PL220789B1 - Warianty endonukleazy restrykcyjnej MwoI o zmienionej specyficzności substratowej - Google Patents
Warianty endonukleazy restrykcyjnej MwoI o zmienionej specyficzności substratowejInfo
- Publication number
- PL220789B1 PL220789B1 PL395923A PL39592311A PL220789B1 PL 220789 B1 PL220789 B1 PL 220789B1 PL 395923 A PL395923 A PL 395923A PL 39592311 A PL39592311 A PL 39592311A PL 220789 B1 PL220789 B1 PL 220789B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mwoi
- mwol
- variants
- variant
- much
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 41
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims description 27
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 title description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 10
- 102220476867 Developmental pluripotency-associated protein 3_A330R_mutation Human genes 0.000 claims description 85
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 82
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 82
- 101000892463 Methanothermobacter wolfeii Type II restriction enzyme MwoI Proteins 0.000 claims description 79
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 37
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 28
- 101710188297 Trehalose synthase/amylase TreS Proteins 0.000 claims description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims description 2
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 40
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 11
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 241001302037 Methanothermobacter wolfeii Species 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 4
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- YLJHCWNDBKKOEB-IHRRRGAJSA-N Glu-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O YLJHCWNDBKKOEB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 3
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 3
- VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJPNNYWHXGADJG-GUBZILKMSA-N Arg-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IJPNNYWHXGADJG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- XLWSGICNBZGYTA-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XLWSGICNBZGYTA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- NKBQZKVMKJJDLX-SRVKXCTJSA-N Arg-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NKBQZKVMKJJDLX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- OLGCWMNDJTWQAG-GUBZILKMSA-N Asn-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O OLGCWMNDJTWQAG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- YVXRYLVELQYAEQ-SRVKXCTJSA-N Asn-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N YVXRYLVELQYAEQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- FBODFHMLALOPHP-GUBZILKMSA-N Asn-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FBODFHMLALOPHP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N Asn-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- WCFCYFDBMNFSPA-ACZMJKKPSA-N Asp-Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O WCFCYFDBMNFSPA-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ORRJQLIATJDMQM-HJGDQZAQSA-N Asp-Leu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O ORRJQLIATJDMQM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- JUWISGAGWSDGDH-KKUMJFAQSA-N Asp-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JUWISGAGWSDGDH-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- ITGFVUYOLWBPQW-KKHAAJSZSA-N Asp-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ITGFVUYOLWBPQW-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KGIHMGPYGXBYJJ-SRVKXCTJSA-N Cys-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CS KGIHMGPYGXBYJJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXAUHIRMWXQRKI-XHNCKOQMSA-N Glu-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O LXAUHIRMWXQRKI-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 2
- PCBBLFVHTYNQGG-LAEOZQHASA-N Glu-Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N PCBBLFVHTYNQGG-LAEOZQHASA-N 0.000 description 2
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N Glu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- SJJHXJDSNQJMMW-SRVKXCTJSA-N Glu-Lys-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O SJJHXJDSNQJMMW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- YGLCLCMAYUYZSG-AVGNSLFASA-N Glu-Lys-His Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 YGLCLCMAYUYZSG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- HRBYTAIBKPNZKQ-AVGNSLFASA-N Glu-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O HRBYTAIBKPNZKQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- YTSVAIMKVLZUDU-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YTSVAIMKVLZUDU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- BXICSAQLIHFDDL-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BXICSAQLIHFDDL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- BDHUXUFYNUOUIT-SRVKXCTJSA-N His-Asp-Lys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BDHUXUFYNUOUIT-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- FJUKMPUELVROGK-IHRRRGAJSA-N Leu-Arg-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N FJUKMPUELVROGK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- ZURHXHNAEJJRNU-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ZURHXHNAEJJRNU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- FGNQZXKVAZIMCI-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N FGNQZXKVAZIMCI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- UCDHVOALNXENLC-KBPBESRZSA-N Leu-Gly-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UCDHVOALNXENLC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- HVHRPWQEQHIQJF-AVGNSLFASA-N Leu-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HVHRPWQEQHIQJF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- MPGHETGWWWUHPY-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN MPGHETGWWWUHPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- IWWMPCPLFXFBAF-SRVKXCTJSA-N Lys-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IWWMPCPLFXFBAF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- NJNRBRKHOWSGMN-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJNRBRKHOWSGMN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- OIQSIMFSVLLWBX-VOAKCMCISA-N Lys-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OIQSIMFSVLLWBX-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N Lys-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- LNMKRJJLEFASGA-BZSNNMDCSA-N Lys-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LNMKRJJLEFASGA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- YSPZCHGIWAQVKQ-AVGNSLFASA-N Lys-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN YSPZCHGIWAQVKQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- LMMBAXJRYSXCOQ-ACRUOGEOSA-N Lys-Tyr-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O LMMBAXJRYSXCOQ-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 2
- HMZPYMSEAALNAE-ULQDDVLXSA-N Lys-Val-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O HMZPYMSEAALNAE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N Phe-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- KBVJZCVLQWCJQN-KKUMJFAQSA-N Phe-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KBVJZCVLQWCJQN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XROLYVMNVIKVEM-BQBZGAKWSA-N Pro-Asn-Gly Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O XROLYVMNVIKVEM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- XFFIGWGYMUFCCQ-ULQDDVLXSA-N Pro-His-Tyr Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1[NH2+]CCC1)CC1=CN=CN1 XFFIGWGYMUFCCQ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N Pro-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N Pro-Phe Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N Pro-Thr-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DFTCYYILCSQGIZ-GCJQMDKQSA-N Thr-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DFTCYYILCSQGIZ-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 2
- SWIKDOUVROTZCW-GCJQMDKQSA-N Thr-Asn-Ala Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N)O SWIKDOUVROTZCW-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 2
- NCXVJIQMWSGRHY-KXNHARMFSA-N Thr-Leu-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O NCXVJIQMWSGRHY-KXNHARMFSA-N 0.000 description 2
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 2
- BPGDJSUFQKWUBK-KJEVXHAQSA-N Thr-Val-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 BPGDJSUFQKWUBK-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 2
- UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- PZXUIGWOEWWFQM-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PZXUIGWOEWWFQM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- LOOCQRRBKZTPKO-AVGNSLFASA-N Tyr-Glu-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 LOOCQRRBKZTPKO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- ARJASMXQBRNAGI-YESZJQIVSA-N Tyr-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N ARJASMXQBRNAGI-YESZJQIVSA-N 0.000 description 2
- JLKVWTICWVWGSK-JYJNAYRXSA-N Tyr-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JLKVWTICWVWGSK-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- KGSDLCMCDFETHU-YESZJQIVSA-N Tyr-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O KGSDLCMCDFETHU-YESZJQIVSA-N 0.000 description 2
- CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 2
- XJPXTYLVMUZGNW-IHRRRGAJSA-N Tyr-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XJPXTYLVMUZGNW-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- SZEIFUXUTBBQFQ-STQMWFEESA-N Tyr-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O SZEIFUXUTBBQFQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- COYSIHFOCOMGCF-WPRPVWTQSA-N Val-Arg-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CCCN=C(N)N COYSIHFOCOMGCF-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 2
- COYSIHFOCOMGCF-UHFFFAOYSA-N Val-Arg-Gly Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CCCN=C(N)N COYSIHFOCOMGCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMPCGRFEZTWIF-IHRRRGAJSA-N Val-Leu-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O AEMPCGRFEZTWIF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- MHHAWNPHDLCPLF-ULQDDVLXSA-N Val-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)CC1=CC=CC=C1 MHHAWNPHDLCPLF-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 108010054813 diprotin B Proteins 0.000 description 2
- 108010049705 endonuclease R Proteins 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 2
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 2
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013030 3-step procedure Methods 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- RCFGLXMZDYNRSC-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RCFGLXMZDYNRSC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ALHMNHZJBYBYHS-DCAQKATOSA-N Asn-Lys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ALHMNHZJBYBYHS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- QYRMBFWDSFGSFC-OLHMAJIHSA-N Asn-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O QYRMBFWDSFGSFC-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- 101001047514 Bos taurus Lethal(2) giant larvae protein homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100289888 Caenorhabditis elegans lys-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000028937 DNA protection Effects 0.000 description 1
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- WNRZUESNGGDCJX-JYJNAYRXSA-N Glu-Leu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O WNRZUESNGGDCJX-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N Glu-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KJBGAZSLZAQDPV-KKUMJFAQSA-N Glu-Phe-Arg Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N KJBGAZSLZAQDPV-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- JDUKCSSHWNIQQZ-IHRRRGAJSA-N Glu-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JDUKCSSHWNIQQZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- QNJNPKSWAHPYGI-JYJNAYRXSA-N Glu-Phe-Leu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QNJNPKSWAHPYGI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- RNVUQLOKVIPNEM-BZSNNMDCSA-N His-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)O RNVUQLOKVIPNEM-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BIZNDKMFQHDOIE-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 BIZNDKMFQHDOIE-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- YNNPKXBBRZVIRX-IHRRRGAJSA-N Lys-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YNNPKXBBRZVIRX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- UDXSLGLHFUBRRM-OEAJRASXSA-N Lys-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O UDXSLGLHFUBRRM-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101100185228 Methanothermobacter wolfeii mwoIM gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480439 Methanothermobacter wolfeii mwoIR gene Proteins 0.000 description 1
- 101150101095 Mmp12 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 1
- IWRZUGHCHFZYQZ-UFYCRDLUSA-N Phe-Arg-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 IWRZUGHCHFZYQZ-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- XNQMZHLAYFWSGJ-HTUGSXCWSA-N Phe-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XNQMZHLAYFWSGJ-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 1
- -1 Phospho Chemical class 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-NJFSPNSNSA-N Phosphorus-33 Chemical compound [33P] OAICVXFJPJFONN-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- SKHPKKYKDYULDH-HJGDQZAQSA-N Thr-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SKHPKKYKDYULDH-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010064978 Type II Site-Specific Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- OSXNCKRGMSHWSQ-ACRUOGEOSA-N Tyr-His-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O OSXNCKRGMSHWSQ-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical class [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku są nowe enzymy restrykcyjne typu II (REazy), warianty enzymu Mwol, o zmienionej specyficzności substratowej względem enzymu wyjściowego, sposób ich wytwarzania oraz sposoby uzyskiwania wariantów termofilnych REaz o dowolnie zmienionej specyficzności substratowej względem enzymów wyjściowych.
REazy stanowią jedno z najczęściej używanych narzędzi biologii molekularnej, a co za tym idzie, znajdują wiele zastosowań w biotechnologii oraz w podstawowych badaniach naukowych we wszystkich dziedzinach nauk biomedycznych. To powszechne stosowanie REaz wynika z wyróżniającej je na tle wszystkich innych znanych endonukleaz zdolności do przecinania dwuniciowego DNA wyłącznie w obrębie lub w bezpośrednim sąsiedztwie ściśle określonej krótkiej sekwencji nukleotydowej. Dzięki tej właściwości fragmentacja dowolnej homogennej próbki DNA prowadzi do uzyskania stałego, zdefiniowanego zestawu fragmentów, które po rozdziale elektroforetycznym generują charakterystyczny wzór prążków umożliwiający szybką i pewną identyfikację DNA.
REazy występują zazwyczaj w parach z metylotransferazami DNA (MTazami), tworząc systemy restrykcji-modyfikacji (RM). MTazy rozpoznają te same sekwencje DNA, co występujące z nimi REazy i chemicznie modyfikują nukleotydy przez metylację w obrębie rozpoznanej sekwencji, w ten sposób zabezpieczając DNA przed przecięciem ich przez REazę. Umożliwia to systemowi RM zabezpieczenie DNA w komórce gospodarza przed zniszczeniem i odróżnienie go od niezmodyfikowanego (lub zmodyfikowanego w inny sposób) obcego DNA.
Większość REaz rozpoznaje sekwencje palindromiczne lub pseudopalindromiczne o długości
4-8 par zasad. Mogą mieć one charakter ciągły lub być przerwane 1-7 parami zasad, których sekwencja nie jest rozpoznawana i nie wpływa na aktywność enzymu. Również dokładne położenie miejsc cięcia oraz geometria generowanych końców jest zazwyczaj ściśle określona dla każdej REazy. Te właściwości umożliwiają wykorzystywanie produktów cięcia do bardzo precyzyjnie zaplanowanych manipulacji in vitro, takich jak rekombinacja DNA stanowiąca podstawę inżynierii genetycznej, czy wprowadzanie znakowania izotopem radioaktywnym pojedynczej pozycji nukleotydowej.
Obecnie znanych jest ponad 3800 REaz (http://rebase.neb.com/rebase/). Mimo tak ogromnej liczby reprezentują one zaledwie ok. 300 różnych specyficzności sekwencyjnych. Tymczasem ze względu na sposoby ich wykorzystania pożądana jest dostępność jak największej liczby specyficzności (np. odcinek 6-nukleotydowy mogą tworzyć 4032 różne sekwencje). Niestety liczba nowo identyfikowanych REaz o nowych nieznanych uprzednio specyficznościach jest minimalna. W całym roku 2010 mimo postępów w sekwencjonowaniu genomów prokariotycznych zidentyfikowano zaledwie 13 enzymów o przypuszczalnych nowych specyficznościach. Co więcej dotychczas żadne z tych przewidywań nie zostało potwierdzone doświadczalnie.
W związku z tym od wielu lat podejmowane są próby wzbogacenia zestawu specyficzności REaz za pomocą inżynierii znanych już enzymów. Pierwsze systematyczne, choć zakończone niepowodzeniem, próby to racjonalnie projektowane zmiany zmierzające do zmiany specyficzności EcoRV (Jeltsch et al., (1996) Trends Biotechnol 14, 235-238; Lanio et al., (2000) Protein Eng 13, 275-281). Pewne sukcesy osiągnięte zostały dla enzymów BsoBI i EcoRV, gdzie przeprowadzono przeszukiwanie produktów randomizacji kilku wybranych pozycji aminokwasowych w kierunku zmienionej specyficzności (Schottler et al., (1998) Eur J Biochem 258, 184-191; Wenz et al., (1998) Biochemistry 37, 2234-2242; Zhu et al., (2003) J Mol Biol 330, 359-372).
Istotny postęp w pracach nad inżynierią specyficzności REaz stanowiło wprowadzenie systemu selekcji enzymów o określonej specyficzności w układzie in vivo (Samuelson et al., (2006) Nucleic Acids Res 34, 796-805; Samuelson and Xu, (2002) J Mol Biol 319, 673-683). Umożliwia on selekcję/różnicowanie wariantów danego enzymu, które wykazują określoną zmienioną specyficzność w 3-etapowej procedurze w odpowiednich gospodarzach bakteryjnych. Wykorzystując ten system udało się uzyskać warianty enzymów Notl i BstYI różniące się specyficznością od enzymów wyjściowych. Poważnym ograniczeniem tej metody jest oparcie selekcji na specyficzności metylotransferazy. W pierwszym etapie wykorzystuje się wybraną metylotransferazę, inną od metylotransferazy wyjściowego systemu RM, do selekcji REaz o nowej specyficzności identycznej lub pokrywającej się częściowo ze specyficznością stosowaną do selekcji metylotransferazy. Powoduje to, że za pomocą tej techniki można uzyskać wyłącznie REazy o znanych już specyficznościach odpowiadających specyficznościom MTaz stosowanych w selekcji. Aby tą drogą uzyskać REazę o nowej specyficzności najPL 220 789 B1 pierw trzeba uzyskać drogą inżynierii MTazę o odpowiedniej nowej specyficzności, co jest trudnym i czasochłonnym zadaniem.
Dwa największe sukcesy w inżynierii specyficzności REaz dotyczą przedstawicieli dość nietypowych podgrup tych enzymów. Powodzeniem zakończyła się próba zmiany specyficzności enzymu Eco57I prowadząca do wariantu rozpoznającego większe spektrum sekwencji (Rimseliene et al., (2003) J Mol Biol 327, 383-391). Enzym ten należy do podgrupy IIC, a więc w jednym łańcuchu polipeptydowym zawiera zarówno domenę katalityczną REazy jak i MTazy, wykorzystujące jeden region odpowiedzialny za specyficzność sekwencyjną wspólną dla obu aktywności. Do zmiany specyficzności doprowadzono po inaktywacji domeny katalitycznej REazy, selekcjonując warianty zdolne do ochrony określonych nowych sekwencji przed innym enzymem restrykcyjnym. W wyselekcjonowanych w ten sposób wariantach o nowych specyficznościach sekwencyjnych przywracano aktywność endonukleazową wprowadzając rewersję pierwotnej mutacji.
Drugi warty odnotowania sukces dotyczy grupy REaz spokrewnionych z Mmel. Jest to grupa enzymów podgrupy IIC o wysokich podobieństwach sekwencji rozpoznająca różne 6-nukleotydowe sekwencje zawierające adeninę w pozycji 5. W tym przypadku dzięki analizie porównawczej powiązano specyficzności tych enzymów z kilkoma określonymi pozycjami aminokwasowymi, a następnie w sposób planowy wytworzono warianty o nowych specyficznościach niewystępujących naturalnie (Morgan et al., (2009) Nucleic Acids Res 37, 5208-522).
Jest kilka powodów, dla których inżynieria specyficzności REaz jest bardzo trudna. Po pierwsze w toku ewolucji enzymy te wytworzyły niezwykle rozbudowaną sieć oddziaływań ze swoimi substratami zapewniającą bardzo wysoką selektywność sekwencyjną. Zmiana tych oddziaływań jest niezwykle trudna i zazwyczaj prowadzi do inaktywacji enzymu. Drugim problemem jest ochrona komórek gospodarza przed działaniem wariantu enzymu o nowej specyficzności sekwencyjnej. W większości enzymów typu II metylotransferaza zapewniająca taką ochronę to odrębne białko i w związku z tym nadal zabezpiecza przed trawieniem tylko wyjściową rozpoznawaną sekwencję.
Znany jest enzym restrykcyjny Mwol wyizolowany z Methanobacterium wolfei, który rozpoznaje sekwencję DNA GC(N7)GC i przecina ją między N5 a N6. W patencie US 5,053,330 opisany jest sposób klonowania genu kodującego Mwol wraz z odpowiadającą mu MTazą oraz sposób wytwarzania tego enzymu.
Nie są znane naturalnie występujące ani uzyskane np. metodami inżynierii molekularnej enzymy warianty Mwol o zmienionej specyficzności, szczególnie o zawężonej specyficzności. Nie są również znane sposoby uzyskiwania enzymów termofilnych o bardzo niskiej aktywności w niższych temperaturach o zawężonej, rozszerzonej i/lub zmienionej specyficzności względem enzymów wyjściowych z wykorzystaniem bakterii gospodarzy mezofilnych bez konieczności równoczesnego klonowania metylotransfery lub jej inżynierowania w takim organizmie albo z wykorzystaniem MTaz do identyfikowania wariantów REaz, które uzyskały zdolność do trawienia sekwencji niechronionych przez naturalną MTaz.
Stąd celem wynalazku jest dostarczenie wariantu enzymu Mwol o zmienionej, korzystnie zawężonej specyficzności substratowej (specyficzności sekwencyjnej), rozpoznającego określony „podzbiór” sekwencji typu dzikiego.
Kolejnym celem wynalazku jest opisanie sposobów uzyskiwania termofilnych enzymów restrykcyjnych o dowolnie zmienionej specyficzności względem enzymów wyjściowych.
Przez „zawężenie specyficzności REazy rozumiemy takie zmiany, które powodują, że zmieniony enzym rozpoznaje miejsca o bardziej specyficznej sekwencji. W szczególności zawężenie specyficzności może polegać na tym, że nowy wariant rozpoznaje dłuższą sekwencję nukleotydową i w związku z tym wprowadza cięcia tylko w podzbiorze miejsc przecinanych przez enzym typu dzikiego.
Istota wynalazku dotyczy wariantów REazy R.MwoI, o zmienionej specyficzności względem enzymów wyjściowych, które przecinają podzbiory sekwencji typu dzikiego.
W jednym aspekcie wynalazek dotyczy wariantu REazy Mwol, który posiada zawężoną specyficzność substratową i zawiera substytucję wybraną spośród S310E, S310K lub S310R w stosunku do sekwencji aminokwasowej dzikiego Mwol przedstawionej na Sekw. Id. Nr 1, który dodatkowo zawiera substytucję A330R.
Wariant REazy Mwol korzystnie zawiera substytucję S310E i wykazuje preferowaną specyficzność sekwencyjną wobec dsDNA GCGN5CGC.
Wariant REazy Mwol korzystnie zawiera substytucję S310K i wykazuje preferowaną specyficzność sekwencyjną wobec dsDNA GCCN5GGC.
PL 220 789 B1
Wariant REazy Mwol korzystnie zawiera substytucję S310R i wykazuje preferowaną specyficzność sekwencyjną wobec dsDNA GCCN5GGC.
Wariant REazy Mwol korzystnie posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną jako Sekw. Id. Nr 2 albo jest kodowany przez sekwencję nukleotydową przedstawioną jako Sekw. Id. Nr 3.
Wynalazek dotyczy również konstruktu obejmującego sekwencję DNA kodującą wariant REazy
A330R,S310E
Mwol według wynalazku. Konstrukt korzystnie obejmuje sekwencję R.MwoIA330R,S310E przedstawioną na Sekw. Id. Nr 3.
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy wektora obejmującego wariant REazy Mwol według wynalazku albo konstrukt według wynalazku. Wynalazek dotyczy również komórki gospodarza obejmującej wektor według wynalazku. Preferowaną komórką gospodarza jest organizm mezofilny, korzystnie E. coli, korzystniej jest nim szczep E. coli ER2566 albo BL21(DE3).
Innym aspektem wynalazku jest sposób wytwarzania wariantu REazy Mwol, o zmienionej specyficzności względem enzymów wyjściowych według wynalazku, który obejmuje hodowlę komórki gospodarza według wynalazku w warunkach odpowiednich do wyrażania wariantu REazy Mwol.
W korzystnym sposobie wytwarzania hodowlę prowadzi się przy braku w komórce MTazy w niepermisywnej temperaturze, korzystnie w temperaturze około 25°C.
Opis wynalazku przedstawia również uzyskiwanie wariantu termofilnej REazy o zmienionej, korzystnie zawężonej, specyficzności substratowej, który obejmuje następujące etapy:
a) wybór termofilnej REazy,
b) mutagenezę sekwencji kodującej termofilną REazę i uzyskanie klonów do wprowadzenia do szczepu biorcy,
c) wprowadzenie uzyskanych klonów do ekspresyjnego mezofilnego szczepu biorcy bez MTazy,
d) ekspresję wariantów termofilnej REazy w niskiej temperaturze niepermisywnej dla aktywności enzymatycznej tej REazy,
e) analizę specyficzności sekwencyjnej uzyskanych wariantów termofilnej REazy,
f) wybór pożądanego wariantu termofilnej REazy o zmienionej, korzystnie zawężonej, specyficzności substratowej.
W korzystnym sposobie uzyskiwania wariantu termofilnej REazy etap mutagenezy b) jest mutagenezą ukierunkowaną poprzedzoną etapem analizy bioinformatycznej struktury termofilnej REazy oraz wyborem obszarów do zmiany przez mutagenezę ukierunkowaną. W korzystnym sposobie uzyskiwania wariantu termofilnej REazy po etapie d) a przed etapem e) następuje etap identyfikacji wytworzonych nieaktywnych wariantów termofilnej REazy, w którym:
i) wytwarza się szalki matrycowe z wariantami termofilnej REazy w niskiej temp. niepermisywnej, ii) hoduje się repliki szalki matrycowej z wariantami termofilnej REazy w wysokiej temp. permisywnej, iii) wybiera się do dalszej analizy specyficzności sekwencyjnej uzyskanych wariantów termofilnej REazy kolonie wykazujące wzrost w temp. niepermisywnej i brak wzrostu w temp. permisywnej.
W preferowanym sposobie temperatura niepermisywna jest równa około 25°C lub niższa, a temperatura permisywna jest równa około 42°C lub wyższa. W korzystnym sposobie ermofilna REaza ma optimum temperaturowe wynoszące około 50°C lub więcej oraz wykazuje niską aktywność dla dowolnej specyficzności sekwencyjnej, korzystnie poniżej 10% aktywności w temperaturze 37°C.
Przedstawiony jest również sposób uzyskiwania wariantu termofilnej REazy z wykorzystaniem MTazy do identyfikowania takich wariantów REazy, które uzyskały zdolność do trawienia sekwencji niechronionych przez naturalną MTazę, który to sposób obejmuje etapy:
a) wybór termofilnej REazy,
b) mutagenezę sekwencji kodującej termofilną REazę i uzyskanie klonów do wprowadzenia do szczepu biorcy,
c) wprowadzenie uzyskanych klonów do ekspresyjnego mezofilnego szczepu biorcy z wprowadzoną MTazą dla wyjściowej REazy,
d) wyrażanie wariantów termofilnej REazy w niskiej niepermisywnej temperaturze,
e) wytwarzanie szalki matrycowej z wariantami termofilnej REazy w niskiej temp. niepermisywnej,
f) hodowlę repliki szalki matrycowej z wariantami termofilnej REazy w wysokiej temp. permisywnej,
g) wybór do dalszej analizy specyficzności sekwencyjnej uzyskanych wariantów termofilnej REazy kolonii wykazujących wzrost w temp. niepermisywnej i brak wzrostu w temp. permisywnej,
h) analizę specyficzności sekwencyjnej uzyskanych wariantów termofilnej REazy o specyficzności sekwencyjnej nie chronionej przez naturalną MTaz,
PL 220 789 B1
i) wybór pożądanego wariantu termofilnej REazy, który uzyskał zdolność do trawienia sekwencji niechronionych przez naturalną MTazę. W takim korzystnym sposobie temperatura niepermisywna jest równa około 25°C lub niższa a temperatura permisywna jest równa około 42°C lub wyższa.
Ponadto korzystne jest w takim sposobie, jeśli termofilna REaza ma optimum temperaturowe wynoszące około 50°C lub więcej oraz wykazuje niską, korzystnie poniżej 10% aktywności w temperaturze 37°C dla dowolnej specyficzności sekwencyjnej.
Przedstawiona w niniejszym wniosku inżynieria specyficzności enzymów restrykcyjnych, w szczególności inżynieria specyficzności R.MwoI, stosuje dwa nowe rozwiązania pozwalające obejść trudności występujące w stanie techniki. W jednym z podejść zastosowanym dla uzyskania nowych wariantów R.MwoI nie usiłowaliśmy zmienić istniejącej specyficzności, a jedynie objąć nią dodatkową pozycję w centralnym regionie sekwencji, który nie jest rozpoznawany przez enzym typu dzikiego. W związku z tym wytworzyliśmy enzym rozpoznający określony „podzbiór” sekwencji typu dzikiego chronionych przed trawieniem w komórce gospodarza przez metylotransferazę typu dzikiego. Co więcej, ponieważ wykorzystana przez nas REaza ma optimum temperaturowe 60°C, a w temperaturze 25°C jej aktywność jest niewykrywalna, ekspresja tego enzymu jest możliwa nawet przy braku ochrony DNA gospodarza przed cięciem. Potwierdziliśmy to stosując ekspresję wariantów enzymu R.MwoI w układzie z MTazą i bez MTazy. Niespodziewanie, okazało się, że można wytworzyć nowe warianty termofilnych enzymów restrykcyjnych o dowolnie zmienionej specyficzności względem enzymów wyjściowych wykorzystując możliwość ich ekspresji w warunkach niepermisywnych w niskiej temperaturze.
Opisane przez nas sposoby uzyskiwania termofilnych enzymów restrykcyjnych o dowolnie zmienionej specyficzności, szczególnie zawężonej specyficzności względem enzymów wyjściowych oraz metoda nadprodukcji takich wariantów w obniżonej temperaturze, likwiduje cytotoksyczność takich REaz w nieobecności ochrony DNA gospodarza zapewnianej w warunkach naturalnych przez MTazę o specyficzności sekwencyjnej identycznej z wyjściowym enzymem restrykcyjnym. W przypadku uzyskania REaz o zmienionej specyficzności niechronionej przez MTazę w dotychczas istniejących systemach, ekspresja uzyskanych wariantów musi być ograniczona do niskiego poziomu. Zastosowana przez nas ekspresja w niskiej temperaturze przy nieobecności MTazy umożliwia wyeliminowanie cytotoksyczności spowodowanej aktywnością REazy w proponowanym rozwiązaniu i pozwala na ekspresję pochodnych enzymów termofilnych oraz ich wariantów o dowolnej specyficzności sekwencyjnej w temperaturze pokojowej, w szczególności R.MwoI i jego wariantów. Takie termofilne REazy, które mogą być uzyskiwane przedstawionymi sposobami uzyskiwania przedstawionymi w opisie wynalazku albo wytwarzane metodą nadprodukcji w obniżonej temperaturze, będą się charakteryzować optimum temperaturowym wynoszącym około 50°C lub wyższym niż 50°C oraz wykazywać niską aktywność, korzystnie poniżej 10% aktywności w temperaturze 37°C dla dowolnej specyficzności sekwencyjnej. W szczególności taki sposób uzyskiwania wariantów termofilnych REaz będzie obejmował etapy:
a) wyboru termofilnej REazy do inżynierowania;
b) mutagenezy genu kodującego REazę, która może być realizowana przykładowo jako mutageneza losowa albo mutageneza ukierunkowana. Przy mutagenezie ukierunkowanej należy wybrać obszar REazy, który ma być zmieniony, co można przeprowadzić przykładowo stosując analizę bioinformatyczną. Przez taką analizę wybranego obiektu inżynierii będą wskazane pozycje aminokwasowe, których mutacja np. substytucja może zmienić specyficzność sekwencyjną REazy;
c) wprowadzenie wygenerowanych klonów bezpośrednio do mezofilnego szczepu ekspresyjnego bez MTazy;
d) ekspresję wariantów termofilnej REazy w niskiej temp. niepermisywnej;
e) analizę specyficzności sekwencyjnej uzyskanych wariantów;
f) wyboru pożądanego wariantu termofilnej REazy.
Ponadto taki sposób uzyskiwania klonów zmutowanych sekwencji kodujących termofilne REazy może być stosowany w innych strategiach inżynierii. W szczególności przy wykorzystaniu różnych temperatur inkubacji można od razu zidentyfikować warianty nieaktywne (1), a wykorzystując szczep ekspresyjny zawierający wyjściową MTazę również warianty, które uzyskały zdolność do trawienia sekwencji niechronionych przez naturalną MTazę (2). W pierwszym przypadku transformanty po mutagenezie należy wysiać na dwie szalki z zachowaniem pozycji każdego klonu (np. techniką „replica plating”), a następnie inkubować w dwu różnych reżimach: w temperaturze permisywnej i niepermisywnej dla danej REazy (np. odpowiednio 42°C i 25°C). W drugim przypadku biorcą mieszaniny transformacyjnej jest szczep zawierający oryginalną MTazę. Do dalszych badań wybiera się tylko te klony,
PL 220 789 B1 które wyrosną wyłącznie w warunkach niepermisywnych, a więc w temperaturze 25°C, w której nie obserwuje się cytotoksycznego działania REazy.
Do przykładowych REaz termofilnych o aktywnościach w 37°C równych lub mniejszych od 10% aktywności w warunkach optymalnych, dla których opisane sposoby uzyskiwania wariantów termofilnych REaz według wynalazku mogą być stosowane należą: ApeKI (GCWGC), BsiHKAI (GWGCWC),
BspQI (GCTCTTC), BssKI (CCNGG), BstaAPI (GCAN5TGC), BstBI (TTCGAA), PspGI (CCWGG), Sfil (GGCCN5GGCC), Smll (CTYRAG), TaqI (TCGA), Tfil (GAWTC), Tlil (CTCGAG), Tsp451 (GTSAC), Tsp509I (AATT), TspRI (CASTG), Tthllll (GACN3GTC), BseDI (CCNNGG), BseJI (GATN4ATC), BseNI (ACTGG), BseXI (GCAGC), Smol (CTRYAG), Taal (ACNGT), Tail (ACGT), Tasl (AATT), Trul (TTAA), TscAI (CASTG), TsoI (TARCCA) (podkreślone sekwencje zawierają reszty nierozpoznawane, oznaczone jako N).
Wytworzone według wynalazku warianty REazy R.MwoI, o zmienionej zawężonej specyficzności względem enzymów wyjściowych, przecinają podzbiory sekwencji typu dzikiego. Uzyskany przez nas enzym R.MwoIS310E, szczególnie R.MwoIA330R,S310E rozpoznaje sekwencję GCGN5CGC. Takiej specyficzności nie posiada żaden znany obecnie enzym restrykcyjny.
Cytowane w opisie publikacje oraz podane w nich odniesienia są niniejszym w całości włączone jako referencje.
Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na których:
Fig. 1. Przedstawia elektroforezę w 10% żelu SDS-PAGE preparatów oczyszczonej REazy
Δ??Γ)Ρ Α31ΠΡ
MwoI otrzymanej w Przykładzie 6a; (A) ER2566 - preparaty uzyskane z 4 niezależnych klonów w szczepie ER2566 zawierającym metylazę indukowane IPTG; BL21(DE3) - preparaty uzyskane z 4 niezależnych klonów w szczepie BL21(DE3) nie zawierającym MTazy i przy użyciu autoindukcji w temperaturze pokojowej; (B) Std - standard wielkości, wielkość poszczególnych białek podano w kDa; Mwo - preparat MwoIA330R,S310E (5 μ l).
Fig. 2. Przedstawia rozdział elektroforetyczny produktów trawienia DNA faga λ enzymami R.MwoIA330R,S310E, R.MwoIA330R,S310K i R.MwoIA330R,S310R. Trawienie 1 μg DNA prowadzono przez 2 godz. w 60°C enzymem typu dzikiego Mwolwt (wt) bądź jego wariantami. Ilości w ng enzymu użytego w reakcji oraz rodzaj użytego wariantu podano pod torami.
Fig. 3. (A) Przedstawia wyniki trawienia enzymem typu dzikiego MwoIwt (wt) oraz jego wariantami R.MwoIA330R,S310E, R.MwoIA330R,S310K i R.MwoIA330R,S310R substratów z pojedynczymi miejscami dla Mwol. Ponad torami podano sekwencję nukleotydów rozszerzających wyjściowy palindrom (A/T = GCAATCTCTGC, T/A = GCTATCTCAGC, G/C = GCGATCTCCGC, C/G = GCCATCTCGGC) oraz użyty wariant. S = substrat, P = produkt trawienia. Trawienia prowadzono z użyciem 7 ng (L) lub 35 ng (H) enzymu na reakcję. (B) Przedstawia wpływ substytucji A330R na specyficzność wariantów R.MwoI
A310E,A330R uzyskanych przez substytucje pozycji S310 na przykładzie porównania wariantów R.MwoIA310E,A330R S310E i R.MwoIS310E. Trawienia przeprowadzono z użyciem 35 ng enzymu na reakcję.
Fig. 4. Wykres przedstawia wyrażone w ng produktu/ng enzymu/ min. prędkości reakcji trawienia poszczególnych 6-nukleotydowych palindromów obejmujących sekwencję dla Mwol, przez warianty 310wt (R.MwoIA330R) z substytucją w pozycji 330, z substytucjami w pozycjach 310 i 330: 310E (R.MwoIA330R,S310E) oraz 310R (R.MwoIA330R,S310R).
A330R,S310E
Fig. 5. Przedstawia sekwencję DNA kodującą wariant MwoIA330R,S310E. Różnice w stosunku do sekwencji typu dzikiego zdeponowanej w bazie danych NCBI (nr dostępu AF051376 pozycje 96-1187) są następujące: C394A (zmiana milcząca, nie zmienia sekwencji białka), TCC (928-930) > GAA [Ser310Glu]; GCA (988-990) > CGC [Ala330Arg]; od nukleotydu 1090 została dodana sekwencja kodująca metkę His6 [LeuGluHisHisHisHisHisHis].
Fig. 6. Przedstawia wprowadzone zmiany w sekwencji aminokwasowej R.MwoIwt dla różnych
S310E uzyskanych wariantów tego enzymu (mutacje wprowadzone zgodnie z Tabelą 1, dla: R.MwoIS310E, R.MwoI S310K, R.MwoIS310R, R.MwoIA330R, R.MwoIA330R,S310E, R.MwoIA330R,S310K oraz R.MwoIA330R,S310R). Na sekwencji zaznaczono strzałką i wytłuszczono zamieniane aminokwasy, natomiast zamienione w poszczególnych wariantach R.MwoI aminokwasy wytłuszczono i podkreślono. Zaznaczono również dodaną sekwencję kodującą metkę His6.
Poniższe przykłady zostały umieszczone jedynie w celu zilustrowania wynalazku oraz wyjaśnienia poszczególnych jego aspektów, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem.
PL 220 789 B1
W poniższych przykładach, jeśli nie wskazano inaczej, stosowano standardowe materiały i metody opisane w Sambrook J. et al., „Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2nd edition. 1989. Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory Press” lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla określonych materiałów i metod.
W niniejszym opisie, jeśli nie wskazano inaczej, stosowane są standardowe skróty stosowane w biologii molekularnej w szczególności dotyczy to nazw aminokwasów i nukleotydów. W podanych sekwencjach starterów odcinki sekwencji komplementarne do matrycy podano dużymi literami, pozostałe małymi.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1
Izolacja totalnego DNA z Methanothemiobacter wolfei
W celu uzyskania totalnego DNA 1 ml aktywnej hodowli Methanothermobacter wolfei (DSMZ
2970) (poprzednia nazwa - Methanobacterium wolfei) żwirowano i wyizolowano DNA za pomocą metody ekstrakcji fenolem/chloroformem i precypitacji etanolem. Uzyskane DNA zawieszono w 20 μΐ buforu TE.
P r z y k ł a d 2
Klonowanie sekwencji kodującej MTazę Mwol
Sekwencję kodującą MTazę Mwol (M.MwoI) sklonowano amplifikując odpowiedni odcinek genomu Methanothermobacter wolfei wykorzystując totalny DNA z Przykładu 1. Gen MTazy (mwoIM) zamplifikowano przy użyciu starterów
MwoIM5Mph1103: taatgcatGTTAAAGGAAAGATTTTATTTGG (podkreślono wprowadzone miejsce Mph1103I)
MwoIM3PvuI: tcgcgatcgTCATTTTTTTATGTAATAAGAAGG (podkreślono wprowadzone miejsce Pvul).
Mieszaniny reakcyjne (50 μθ zawierały 5 μl preparatu totalnego DNA z M. wolfeii, 20 mM TrisCl pH 8,8, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% (v/v) Triton X-100, 2 mM MgSO4), 200 μM stężenie każdego z czterech nukleotydów (dATP, dGTP, dCTP i dTTP), 1 pM każdego ze starterów i 2,5 jednostki polimerazy DNA Pfu (Fermentas). Profil amplifikacji genu mwoIM: 1 min. 95°C; 35 cykli: 30 sek., 95°C, 30 sek., 50°C, 4 min., 72°C oraz 1 min., 72°C.
Produkt reakcji PCR rozdzielono w 0,7% żelu agarozowym (bufor TAE) i wyizolowano zestawem Gel-Out (A&A Biotechnology). Oczyszczony produkt trawiono enzymami Mph1103I i Pvul w buforze R (Fermentas) przez 2 godz. w 37°C. Produkt trawienia ponownie oczyszczono przez elektroforezę w żelu agarozowym i izolację zestawem Gel-Out i ligowano z wektorem plamzidowym pALTER-Ex2 (Promega) strawionym enzymami Mph1103I i Pvul. Rekombinowane plazmidy identyfikowano przez analizę wzoru trawienia odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Identyfikację potwierdzano przez sekwencjonowanie wprowadzonego insertu. Uzyskany plazmid (pMwoMAx) ekspresjonuje metylotransferazę Mwol pod kontrolą promotora tac, który zapobiega ekspresji w normalnych warunkach hodowli natomiast jest indukowany przez IPTG. DNA w komórkach niosących ten plazmid hodowanych w obecności IPTG nie jest wrażliwy na trawienie REazą Mwol.
P r z y k ł a d 3
Klonowanie sekwencji kodującej REazę Mwol
Sekwencję kodującą REazę Mwol sklonowano amplifikując odpowiedni odcinek genomu Methanothermobacter wolfei wykorzystując totalny DNA z Przykładu 1. Gen endonukleazy (mwoIR) zamplifikowano przy użyciu następującej pary starterów:
MwoIR5Nco: taccatggAAAATCCCAAATTCACAGAAAAC (podkreślono wprowadzone miejsce Ncol), i
MwoIR3Xho: tactcgagTAACCTTTTCTCTGTTAGCTC (podkreślono wprowadzone miejsce XhoI).
Mieszaniny reakcyjne (50 μθ zawierały 5 μl preparatu totalnego DNA z M. wolfeii, 20 mM TrisCl pH 8,8, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% (v/v) Triton X-100, 2 mM MgSO4), 200 μM stężenie każdego z czterech nukleotydów (dATP, dGTP, dCTP i dTTP), 1 μM każdego ze starterów i 2,5 jednostki polimerazy DNA Pfu (Fermentas). Profil amplifikacji genu mwoIR: 1 min. 95°C; 35 cykli 30 sek. 95°C, 30 sek. 54°C, 4 min. 72°C oraz dodatkowe wydłużanie - 1 min., 72°C. Produkt reakcji PCR rozdzielono w 0,7% żelu agarozowym w buforze TAE i wyizolowano z żelu zestawem Gel-Out (A&A Biotechnology). Oczyszczony produkt trawiono enzymami Ncol i XhoI w buforze R (Fermentas) przez 2 godziny w 37°C. Produkt trawienia ponownie oczyszczono przez elektroforezę w żelu agarozowym i izolację zestawem Gel-Out i ligowano z wektorem plazmido8
PL 220 789 B1 wym pET28a (Novagen) strawionym enzymami Ncol i XhoI. Rekombinowane plazmidy identyfikowano przez analizę wzoru trawienia odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Identyfikację potwierdzano przez sekwencjonowanie wprowadzonego insertu. Uzyskany plazmid (pMwoIRHis) ekspresjonuje pod kontrolą promotora T7 endonukleazę Mwol zawierającą metkę His6 na końcu karboksylowym.
P r z y k ł a d 4
Mutageneza sekwencji kodującej REazę Mwol
W celu uzyskania wariantów R.MwoIwt można zastosować kilka podejść. Jednym z nich jest poddanie genu kodującego wyjściową wersję enzymu losowej mutagenezie prowadzącej do losowej zmiany sekwencji aminokwasowej danego enzymu. Innym podejściem jest wytypowanie konkretnych obszarów w wyjściowej REazie do zmiany jej sekwencji aminokwasowej i poszukiwania wariantów o konkretnej zmienionej specyficzności. W tym przypadku wyboru obszarów do ukierunkowanej mutagenezy można przykładowo dokonać w oparciu o analizę sekwencji i/lub struktury enzymu, pochodzącej z analizy doświadczalnej (np. krystalograficznej lub NMR) lub z przewidywania komputerowego stosującego analizę bioinformatyczną. W celu uzyskania termofilnych REaz wariantów R.MwoIwt w przedstawionym przykładzie wykonania zastosowano modelowanie komputerowe i wytypowano w oparciu o analizę modelu struktury przestrzennej enzymu do mutagenezy obszar obejmujący aminokwas serynę w pozycji 310 R. MwoIwt.
W sekwencji kodującej dziką wersję genu REazy Mwol w plazmidzie pMwoIRHis wprowadzono mutację powodującą podstawienie seryny 310 kwasem glutaminowym (S310E), argininą (S310R) oraz lizyną (S310K).
Substytucję S310E wprowadzono przy użyciu pary starterów:
MwoS310Rf: TTCAGATATCATTACAAGAAAAGCGGTAAC, i
MwoS310Er: ttcAGATCCCCAGCTCTTGC;
Substytucję S310R, wprowadzono przy użyciu pary starterów: MwoS310Rf, i
MwoS310Rr: gcgAGAgCCCCAGCTCTTGC;
Substytucję S310K, wprowadzono przy użyciu pary starterów: MwoS310Rf, i
MwoS310Kr: cttgGATCCCCAGCTCTTGCC
Ponadto zarówno w sekwencji typu dzikiego, jak i w wyżej wymienionych wariantach zmienionych w pozycji 310 wprowadzono substytucję A330R, usuwającą jedyne miejsce Mwol znajdujące się w sekwencji kodującej enzym Mwol.
W tym celu wykorzystano startery:
A330Rf: gcTCCCGTGCCGTGTTC, i
A330Rr: gCTTGTTATCTAATCCTTTGAAAACTGAGTTAC.
Wszystkie substytucje wprowadzono w reakcji PCR amplifikującej cały rekombinowany plazmid ze zmianami sekwencji wprowadzonymi przez startery w pobliżu końców produktu reakcji.
Mieszaniny reakcyjne (50 μΐ) zawierały ok. 5 ng plazmidowego DNA, 20 mM TrisCl pH 8,8, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% (v/v) Triton X-100, 2 mM MgSO4, 350 μM stężenie każdego z czterech nukleotydów (dATP, dGTP, dCTP i dTTP), 1 μM każdego ze starterów i 2,5 jednostki polimerazy DNA Pfu (Fermentas). Profil amplifikacji: 1 min. 95°C; 25 cykli po 30 sek. 95°C, 30 sek. 58°C, 12 min. 40 sek. 72°C. Z produktu PCR usuwano matrycowe (niezmutowane) DNA dodając do reakcji 5 jednostek enzymu DpnI i inkubując przez 1 godz. w 37°C. Produkt PCR został oczyszczony przy użyciu zestawu Gel-Out po rozdziale elektroforetycznym w 0,7% żelu agarozowym w buforze TAE. Końce 5 poddano fosforylacji 10u kinazy polinukleotydowej T4 (Fermentas) w obecności 1 mM ATP w buforze 40 mM TrisCl pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT przez 30 min. w 37°C. Kinazę polinukleotydową inaktywowano przez 10 minut w temperaturze 75°C. Następnie po schłodzeniu dodano glikol polietylenowy 4000 do 5% i nową porcję ATP do 0,5 mM oraz 5 jednostek ligazy DNA T4 i reakcję inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnego szczepu-biorcy E. coli DH10B (Invitrogen) z plazmidem pMwoMAx kodującym MTazę M.MwoI, lub bezpośrednio do szczepów przeznaczonych do nadprodukcji, tj. E. coli ER2566 (New England Biolabs) zawierającego plazmid pMwoMAx lub E. coli BL21(DE3) (Novagen) nie zawierającego MTazy. W tym ostatnim przypadku transformanty selekcjonowano na szalkach zawierających 1% glukozę w temperaturze 25°C.
Nie odnotowano znaczących różnic w wydajności transformacji w odniesieniu do poziomu kompetencji poszczególnych szczepów mierzonych dla samego wektora (pET28a) nie zawierającego żadnej wstawki. Natomiast sposób transformacji tylko jednego plazmidu do BL21(DE3) dla uzyskania transformantów produkcyjnych zdecydowanie upraszcza przebieg całej procedury, bowiem selekcja
PL 220 789 B1 wymaga tylko jednego antybiotyku, analiza jest prostsza ze względu na obecność tylko jednego plazmidu w transformantach, a uzyskany klon nadaje się do kolejnego etapu, jakim jest nadprodukcja rekombinowanej REazy.
Obecność mutacji prowadzących do zaplanowanych substytucji (S310E, S310K, S310R i A330R) w uzyskanych plazmidach pMwo310E, pMwo310K, pMwo310R, pMwo330R oraz do substytucji podwójnych w pMwo310E330R, pMwo310K330R, pMwo310R330R potwierdzono przez sekwenS310E cjonowanie wstawek. Uzyskane w ten sposób warianty R.MwoI nazwano odpowiednio R.MwoIS310E, R.MwoI S310K, R.MwoIS310R, R.MwoIA330R oraz R.MwoIA330E,S310R, R.MwoIA330R,S310K, MwoI A330R,S310R. Rodzaj wprowadzonych substytucji, odpowiadające im plazmidy oraz wytworzone warianty R.MwoI zebrane są w poniższej Tabeli 1.
T a b e l a 1
| Rodzaj(e) subsytucji | Plazmid | Uzyskany wariant Mwol |
| S310E | pMwo310E | R.MwoIS310E |
| S310K | pMwo310K | R.MwoIS310K |
| S310R | pMwo310R | R.MwoIS310R |
| A330R | pMwo330R | R.MwoIA330R |
| A330R i S310E | pMwo310E330R | R.MwoIA330R,S310E |
| A330R i S310K | pMwo310K330R | R.MwoIA330R,S310K |
| A330R i S310R | pMwo310R330R | R.MwoIA330R,S310R |
REazy produkowane za pomocą tych konstruktów dodatkowo zaopatrzone zostały w His-tag (metkę histydynową) w celu łatwego oczyszczania wytworzonych białek.
P r z y k ł a d 5
Nadprodukcja uzyskanych wariantów enzymu R.MwoI w E. coli a) Nadprodukcja R.MwoI A330R,S310E
Indukowaną nadprodukcję białka prowadzono w szczepie E. coli ER2566 (New England Biolabs) niosącym plazmid pMwoMAx i pMwo310E330R oraz w szczepie BL21(DE3) (Novagen) niosącym wyłącznie plazmid pMwo310E330R. W szczepie ER2566 indukcję prowadzono stosując IPTG natomiast autoindukcję w szczepie BL21(DE3) zapewnia laktoza po wyczerpaniu przez bakterie glukozy z pożywki Studier (Protein Expr. Purif. 2005 May; 41(1):207-34). Szczep niosący rekombinowany plazmid hodowano w temperaturze 25°C przez noc w 3 ml pożywki LB uzupełnionej kanamycyną do 30 μg/ml i glukozą do 1%. Hodowlą nocną szczepiono 500 ml pożywki do autoindukcji (10 g/l trypton, 5 g/l ekstrakt drożdżowy, 25 mM (NH4)2SO4, 50 mM KH2PO4, 50 mM Na2HPO4, 5 g/l glicerol, 0,5 g/l glukoza, 2 g/l laktoza, 1 mM MgSO4, kanamycyna 100 μg/ml) w proporcji 1:1000. Hodowlę w 25°C kontynuowano przez co najmniej pięć godzin po uzyskaniu fazy stacjonarnej (ustabilizowaniu się gęstości optycznej w świetle o długości 600 nm). Zwykle zajmowało to ponad 36 godzin od zaszczepienia. Hodowlę zagęszczano przez wirowanie (6000 g, 15 min. 4°C), płukano przez zawieszenie w 50 ml buforu STE (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF) i ponowne odwirowanie. Osad bakteryjny zamrażano w temperaturze -70°C. W przypadku nadprodukcji białka w szczepie BL21(DE3) (Novagen) niosącym wyłącznie plazmid pMwo310E330R (w nieobecności
A330R,S310E metylotransferazy) uzyskiwano większą i stabilniejszą wydajność wytwarzania R.MwoIA330R,S310E. Otrzymane wyniki przedstawiono na Fig 1.
b) Nadprodukcja wariantów R.MwoIS310E, R.MwoIS310K, R.MwoIS310r, R.MwoIA330R, R.MwolA330R,S310K, R.MwoIA330R,S310R.
Indukowaną nadprodukcję białek tych wariantów prowadzono w szczepach E. coli ER2566 niosącym również plazmid pMwoMAx oraz BL21(DE3) z odpowiednim plazmidem (patrz Tabela 1) sposobem opisanym w Przykładzie 5a.
P r z y k ł a d 6
Oczyszczanie rekombinowanych białek wariantów R.MwoI
a) Oczyszczanie rekombinowanego białka R.MwoIA330R,S310E
Zamrożony osad bakterii otrzymany w Przykładzie 5a ogrzewano gwałtownie (przez 2 min.) do temperatury 25°C i zawieszano w schłodzonym buforze A (300 mM NaCl, 50 mM HEPES pH 8,0, 1 mM imidazol, 10 mM 2-merkaptoetanol, 10% glicerol). Komórki bakteryjne dezintegrowano przez
PL 220 789 B1 jednokrotne przepuszczenie przez dezintegrator ciśnieniowy (TS Cell Disruptor, Constant Systems) przy ciśnieniu 20 000 psi. Ekstrakt komórkowy uzupełniano PMSF do stężenia 1 mM i Triton X-100 do
0,1%, klarowano przez wirowanie (50000 g, 10 min., 4°C) i mieszano ze złożem do chromatografii powinowactwa Ni-NTA (Sigma) stosując 0,5 ml złoża/500 ml hodowli. Po związaniu białka rekombinoA330R,S310E wanego R.MwoIA330R,S310E zaopatrzonego w metkę histydynową ze złożem (15 min., 4°C z łagodnym mieszaniem) mieszaninę odwirowywano (5000 g, 5 min., 4°C), a supernatant usuwano. Złoże płukano 5 ml buforu A i po usunięciu supernatantu umieszczano w kolumnie chromatograficznej. Zanieczyszczenia usuwano przez kolejne płukania: 15 ml bufor A uzupełniony imidazolem (do 10 mM) i Triton X-100 (do 0,1%), następnie 2,5 ml bufor A uzupełniony imidazolem (do 10 mM), następnie 2,5 ml bufor B (2 M NaCl, 50 mM HEPES pH 8,0, 10 mM 2-merkaptoetanol, 10 mM imidazol) oraz 1,5 ml bufor A uzupełniony imidazolem (do 10 mM) i 2,5 ml bufor A uzupełniony imidazolem (do 20 mM). Oczyszczony rekombinowany enzym wymywano buforem E (300 mM NaCl, 50 mM HEPES pH 8,0, 10 mM 2-merkaptoetanol, 250 mM imidazol, 10% glicerol) w porcjach po 0,5 ml. Zebrane porcje numer 2 i 3 zmieszano, uzupełniano glicerolem do 50% i przechowywano w temperaturze -20°C. Próbki oczyszczonej endonukleazy R.MwoIA330R,S310E poddano elektroforezie w 10% żelu SDS-PAGE, a otrzymany wynik przedstawiono na Fig. 1(A). Elektroforeza potwierdziła uzyskanie ekspresji i znacznego oczyszczenia białka o wielkości ok. 43,3 kDa, które odpowiada rekombinowanemu R.MwoIA330R,S310E.
b) Oczyszczanie rekombinowanych białek wariantów R.MwoIS310E, R.MwoIS310K, R.MwoIS310R, R.MwoI A330R, R.MwoIA330R S310K, R.MwoIA330R,S310R.
Zamrożone osady bakterii otrzymane w Przykładzie 5b oczyszczano metodą przedstawioną w Przykładzie 6a.
P r z y k ł a d 7
Wytworzenie substratów do testowania specyficzności sekwencyjnej uzyskanych wariantów R.MwoI
Do badania specyficzności sekwencyjnej uzyskanych REaz skonstruowano panel 4 substratów zwierających różne rozszerzenia sekwencji rozpoznawanej przez enzym wyjściowy z pseudopalindromu 4-nukleotydowego (GCN7GC) do 6-nukleotydowego (GCXN5YGC), gdzie X i Y oznaczają nukleotydy rozszerzające palindrom. W tym celu w miejsce Smal wektora pTZ19R (Fermentas) wprowadzono dwuniciowe oligonukleotydy 1A/T, 1T/A, 1G/C i 1C/G przedstawione w Tabeli 2.
T a b e l a 2
| Nazwa oligonukleotydu | Sekwencja | Uzyskany konstrukt |
| 1A/T | GCAATCTCTGC i GCAGAGATTGC | pMwoSub_AT |
| 1T/A | GCTATCTCAGC i GCTGAGATAGC | pMwoSub_TA |
| 1G/C | GCGATCTCCGC i GCGGAGATCGC | pMwoSub_GC |
| 1C/G | GCCATCTCGGC i GCCGAGATGGC | pMwoSub_CG |
Zgodność uzyskanych konstruktów (pMwoSub_AT, pMwoSub_TA, pMwoSub_GC i pMwoSub_CG, odpowiednio) z projektem potwierdzono przez sekwencjonowanie.
Wykorzystując powyższe plazmidy, jako matryce oraz parę starterów:
Mwo_SUBf: CGATCGGTGCGGGCCTC i
Mwo_SUBr: CACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTC zamplifikowano w reakcji PCR odcinki DNA o długości 316 pz zawierające w pozycji 140 unikalne miejsce dla Mwol. Reakcję PCR prowadzono przy użyciu polimerazy Run (A&A Biotechnology) w buforze dostarczonym przez producenta. Profil amplifikacji był następujący: 1 min. 95°C; 35 cykli po 30 sek. 95°C, 30 sek. 64°C, 1 min. 72°C; oraz 4 min. 72°C. Produkty reakcji oczyszczano przy użyciu zestawu Clean-Up (A&A Biotechnology). W wyniku trawienia wszystkich czterech tak uzyskanych substratów enzymem Mwol typu dzikiego z substratu o długości 316 pz powstawały dwa współmigrujące w elektroforezie w żelu agarozowym 1,5% fragmenty o długościach 144 i 172 pz.
P r z y k ł a d 8
Trawienie DNA uzyskanymi wariantami R.MwoI
DNA bakteriofaga lambda trawiono enzymem dzikim R.MwoIwt oraz jego wariantami R.MwoI A330R,S310E, R.MwoIA330R,S310K i R.MwoIA330R,S310R przez 2 godz. w temperaturze 60°C w buforze O
PL 220 789 B1 (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 0,1 mg/ml albumina surowicy bydlęcej). Reakcje zawierały 1 μg substratu w 30 μΐ objętości. Otrzymane wyniki przedstawiono na Fig. 2. Wzór trawienia uzyskanych wariantów R.MwoI wyraźnie różni się od wzoru trawienia dla enzymu wyjściowego
R.MwoIwt, przy czym wzór uzyskany dla wariantów R.MwoIA330R,S310K i R.MwoIA330R,S310R jest podobny,
A330R,S310E a jednocześnie różni się od wzoru uzyskanego dla wariantu R.MwoIA330R,S310E.
Trawienie DNA substratów wytworzonych w Przykładzie 7 prowadzono przez 2 godz. w temperaturze 60°C w buforze O. Reakcje zawierały 7 lub 35 ng enzymu i 300 ng substratu i prowadzone były w objętości 30 μ|. Produkty reakcji rozdzielano przez elektroforezę w 1,5% żelu agarozowym w buforze TAE i przedstawiono na Fig. 3A.
W odróżnieniu od enzymu typu dzikiego R.MwoIwt zmutowana wersja R.MwoIA330R,S310E trawiła preferencyjnie sekwencję GCGN5CGC nie trawiąc pozostałych 6-nukleotydowych palindromów zawierających sekwencję dla Mwol (GCAN5TGC, GCTN5AGC, GCCN5GGC). Uzyskany wariant Mwol (R.MwoIA330R,S310E) jest w związku z tym unikalnym enzymem restrykcyjnym rozpoznającym sekwencję GCGN5CGC.
Warianty R.MwoIA330R,S310K i R.MwoIA330R,S310R trawiły preferencyjnie sekwencję GCCN5GGC nie trawiąc pozostałych 6-nukleotydowych palindromów zawierających sekwencję dla Mwol (GCAN5TGC, GCTN5AGC, GCGN5CGC). Są one w związku z tym izoschizomerami enzymu Bg1l.
Zbadano również wpływ substytucji A330R na obserwowane zmiany specyficzności wariantów
R.MwoI. We wszystkich przypadkach enzymy z podwójną substytucją wykazywały widocznie wyższą selektywność od wariantów zawierających wyłącznie substytucje pozycji S310. Fig. 3B ilustruje to dla wariantów R.MwoIA330R,S310E i R.MwoIS310E. O ile wariant R.MwoIA330R,S310E trawi wyłącznie substrat S310E
GCGN5CGC, to wariant R.MwoI trawiąc najefektywniej tą samą sekwencję wykazuje też nieznaczną aktywność wobec substratów z sekwencjami GCTN5AGC i GCCN5GGC.
Aby dokładnie ustalić stopień selektywności uzyskanych enzymów z podwójnymi substytucjami zmierzono prędkość trawienia każdej z czterech palindromicznych sekwencji przez enzym typu dzikiego R.MwoIwt oraz warianty S310E - R.MwoIA330R,S310E i S310R - R.MwoIA330R,S310R. Reakcję prowadzono w objętości 180 μl w buforze O w obecności 1,8 μg substratu i 6 - 360 ng enzymu w temperaturze 60°C. Postęp reakcji mierzono analizując próbki pobrane w określonym czasie od dodania enzymu, w których zatrzymywano trawienie dodając EDTA do 20 mM i przenosząc je do lodu. Próbki poddawano elektroforezie w żelu agarozowym 1,5% w TAE, a następnie mierzono densytometrycznie proporcje substrat/produkt uzyskane w danym czasie. Pomiar wykonano trzykrotnie, a uzyskane wyniki przedstawione są na Fig. 4.
A330R,S310E
Prędkość reakcji dla wariantu R.MwoIA330R,S310E można było zmierzyć jedynie dla sekwencji preferowanej GCGN5CGC. Dla pozostałych substratów wynosi ona poniżej 0,001, czyli poniżej progu detekcji. W związku z tym wykazano, że selektywność tego enzymu dla sekwencji GCGN5CGC wynosi ponad 57000 razy.
A330R,S310R
Z kolei dla wariantu R.MwoIA330R,S310R prędkość reakcji można było zmierzyć jedynie dla sekwencji preferowanej GCCN5GGC.
P r z y k ł a d 9
Oznaczanie specyficzności wiązania substratowego DNA
Stałe powinowactwa dla enzymu R.MwoIA330R i wariantu R.MwoIA330R,S310E zmierzono metodą wiązania kompleksu kwas nukleinowy-białko na błonie nitrocelulozowej. Mieszaniny reakcyjne (180 μl lub 1950 μ!) zawierały enzym (1 pM-500 nM) i substratowe DNA (6 pM lub 0,5 pM). Substratem były dwuniciowe oligonukleotydy DNA:
1T/ABind: GACAGTGCTATCTCAGCGACAGT
1A/TB ind: GACAGTGCAATCTCTGCGACAGT
1G/CBind: GACAGTGCGATCTCCGCGACAGT
1C/GBind: GACAGTGCCATCTCGGCGACAGT wyznakowane na końcu 5' fosforem 33. Znakowanie prowadzono w obecności γ P ATP (Hartmann Analytic) przy użyciu kinazy polinukleotydowej T4 (Fermentas) zgodnie z zaleceniami producenta. Po reakcji inaktywowano enzym przez 10 min. w 75°C. Następnie usuwano niewinkorporowany izotop przez sączenie mieszaniny na kolumience wirówkowej ze złożem G-25 (mini Quick Spin Oligo Columns, Roche). Wyznakowaną radioaktywnie nić DNA hybrydyzowano z nieznakowaną nicią komplementarną (proporcja molarna 1:1,2) przez ogrzanie na 3 minuty do temperatury 95°C i powolnym (>30 min) schłodzeniu do temperatury pokojowej. Skład buforu używanego do wiązania: 50 mM TrisCl pH 7,5, 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 10 μg/ml albuminy surowicy bydlęcej. Mieszaniny inkubo12
PL 220 789 B1 wano 20-30 min. w temperaturze pokojowej, a następnie 3 równe porcje każdej reakcji filtrowano przy wykorzystaniu pompy próżniowej przez błonę nitrocelulozową 45 μm (Whatman). Błonę płukano trzykrotnie filtrując 150 μΐ buforu do wiązania, suszono i poddawano autoradiografii przy użyciu ekranów Storage Phospho Screen (GE Healthacare). Ilość wychwyconej radioaktywności mierzono analizując wyniki autoradiografii przy użyciu skanera Storm Imager i oprogramowania Image Quant (GE Healthcare). Na podstawie dopasowania uzyskanych wartości do wzoru opisującego wiązanie specyficzne ustalono równowagową stałą dysocjacji (KD). Pomiar wykonano dwukrotnie, a wyniki przedstawiono w Tabeli 3.
T a b e l a 3. Stałe powinowactwa (KD) dla R.MwoI typu dzikiego oraz wariantu S310E wobec poszczególnych 6-nukleotydowych palindromów.
| Sekwencja | R.MwoIwt | R.MwoIA330R,S310E |
| GCAN5TGC | 5,95 (+/- 0,61) pM | 29,7 (+/-13,11) nM |
| GCTN5AGC | 6,90 (+/- 0,93) pM | 46,05 (+/-4,38) nM |
| GCGN5CGC | 7,34 (+/-1,66) pM | 27,7 (+/-2,6) pM |
| GCCN5GGC | 2,34 (1,02) pM | 17,8 (+/-1,7) nM |
A330R,S310E
Uzyskane wyniki pokazują, że wytworzony wariant endonukleazy Mwol - R.MwoIA330R,S310E wykazuje niewielkie obniżenie powinowactwa do preferowanej sekwencji wobec enzymu typu dzikiego, natomiast wiąże inne palindromiczne rozszerzenia sekwencji wyjściowej ok. 1 000-krotnie gorzej. Pozostaje to w pełnej zgodności z danymi dotyczącymi trawienia tychże sekwencji.
W przedstawionych przykładach pokazano, że stosując sposób uzyskiwania wariantów termofilnych REaz według wynalazku można uzyskać enzymy o zmienionej specyficzności względem enzymów wyjściowych bez obecności odpowiadających im MTaz zapewniających ochronę DNA gospodarza. W przedstawionych przykładach wykazano możliwość wyinżynierowania nowych wariantów termofilnego enzymu Mwol o nieznanych dotąd specyficznościach, których zestawienie przedstawiono w Tabeli 4.
T a b e l a 4. Preferowane specyficzności sekwencyjne uzyskanych wariantów termofilnej REazy Mwol.
| Wariant Mwol | Preferowana specyficzność sekwencyjna |
| R.MwoIwt | GCN7GC |
| R.MwoIA330R | GCN7GC |
| R.MwoIS310E | GCGN5CGC |
| R.MwoIS310K | GCCN5GGC |
| R.MwoIS330R | GCCN5GGC |
| R.MwoIA330R,S310E | GCGN5CGC |
| R.MwoIA330R,S310K | GCCN5GGC |
| R.MwoIA330R,S310R | GCCN5GGC |
Wykaz sekwencji:
Sek. Id. Nr 1 - przedstawia sekwencję aminokwasową dzikiej wersji enzymu R.MwoIwt
A330R,S310E
Sek. Id. Nr 2 - przedstawia sekwencję aminokwasową uzyskanego wariantu R.MwoIA330R,S310E pokazanego również na Fig. 5, ale bez dodanej na końcu metki His6 [LeuGluHisHisHisHisHisHis]
A330R,S310E
Sek. Id. Nr 3 - przedstawia sekwencję DNA uzyskanego wariantu R.MwoA330R,S310E pokazanego również na Fig. 6 z sekwencją dodanej na końcu metki His6.
PL 220 789 B1
Wykaz sekwencji <110> MIBMiK <120> Warianty endonukleazy restrykcyjnej Mwol, sposób ich wytwarzania oraz sposoby uzyskiwania wariantów termofilnych REaz o zmienionej specyficzności substratowe <130> PK/1288/AGR <160> 3 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 363 <212> PRT <213> Metanothermobacter wolfei <400> 1
| Met 1 | Glu Asn | Pro Lys 5 | Phe | Thr | Glu | Asn | Gin 10 | Lys | Glu | Ile | Glu | Lys 15 | Glu | ||
| GlU | Phe | Glu | Phe | Leu | Gin | Lys | Leu | Asn | Phe | Ile | Ile | Lys | Glu | Ser | Leu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| GlU | Leu | Phe | Asn | Thr | Asn | Leu | Lys | Asn | Ser | Met | Lys | Phe | Ile | Asn | Tyr |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Iie | Thr | Leu | Pro | Ile | Ile | Met | Ala | Ser | Ile | Glu | Ser | Lys | Ser | Phe | Asn |
| 50 | 55 | 50 | |||||||||||||
| Pro | Phe | Ser | Glu | Ile | Ile | Glu | Lys | His | Ile | Ala | Phe | Ile | Leu | Asn | Ser |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Lys | Met | Asn | Ser | Leu | Gly | Tyr | Lys | Phe | Leu | Pro | Leu | Gly | Tyr | Ser | Ser |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Asp | Leu | Thr | Tyr | Glu | Asn | Asp | Asn | Ser | Ile | Ile | His | Ile | Asp | Ile | Lys |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Thr | Ala | Asn | Leu | GLu | Asn | Pro | Ser | Asp | Phe | Lys | Asp | Thr | Val | Pro | Leu |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Gly | Ile | Asn | Gin | Ser | Ser | Tyr | Pro | Gly | Val | Leu | Asp | Cys | Lys | Ile | Arg |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Gly | Lys | Asn | Ile | Lys | Ala | Asp | Cys | Lys | Lys | Ile | Lys | Val | Tyr | Pro | Aan |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ile | Pro | Thr | Thr | Tyr | Asn | Asn | Lys | Leu | Thr | Ile | Thr | Asn | Ala | Leu | Leu |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Phe | Ile | Tyr | Pro | Asp | Tyr | Lys | Glu | Ile | Ile | Asp | Glu | Ile | Arg | Glu | Asp |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Tyr | Ile | Ala | Ile | Arg | Glu | Leu | Ile | Ser | Ile | Asn | Leu | Lys | Asp | Ile | Leu |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Thr | Pro | Ile | Glu | Gly | Ser | Leu | Glu | Glu | Phe | Leu | Asn | Tyr | Lys | Pro | Ser |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Asn | Glu | Lys | Lys | Arg | Leu | Glu | Pro | Ile | Leu | Asp | Asn | Ile | Val | Arg | Gly |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Tyr | Phe | Ile | His | Asp | Lys | Leu | Arg | His | Glu | Phe | Ser | Glu | Asn | Val | Glu |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Lys | Asp | Leu | Glu | Glu | Phe | Glu | Lys | Lys | Ile | Ile | Gly | Ile | Ala | Lys | Lys |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Leu | Lys | Glu | Arg | Glu | Ile | Lys | Pro | Val | Ala | Ile | Leu | Ser | Ile | Ser | Ile |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Pro | Asn | Gly | Glu | Leu | Ala | Pro | His | Tyr | Asp | Asp | Glu | Ile | Val | Ser | Gly |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Lys | Ser | Trp | Gly | Ser | Ser | Phe | Arg | Tyr | His | Tyr | Lys | Lys | Ser | Gly | Asn |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Ser | Val | Phe | Lys | Gly | Leu | Asp | Asn | Lys | Ala | Ser | Arg | Ala | Val | Phe | Leu |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| His | Ile | Asn | Lys | Glu | Tyr | Leu | Pro | Val | Leu | Lys | Lys | Tyr | Phe | Asp | Pro |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Ile | Thr | Val | Tyr | Glu | Leu | Thr | Glu | Lys | Arg | Leu | |||||
| 355 | 360 |
PL 220 789 B1 <210> 2 <211> 363 <212> PRT <213> Metanothermobacter wolfei <400> 2
| Met | Glu Asn | Pro Lys Phe Thr Glu Asn | Gin | Lys | Glu | Ile | Glu | Lys | Glu | ||||||
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Glu | Phe | Glu | Phe | Leu | Gin | Lys | Leu | Asn | Phe | Ile | Ile | Lys | Glu | Ser | Leu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Glu | Leu | Phe | Asn | Thr | Asn | Leu | Lys | Asn | Ser | Met | Lys | Phe | Ile | Asn | Tyr |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ile | Thr | Leu | Pro | Ile | Ile | Met | Ala | Ser | Ile | Glu | Ser | Lys | Ser | Phe | Asn |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Pro | Phe | Ser | Glu | Ile | Ile | Glu | Lys | His | Ile | Ala | Phe | Ile | Leu | Asn | Ser |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Lys | Met | Asn | Ser | Leu | Gly | Tyr | Lys | Phe | Leu | Pro | Leu | Gly | Tyr | Ser | Ser |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Asp | Leu | Thr | Tyr | Glu | Asn | Asp | Asn | Ser | Ile | Ile | His | Ile | Asp | Ile | Lys |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Thr | Ala | Asn | Leu | Glu | Asn | Pro | Ser | Asp | Phe | Lys | Asp | Thr | Val | Pro | Leu |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Gly | Ile | Asn | Gin | Ser | Ser | Tyr | Pro | Gly | Val | Leu | Asp | Cys | Lys | Ile | Arg |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Gly | Lys | Asn | Ile | Lys | Ala | Asp | Cys | Lys | Lys | Ile | Lys | Val | Tyr | Pro | Asn |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ile | Pro | Thr | Thr | Tyr | Asn | Asn | Lys | Leu | Thr | Ile | Thr | Asn | Ala | Leu | Leu |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Phe | Ile | Tyr | Pro | Asp | Tyr | Lys | Glu | Ile | Ile | Asp | Glu | Ile | Arg | Glu | Asp |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Tyr | Ile | Ala | Ile | Arg | Glu | Leu | Ile | Ser | Ile | Asn | Leu | Lys | Asp | Ile | Leu |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Thr | Pro | Ile | Glu | Gly | Ser | Leu | Glu | Glu | Phe | Leu | Asn | Tyr | Lys | Pro | Ser |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Asn | Glu | Lys | Lys | Arg | Leu | Glu | Pro | Ile | Leu | Asp | Asn | Ile | Val | Arg | Gly |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Tyr | Phe | Ile | His | Asp | Lys | Leu | Arg | His | Glu | Phe | Ser | Glu | Asn | Val | Glu |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Lys | Asp | Leu | Glu | Glu | Phe | Glu | Lys | Lys | Ile | Ile | Gly | Ile | Ala | Lys | Lys |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Leu | Lys | Glu | Arg | Glu | Ile | Lys | Pro | Val | Ala | Ile | leu | Ser | Ile | Ser | Ile |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Pro | Asn | Gly | Glu | Leu | Ala | Pro | His | Tyr | Asp | Asp | Glu | Ile | Val | Ser | Gly |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Lys | Ser | Trp | Gly | Ser | Glu | Phe | Arg | Tyr | His | Tyr | Lys | Lys | Ser | Gly | Asn |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Ser | Val | Phe | Lys | Gly | Leu | Asp | Asn | Lys | Arg | Ser | Arg | Ala | Val | Phe | Leu |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| His | Ile | Asn | Lys | Glu | Tyr | Leu | Pro | Val | Leu | Lys | Lys | Tyr | Phe | Asp | Pro |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Ile | Thr | Val | Tyr | Glu | Leu | Thr | Glu | Lys | Arg | Leu | |||||
| 355 | 360 |
<210> 3 <211> 1116 <212> DNA <213> Metanothermobacter wolfei <400> 3 atggaaaatc ccaaattcac agaaaaccaa aaagaaattg aaaaagaaga atttgaattt 60 ctacaaaagc taaactttat aataaaagaa agtttggaat tatttaatac aaatctaaag 120
PL 220 789 B1
| aattcaatga | agtttattaa | ttatataaca | ttgcctataa | tcatggcaag | catagaatca | 180 |
| aaatctttta | atccattctc | tgagattata | gaaaaacata | tagcattcat | tttaaattct | 240 |
| aaaatgaatt | cacttggtta | taaattttta | ccattaggtt | attcttctga | tttaacatat | 300 |
| gaaaatgata | atagtattat | tcatatagat | atcaaaactg | ctaatcttga | aaacccttca | 360 |
| gattttaaag | acactgtacc | tcttggaatt | aatcaatcaa | gttatccggg | agttttagat | 420 |
| tgcaaaataa | gaggtaagaa | tataaaggct | gattgtaaaa | aaataaaggt | atacccaaat | 4 80 |
| attcccacca | cttataataa | taagcttaca | atcacgaatg | ctcttctatt | catctatccc | 540 |
| gactataaag | aaataattga | tgagataagg | gaagattata | ttgctataag | agagttaatt | 600 |
| agtatcaatt | taaaagacat | tcttactcca | atagaaggct | ctttagaaga | atttttgaat | 660 |
| tataaaccat | ctaatgaaaa | aaagagatta | gaacctattt | tggataatat | agtgagaggg | 720 |
| tattttatac | atgataaact | acgtcatgaa | ttctcagaaa | acgttgaaaa | ggacttggaa | 780 |
| gaatttgaga | aaaagattat | tggaatagca | aaaaagttaa | aggaacgaga | aataaaaccc | 840 |
| gttgccatat | tatccatttc | tattcccaat | ggagaattag | cgcctcatta | tgatgatgaa | 900 |
| atagtgagtg | gcaagagctg | gggatctgaa | ttcagatatc | attacaagaa | aagcggtaac | 960 |
| tcagttttca | aaggattaga | taacaagcgc | tcccgtgccg | tgttcctaca | catcaacaaa | 1020 |
| gaatacttac | ctgttttaaa | aaaatatttt | gatcccatta | ccgtatatga | gctaacagag | 1080 |
| aaaaggttac | tcgagcacca | ccaccaccac | cactga | 1116 |
Zastrzeżenia patentowe
Claims (12)
- Zastrzeżenia patentowe1. Wariant REazy Mwol, znamienny tym, że posiada zawężoną specyficzność substratową i zawiera substytucję A330R oraz dodatkowo substytucję wybraną spośród S310E, S310K lub S310R w stosunku do sekwencji aminokwasowej dzikiego Mwol przedstawionej na Sekw. Id. Nr 1.
- 2. Wariant REazy Mwol według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera substytucję S310E i wykazuje preferowaną specyficzność sekwencyjną wobec dsDNA GCGNCGC.
- 3. Wariant REazy Mwol według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera substytucję S310K i wykazuje preferowaną specyficzność sekwencyjną wobec dsDNA GCCN5GGC.
- 4. Wariant REazy Mwol według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera substytucję S310R i wykazuje preferowaną specyficzność sekwencyjną wobec dsDNA GCCN5GGC.
- 5. Wariant REazy Mwol według zastrz. 1, znamienny tym, że ma sekwencję aminokwasową przedstawioną jako Sekw. Id. Nr 2 albo jest kodowany przez sekwencję nukleotydową przedstawioną jako Sekw. Id. Nr 3.
- 6. Konstrukt obejmujący sekwencję DNA kodującą wariant REazy Mwol jak określony w zastrz. 1-5.A330R,S310E
- 7. Konstrukt według zastrz. 6, znamienny tym, że obejmuje sekwencję R.MwoIA330R,S310E przedstawioną na Sekw. Id. Nr 3.
- 8. Wektor obejmujący wariant REazy Mwol określonej w zastrz. 1-5 albo konstrukt określony w zastrz. 6-7.
- 9. Komórka gospodarza obejmująca wektor określony w zastrz. 8.PL 220 789 B1
- 10. Komórka gospodarza według zastrz. 9, znamienna tym, że jest organizmem mezofilnym, korzystnie E. coli, korzystniej szczepem E. coli ER2566 albo E. coli BL21(DE3).
- 11. Sposób wytwarzania wariantu REazy Mwol, o zmienionej specyficzności względem enzymów wyjściowych jak określonego w zastrz. 1-5, znamienny tym, że obejmuje hodowlę komórki gospodarza określonej w zastrz. 9-10 w warunkach odpowiednich do wyrażania wariantu REazy Mwol.
- 12. Sposób wytwarzania wariantu REazy Mwol według zastrz. 11, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się przy braku w komórce MTazy w niepermisywnej temperaturze, korzystnie w temperaturze równej około 25°C lub niższej.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL395923A PL220789B1 (pl) | 2011-08-10 | 2011-08-10 | Warianty endonukleazy restrykcyjnej MwoI o zmienionej specyficzności substratowej |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL395923A PL220789B1 (pl) | 2011-08-10 | 2011-08-10 | Warianty endonukleazy restrykcyjnej MwoI o zmienionej specyficzności substratowej |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL395923A1 PL395923A1 (pl) | 2013-02-18 |
| PL220789B1 true PL220789B1 (pl) | 2016-01-29 |
Family
ID=47682202
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL395923A PL220789B1 (pl) | 2011-08-10 | 2011-08-10 | Warianty endonukleazy restrykcyjnej MwoI o zmienionej specyficzności substratowej |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL220789B1 (pl) |
-
2011
- 2011-08-10 PL PL395923A patent/PL220789B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL395923A1 (pl) | 2013-02-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2022231746B2 (en) | Multiple ligase compositions, systems, and methods | |
| JP7175290B2 (ja) | エラーを最少限に抑える核酸分子の合成のための材料及び方法 | |
| CN113811608B (zh) | 毛螺菌科细菌nd2006 cas12a突变型基因和由其编码的多肽 | |
| EP1176204B1 (en) | Nuclease | |
| EP1303530B1 (en) | CLONING AND PRODUCING THE N. i Bst /i NBI NICKING ENDONUCLEASE AND RELATED METHODS FOR USING NICKING ENDONUCLEASES IN SINGLE-STRANDED DISPLACEMENT AMPLIFICATION | |
| LT5263B (lt) | Grandines specifiškai nikuojančių endonukleazių konstravimo iš restrikcijos endonukleazių būdas | |
| WO2006012593A1 (en) | Nicking endonuclease methods and compositions | |
| US9353358B2 (en) | Sequence-specific engineered ribonuclease H and the method for determining the sequence preference of DNA-RNA hybrid binding proteins | |
| Zylicz-Stachula et al. | Cloning and analysis of a bifunctional methyltransferase/restriction endonuclease TspGWI, the prototype of a Thermus sp. enzyme family | |
| PL220789B1 (pl) | Warianty endonukleazy restrykcyjnej MwoI o zmienionej specyficzności substratowej | |
| US20110014660A1 (en) | Thermostable dna polymerase from palaeococcus ferrophilus | |
| US6893854B2 (en) | Nuclease | |
| JP7612678B2 (ja) | 海洋性ｄｎａポリメラーゼｉ | |
| JP4452834B2 (ja) | 新規ｄｎａ分解酵素 | |
| WO2004020621A1 (ja) | 耐熱性リボヌクレアーゼh | |
| US5731185A (en) | Isolated DNA encoding the hphi restriction endonuclease and related methods for producing the same | |
| CA3013916C (en) | Multiple ligase compositions, systems, and methods | |
| KR20240004213A (ko) | 신규 중합효소 및 이의 용도 | |
| JP2007530046A (ja) | 新規モジュラーＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＣｓｐＣＩ、および新規特異性を有するエンドヌクレアーゼを製造するためのモジュラーエンドヌクレアーゼの用途 | |
| JP2010088446A (ja) | 新規ｄｎａ分解酵素 | |
| PL222512B1 (pl) | Endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNA |