PL220399B1 - Kompozycja i preparat zawierające tioprolinę i kwas rozmarynowy, zastosowanie tej kompozycji oraz sposób ochrony skóry przed procesem starzenia zewnątrzpochodnego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja i preparat zawierające tioprolinę i kwas rozmarynowy, zastosowanie tej kompozycji oraz sposób ochrony skóry przed procesem starzenia zewnątrzpochodnego.

Starzenie się skóry spowodowane jest działaniem czynników zewnątrzpochodnych (środowiskowych) i wewnątrzpochodnych, np. genetycznych. Wpływ uszkadzających czynników środowiska wyraża się przede wszystkim starzeniem przedwczesnym skóry, najbardziej widocznym w miejscach eksponowanych na przewlekłe działanie promieniowania ultrafioletowego - na skórze twarzy i rąk. Szacuje się, że 80% wszystkich zmian obserwowanych podczas procesu starzenia w skórze niechronionej jest indukowanych promieniowaniem ultrafioletowym.

Zmiany charakterystyczne dla procesu starzenia zewnątrzpochodnego w skórze wywołane są bezpośrednim działaniem promieni UVA i UVB oraz ich działaniem pośrednim związanym z wywołaniem reakcji zapalnej w komórkach skóry.

Promienie UVA nie powodują zaczerwienienia skóry, ale odgrywają rolę w powstawaniu słonecznych zmian degeneracyjnych tkanki łącznej, niszczą kolagen, sprzyjają powstawaniu dermatoz i nowotworów skóry. Mogą też, podobnie jak promienie podczerwone, doprowadzać do uszkodzenia naczyń włosowatych i zaburzeń ukrwienia skóry.

Promienie UVB są odpowiedzialne za rumień słoneczny, poparzenia skóry oraz odgrywają decydującą rolę w powstawaniu zmian przednowotworowych i nowotworów skóry (działanie mutagenne). Około 10% promieniowania UVB przenika do skóry właściwej, uszkadzając włókna podporowe. Promienie UVB stymulują w naskórku wydzielanie interleukin czy TNFa pośredniczących w powstawaniu reakcji zapalnej. W skórze właściwej dochodzi do zwiększonej syntezy i wzrostu aktywności metaloproteinaz rozkładających włókna kolagenowe, co doprowadza do zmniejszenia gęstości i utraty właściwości tkanki podporowej skóry.

Zarówno bezpośrednie działanie promieniowania ultrafioletowego, jak i generowane przez niewolne rodniki uszkadzają elementy bariery naskórkowej. Degradacji ulegają składniki cementu międzykomórkowego warstwy rogowej (nienasycone lipidy) oraz zmniejsza się aktywność gruczołów łojowych. W przypadku cer suchych powoduje to pogorszenie bilansu wodnego skóry.

Oksydacyjne uszkodzenia DNA

Materiał genetyczny wszystkich organizmów narażony jest na działanie czynników mających zdolność modyfikacji chemicznej struktury DNA. Należą do nich przede wszystkim promieniowanie ultrafioletowe, substancje chemiczne i wolne rodniki.

Głównymi uszkodzeniami DNA pojawiającymi w wyniku działania promieniowania ultrafioletowego są uszkodzenia oksydacyjne oraz tzw. fotouszkodzenia, czyli powstawanie dimerów pirymidynowych (dimery tymidynowe i dimery tyminy z cytozyną) oraz fotoproduktów 6-4 (wiązanie pomiędzy węgłem 6 pierścienia pirymidyny w 5' nici DNA i węgłem 4 pirymidyny w 3' nici DNA). Pary sąsiadujących w łańcuchu DNA pirymidyn, powiązane wiązaniami kowalencyjnymi, zatrzymują w procesie replikacji włączanie nukleotydów przez polimerazę DNA III do nowo tworzonej nici kwasu nukleinowego, co powoduje fragmentację DNA i efekt letalny (Wójtkowiak D. i wsp.; Efekty oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego - rola kosmetyków. Część I. Polish Journal of Cosmetology, 1999, 1: 10-33; Gajewski W.: Mutageneza, reperacja i rekombinacja DNA. Genetyka Molekularna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2000, 248-279).

Uszkodzenia oksydacyjne polegają na reakcji aktywnych form tlenu z resztami cukrowymi lub zasadami nukleinowymi. W wyniku tego procesu powstają 5-hydroksymetylouracyl (addukt) oraz utlenione formy pirymidyn i puryn (glikol tyminy, 8-oksoguanina jako uszkodzenie o charakterze mutagennym). Oddziaływania aktywnych form tlenu z resztami cukrowymi mogą powodować powstawanie wiązań między nićmi DNA i w efekcie końcowym doprowadzać do ich pęknięcia. Dla komórki jest to letalne (Gros L. i wsp.: Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene, 2002, 21: 8905-8925).

Niezależnie od źródła czynnika uszkadzającego, wszystkie uszkodzenia DNA zmieniają strukturę chromosomów i zaburzają procesy replikacji DNA (Widłak P.: Struktura chromatyny a powstawanie i naprawa uszkodzeń DNA. Kosmos, 2002, 1(254): 5-12).

Wpływ wolnych rodników na procesy starzenia się skóry

Poza bezpośrednim i pośrednim działaniem promieni UV bardzo duży wpływ na procesy starzenia się skóry mają wolne rodniki, zarówno uwalniane w atmosferze, jak i powstające wewnątrz

PL 220 399 B1 organizmu. Cząstki te działają zazwyczaj jako bardzo agresywne utleniacze, niszczące różne struktury skóry i naskórka. Wraz z wiekiem maleje sprawność własnych systemów antyutleniających organizmu (np. enzymów katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej SOD) i skóra traci zdolność do samoregeneracji uszkodzeń (Ichihashi M. i wsp.: UV-induced skin damage. Toxicology, 2003, 189: 21-39). Do endogennych czynników wpływających na powstanie stresu oksydacyjnego należy m.in. proces glikacji, czyli, nieenzymatycznego przyłączania się wolnych reszt cukrowych glukozy i fruktozy do białek. Proces glikacji zmienia strukturę i właściwości białek. Konsekwencją tego procesu jest powstanie struktur o nazwie AGEs (Advanced Glycation Endproducts), które zakłócają wiele procesów metabolicznych. Jednym z nich jest obniżenie aktywności SOD, powodując zaburzenia w usuwaniu wolnych rodników (Liu JP i wsp.: The In Vitro Protective Effects of Curcumin and Demethoxycurcumin in Curcuma longa Extract on Advanced Glycation End Products-Induced Mesangial Cell Apoptosis and Oxidative Stress. Planta Med. 2012 Aug 24. [Epub ahead of print]).

Największym egzogennym źródłem aktywnych form tlenu, czyli wolnych rodników jest dym tytoniowy i spaliny. Wywołany w komórkach stres oksydacyjny prowadzi do: uszkodzeń błon biologicznych (peroksydacja lipidów) i związany z tym rozpad komórek naskórka, a w konsekwencji przyspieszenie elastozy skóry, uszkodzeń DNA, hamowania rozwoju/ różnicowania keratynocytów, indukcji procesów nowotworzenia oraz przyspieszenia apoptozy komórek skóry, a tym samym starzenia się skóry.

Efektem stresu oksydacyjnego jest:

a. zaburzenie prawidłowego funkcjonowania układu immunologicznego skóry,

b. zmiany w aktywności istotnych dla prawidłowego funkcjonowania komórki enzymów, receptorów błonowych i białek transportowych (kanały jonowe),

c. degradacja kolagenu poprzez aktywację MMP-1, stanowiącego główny budulec zdrowej skóry, które niszczone i niezdolne do regeneracji prowadzą do starzenia się skóry, przy jednoczesnej nadmiernej produkcji włókien elastycznych - włókna kolagenowe i elastyczne ulegają zbijaniu się,

d. skurcz naczyń krwionośnych w skórze, zmniejszenie transportu tlenu i substancji odżywczych, zaburzenia mikrokrążenia,

e. spowolnienie procesu gojenia się ran,

f. zwiększenie częstości występowania łuszczycy, co sprzyja wystąpieniu pierwszych zmian lub zaostrza objawy istniejącej choroby,

g. nasilenie objawów trądziku,

h. przyspieszenie wypadania włosów.

W konsekwencji pojawia się zwiększona utrata wody (TEWL), suchość skóry, podatność na podrażnienia i wrażliwość na czynniki środowiskowe (ciepło, zimno, słońce, substancje chemiczne), przyspieszone tworzenie się zmarszczek (liczne, głębokie i wyraźnie zaznaczone), upośledzenie zdolności regeneracyjnych, zmniejszenie syntezy kolagenu i postępująca elastoza skóry.

Opisane zaburzenia powodują że osoby poddane stresowi oksydacyjnemu wyglądają na starsze niż są w rzeczywistości. Badania dowiodły, iż palenie średnio 20 papierosów dziennie przyspiesza fizjologiczny proces starzenia się skóry o 10 lat (Rosińska A. i wsp. Dermatologia dla kosmetologów. red. A. Kaszuba, Wyd. Naukowe UM w Poznaniu, 2008: 234-238).

Wpływ wolnych rodników na rozwój cery naczyniowej i trądziku różowatego

Przyczyny powstawania cery naczyniowej nie są do końca poznane. Uważa się, że w skórze właściwej niektórych okolic twarzy, a także szyi i dekoltu, dochodzi do zaburzeń krążenia, które mogą być spowodowane m.in. nadmierną ekspozycją skóry na działanie czynników środowiskowych, które wpływają na czynność naczyń krwionośnych skóry np. promieniowanie cieplne i UV oraz wolne rodniki.

W większości przypadków wiele czynników nakłada się na siebie i u jednej osoby można wykryć kilka różnych przyczyn wystąpienia cery naczyniowej.

Najnowsze doniesienia Yamasaki i Gallo sugerują że u podstaw wszystkich mechanizmów biorących udział w patogenezie trądziku różowatego leżą zaburzenia odpowiedzi immunologicznej. Szeroko opisywane czynniki zewnętrzne, pełniące rolę mechanizmów spustowych, indukują zaburzenia immunologiczne, prowadzące do powstawania objawów klinicznych choroby. Autorzy ci wśród mechanizmów patogenetycznych w trądziku różowatym za najistotniejsze uznali m.in. działanie reaktywnych form tlenu (ROS) i działanie promieniowania UV (Górkiewicz-Petkow A. Trądzik różowaty - etiopatogeneza i leczenie. Przegl. Dermatol 2007, 94(3); 373-383, Yamasaki K i wsp. The molecular pathology of rosacea. J Dermatol Sci 2009, Geria AN i wsp. Rosacea: a review. Kosmetische Medizin 2008,6: 303-308).

PL 220 399 B1

Tioprolina (tymonacyk), czyli kwas tiazolidyno-4-karboksylowy jest metabolizowana do cysteiny, która wchodzi w skład białek włosów, naskórka, paznokci (białko keratyna) i glutationu. Glutation umożliwia detoksykację. Jest także źródłem licznych istotnych w funkcjonowaniu organizmu metabolitów.

Tioprolina pełni liczne funkcje w organizmie, między innymi działa lipotropowo: przeciwmiażdżycowo, obniża stężenie lipidów we krwi, chroni wątrobę, nerki i serce przed stłuszczeniem; działa żółciopędnie, rozkurczowo; ma działanie ochronnie na miąższ wątroby, chroniąc przed szkodliwymi czynnikami wirusowymi, bakteryjnymi, metalami ciężkimi, węglowodorami i lekami; poprawia strukturę i pobudza wzrost oraz regenerację naskórka, włosów i paznokci, ma ponadto właściwości przeciwtrądzikowe i przeciwłuszczycowe; a także, wraz z N-acetylocysteiną stanowią antyoksydanty, które znalazły zastosowanie w suplementacji anti-aging - Miguel J. Menopause: A review on the role of oxygen stress and favorable effects of dietary antioxidants. (2006) Arch Gerontol Geriatr; Guayerbas N. Thiolic antioxidant supplementation of the diet reverses age-related behavioural dysfunction in prematurely ageing mice. (2005) Pharmacol Biochem Behav 80: 45-51. W organizmie jest metabolizowana do cysteiny.

W US 5047409 opisano sole tioproliny z 3-tlenkiem 6-piperydyno-2,4-diaminopirymidyny oraz ich miejscowe stosowanie, a także ich kosmetyczne i medyczne zastosowanie do leczenia utraty włosów lub stanów patologicznych takich jak między innymi łysienie, zapalenie skóry.

W US 6150405 ujawniono zastosowanie związków sulfhydrylowych, w tym tioproliny, do leczenia utraty włosów.

US 20040028787 wymieniono tioprolinę do aromatyzowania żywności i napojów, a także do stosowania w kosmetyce.

Kwas rozmarynowy jest estrem kwasu kawowego i kwasu alfa-hydroksydihydrokawowego. Występuje powszechnie u gatunków z rodziny ogórecznikowatych (Boraginaceae) oraz u jasnotowatych (Lamiaceae) głównie w rozmarynie lekarskim. Posiada on szereg interesujących właściwości m.in. przeciwwirusowych, przeciwbakteryjnych, przeciwzapalnych oraz przeciw-utleniających (M. Sάnchez-Campillo, i wsp.: Rosmarinic acid, a photo-protective agent against UV and other ionizing radiations. Food Chem Toxicol. 2009 Feb;47(2): 386-92).

Ester ten, dzięki swoim właściwościom przeciw-utleniającym, jest w stanie ograniczyć uszkodzenia związane z brakiem witaminy E, obniżyć produkcję prozapalnych lizofosfatydylocholin i przeciwdziałać utlenieniu LDL („zły” cholesterol). Kwas rozmarynowy działa egzogennie i endogennie jako czynnik foto-ochronny. W pierwszym przypadku działa jako zmiatacz wolnych rodników, a w drugim jako czynnik indukujący endogenne mechanizmy obronne, poprzez regulowanie aktywności tyrozynazy i stymulowanie produkcji melaniny.

Kwas rozmarynowy, dzięki swoim właściwościom przeciw-utleniającym oraz modulacji działania enzymów szlaku melanogenezy, może być interesującym narzędziem do walki ze skutkami nadmiernego promieniowania (Lee J. i wsp.: Rosmarinic acid induces melanogenesis through protein kinase A activation signaling. Biochem Pharmacol. 2007 Oct 1;74(7): 960-8).

W przeprowadzonych testach związek ten obniżał w różnym stopniu aktywność: cyklooksygenazy 1 i 2, lipooksygenazy, hialuronidazy, b-heksozaminidazy, dekarboksylazy ornitynowej, reduktazy aldozowej, a-amylazy, karboksypeptydazy A, cyklazy adenylowej oraz dejodynazy jodotyroniny. Nie posiada jednak zdolności modyfikowania metabolizmu ksenobiotyków i nie zmienia aktywności enzymów obu faz detoksykacji. Cechuje go natomiast aktywność immunomodulująca. Pobudza produkcję prostaglandyny E2 oraz obniża syntezę leukotrienów B4 w ludzkich leukocytach różnokształtnojądrowych. Na układ dopełniacza, pełniącego istotną rolę w odczynie zapalnym, działa hamująco. Obserwowany pod jego wpływem efekt antytrombinowy powstaje przypuszczalnie w drodze zapobiegania agregacji płytek krwi lub ewentualnego pobudzania procesu fibrynolizy (Psotova J. i wsp.: Biological activities of Prunella vulgaris extract. Phytother Res. 2003 Nov;17(9): 1082-7; Murata T i wsp.: Hyaluronidase Inhibitory Rosmarinic Acid Derivatives from Meehania Urticifolia. Chem. Pharm. Bull. 59(1) 88-95 (2011); Aufmkolk M. i wsp.: The active principles of plant extracts with antithyrotropic activity: oxidation products of derivatives of 3,4-dihydroxycinnamic acid. Endocrinology. 1985 May; 116(5): 1677-86; Kusano G. i wsp.: Studies on inhibitory activities of fukiic acid esters on germination, alpha-amylase and carboxypeptidase A. Biol Pharm Bull. 1998 Sep;21(9): 997-9; Zhang JJ i wsp.: Rosmarinic acid inhibits proliferation and induces apoptosis of hepatic stellate cells. Biol Pharm Bull. 2011 Mar;34(3): 343-8).

PL 220 399 B1

Jakkolwiek znanych jest szereg preparatów przeznaczonych do profilaktyki i leczenia starzenia się skóry, to nadal istnieje potrzeba opracowania skutecznych środków do ochrony skóry przed procesem starzenia zewnątrzpochodnego.

Spółka Laboratorium Kosmetyczne Dr Irena Eris Sp. z o.o. od lat zajmuje się nie tylko wytwarzaniem kosmetyków do stosowania zarówno przez salony kosmetyczne jak i do stosowania osobistego, ale także prowadzi sieć salonów kosmetycznych oraz salonów SPA, w których oferuje szeroką gamę zabiegów z użyciem tych kosmetyków.

US 6492429 dotyczy kompozycji do leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów, która składa się z apocyniny (inhibitora oksydazy NADPH), inhibitora indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS) oraz substancji wzmacniającej działanie tej kompozycji. W opisie US 6492429 jako inhibitor iNOS wymieniono m.in. kwas rozmarynowy (akapit łączący 3. i 4. szpaltę). Jako substancję wzmacniającą działanie kompozycji wymieniono m.in. tioprolinę (4. szpalta, dolna część). W zastrzeżeniach jednak o tioprolinie się już nie wspomina, a jako jedyną substancję wzmacniającą wskazuje się kwasy bosweliowe (pochodzące np. z kadzidłowca, Boswellia, zwłaszcza Boswellia serrata). W US 6492429 nie ujawniono przy tym jakiejkolwiek konkretnej kompozycji, która zawierałaby jednocześnie kwas rozmarynowy i tioprolinę.

Wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej tioprolinę i kwas rozmarynowy w synergicznie skutecznej ilości.

Kompozycję stanowi antyoksydacyjne połączenie tych związków, które spowalnia procesy starzenia zewnątrzpochodnego, uwarunkowanego działaniem czynników zewnętrznych (zanieczyszczenia) oraz jego najbardziej znanej formy - fotostarzenia, związanego z nadmierną ekspozycją na promieniowanie UV. Kompozycja ta znajduje zastosowanie w pielęgnacji skóry starzejącej się, suchej, odwodnionej, przesuszonej, wrażliwej, skóry naczyniowej i z trądzikiem różowatym, skóry poddanej działaniu promieniowania słonecznego i promieniowania stosowanego np. w solariach.

Środek kosmetyczny według wynalazku wykazuje liczne zalety na tle znanych ze stanu techniki preparatów.

Z uwagi na synergiczne działanie składników możliwe jest użycie w preparacie mniejszej ilości tioproliny i kwasu rozmarynowego, a więc zmniejszenie prawdopodobieństwa wystąpienia nietolerancji, takich jak reakcja podrażnienia czy alergia.

Kompozycję tioproliny i kwasu rozmarynowego można podawać w połączeniu z kosmetycznie dopuszczalnymi nośnikami lub rozcieńczalnikami w wielu różnych postaciach dawkowanych do stosowania miejscowo. Można je łączyć z wieloma różnymi kosmetycznie dopuszczalnymi, chemicznie obojętnymi nośnikami, w postać kremu, balsamu, lotionu, żelu, emulsji O/W i W/O, żeli myjących, itp., zgodnie ze standardową praktyką kosmetyczną.

Kremy i żele można np. formułować z wodnym lub oleistym podłożem, z dodatkiem odpowiednich środków zagęszczających i/lub żelujących i/lub rozpuszczalników. Takie podłoża mogą zawierać np. wodę i/lub olej, taki jak ciekła parafina lub dowolny olej roślinny, albo rozpuszczalnik, taki jak glikol polietylenowy. Do środków zagęszczających i środków żelujących, które można stosować w zależności od charakteru podłoża, należą miękka parafina, stearynian glinu, alkohol cetostearylowy, glikole polietylenowe, tłuszcz z wełny, wosk pszczeli, karboksypolimetylen i pochodne celulozy i/lub monostearynian glicerylu i/lub niejonowe środki emulgujące.

Emulsje O/W i W/O zawierają fazę wodną, fazę tłuszczową i środek powierzchniowo czynny lub mieszaninę środków powierzchniowo czynnych (emulgatorów), które umożliwiają powstanie emulsji. Stosunek ilościowy zależy od wymaganej konsystencji, od właściwości składników fazy tłuszczowej i właściwości emulgatora. Można je formułować poprzez połączenie fazy wodnej z fazą olejową z odpowiednimi emulgatorami. Faza wodna może zawierać ekstrakty roślinne wodne lub/i alkoholowe, faza olejowa - oleje roślinne naturalne (oleinowy, linolowy, linolenowy), parafinowe (wazelinowe, białe, mineralne, płynne parafiny), masła, oleje syntetyczne.

Lotiony można formułować z użyciem wodnego lub olejowego podłoża np. etanolu lub alkoholu oleilowego.

W razie potrzeby środki kosmetyczne według wynalazku można buforować przez dodanie odpowiednich środków buforujących.

Zazwyczaj preparaty zawierają również jeden lub większą liczbę środków emulgujących, stabilizatorów, środków dyspergujących, środków zagęszczających, środków barwiących, substancji zapachowych, środków konserwujących środków nawilżających itp.

PL 220 399 B1

Nośniki odpowiednie do stosowania zgodnie z wynalazkiem obejmują stałe rozcieńczalniki lub wypełniacze, ośrodki wodne i różne nietoksyczne rozpuszczalniki organiczne i nieorganiczne.

Poniżej przedstawiono przykładowe ramowe receptury środków kosmetycznych oraz preparatów według wynalazku.

Receptura ramowa kremów, balsamów, logionów, żeli i pianek

Składniki	Maksymalne stężenie
Oleje (roślinne i mineralne np. parafina ciekła), woski i alkohole tłuszczowe, lanolina i jej związki	95
Składniki nawilżające (np. gliceryna, glikol propylenowy, PEG)	25
Składniki emulgujące (np. stearynian glicerylu, stearynian cynku)	25
Silikony (np. dimetikon, cyklometikon)	20
Anionowe/amfoteryczne/niejonowe związki powierzchniowo czynne (np. sól sodowa oksyetylenowanego siarczanu krylowego)	20
Składniki zagęszczające (np. karbomer, eter celulozy, guma ksantanowa)	12
Emolienty (np. mirystynian izopropylu, alkohole tłuszczowe)	10
Składniki dodatkowe (np. witaminy, antyoksydanty, ekstrakty roślinne)	10
Kationowe związki powierzchniowo czynne (>/= C12) i polimery (np. chlorek distearylodometyloamoniowy, polyquaterium-7)	5
Kompozycja zapachowa	5
Stabilizatory (np. siarczan magnezu)	3
Konserwanty	2
Barwniki	1
Kwas rozmarynowy zamknięty (30% czystej substancji)	0,09
Tioprolina	3
Woda	do 100

Poniżej przedstawiono przykłady ilustrujące przedmiot wynalazku. W tabelach podano składy preparatów według wynalazku zawierających kompozycję według wynalazku.

Przykłady

P r z y k ł a d 1 - Krem tłusty

Lp.	Nazwa składnika	Zawartość [% wag.]
1	2	3
1.	Ester hydroksydodecylowy kwasu palmitynowego (Emolient)	10,00
2.	Zmodyfikowany polieter-polisiloksan oraz poligliceryna; poli(kwas 12-hydroksystearynowy) (Emulgator)	3,00
3.	Cyklometykon (Silikon)	6,50
4.	2-tert-butylo-4-metoksyfenol; 3-tert-butylo-4-metoksyfenol (Przeciwutleniacz)	0,02
5.	Gliceryna	5,00
6.	Siarczan magnezu	1,00

PL 220 399 B1 ciąg dalszy

1	2	3
7.	Olej winogronowy	2,00
8.	Stearynian cynku	2,00
9.	Wosk pszczeli	0,50
10.	Chlorek 3-chloroallilometenaminy (środek konserwujący)	1,15
11.	Octan tokoferolu	1,00
12.	Kwas rozmarynowy zamknięty (30% czystej substancji)	0,02
13.	Tioprolina	0,001
14.	Woda	do 100

P r z y k ł a d 2 - pianka do mycia twarzy

Lp.	Nazwa składnika	Zawartość [% wag.]
1.	PEG-7 Glyceryl Cocoate (Emolient)	3,50
2.	D-pantenol	1,50
3.	Polimer hydroksyetylocelulozy (Zagęstnik)	0,40
4.	Gliceryna	5,00
5.	Allantoina	0,10
6.	Disodium ricinoleamino MEA-sulfosuccinate (środek powierzchniowo czynny)	10,00
7.	Naturalna betaina, monohydrat (Substancja nawilżająca)	4,00
8.	Chlorek 3-chloroallilometenaminy (środek konserwujący)	0,12
9.	Kwas rozmarynowy zamknięty (30% czystej substancji)	0,02
10.	Tioprolina	0,0001
11.	Woda	do 100

P r z y k ł a d 3 - żel pod prysznic

Lp.	Nazwa składnika	Zawartość [% wag.]
1.	Barwniki	0,002
2.	Benzofenon-4 (Filtr UV)	0,50
3.	Gliceryna	3,00
4.	Salicylan sodowy	0,50
5.	Sól sodowa siarczanu oksyetylenowanego alkoholu laurylowego (środek powierzchniowo czynny)	27,00
6.	Sól	0,80
7.	Kwas rozmarynowy zamknięty (30% czystej substancji)	0,03
8.	Tioprolina	0,0001
9.	Woda	do 100

PL 220 399 B1

P r z y k ł a d 4 - Mleczko do demakijażu

Lp.	Nazwa składnika	Zawartość [% wag.]
1.	Alkohol cetearylowy (alkohol tłuszczowy)	0,90
2.	Ceteareth-20 (Emulgator)	2,20
3.	Allantoina	0,10
4.	Polimer usieciowany akrylan/C10-30 alkiloakrylan (Składnik zagęszczający)	0,18
5.	PEG8; Tokoferol; palmitynian askorbylu; kwas askorbinowy (oraz) kwas cytrynowy (Przeciwutleniacze)	0,05
6.	Wersenian dwusodowy	0,05
7.	Gliceryna	2,00
8.	Trójetanoloamina (Regulator pH)	0,18
9.	Olej wazelinowy	18,00
10.	p-hydroksybenzoesan metylu (środek konserwujący)	0,90
11.	Kwas rozmarynowy zamknięty (30% czystej substancji)	0,02
12.	Tioprolina	0,0001
13.	Woda	do 100

P r z y k ł a d 5 - Balsam do ciała

Lp.	Nazwa składnika	Zawartość [% wag.]
1.	Alkohol cetearylowy (alkohol tłuszczowy)	1,20
2.	Ceteareth-20 (Emulgator)	2,50
3.	Allantoina	0,05
4.	Polimer usieciowany akrylan/C10-30 alkiloakrylan (Składnik zagęszczający)	0,27
5.	Olej wazelinowy	1,00
6.	Wersenian dwusodowy	0,05
7.	Gliceryna	2,00
8.	Dimetikon (Silikon)	1,00
9.	Olej wazelinowy	17,00
10.	p-hydroksybenzoesan metylu (środek konserwujący)	0,90
11.	Kwas rozmarynowy zamknięty (30% czystej substancji)	0,04
12.	Tioprolina	0,001
13.	Woda	do 100

P r z y k ł a d 6 - Krem nawilżający

Lp.	Nazwa składnika	Zawartość [% wag.]
1	2	3
1.	Alkohol cetearylowy (alkohol tłuszczowy)	4,00
2.	Ceteareth-20 (Emulgator)	2,00
3.	Olej parafinowy	3,00

PL 220 399 B1 ciąg dalszy

1	2	3
4.	Wersenian dwusodowy	0,02
5.	PEG8; Tokoferol; palmitynian askorbylu; kwas askorbinowy (oraz) kwas cytrynowy (Przeciwutleniacze)	0,10
6.	Gliceryna	2,00
7.	Polimer usieciowany akrylan/C10-30 alkiloakrylan (Składnik zagęszczający)	0,12
8.	Palmitynian izopropylu	3,40
9.	Allantoina	0,10
10.	Trójetanoloamina (Regulator pH)	0,12
11.	Masło roślinne	1,80
12.	Olej sojowy	2,50
13.	Olej parafinowy	1,20
14.	p-hydroksybenzoesan metylu (środek konserwujący)	0,70
15.	Wazelina	3,50
16.	Dimetikon (Silikon)	1,00
17.	Kwas rozmarynowy zamknięty (30% czystej substancji)	0,09
18.	Tioprolina	0,0001
19.	Woda	do 100

Próby biologiczne

I. Test na zdolność zmiatania rodnika DPPH (właściwości przeciwutleniających) metodą elektronowego rezonansu paramagnetycznego EPR.

1.1. Opis próby

Rodnik 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylowy DPPH okazał się bardzo dobrym testerem właściwości antyutleniających, zwłaszcza polifenoli. DPPH w wyniku reakcji ze związkami zawierającymi wiązania C-H, N-H, O-H, S-H występuje jako akceptor wodoru i przekształca się w difenylopikrylohydrazynę. Do tej pory ukazało się wiele prac opisujących zastosowanie tego rodnika, w tym np. Ratz-Lyko A. i in. „Methods for evaluation of cosmetics antioxidant capacity” „Skin Research and technology” 2011, publ. 9 października 2011, Kusznierewicz B. i in. „Metody oznaczania in vitro właściwości przeciwutleniających próbek żywności” Cz. II Bromat. Chem. Toksykol 2006, 36: 261-270 Vertuani S. i in., oraz „Determination of antioxidant efficacy of cosmetic formulations by non-invasive measurements” Skin Res. Technol. 2003, 9: 245-253.

1.2. Wykonanie pomiarów - Technika pomiaru EPR

Pomiary wykonano na spektrometrze Magnettech Miniscope MS200, promieniowanie o częstości 9.3 GHz (pasmo X), cyfrowy sygnał z detektora mikrofal poddawany jest obróbce komputerowej.

Parametry pomiaru:

czas pomiaru 20 s Bo = 333,34 mT AB = 7,5 mT temp. pokojowa 22°C

1.3. Preparatyka

Do wyznaczenia pojemności antyoksydacyjnej TE przygotowano roztwory TioP (tioprolina w postaci odczynnika chemicznego (Merck)) i KR (kwas rozmarynowy w postaci surowca kosmetycznego (Basf)), o stężeniu 0,60 mg/ml w mieszaninie aceton-woda 1:1 (v/v). Przygotowane roztwory zmieszano z acetonowym roztworem rodnika DPPH (stężenie 0,45 mg/ml) w stosunku objętościowym 1:4. Próbki szczelnie zamknięto i pozostawiono na 1 h, mieszając co 15 min. Następnie wykonano pomiary EPR. Dla każdego preparatu procedurę powtórzono trzykrotnie. W celu określenia potencjalnego efektu synergicznego wykonano analogiczny eksperyment dla równoobjętościowej mieszaniny roztworów TioP i KR (0,5:0,5:4). Obliczono pojemność antyoksydacyjną badanych preparatów w przeliczeniu na

PL 220 399 B1 gram preparatu jako równoważniki wzorcowego antyoksydantu - Troloksu (mmol Troloksu na 1 g substancji lub 1 g mieszaniny; TE) i wyznaczono wartość średnią dla każdego preparatu. Większa wartość oznacza większą zdolność zmiatania rodnika.

I.4. Wyniki

Próbka	Pojemność antyoksydacyjna
(mg/ml)	(TE)/g produktu
TioP	0,69
KR	3,36
TioP-KR	2,83

I.4.1. Metoda Kulla

Do oceny wyników pod względem występowania synergii zastosowano równanie Kulla, opracowane i opublikowane w roku 1961 przez F.C. Kulla i in. z Research Department CIBA Pharmaceutical Products (New Jersey). Zastosowanie równania Kulla do oceny synergii dwóch lub większej liczby surowców kosmetycznych w kompleksie patrz David C. Steinberg, Measuring Synergy, C&T 2000, tom 115, nr 11; Dębowska R. i in.. Synergistic effect of three active cosmetic ingredients on human skin cell cultures. 14-th EADV Conference, Londyn 2005.

Równanie Kulla:

^wa ' TEą+b TE_a ^WB ' TEą+b TE~b gdzie:

w_A oznacza ułamek wagowy substancji TioP wB oznacza ułamek wagowy substancji KR

TE_a oznacza pojemność antyoksydacyjną substancji TioP przy ułamku wagowym tej substancji TEB oznacza pojemność antyoksydacyjną substancji KR przy ułamku wagowym tej substancji TEA+B oznacza pojemność antyoksydacyjną mieszaniny substancji TioP i KR

Wartość X większa od 1 wskazuje na działanie synergistyczne, a mniejsza od 1 wskazuje na działanie antagonistyczne. W przypadku badanych substancji wynosi ona: 2,47.

I.4.2. Metoda Hidalgo

Niezależnie, od oceny wyników pod względem występowania synergii zastosowano także równanie Hidalgo,

ES% = ' TE_a+b - (TE_a + TEg) TE_a + TEg

100 opracowane dla oceny właściwości antyoksydacyjnych substancji i opublikowane w roku 2010 przez Hidalgo M. i in. w Food Chemistry 121 (2010) 691-696.

Mieszanina roztworów wykazuje silny efekt synergiczny wynoszący +39,75%, zgodnie z równaniem Hidalgo.

II. Badanie proliferacji keratynocytów

Komórki hodowano przez 24 godz. w standardowym podłożu RPMI z antybiotykami i glutaminą, ₂ uzupełnionym 10% surowicą FCS. Następnie naświetlano komórki UVB=0,030 J/m², t=60 sek., i stymulowano badanymi substancjami w różnych stężeniach przez 24 godz. Żywotność komórek oceniono spektrofotometrycznie, testem MTT (testem redukcji pobranej przez komórki soli tetrazolowej MTT).

11.1. Test MTT

Test MTT jest testem kolorymetrycznym służącym do ilościowej oceny proliferacji komórek w odpowiedzi na różnorodne czynniki oraz potencjonalnego efektu cytotoksycznego i cytostatycznego tychże czynników. Jest on metodą powszechnie stosowaną np. przy ocenie cytotoksyczności substancji aktywnych o potencjalnym zastosowaniu w kosmetyce.

11.2. Zasada oznaczenia

MTT jest solą diazolową pobieraną przez komórki i redukowaną przez obecną w mitochondriach dehydrogenazę bursztynianową - jeden z enzymów łańcucha oddechowego aktywny tylko w żywych komórkach. MTT ulega redukcji do nierozpuszczalnego w wodzie formazanu, który gromadzi

PL 220 399 B1 się we wnętrzu komórek. Do pomiarów usuwano pożywkę znad komórek i dodawano roztwór MTT (100 μΐ/studzienkę) sporządzony w płynie hodowlanym DMEM w stężeniu 0,5 mg/ml. Następnie komórki umieszczano na 2 godziny w 37°C, 5% CO₂. Po tym czasie usuwano roztwór MTT znad komórek i dodawano do studzienki po 100 μl izopropanolu zakwaszonego 5 mM HCl w celu upłynnienia błon komórkowych oraz kryształków formazanu. Intensywność pojawiającego się fioletowego zabarwienia jest wprost proporcjonalna do ilości wytworzonego formazanu, która koreluje z ilością metabolicznie aktywnych komórek w hodowli. Pomiaru ilości formazanu dokonuje się spektrofotometrycznie w czytniku do mikropłytek przy długości fali świetlnej 595 nm względem ślepej próby (izopropanol zakwaszony 5 mM HCl). Test MTT z ww. surowcami wykonano trzykrotnie (po 3 powtórzenia każdej kombinacji).

III. Wyniki badań biologicznych

III.1. Badanie przeżywalności komórek naskórka po napromieniowaniu UVB dla połączenia kwas rozmarynowy (KR) i tioprolina (TioP)

Żywotność komórek oceniono spektrofotometrycznie, testem MTT. Zarówno pojedynczo stosowane substancje, jak i w połączeniu wykazują korzystny efekt na keratynocyty - komórki wykazywały wyższy stopień przeżywalności po naświetlaniu UVB, a następnie po potraktowaniu testowanymi substancjami przez 24 godz., niż komórki kontrolne naświetlone w tych samych warunkach i nie poddane działaniu substancji po naświetleniu.

₂

Żywotność komórek jest wyższa o 1% w komórkach naświetlonych UVB (UVB = 0,030 J/m², t = 60 sek.), a następnie poddanych działaniu tioproliny w stężeniu 0,00001 mg/ml przez 24 godz., niż komórek kontrolnych naświetlonych UVB i nie potraktowanych substancją po naświetleniu.

₂

Żywotność komórek jest wyższa o 7,2% w komórkach naświetlonych UVB (UVB = 0,030 J/m , t = 60 sek.), a następnie poddanych działaniu kwasu rozmarynowego w stężeniu 0,01 mg/ml przez 24 godz., niż komórek kontrolnych naświetlonych UVB i nie potraktowanych substancją po naświetleniu.

Wykazano, że kompozycja tioproliny i kwasu rozmarynowego wykazuje efekt synergiczny - przeżywalność keratynocytów po naświetlaniu w warunkach jw., a następnie poddanych działaniu kompozycji tioproliny i kwasu rozmarynowego (w stężeniu odpowiednio 0,00001 i 0,01 mg/ml) jest wyższa o 20% niż komórek kontrolnych (naświetlanych i nie poddanych działaniu substancji) oraz komórek naświetlanych i poddanych działaniu substancji stosowanych pojedynczo. Wykonano cztery niezależne eksperymenty, w których uzyskano efekt synergii.

Efekt synergii równy 1,1305 wyliczono przy zastosowaniu równania Kulla.

Keratynocyty, linia KB	Żywotność komórek (test MTT), wartość OD (opitcal density) przy długości fali 595 nm	% zwiększenia przeżywalności w stosunku do kontroli
Komórki kontrolne naświetlone UVB 0,030 J/m2, t=60 sek.	0,195	100%
Komórki poddane działaniu kwasu rozmarynowego 0,01 mg/ml po naświetlaniu UVB, przez 24 godz.	0,207	107,2%
Komórki poddane działaniu tioproliny 0,00001 mg/ml po naświetlaniu UVB, przez 24 godz.	0,197	101%
Komórki poddane działaniu połączenia tioproliny i kwasu rozmarynowego (o stężeniach odpowiednio 0,00001 i 0,01 mg/ml) po naświetlaniu UVB, przez 24 godz.	0,234	120%

III.2. Badania in vitro

W warunkach in vitro przebadano, na linii komórkowej naskórka KB, po naświetlaniu UVB, zarówno pojedyncze substancje, jak i ich połączenia w różnych stężeniach.

Najskuteczniejsze połączenie wykazujące efekt synergii, uzyskano dla połączenia TioP i KR o stężeniach odpowiednio 0,00001 i 0,01 mg/ml. Niemniej jednak połączenie TioP i KR o stężeniach odpowiednio 0,0001 i 0,1 mg/ml również wykazuje efekt synergii, który wynosi 1,0015 oraz w doświadczeniu gdzie występowało połączenie TioP i KR o stężeniach odpowiednio 0,000001 i 0,001 mg/ml wykazano efekt synergii wynoszący 1,1273.

W poniższej tabeli podano ocenę zdolności proliferacyjnych komórek naskórka poddanych działaniu substancji.

PL 220 399 B1

Substancje aktywne i stężenie (w mg/ml)	MTT (% przeżywalności w stosunku do kontroli)	Synergia wyliczona metodą Kulla
Kontrola		100%
tioprolina	0,0001	99,5%
tioprolina	0,00001	101,0%
tioprolina	0,000001	97,9%
kwas rozmarynowy	0,1	107,2%
kwas rozmarynowy	0,01	106,2%
kwas rozmarynowy	0,001	105,3%
tioprolina i kw. rozmarynowy	0,0001 i 0,1	107,2%	1,0015
tioprolina i kw. rozmarynowy	0,00001 i 0,01	120,0%	1,1305
tioprolina i kw. rozmarynowy	0,000001 i 0,001	105,5%	1,1273

Najskuteczniejsze połączenie substancji uzyskano w mieszaninie związków w proporcji 0,001:1 (TioP:KR).

IV. Wniosek ogólny:

Zarówno pojedynczo stosowane substancje, jak i w połączeniu wykazują pozytywny efekt na komórki - komórki wykazują wyższy stopień przeżywalności po potraktowaniu substancjami niż komórki kontrolne w tych samych warunkach i nie poddane działaniu substancji.

Claims (16)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera tioprolinę i kwas rozmarynowy w synergicznie skutecznej ilości w proporcji od 0,00001:1 do 1:0,00001.
2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera tioprolinę i kwas rozmarynowy w proporcji od 0,0001:1 do 1:0,0001, korzystniej od 0,01:1 do 1:0,01, w szczególności od 0,1:1 do 1:0,1, a zwłaszcza 0,001:1.
3. 3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera tioprolinę w ilości 0,0001 i kwas rozmarynowy w ilości 0,1, korzystnie tioprolinę w ilości 0,000001 i kwas rozmarynowy w ilości 0,001, najkorzystniej tioprolinę w ilości 0,00001 i kwas rozmarynowy w ilości 0,01 mg/ml.
4. 4. Preparat zawierający substancję czynną oraz kosmetycznie dopuszczalne zaróbki, nośniki i substancje dodatkowe, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera tioprolinę i kwas rozm arynowy w synergicznie skutecznej ilości w proporcji od 0,00001:1 do 1:0,00001.
5. 5. Preparat według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera tioprolinę i kwas rozmarynowy w proporcji od 0,00001:1 do 1:0,00001, korzystniej od 0,01:1 do 1:0,01, w szczególności od 0,1:1 do 1:0,1, a zwłaszcza 0,001:1.
6. 6. Preparat według któregokolwiek z zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że zawiera tioprolinę w ilości od 0,00001% do 3% wagowych, w przeliczeniu na całość preparatu i kwas rozmarynowy w ilości od 0,02% do 0,09% wagowych, w przeliczeniu na całość preparatu.
7. 7. Preparat według któregokolwiek z zastrz. 4-6, znamienny tym, że jest w postaci kremu, balsamu, lotionu, aerozolu, żelu, fluidu, korektora, emulsji O/W i W/O, toniku, żeli myjących, szamponów, pianek, a także mleczek, galaretek, past, maści, plastrów i systemów transdermalnych.
8. 8. Preparat według któregokolwiek z zastrz. 4-7, znamienny tym, że stanowi preparat kosmetyczny.
9. 9. Zastosowanie kosmetyczne kompozycji zdefiniowanej w zastrz. 1 do spowalniania, przeciwdziałania, zapobiegania procesowi starzenia zewnątrzpochodnego.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 9 do ochrony skóry przed promieniowaniem UV, substancjami chemicznymi, wolnymi rodnikami i czynnikami środowiskowymi.
11. 11. Zastosowanie według zastrz. 9 do pielęgnacji skóry po naświetlaniu promieniowaniem UVA i/lub UVB.

    PL 220 399 B1
12. 12. Zastosowanie według zastrz. 9 do ochrony skóry osób nałogowo palących i/lub biernych palaczy.
13. 13. Zastosowanie według zastrz. 9 do ochrony skóry przed wolnymi rodnikami generowanymi w komórkach i/lub uwalnianymi w atmosferze.
14. 14. Zastosowanie według zastrz. 9 do ochrony skóry osób z cerą naczyniową i/lub trądzikiem różowatym.
15. 15. Sposób kosmetycznego spowalniania, przeciwdziałania, zapobiegania procesowi starzenia zewnątrzpochodnego skóry, znamienny tym, że skórę traktuje się skuteczną ilością kompozycji zdefiniowanej w zastrz. 1 i/lub preparatu zdefiniowanego w zastrz. 4.
16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że skórę traktuje się przed, w trakcie i/lub po naświetlaniu promieniowaniem UV, traktowaniu substancjami chemicznymi, działaniu czynników środowiskowych i/lub wolnych rodników.