PL219703B1

PL219703B1 - Preparat zapobiegający masowemu wymieraniu owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae) oraz zastosowania tego preparatu

Info

Publication number: PL219703B1
Application number: PL401225A
Authority: PL
Inventors: Mariusz Gagoś
Original assignee: Bioactive Tech Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością
Priority date: 2012-10-16
Filing date: 2012-10-16
Publication date: 2015-06-30
Also published as: PL401225A1; US20150283098A1; WO2014060803A1; EP2908634A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest preparat zapobiegający masowemu wymieraniu owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae), zwłaszcza pszczół i trzmieli, w następstwie syndromu określanego jako CCD (ang. Colony Collapse Disorder) oraz zastosowania tego preparatu. Wynalazek należy do dziedziny pszczelarstwa i ochrony środowiska przed negatywnymi skutkami stosowania środków owadobójczych w uprawach polowych i w sadownictwie.

Syndrom masowego ginięcia rodzin pszczelich (CCD) występujący w okresie poużytkowym stanowi problem ogólnoświatowy. Szczególnie dotkliwie przebiega on w krajach wysoce uprzemysłowionych. Dane statystyczne wskazują, że CCD może powodować śmierć nawet 90% rodzin pszczelich w pasiece. Pociąga to za sobą nie tylko drastyczny spadek produkcji miodu, ale przede wszystkim olbrzymie straty w produkcji rolnej.

Przełom w zrozumieniu zjawiska CCD stanowiły doniesienia pszczelarzy francuskich z 1993 roku o masowym ginięciu rodzin pszczelich po zastosowaniu preparatów owadobójczych, z grupy neonikotynoidów, do zaprawiania nasion słonecznika. Naukowcy z National Institute for Agricultural Research w Avignon stwierdzili, że jedną z przyczyn wywołującą CCD jest stosowanie w rolnictwie związku z grupy neonikotynoidów imidaklopridu (Environmental Microbiology 2010. 12(3). 774-782). Związek ten jest neurotoksyną, czyli oddziałuje na układ nerwowy owadów, powodując m.in. ich dezorientację, a ostatecznie śmierć. Stosowany jest powszechnie jako składnik zaprawy nasiennej, mający chronić rośliny uprawne przed szkodnikami oraz jako substancja czynna wielu preparatów, które stosuje się bezpośrednio na rośliny.

Głównym celem działania neonikotynoidów jest układ nerwowy owadów. Są to związki strukturalnie i funkcjonalnie zbliżone do nikotyny, a ze względu na budowę chemiczną zwane również chloronikotynylami. Skutecznie naśladują one działanie nikotyny w ośrodkowym układzie nerwowym. W niewielkich stężeniach powodują pobudzenie receptorów cholinergicznych typu nikotynowego i depolaryzację błony neuronów, a więc stan pobudzenia, natomiast w wyższych stężeniach blokują przewodnictwo synaptyczne. Stan ten utrzymuje się ponieważ w przestrzeni synaptycznej nie ma esteraz rozkładających nikotynę, czy też jej strukturalne analogi. Prowadzi to do zaburzenia przekaźnictwa impulsów nerwowych, powodując nadpobudliwość neuronów postsynaptycznych, objawiającą się drgawkami i konwulsjami. Ekscytotoksyczność nikotyny i jej analogów prowadzi do uszkodzenia neuronów i w konsekwencji do śmierci owadów.

Poza objawami neurologicznymi neonikotynoidy powodują również osłabienie odporności pszczół i trzmieli na choroby, zwłaszcza nosemozę, wywołaną pasożytami z gatunku Nosema spp.

Jak do tej pory nie są znane w literaturze żadne doniesienia o skutecznej metodzie lub środku, który by pozwolił na wyeliminowanie lub zabezpieczenie pszczół przed działaniem związków nikotynoidowych, a zwłaszcza imidakloprilu stosowanych w preparatach owadobójczych a tym samym, który pozwolił by na wyeliminowanie zjawiska CCD.

Celem badań prezentowanych w niniejszym zgłoszeniu było dostarczenie związków o potencjale neuroprotekcyjnym, które zapobiegałyby masowemu ginięciu owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae) szczególnie zaś rodzin pszczelich oraz trzmieli narażonych na insektycydy z grupy neonikotynoidów. Innym celem było także polepszenie wigoru i zwiększenie odporności owadów z rodziny pszczołowatych w szczególności pszczół i trzmieli na choroby pojawiające się w następstwie stosowania pestycydów, oraz zwalczaniu u owadów z rodziny pszczołowatych nosemozy Nosema spp, głównie Nosema Apis i Nosema Ceranae.

Przedmiotem wynalazku jest preparat zapobiegający masowem u wymieraniu owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae) w następstwie występowania syndromu Colony Collapse Disorder (CCD), charakteryzujący się tym, że zawiera prenylową pochodną chalkonu lub jej metabolity, rozpuszczalnik oraz syrop cukrowy w stężeniu prenylowej pochodnej chalkonu lub jej metabolitu 0,001-1000 mg/l preparatu i ewentualnie dopuszczalne w pszczelarstwie substancje dodatkowe.

W korzystnym wykonaniu wynalazku jako prenylową pochodną chalkonu preparat zawiera związek wybrany z grupy składającej się z ksantohumolu, ksantohumolu B, ksantohumolu E, α,β-dihydroksantohumolu, izobawachalkonu, ksantohumolu C, ksantohumolu D, wodzianu izodehydrocykloksantohumolu, desmetyloksantohumolu, ksantogalenolu, 4'-O-metyloksantohumolu, 3'-geranylochalkonaryngeniny, 3',5'-diprenylochalkonaryngeniny, 5'-prenyloksantohumolu, flawokawiny.

W bardziej korzystnym rozwiązaniu preparat jako prenylową pochodną chalkonu zawiera ksantohumol.

PL 219 703 B1

W kolejnym korzystnym rozwiązaniu preparat jako metabolit prenylowej pochodnej chalkonu zawiera związek wybrany z grupy składającej się z izoksantohumolu, desmetyloksantohumolu, 6-prenylonaryngeniny, 8-prenylonaryngeniny, 6,8-prenylonaryngeniny.

Korzystnym stężeniem ksantohumolu w preparacie jest stężenie 5-20 mg ksantohumolu na 1 litr preparatu, a bardziej korzystnym jest 5 mg ksantohumolu na 1 litr preparatu.

W korzystnym wykonaniu wynalazku czystość ksantohumolu w preparacie wynosi od 0,001 do 100%.

W bardziej korzystnym wykonaniu preparatu według wynalazku czystość ksantohumolu w preparacie wynosi 96%.

W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku jako syrop cukrowy preparat zawiera syrop do dokarmiania pszczół.

Syropami cukrowymi stosowanymi do sporządzania preparatu według wynalazku mogą być znane w stanie techniki roztwory używane w pszczelarstwie składające się z sacharozy, glukozy i fruktozy dostępne w handlu, jak również roztwór izoglukozy, który również dostępny jest na rynku (Apiinwert, Niemcy; Bioinwert, Puławy, Polska).

W preparacie jako rozpuszczalnik korzystnie stosuje się roztwór wodny, lub także korzystnie stosuje się wodny roztwór alkoholu etylowego, ewentualnie również korzystnie stosuje się wodny roztwór dimetylosulfotleneku (DMSO).

W innym korzystnym rozwiązaniu jako rozpuszczalnik stosuje się cyklodekstryny i/lub cukry.

W bardziej korzystnych rozwiązaniach preparatu według wynalazku, roztwór wodny jest roztworem alkalicznym, ewentualnie roztwór wodny jest roztworem kwaśnym, lub też roztwór wodny może być roztworem zawierającym cukry, cyklodekstryny, kompleksy ksantohumolu z metalami ziem alkalicznych i przejściowych.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku jako rozpuszczalnik stosuje się rozpuszcza lnik niepolarny.

W kolejnym korzystnym rozwiązaniu preparat jako substancje dodatkowe zawiera substancje wybrane z grupy obejmującej inne flawonoidy i chalkony, kumaryny, karotenoidy, polifenole, kwasy tłuszczowe, lipidy, wspomniane związki zamknięte w liposomach, białka, peptydy, witaminy, minerały, propolis, pochodne oleju rycynowego, ekstrakty z herbaty, ekstrakty z kawy lub inne ekstrakty ziołowe lub owocowe i warzywne.

Preparat według wynalazku korzystnie jest w postaci zestalonej lub ciekłej, a bardziej korzystnie w postaci syropu cukrowego lub w postaci ciasta do podkarmiania owadów.

W innej korzystnej postaci preparat według wynalazku jest w postaci paska cukrowego lub innego paska z substancji odżywczych do zgryzania przez owady.

Preparat według wynalazku, korzystnie jest w postaci paska na matrycy z kartonu lub tworzyw sztucznych.

Przedmiotem wynalazku jest również prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania w zapobieganiu i zwalczaniu wymierania owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae) w następstwie występowania syndromu masowego ginięcia pszczół i trzmieli (CCD).

Prenylową pochodną chalkonu do zastosowania według wynalazku korzystnie jest związek wybrany z grupy składającej się z ksantohumolu, ksantohumolu B, ksantohumolu E, α,β-dihydroksantohumolu, izobawachalkonu, ksantohumolu C, ksantohumolu D, wodzianu izodehydrocykloksantohumolu, desmetyloksantohumolu, ksantogalenolu, 4'-O-metyloksantohumolu, 3'-geranylochalkonaryngeniny, 3',5'-diprenylochalkonaryngeniny, 5'-prenyloksantohumolu, flawokawiny.

W bardziej korzystnym wykonaniu wynalazku prenylową pochodną chalkonu stanowi ksantohumol.

W kolejnym korzystnym rozwiązaniu jako metabolit prenylowej pochodnej chalkonu do zastosowania według wynalazku wybiera się związek z grupy składającej się z izoksantohumolu, desmetyloksantohumolu, 6-prenylonaryngeniny, 8-prenylonaryngeniny, 6,8-prenylonaryngeniny.

Zgodnie z innym korzystnym wykonaniem wynalazku prenylową pochodną chalkonu można stosować u pszczół i trzmieli, a bardziej korzystnie u pszczół z gatunków Apis mellifera i Apis ceranae.

PL 219 703 B1

Przedmiotem wynalazku jest również preparat zdefiniowany powyżej do zastosowania w zapobieganiu i zwalczaniu wymierania owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae) w następstwie występowania syndromu masowego ginięcia pszczół i trzmieli (CCD).

Przedmiotem wynalazku jest również prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania do poprawy wigoru owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae).

Korzystnie jako prenylową pochodną chalkonu wybiera się związek z grupy składającej się z ksantohumolu, ksantohumolu B, ksantohumolu E, α,β-dihydroksantohumolu, izobawachalkonu, ksantohumolu C, ksantohumolu D, wodzianu izodehydrocykloksantohumolu, desmetyloksantohumolu, ksantogalenolu, 4'-O-metyloksantohumolu, 3'-geranylochalkonaryngeniny, 3',5'-diprenylochalkonaryngeniny, 5'-prenyloksantohumolu, flawokawiny. Prenylową pochodną chalkonu, bardziej korzystnie stanowi ksantohumol.

W kolejnym korzystnym rozwiązaniu, jako metabolit prenylowej pochodnej chalkonu do zastosowania w poprawie wigoru owadów stosuje się związek wybrany z grupy składającej się z izoksantohumolu, desmetyloksantohumolu, 6-prenylonaryngeniny, 8-prenylonaryngeniny, 6,8-prenylonaryngeniny.

Zgodnie z innym korzystnym wykonaniem wynalazku prenylową pochodną chalkonu lub jej metabolit korzystnie można stosować u pszczół i trzmieli, a bardziej korzystnie u pszczół z gatunków Apis mellifera i Apis ceranae.

Przedmiotem wynalazku jest również preparat zdefiniowany powyżej i w załączonych zastrzeżeniach do zastosowania do poprawy wigoru owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae).

Przedmiotem wynalazku jest również prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowanie w zwalczaniu Nosema spp. u owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae).

Korzystnie jako prenylową pochodną chalkonu lub jej metabolity do zastosowania w zwalczaniu

Nosema spp. wybiera się związek wybrany z grupy składającej się z ksantohumolu, ksantohumolu B, ksantohumolu E, α,β-dihydroksantohumolu, izobawachalkonu, ksantohumolu C, ksantohumolu D, wodzianu izodehydrocykloksantohumolu, desmetyloksantohumolu, ksantogalenolu, 4'-O-metyloksantohumolu, 3'-geranylochalkonaryngeniny, 3',5'-diprenylochalkonaryngeniny, 5'-prenyloksantohumolu, flawokawiny. W bardziej korzystnym wykonaniu wynalazku wybiera się ksantohumol.

W kolejnym korzystnym rozwiązaniu według wynalazku metabolitem prenylowej pochodnej chalkonu, jest związek wybrany z grupy składającej się z izoksantohumolu, desmetyloksantohumolu,

6-prenylonaryngeniny, 8-prenylonaryngeniny, 6,8-prenylonaryngeniny.

Prenylową pochodną chalkonu korzystnie można stosować u pszczół i trzmieli, a bardziej korzystnie u pszczół z gatunków Apis mellifera i Apis ceranae.

Przedmiotem wynalazku jest także preparat jak zdefiniowano powyżej i w załączonych zastrzeżeniach do zastosowania w zwalczaniu Nosema spp. u owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae).

Wynalazek dotyczy również prenylowej pochodnej chalkonu lub jej metabolitów do zastosowania w zapobieganiu oraz zwalczaniu skutków stosowania środków owadobójczych z grupy neonikotynoidów oraz innych toksyn u owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae).

W tym wynalazku korzystną prenylową pochodną chalkonu lub jej metabolitem jest związek wybrany z grupy składającej się z ksantohumolu, ksantohumolu B, ksantohumolu E, α,β-dihydroksantohumolu, izobawachalkonu, ksantohumolu C, ksantohumolu D, wodzianu izodehydrocykloksantohumolu, desmetyloksantohumolu, ksantogalenolu, 4'-O-metyloksantohumolu, 3'-geranylochalkonaryngeniny, 3',5'-diprenylochalkonaryngeniny, 5'-prenyloksantohumolu, flawokawiny, a jeszcze bardziej korzystną jest ksantohumol.

W korzystnej realizacji wynalazku metabolit prenylowej pochodnej chalkonu stanowi związek wybrany z grupy składającej się z izoksantohumolu, desmetyloksantohumolu, 6-prenylonaryngeniny, 8-prenylonaryngeniny, 6,8-prenylonaryngeniny.

Zgodnie z wynalazkiem, prenylową pochodną chalkonu lub jej metabolity stosuje się korzystnie u pszczół i trzmieli, jeszcze bardziej korzystnie jako pszczoły wybiera się pszczoły z gatunków Apis mellifera i Apis ceranae.

Przedmiotem wynalazku jest również preparat jak zdefiniowano powyżej oraz w zastrzeżeniach do zastosowania w zapobieganiu oraz zwalczaniu skutków stosowania środków owadobójczych z grupy neonikotynoidów oraz innych toksyn u owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae).

Owady z rodziny pszczołowate (Apidae) obejmują między innymi owady z podrodziny pszczoły właściwe, plemię Apini, rodzaj pszczoła Apis, który z kolei dzieli się na gatunki znane w systematyce jako pszczoła wschodnia (Apis ceranae), pszczoła olbrzymia (Apis dorsata), pszczoła karłowata (Apis florea) i pszczoła miodna (Apis mellifera). Wszystkie gatunki należące do rodzaju Apis żyją w zorganiPL 219 703 B1 zowanych społeczeństwach. Owady te odżywiają się nektarem, syropem spadziowym oraz pyłkiem kwiatowym. Ich znaczenie w biologii i środowisku naturalnym oraz w przemyśle rolniczym i sadowniczym polega na zapylaniu kwiatów, a tym samym umożliwia uzyskanie plonów z upraw sadowniczych i innych upraw roślin.

Do rodziny pszczołowatych należą również owady o wyglądzie dużej, krępej i gęsto owłosionej pszczoły, które są nazywane trzmielami. W systematyce są określane jako pszczoły z rodzaju Bombus, który obejmuje również trzmielce.

Analizy morfologiczne i molekularne wykazały, że pszczoły i trzmiele są bardzo do siebie zbliżone. Ich biologia i zachowanie w wielu aspektach są podobne, zaś różnią się tym, przykładowo, że pszczoły rozpoczynają obloty w temperaturze 10°C, a trzmiele już w 8°C. W porównaniu z innymi owadami trzmiele są bardzo wydajne. Istotną zaletą trzmieli jest także brak systemu komunikacji.

Badania wykazały także, że budowa postsynaptycznego receptora nikotynowego zakończeń nerwowych mózgu tych owadów i innych owadów jest bardzo zbliżona.

Chalkony (1,3-diarylo-2-pren), są pochodnymi acetofenolu i są związkami pośrednimi w biosyntezie flawonoidów. Są to związki o otwartym pierścieniu heterocyklicznym, a zamknięcie pierścienia daje układ flawonu. Obecność chalkonów stwierdzono w lukrecji (Glycorrhiza gabra), chmielu (Humulus lup ulus), kocankach (Helichrysum arenarium) i w wierzbach (Salix sp.).

Prenylowe pochodne chalkonów są ważną grupą metabolitów, które można ekstrahować z szyszek chmielu i obejmują one związki takie jak ksantohumol (Xn), desmetyloksantohumol (DMX), izoksantohumol (IX), 6-prenylonaryngenina (6-PN) oraz 8-prenylonaryngenina (8-PN).

Budowa przykładowych chalkonów

Ksantohumol E

PL 219 703 B1

Ksantohumol C

Ksantohumol D

Wodzian izo-dehydrocykloksantohumolu

PL 219 703 B1

Pozostałe prenylowe pochodne chalkonów:

	R1	R2	R3	R4
Desmetyloksantohumol	H	H	H	Prenyl
Ksantogalenol	H	Me	H	Prenyl
4-O-metyloksantohumol	Me	Me	H	Prenyl
3'-geranylochalkonaryngenina	H	H	H	Geranyl
3',5'-diprenylochalkonaryngenina	H	H	Prenyl	Prenyl
5-prenyloksantohumol	Me	H	Prenyl	Prenyl
Flawokawina	Me	Me	H	H

Metabolity ksantohumolu:

R = H, 8-prenylonaryngenina R = Me, Izoksantohumol

6,8-diprenylonaryngenina

PL 219 703 B1

Jakkolwiek dane dotyczące oddziaływania ksantohumolu na receptory błonowe owadów są jak do tej pory bardzo skąpe to badania prowadzone na zwierzętach pokazują liczne zastosowania tego związku.

Z badań in vitro i in vivo wynika także, że ksantohumol redukuje procesy zapalne i oksydacyjne za pośrednictwem różnorodnych mechanizmów. Najważniejsze z nich to: usuwanie wolnych rodników tlenowych i ich reaktywnych form (RTF), hamowanie aktywności cyklooksygenaz (COX I i COX II), obniżanie produkcji prostaglandyn, NO, TNFa, NFkB oraz przeciwdziałanie peroksydacji błonowych fosfolipidów.

Aktywność antyoksydacyjna i przeciwzapalna ksantohumolu związana jest z obecnością w jego cząsteczce grup hydroksylowych i podstawnika prenylowego. Duże znaczenie ma też α,βnienasycone ugrupowanie karbonylowe. Uczestniczy ono w reakcji Michela z biologicznie ważnymi nukleofilami np.: L-cysteiną w białkach oraz z innymi cząsteczkami zawierającymi grupy sulfhydrylowe. W ten sposób powstają addukty kowalencyjne będące przyczyną utraty aktywności biologicznej różnych cząsteczek wiązanych przez ksantohumol.

Szerokie spektrum działania ksantohumolu wynika prawdopodobnie ze zdolności tego związku do wiązania ważnych biologicznie cząsteczek. Do najlepiej poznanych należy wpływ Xn na syntetazę polimerazy α, topoizomerazę I, fosfatazę alkaliczną, aromatazę, acylotransferazę diacyloglicerolu, białka szlaku sygnałowego MAPK, kinazę FAK, Akt oraz czynniki transkrypcyjne STAT czy NF-kB. Indukowane Xn zmniejszenie aktywności tych białek wywołuje plejotropowe efekty komórkowe będące konsekwencją zaburzenia proliferacji, cyklu komórkowego, adhezji i migracji komórek nowotworowych.

Na uwagę zasługują również informacje dotyczące jego właściwości neuroprotekcyjnych. W modelu ogniskowej ischemii wywołanej przez MCAO u szczurów, odzwierciedlającym ogniskowe niedokrwienie mózgu in vivo, ksantohumol znacząco zmniejszał obszar martwicy niedokrwiennej mózgu. Sugeruje to, że ksantohumol może zmniejszać efekt neurotoksyczny indukowany również peptydem β-amyloidowym (Αβ). Wiadomo, że Aβ pośredniczy w mechanizmie wolnorodnikowym i jest jednym z głównych przyczyn choroby Alzheimera, zwiększając produkcję wolnych rodników i peroksydację lipidów w komórkach nerwowych, co w konsekwencji powoduje ich apoptozę.

Ponadto, oprócz działania na receptory mechanizm aktywności ksantohumolu może być związany z jego selektywną aktywnością w stosunku do błon lipidowych. Badania mechanizmów oddziaływania ksantohumolu z modelowymi błonami lipidowymi wskazują na silną modyfikację własności dynamicznych i strukturalnych błony. Ksantohumol nawet w bardzo małych stężeniach silnie oddziaływuje z hydrofilowymi fragmentami błony lipidowej wpływając na zmiany grubości dwuwarstwy. Wiadomo także, że neonikotynoidy ze względu na swoją wysoką hydrofobowość bardzo łatwo przenikają przez błony lipidowe. Oddziaływanie ksantohumolu z błoną lipidową może znacząco ograniczyć penetrację jej przez neonikotynoidy, co może być oprócz blokady receptorów nikotynowych wytłumaczeniem jego silnej aktywności.

Podczas realizacji badań prezentowanych w niniejszym zgłoszeniu zauważono, że mechanizm osłonowej aktywności ksantohumolu (Xn) związany jest z jego neuroprotekcyjnym działaniem opartym na blokowaniu receptorów nikotynowych u spożywających preparat owadów.

Ksantohumol (Xn) czyli ((E)-1-[2,4-dihydroksy-6-metoksy-3-(3-metylobut-2-enylo)-fenylo]-3-(4-hydroksyfenylo)-prop-2-en-1-on) jest związkiem naturalnym z grupy prenylowanych chalkonów, którego głównym źródłem są żeńskie kwiatostany Humulus Lupulus. Występuje on też w piwie jednak w ilościach śladowych. Związek ten zbudowany jest z dwóch pierścieni benzenowych (A i B) połączonych ze sobą α,β-nienasyconym układem karbonylowym.

Obecność w jego cząsteczce wolnej grupy hydroksylowej sprawia, że łatwo ulega izomeryzacji do właściwego flawanonu - produktu pośredniego w szlaku biosyntezy flawonoidów. W odróżnieniu od innych składników zawartych w szyszkach chmielu, ksantohumol odznacza się wyższą lipofilnością, co wiąże się z występowaniem w jego strukturze prenylowanego podstawnika. Warto nadmienić, że w żywych układach biologicznych ugrupowania prenylowe (farnezylowe lub geranylogeranylowe) pozwalają licznym wewnątrzkomórkowym molekułom na kotwiczenie się w błonie komórkowej decydując o ich właściwym funkcjonowaniu. Podobnie, sugeruje się, że w przypadku ksantohumolu ugrupowania te mogą znacząco modulować aktywność biologiczną tego związku, a co więcej wpływać na jego właściwości fizyko-chemiczne i subkomórkowe rozmieszczenie.

Ksantohumol bardzo słabo rozpuszcza się w wodzie. W celu rozpuszczenia go w środowisku wodnym można zastosować różne znane w stanie techniki rozpuszczalniki w tym cyklodekstryny.

PL 219 703 B1

Można także stosować roztwór etanolowy ksantohumolu lub ksantohumol rozpuszczony w DMSO dodać do syropu uzyskując aktywny preparat.

Preparat według wynalazku może być stosowany jako preparat osłonowy w formie dodatku do syropu w okresie zimowym, wiosennym oraz bez pożytkowym (podczas oczekiwania na rozkwit kwiatów kolejnych roślin). Preparat można dodawać do syropu, produkować jako gotowy do użytku z syropem oraz stosować go jako oprysk na pszczoły np. przed wystawieniem uli na pożytek, co do którego jest obawa, że może być skażony pestycydami.

Bardzo skutecznym sposobem podawania owadom preparatu może też być rozpuszczenie go syropie cukrowym w odpowiednim rozcieńczeniu wodą i zastosowanie jako oprysk na pszczołowate, które spożywają ten preparat w trakcie zlizywania go z ciała i skrzydeł.

Zastosowanie preparatu na bazie ksantohumolu może przyczynić się znacząco do ochrony owadów z rodziny pszczołowatych a zwłaszcza pszczół oraz trzmieli przed niekorzystnym wpływem neonikotynoidów i innych toksyn oraz infekcji Nosema spp. Problem ten ma zasięg globalny dlatego zasługuje na szczególną uwagę. Dotychczas nie wynaleziono preparatu o tak dużej skuteczności przeciw CCD, w którym substancją czynną jest związek pochodzenia naturalnego. Ponadto w oparciu o wiele danych literaturowych wiadomo, że ksantohumol jest związkiem bardzo korzystnie wpływającym na zdrowie ludzi.

Ze względu na antygrzybiczą i antybakteryjną aktywność ksantohumolu preparat wykazuje także aktywność w zwalczaniu Nosema spp (apis oraz ceranae). Na podstawie badań (wyniki wstępne) stwierdzono, że ilość spor obserwowanych pod mikroskopem po zastosowaniu Xn zmniejszała się średnio o 60% w stosunku do kontroli. Obserwacja pod mikroskopem zmiksowanych martwych pszczół związana była z liczeniem komórek Nosema w zawiesinie wody destylowanej. Pszczoły, które nie spożywały preparatu z Xn zawierały średnio 30 +/- 3 sztuk Nosema, natomiast po zastosowaniu preparatu przez 1 tydzień liczebność ich spadła średnio do 8 +/- 2.

Wynalazek zostanie bliżej objaśniony na podstawie przykładów wykonania i Figur na których:

Fig. 1. przedstawia fotografię typowego stosowanego ulika zawierającego 100 szt. pszczół.

Fig. 2. stanowi wykres zależności wpływu stężenia ksantohumolu w syropie na przeżywalność pszczół.

Fig. 3. jest chromatogramem porównawczym czystości otrzymywanego ksantohumolu w porównaniu z wzorcem. Na chromatogramie ksantohumolu (Xn) kontrola stanowi wzorzec zakupiony w Sigma Aldrich. Panel dolny przedstawia chromatogram ksantohumolu otrzymanego własną metodą z odpadów poekstrakcyjnych chmielu. Czystość preparatu stosowanego do sporządzenia roztworu wodnego w syropie wynosiła powyżej 99%.

Fig. 4. przedstawia stosowaną typową ramkę pszczelą w ulu ~40 tysięcznym z pszczołami przed opryskiem imidaklopridem.

Fig. 5. A, B, C przedstawiają wnętrze ula kontrolnego (bez działania osłonowego preparatu ksantohumolu) w 2 godziny, 1 dzień i 13 dni po dokonaniu oprysku imidaklopridem.

Fig. 5A

Wnętrze ula kontrolnego w 2 godziny po zastosowaniu oprysku imidaklopridem. Prawie wszystkie pszczoły zostały porażone.

Fig. 5B

Ramka z ula kontrolnego w 1 dzień po zastosowaniu oprysku imidaklopridem. Zbijanie się pszczół w kłęby.

Fig. 5C

Ramka z ula kontrolnego w 13 dni po zastosowaniu oprysku imidaklopridem. Pszczoły nadal zbijają się w kłęby.

Fig. 6 A, B, C

Wnętrze ula gdzie pszczoły pobierały preparat osłonowy z ksantohumolem, przedstawiony w 2 godziny po oprysku, 1 dzień i 13 dni po oprysku.

Fig. 6A

Wnętrze ula, w którym pszczoły pobierały preparat osłonowy z ksantohumolem, w 2 godziny po zastosowaniu oprysku imidaklopridem. Widać upadki lecz w porównaniu do ula kontrolnego obraz jest znacząco różny. Zachowanie pszczół wskazywało na ich znacznie lepszą kondycję w stosunku do pszczół, które nie pobierały preparatu osłonowego.

PL 219 703 B1

Fig. 6B

Ramka z ula, w którym pszczoły pobierały preparat osłonowy z ksantohumolem (zdjęcie zostało wykonane 1 dzień po zastosowaniu oprysku imidaklopridem). Pszczoły nie opuściły czerwiu i wystawiły straże. Ogólny obraz podobny do zdrowych pszczół.

Fig. 6C

Ramka z ula w którym pszczoły pobierały preparat osłonowy z ksantohumolem (zdjęcie zostało wykonane 13 dni po zastosowaniu oprysku imidaklopridem). Pszczoły były aktywne tak jak w ulach normalnych. Jak widać (zasklepione woskiem oraz świecące komórki) produkują miód w tym przypadku z nawłoci.

Wynalazek jest zilustrowany następującymi przykładami wykonania:

P r z y k ł a d 1

Badanie wpływu różnych stężeń ksantohumolu na przeżywalność pszczół przy zastosowaniu wysokiego stężenia imidaklopridu na ulikach eksperymentalnych.

Wpływ stężeń ksantohumolu w syropie cukrowym na przeżywalność pszczół badano na próbach po 100 sztuk pszczół umieszczonych w specjalnym uliku do badań, (Fig. 1). Pszczoły pobierały przez trzy dni preparat osłonowy w postaci ksantohumolu rozpuszczonego w standardowym syropie cukrowym w trzech stężeniach odpowiednio 5, 10 i 20 mg ksantohumolu/l. Każde stężenie badano w trzech niezależnych ulikach. Po trzech dniach pobierania preparatu osłonowego pszczoły otrzymywały imidakloprid (w preparacie Kohinor 200 SL Makhteshim Chemical Works Ltd., Izrael) w stężeniu 375 μΙ/l (mikrolitrów na litr) w objętości 5 ml syropu (podobne dawki stosuje się w zwalczaniu owadów w uprawach warzyw). Jako grupę kontrolną stosowano trzy uliki po 100 sztuk pszczół, które nie były karmione preparatem zawierającym ksantohumol. Wszystkie stężenia ksantohumolu oraz grupę kontrolną badano w trzech powtórzeniach. Stosowano ksantohumol otrzymywany metodą chromatograficzną z odpadów poekstrakcyjnych chmielu. Czystość preparatu wynosiła ~ 99% (Fig. 3).

Jak pokazano na Fig. 2. istnieje bardzo wyraźna zależność wpływu stężeń preparatu ksantohumolu w syropie na przeżywalność pszczół. Przy stężeniu 10 mg/l ksantohumolu przeżywalność pszczół była największa i wynosiła ~ 45%. Pszczoły kontrolne, które nie były karmione preparatem zawierającym ksantohumol padły w 100%-tach.

Czystość ksantohumolu odgrywa ważną rolę gdyż preparat o mniejszej czystości zawiera inne związki z chmielu np. humulony, których intensywny zapach może obniżać atrakcyjność preparatu dla pszczół. Ponadto w próbkach ksantohumolu o mniejszej czystości obecne są pestycydy stosowane podczas uprawy chmielu, które mogą przedostawać się do miodu.

P r z y k ł a d 2

Badanie wpływu ksantohumolu w syropie na przeżywalność pszczół przy zastosowaniu niskiego stężenia imidaklopridu wykonano na ulach w pasiece.

Podobne badania jak opisano w przykładzie 1 wykonano na trzech ulach pszczelich zawierających po ~ 40 tys. pszczół. Ramki z pszczołami (Fig. 4) poddano opryskowi imidakloridem rozpuszczonym w wodzie w stężeniu 125 μΗ (mikrolitrów na litr). Jest to połowa stężenia imidaklopridu w preparacie Kohinor 200 SL stosowanego w uprawie roślin warzywnych w gruncie. Celem badania było sprawdzenie małych dawek imidaklopridu, na które narażone są głównie pszczoły zbierające nektar i pyłki kwiatowe podczas zabiegów agrotechnicznych.

Pszczoły badano w dwóch grupach. Pszczoły w ulach kontrolnych nie otrzymywały osłony w postaci preparatu ksantohumolu przed opryskiem imidaklopridem (Fig. 5A, 5B, i 5C). Grupę badaną stanowiły pszczoły, którym podawano preparat osłonowy ksantohumolu w syropie 10 mg/l (miligram na litr) przez tydzień a następnie traktowano opryskiem imidaklopridu w stężeniu podanym powyżej (Fig. 6A, 6B i 6C).

Wyniki zilustrowane na Fig. 5 i 6 pokazują zachowanie się pszczół w 2 godziny, 1 dzień i 13 dni po oprysku odpowiednio w grupie kontrolnej (bez preparatu osłonowego) i badanej (z preparatem osłonowym). W oparciu o powyższe badania można stwierdzić, że dla pszczół, które nie otrzymały osłonowo preparatu ksantohumolu, imidakloprid znacząco przyczyniał się do ich śmierci. Można zauważyć, że w dwie godziny po oprysku prawie wszystkie pszczoły zostały porażone (Fig. 5A), w 1 dzień po oprysku te pszczoły, które przeżyły porzuciły opiekę nad czerwiem zbijając się w dużą grupę podobną do tej z okresu zimowego zwaną w pszczelarstwie „kłębem”. Ponadto pszczoły były bardzo osłabione i nie wystawiały straży przed ulem (Fig. 5B). Padło około połowy populacji. Nawet po dwóch tygodniach od momentu zabiegu pszczoły nadał grupowały się, porzucając opiekę nad czerwiem. Ogólny stan wskazywał na ich bardzo duże osłabienie, czego konsekwencją był brak straży

PL 219 703 B1 oraz pozostawanie pszczół w ulu bez wylotów na pożytki. Po 13 dniach od podania imidaklopridu pszczoły nadal zbijały się w kłęby (Fig. 5C), nie wylatywały poza ul i nie produkowały miodu. Wymagały podkarmiania ponieważ w przeciwnym razie ginęły.

Zupełnie inaczej zachowywały się pszczoły, które pobierały preparat z ksantohumolem (Fig. 6A, B, C). Jak wspomniano powyżej syrop z ksantohumolem był dla nich bardziej atrakcyjny i podczas pierwszej doby pobrały 2,5 litra. Zastosowanie, podobnie jak na grupie kontrolnej imidaklopridu nie powodowało tak drastycznych efektów. Część pszczół padła, ~10%, lecz pozostałe już na drugi dzień wystawiły straże i nie pozostawiły opieki nad czerwiem. Ogólny wygląd roju wskazywał na wysoką skuteczność preparatu ksantohumolu. Częściowy upadek pszczół można wytłumaczyć stosowaniem preparatu na ramki, gdzie imidakloprid działał także na młode pszczoły, które ze względu na hierarchię panującą w ulu mogły nie spożywać wystarczającej ilości preparatu z ksantohumolem. Po trzech dniach od oprysku pszczoły zaczęły wylatywać na pożytki (kwiaty nawłoci). Po dwóch tygodniach od podania imidaklopridu pszczoły z obu uli traktowanych preparatem osłonowym nie wykazywały żadnych różnic w zachowaniu w stosunku do uli zdrowych.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Preparat zapobiegający masowemu wymieraniu owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae) w następstwie występowania syndromu Colony Collapse Disorder (CCD), znamienny tym, że zawiera prenylową pochodną chalkonu lub jej metabolity, rozpuszczalnik oraz syrop cukrowy, o stężeniu prenylowej pochodnej chalkonu lub jej metabolitu 0,001-1000 mg/l preparatu i ewentualnie dopuszczalne w pszczelarstwie substancje dodatkowe.
2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako prenylową pochodną chalkonu zawiera związek wybrany z grupy składającej się z ksantohumolu, ksantohumolu B, ksantohumolu E, α,β-dihydroksantohumolu, izobawachalkonu, ksantohumolu C, ksantohumolu D, wodzianu izodehydrocykloksantohumolu, desmetyloksantohumolu, ksantogalenolu, 4'-O-metyloksantohumolu, 3'-geranylochalkonaryngeniny, 3',5'-diprenylochalkonaryngeniny, 5'-prenyloksantohumolu, flawokawiny.
3. Preparat według zastrz. 2, znamienny tym, że jako prenylową pochodną chalkonu zawiera ksantohumol.
4. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako metabolit prenylowej pochodnej chalkonu zawiera związek wybrany z grupy składającej się z izoksantohumolu, desmetyloksantohumolu, 6-prenylonaryngeniny, 8-prenylonaryngeniny, 6,8-prenylonaryngeniny.
5. Preparat według zastrz. 3, znamienny tym, że stężenie ksantohumolu w preparacie wynosi 5-20 mg/l.
6. Preparat według zastrz. 5, znamienny tym, że stężenie ksantohumolu w preparacie wynosi

5 mg/l.
7. Preparat według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera ksantohumol o czystości od 0,001 do 100%.
8. Preparat według zastrz. 7, znamienny tym, że zawiera ksantohumol o czystości 96%.
9. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako syrop cukrowy zawiera dowolny syrop do dokarmiania pszczół.
10. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik zawiera roztwór wodny.
11. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik zawiera wodny roztwór alkoholu etylowego.
12. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik zawiera roztwór wodny dimetylosulfotlenku (DMSO).
13. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik zawiera cyklodekstryny i/lub cukry.
14. Preparat według zastrz. 10, znamienny tym, że roztwór wodny jest roztworem alkalicznym.
15. Preparat według zastrz. 10, znamienny tym, że roztwór wodny jest roztworem kwaśnym.
16. Preparat według zastrz. 10, znamienny tym, że roztwór wodny jest roztworem zawierającym kompleksy ksantohumolu z metalami ziem alkalicznych i przejściowych.
17. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik stosuje się rozpuszczalnik niepolarny.

PL 219 703 B1
18. Preparat według zastrz. 1-17, znamienny tym, że jako substancję dodatkową zawiera substancję wybraną z grupy składającej się z innych flawonoidów i chalkonów, kumaryn, karotenoidów, polifenoli, kwasów tłuszczowych, lipidów, form liposomalnych wspomnianych związków, białek, peptydów, witamin, minerałów, propolisu, pochodnych oleju rycynowego, ekstraktów z herbat, ekstraktów z kawy lub innych ekstraktów ziołowych lub owocowych i warzywnych.
19. Preparat według zastrz. 1-18, znamienny tym, że jest w postaci zestalonej lub ciekłej.
20. Preparat według zastrz. 19, znamienny tym, że jest w postaci syropu cukrowego lub w postaci ciasta do podkarmiania owadów.
21. Preparat według zastrz. 19, znamienny tym, że jest w postaci paska cukrowego lub innego paska z substancji odżywczych do zgryzania przez owady.
22. Preparat według zastrz. 19, znamienny tym, że jest w postaci paska na matrycy z kartonu lub tworzyw sztucznych.
23. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania w zapobieganiu i zwalczaniu wymierania owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae) w następstwie występowania syndromu masowego ginięcia pszczół i trzmieli (CCD).
24. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 23, znamienna tym, że stanowi ją związek wybrany z grupy składającej się z ksantohumolu, ksantohumolu B, ksantohumolu E, α,β-dihydroksantohumolu, izobawachalkonu, ksantohumolu C, ksantohumolu D, wodzianu izodehydrocykloksantohumolu, desmetyloksantohumolu, ksantogalenolu, 4'-O-metylo-ksantohumolu, 3'-geranylochalkonaryngeniny, 3',5'-diprenylochalkonaryngeniny, 5'-prenyloksantohumolu, flawokawiny.
25. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 24, znamienna tym, że prenylową pochodną chalkonu stanowi ksantohumol.
26. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 23, znamienna tym, że metabolit prenylowej pochodnej chalkonu stanowi związek wybrany z grupy składającej się z izoksantohumolu, desmetyloksantohumolu, 6-prenylonaryngeniny, 8-prenylonaryngeniny,

6.8- prenylonaryngeniny.
27. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 23-26, znamienna tym, że prenylową pochodną chalkonu lub jej metabolit stosuje się u pszczół i trzmieli.
28. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania, według zastrz. 27, gdzie jako pszczoły wybiera się pszczoły z gatunków Apis mellifera i Apis ceranae.
29. Preparat, jak zdefiniowano w zastrz. 1-22, do zastosowania w zapobieganiu i zwalczaniu wymierania owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae) w następstwie występowania syndromu masowego ginięcia pszczół i trzmieli (CCD).
30. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania do poprawy wigoru owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae).
31. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 25, znamienna tym, że prenylową pochodną chalkonu stanowi związek wybrany z grupy składającej się z ksantohumolu, ksantohumolu B, ksantohumolu E, α,β-dihydroksantohumolu, izobawachalkonu, ksantohumolu C, ksantohumolu D, wodzianu izodehydrocykloksantohumolu, desmetyloksantohumolu, ksantogalenolu, 4'-O-metyloksantohumolu, 3'-geranylochalkonaryngeniny, 3',5'-diprenylochalkonaryngeniny, 5'-prenyloksantohumolu, flawokawiny.
32. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 31, znamienna tym, że prenylową pochodną chalkonu stanowi ksantohumol.
33. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 30, znamienna tym, że metabolit prenylowej pochodnej chalkonu stanowi związek wybrany z grupy składającej się z izoksantohumolu, desmetyloksantohumolu, 6-prenylonaryngeniny, 8-prenylonaryngeniny,

6.8- prenonaryngeniny.
34. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 30-33, znamienna tym, że prenylową pochodną chalkonu lub jej metabolity stosuje się u pszczół i trzmieli.
35. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 34, gdzie jako pszczoły wybiera się pszczoły z gatunków Apis mellifera i Apis ceranae.
36. Preparat, jak zdefiniowano w zastrz. 1-22, do zastosowania do poprawy wigoru owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae).
37. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania w zwalczaniu Nosema spp. u owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae).

PL 219 703 B1
38. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 37, znamienna tym, że prenylową pochodną chalkonu stanowi związek wybrany z grupy składającej się z ksantohumolu, ksantohumolu B, ksantohumolu E, α,β-dihydroksantohumolu, izobawachalkonu, ksantohumolu C, ksantohumolu D, wodzianu izodehydrocykloksantohumolu, desmetyloksantohumolu, ksantogalenolu, 4'-O-metyloksantohumolu, 3'-geranylochalkonaryngeniny, 3',5'-diprenylochalkonaryngeniny, 5'-prenyloksantohumolu, flawokawiny.
39. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 38, znamienna tym, że prenylową pochodną chalkonu stanowi ksantohumol.
40. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 37, znamienna tym, że metabolit prenylowej pochodnej chalkonu stanowi związek wybrany z grupy składającej się z izoksantohumolu, desmetyloksantohumolu, 6-prenylonaryngeniny, 8-prenylonaryngeniny,

6,8-prenylonaryngeniny.
41. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 37-40, znamienna tym, że prenylową pochodną chalkonu stosuje się u pszczół i trzmieli.
42. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 41, gdzie jako pszczoły wybiera się pszczoły z gatunków Apis mellifera i Apis ceranae.
43. Preparat jak zdefiniowano w zastrz. 1-22 do zastosowania w zwalczaniu Nosema spp. u owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae).
44. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania w zapobieganiu oraz zwalczaniu skutków stosowania środków owadobójczych z grupy neonikotynoidów oraz innych toksyn u owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae).
45. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 44, znamienna tym, że prenylową pochodną chalkonu stanowi związek wybrany z grupy składającej się z ksantohumolu, ksantohumolu B, ksantohumolu E, α,β-dihydroksantohumolu, izobawachalkonu, ksantohumolu C, ksantohumolu D, wodzianu izodehydrocykloksantohumolu, desmetyloksantohumolu, ksantogalenolu, 4'-O-metyloksantohumolu, 3'-geranylochalkonaryngeniny, 3',5'-diprenylochalkonaryngeniny, 5'-prenyloksantohumolu, flawokawiny.
46. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 45, znamienna tym, że prenylową pochodną chalkonu stanowi ksantohumol.
47. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 44, znamienna tym, że metabolit prenylowej pochodnej chalkonu stanowi związek wybrany z grupy składającej się z izoksantohumolu, desmetyloksantohumolu, 6-prenylonaryngeniny, 8-prenylonaryngeniny,

6,8-prenylonaryngeniny.
48. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 44-47, znamienna tym, że zapobieganie prowadzi się u pszczół i trzmieli.
49. Prenylowa pochodna chalkonu lub jej metabolity do zastosowania według zastrz. 48, gdzie jako pszczoły wybiera się pszczoły z gatunków Apis mellifera i Apis ceranae.
50. Preparat jak zdefiniowano w zastrz. 1-22 do zastosowania w zapobieganiu oraz zwalczaniu skutków stosowania środków owadobójczych z grupy neonikotynoidów oraz innych toksyn u owadów z rodziny pszczołowatych (Apidae).