiotyki (100 pL) i prowadzono dalszą inkubację komórek przez 36 h (czas post-inkubacji). Następnie komórki płukano 3-krotnie buforem fosforanowym PBS (100 pL). Po ostatnim płukaniu pozostawiano po 100 pL roztworu nad komórkami i dodawano po 50 pL buforu do lizy NP-40 (150 mM NaCI, 1% IGEPAL, 50 mM Tris-HCI (pH 7), 1 mM PMSF) w 37°C przez noc w ciemności. Lizaty posłużyły do odczytu fluorescencji bezpośrednio z płytek. Fluorescencję białek mierzono w czytniku płytek Synergy™ HT (BioTek), obsługiwanym przez program KC4. Odczyty prowadzono w zakresach długości fal ekscytacji i emisji charakterystycznych dla zielonej fluorescencji (GFP i BACE-GFP) λ_ΕΧ = 485/20 nm i X_EM = 528/20 nm oraz dla czerwonej fluorescencji (RFP) λ_ΕΧ = 530/25 nm i ź~_EM = 590/30 nm. Aktywność DNAzymów wyliczano na podstawie stosunków wartości poziomu fluorescencji GFP (BACE-GFP) do poziomu fluorescencji RFP. Każde doświadczenie było przeprowadzone w 8 równoległych powtórzeniach. Kontrolę pozytywną stanowiły komórki transfekowane plazmidami i DNA o tej samej długości co deoksyrybozymy. DNA użyte do kontroli pozytywnej nie było komplementarne do sekwencji docelowej BACE.

Na fig. 3 pokazano przykładowy wynik aktywności wewnątrzkomórkowej deoksyrybozymów 1 o numerach 12-17 (odpowiednio 2,2(1),2(2),2(3),2(4) i 2(5)) i 18-23 (odpowiednio 4,4(1),4(2),4(3),4(4) i 4(5)) z Tabeli 4.

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Modyfikowany deoksyrybozym 10-23 o ogólnym wzorze 1, o ustabilizowanej odporności na hydrolizę oraz podwyższonej aktywności katalitycznej, zawierający co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie tiofosforanowe o wzorze 4a i/lub 4b, znajdujące się w wybranych pozycjach PI do P15, domeny katalitycznej, zwłaszcza w pozycji P1, P7, P8, P14 i/lub P15, korzystnie o określonej konfiguracji absolutnej na chiralnych atomach fosforu, i/lub co najmniej jedną resztę nukleozydową o ogólnym

   PL 219 355 B1 wzorze 2, w którym B oznacza resztę uracylu modyfikowaną w pozycji 5 lub resztę adeniny modyfikowaną w pozycji 6, przedstawione wzorem 2' lub 2, gdzie R2 oznacza resztę alkiloaminy lub aminokwasu, korzystnie resztę histaminy lub glicyny, i/lub co najmniej jedną resztę nukleozydową o wzorze 3, w którym B1 oznacza resztę tyminy, uracylu, cytozyny, adeniny i/lub guaniny, a R1 oznacza atom F lub grupę alkoksylową -OR, gdzie R oznacza grupę o wzorze -C_nH_2n+₁, a n oznacza liczbę naturalną od 1 do 5, korzystnie -OR oznacza grupę metoksylową, przy czym wymienione reszty nukleozydowe znajdują się w wybranych pozycjach N.
2. 2. Deoksyrybozym według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie tiofosforanowe o wzorze 4a i/lub 4b, znajdujące się w wybranych pozycjach P domeny katalitycznej, zwłaszcza w pozycji P1, P7, P8, P14 i/lub P15, i/lub co najmniej jedną resztę nukleozydową o wzorze 2, w którym B i R1 mają wyżej podane znaczenie, znajdującą się w pozycji wybranej z grupy obejmującej N2, N7, N8, N11, N14 i/lub N15.
3. 3. Deoksyrybozym według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie tiofosforanowe o wzorze 4a i/lub 4b, znajdujące się w wybranych pozycjach domeny katalitycznej P, i/lub co najmniej jedną resztę nukleozydową o wzorze 2a, 2b, 2c i/lub 2d znajdującą się w pozycji N.
4. 4. Deoksyrybozym według zastrz. 1, znamienny tym, że w wymienionych P pozycjach domeny katalitycznej zawiera, co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie tiofosforanowe o wzorze 4a i/lub 4b znajdujące się w wybranych pozycjach P domeny katalitycznej, zwłaszcza w pozycji P1, P7, P8, P14 i/lub P15, i ewentualnie co najmniej jedną modyfikowaną resztę nukleozydową w pozycji N przedstawioną wzorem 3, w którym B i R1 mają wyżej podane znaczenie.
5. 5. Deoksyrybozym według zastrz. 4, znamienny tym, że zawiera co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie tiofosforanowe o wzorze 4a i/lub 4b, znajdujące się w wybranych pozycjach P domeny katalitycznej, P1 do P15, zwłaszcza w pozycji P1, P7, P8, P14 i/lub P15, i/lub co najmniej jedną resztę nukleozydową w pozycji N o wzorze 3a, 3b, 3c i/lub 3d, w którym R1 oznacza grupę alkoksylową, zwłaszcza metoksylową, przy czym wymienione reszty nukleozydowe znajdują się w pozycji wybranej z grupy obejmującej N2, N7, N8, N11, N14 i/lub N15.
6. 6. Deoksyrybozym według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera co najmniej jedną modyfikowaną resztę nukleozydową N przedstawioną wzorem 2c lub 2d w pozycji N8.
7. 7. Deoksyrybozym według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera pojedyncze wiązanie tiofosforanowe o konfiguracji Rp w pozycji P1, zaś wszystkie jednostki nukleozydowe N domeny katalitycznej są identyczne z niemodyfikowanym enzymem 10-23.
8. 8. Deoksyrybozym według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera dwa wiązania tiofosforanowe, w pozycji P1 o konfiguracji Rp i w pozycji P8 o konfiguracji Sp, zaś wszystkie jednostki nukleozydowe N domeny katalitycznej są identyczne z niemodyfikowanym enzymem 10-23.
9. 9. Sposób wytwarzania deoksyrybozymów o ustabilizowanej odporności na hydrolizę oraz podwyższonej aktywności katalitycznej, przedstawionych wzorem 1, zawierającego w wybranych pozycjach P domeny katalitycznej od P1 do P15, zwłaszcza w pozycji P1, P7, P8, P14 i/lub P15, co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie tiofosforanowe o wzorze 4a lub 4b, i/lub w wybranych pozycjach N, co najmniej jedną resztę nukleozydową o ogólnym wzorze 2, w którym B oznacza resztę uracylu modyfikowaną w pozycji 5 lub resztę adeniny modyfikowaną w pozycji 6, przedstawione wzorem 2' lub 2, gdzie R2 oznacza resztę alkiloaminy lub aminokwasu, korzystnie resztę histaminy lub glicyny, i/lub co najmniej jedną resztę nukleozydową o wzorze 3, w którym B1 oznacza resztę tyminy, uracylu, cytozyny, adeniny i/lub guaniny, a R1 oznacza atom F lub grupę alkoksylową -OR, gdzie R oznacza grupę o wzorze -C_nH_2n+₁, a n oznacza liczbę naturalną od 1 do 5, korzystnie -OR oznacza grupę metoksylową, znamienny tym, że wiązanie tiofosforanowe, korzystnie stereozdefiniowane wprowadza się do oligonukleotydu poprzez zastosowanie procedury pozwalającej na syntezę stereozdefiniowanego tiofosforanu dinukleozydu, z wykorzystaniem stereokontrolowanego otwarcia pierścienia chiralnego oksatiafosfolanu 3'-nukleozydu za pomocą grupy 5'-hydroksylowej drugiego komponenta nukleozydowego, a następnie po usunięciu zasadowo-labilnej grupy ochronnej z funkcji 3'-hydroksylowej dimeru i ochrony funkcji tiofosforanowej za pomocą grupy alkiloarylowej, prowadzi się aktywację grupy 3'-hydroksylowej dinukleozydotiofosforanu za pomocą reszty amidofosforynowej do otrzymania monomeru, który wykorzystuje się następnie, obok amidofosforynów jednostek kanonicznych oraz/lub jednostek modyfikowanych 2 i/lub 3, do syntezy oligonukleotydu o sekwencji deoksyrybozymu 10-23 poprzez zastosowanie standardowej procedury amidofosforynowej, z wydłużonym czasem kondensacji i zwiększonym nadmiarem amidofosofrynów modyfikowanych jednostek w po22

   PL 219 355 B1 równaniu do monomerów jednostek kanonicznych oraz zastosowaniu odpowiedniej procedury odcinania oligonukleotydówod złoża stałego i usuwania grup ochronnych, w tym usuwania grupy ochronnej z funkcji tiofosforanowej, które prowadzi się za pomocą układu rozpuszczalników zawierających tiofenol.
10. 10. Sposób wytwarzania deoksyrybozymów o ustabilizowanej odporności na hydrolizę oraz podwyższonej aktywności katalitycznej, przedstawionych wzorem 1, zawierającego w wybranych pozycjach P domeny katalitycznej P1 do P15, zwłaszcza w pozycji P1, P7, P8, P14 i/lub P15, co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie tiofosforanowe o wzorze 4a lub 4b, i/lub w wybranych pozycjach N, co najmniej jedną resztę nukleozydową o ogólnym wzorze 2, w którym B oznacza resztę uracylu modyfikowaną w pozycji 5 lub resztę adeniny modyfikowaną w pozycji 6, przedstawione wzorem 2' lub 2, gdzie R2 oznacza resztę alkiloaminy lub aminokwasu, korzystnie resztę histaminy lub glicyny, znamienny tym, że odpowiednio modyfikowane jednostki nukleozydowe o ogólnym wzorze 2, przygotowuje się w reakcji aktywacji funkcji egzaminowej adeniny i kondensacji z aktywnym odczynnikiem niosącym w swojej strukturze resztę aminokwasu lub alkiloaminy, bądź poprzez aktywację pozycji 5 pierścienia tyminy i następujące po niej przyłączenie reszty niosącej ugrupowanie aminokwasowe lub grupę alkiloaminową, a następnie wbudowanie tak modyfikowanej jednostki do łańcucha oligonukleotydu z wykorzystaniem zaktywowanych funkcją amidofosforynową modyfikowanych jednostek N oraz jednostek o wzorze ogólnym 25 niosących stereozdefiniowane funkcje tiofosforanowe o wzorze 4a lub 4b.