PL222512B1 - Endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNA - Google Patents
Endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNAInfo
- Publication number
- PL222512B1 PL222512B1 PL395179A PL39517911A PL222512B1 PL 222512 B1 PL222512 B1 PL 222512B1 PL 395179 A PL395179 A PL 395179A PL 39517911 A PL39517911 A PL 39517911A PL 222512 B1 PL222512 B1 PL 222512B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- dna
- zinc finger
- qqr
- rna
- ribonuclease
- Prior art date
Links
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 title description 5
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 title description 5
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 52
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 52
- 241000006382 Bacillus halodurans Species 0.000 claims description 44
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 44
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 42
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 38
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 38
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 33
- 102220478793 Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-10_K81A_mutation Human genes 0.000 claims description 29
- 102220480585 Serine/threonine-protein kinase RIO2_K123A_mutation Human genes 0.000 claims description 29
- 102200036809 rs387907341 Human genes 0.000 claims description 29
- 102100030011 Endoribonuclease Human genes 0.000 claims description 16
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 claims description 16
- 108010052833 ribonuclease HI Proteins 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 101150059756 rnhA gene Proteins 0.000 claims description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 36
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 28
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 22
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 21
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- OAICVXFJPJFONN-NJFSPNSNSA-N Phosphorus-33 Chemical compound [33P] OAICVXFJPJFONN-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 3
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 101100528654 Lactococcus lactis subsp. lactis (strain IL1403) rnhC gene Proteins 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 101150106284 deoR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 1
- 101150041954 galU gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 101150096208 gtaB gene Proteins 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 101150023497 mcrA gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 101150012154 nupG gene Proteins 0.000 description 1
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007671 third-generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
(21) Numer zgłoszenia: 395179 (51) Int.Cl.
C12N 9/22 (2006.01)
Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 08.06.2011 (54) Endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNA (73) Uprawniony z patentu:
MIĘDZYNARODOWY INSTYTUT BIOLOGII MOLEKULARNEJ I KOMÓRKOWEJ W WARSZAWIE, Warszawa, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono:
17.12.2012 BUP 26/12 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.08.2016 WUP 08/16 (72) Twórca(y) wynalazku:
JANUSZ MAREK BUJNICKI, Warszawa, PL AGATA KAMASZEWSKA, Warszawa, PL MARCIN NOWOTNY, Warszawa, PL KRZYSZTOF JERZY SKOWRONEK, Hornówek, PL (74) Pełnomocnik:
rzecz. pat. Anna Grzelak
PL 222 512 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNA, będąca fuzją rybonukleazy HI z palcem cynkowym. Prezentowany wynalazek ma zastosowanie w genetyce.
Specyficzna sekwencyjnie endorybonukleaza przecinająca hybrydy DNA-RNA jest przydatna do jakiegokolwiek przeznaczenia, wtedy gdy reakcja przecinania nici RNA w hybrydzie DNA-RNA może być przeprowadzona, na przykład metodą in vitro manipulacji kwasami nukleinowymi, w szczególności hybrydami DNA-RNA o określonej sekwencji. Oprócz zastosowań in vitro, enzymy przecinające hybrydy DNA-RNA w sekwencyjnie specyficzny sposób mogą również znaleźć zastosowanie w terapii niektórych wirusów RNA (np. wirusy onkogenne, retrowirusy, zapalenia wątroby typu B, gr ypy), które replikują się przez przejściowe utworzenie nici DNA na matrycy RNA. Istotnymi elementami tworzenia takich leków, skierowanych przeciwko konkretnym wirusom, byłoby optymalizowanie sekwencji rozpoznawanej przez enzym.
Znane są z opisów patentowych WO2007014181A2 oraz WO2007014182A2 fuzje wielu domen palców cynkowych oraz nukleazy FokI służące do ukierunkowanej edycji genomu. Sama fuzja niezmienionych białek nie pozwala na uzyskanie specyficznego enzymu. Selektywność sekwencyjna uzyskanego prototypu nie jest wystarczająca, aby miał on zastosowanie w manipulacji RNA. Enzym wymaga wielostopniowej optymalizacji obu domen mającej na celu zwiększenie polaryzacji funkcji w poszczególnych elementach. Istnieje również potrzeba sposobu badania białek oddziałujących z hybrydami DNA-RNA w celu ustalenia pełnego zakresu sekwencji rozpoznawanych przez białko wiążące specyficzną sekwencję w hybrydzie DNA-RNA.
Wynalazek dotyczy endorybonukleazy przecinającej nić RNA w hybrydach DNA-RNA, która to endorybonukleaza jest białkiem fuzyjnym obejmującym:
- pochodną domeny katalitycznej rybonukleazy HI (RNazy HI), z Bacillus halodurans, obejmującą polipeptyd kodowany przez nukleotydy 175 do 588 z genu rnhA przedstawionego WSE ID nr: 1,
- przy czym pochodna domeny katalitycznej RNazy HI obejmuje przynajmniej jedną substytucję reszty aminokwasowej w rejonie wiązania substratu wybraną spośród: K81A, K89E i K123A w odniesieniu do sekwencji polipeptydu kodowanego przez SEQ ID nr: 1, która to zmiana(y) zapewnia destabilizację wiązania substratu przez domenę katalityczną RNazy HI lub jej pochodną; oraz
- domenę palca cynkowego wiążącą hybrydę DNA-RNA, przy czym domena palca cynkowego ma zdolność do wiązania się ze specyficzną sekwencją w hybrydzie DNA-RNA.
W korzystnej endorybonukleazie pochodna domeny katalitycznej RNazy HI obejmuje w rejonie wiązania substratu substytucje reszt aminokwasowych K81A i K89E i K123A w odniesieniu do sekwencji polipeptydu kodowanego przez SEQ ID nr: 1.
W korzystnej endorybonukleazie domeną palca cynkowego jest pochodna palca cynkowego Zf-QQR, korzystnie polipeptyd kodowany przez nukleotydy od 19 do 303 z sekwencji Zf-QQR przedstawionej w SEQ ID Nr: 2.
Przedstawiona jest endorybonukleza przecinająca hybrydy DNA-RNA, charakteryzująca się tym, że zawiera fuzję rybonukleazy HI lub jej pochodnej i palca cynkowego wiążącego hybrydę DNA-RNA, przy czym rybonukleza HI pochodzi z Bacillus halodurans a palec cynkowy posiada zdolność do wiązania specyficznej sekwencji w hybrydzie DNA-RNA. Korzystnie endorybonukleza charakteryzuje się tym, że pochodna rybonukleazy HI pochodzącej z Bacillus halodurans zawiera polipeptyd stanowiący domenę katalityczną, korzystniej obejmujący polipeptyd kodowany przez nukleotydy od 175 do 488 genu rnhA przedstawionego na SEQ ID Nr 1 (Figura 1). Równie korzystnie endoryb onukleaza charakteryzuje się tym, że natywna pochodna rybonukleazy HI zawiera delecję domeny wiążącej hybrydy. Korzystniej endorybonukleza charakteryzuje się tym, że domena katalityczna pochodnej rybonuklezy HI zawiera substytucję, co najmniej jednego aminokwasu w rejonie wiązania substratu wybraną spośród: K81A, K89E i K123A. Najkorzystniej endorybonukleza charakteryzuje się tym, że domeną palca cynkowego jest pochodna palca cynkowego Zf-QQR, korzystnie polipeptyd kodowany przez nukleotydy od 19 do 303 palca cynkowego Zf-QQR przedstawionego na SEQ ID nr 2 (Figura 2).
Przecinanie łańcuchów kwasów nukleinowych w określonym miejscu jest stosowane w wielu technikach inżynierii genetycznej. Znanych jest wiele metod umożliwiających obróbkę cząsteczek
PL 222 512 B1
DNA, w tym powszechnie stosowane dostępne komercyjnie enzymy restrykcyjne. Znacznie mniej jest enzymów umożliwiających obróbkę cząsteczek RNA i większość ze znanych rybonukleaz charakteryzuje się niską specyficznością sekwencyjną lub jej zupełnym brakiem. Specyficzna s ekwencyjnie rybonukleaza H może znaleźć zastosowanie w określonej i zlokalizowanej fragm entacji kwasów nukleinowych do spektrometrii mas RNA, w tym badania modyfikacji RNA.
Przedmiot wynalazku może znaleźć zastosowanie do generowania fragmentów RNA do sekwencjonowania trzeciej generacji. Specyficzna sekwencyjnie rybonukleaza H może znaleźć zastosowanie do detekcji lub mapowania RNA np. wirusowego o konkretnej sekwencji, gdzie do jednoniciowego RNA dohybrydyzowane zostaje DNA, a powstająca hybryda jest przecinana. Do inżynierii białek przez przetasowanie fragmentów i ligację mRNA, gdzie fragmenty są uzyskiwane przez trawienie specyficzną rybonukleazą H.
Enzymy o nowych cechach można uzyskać przez konstruowanie zrekombinowanych białek składających się z kilku domen o różnej funkcjonalności. Inżynieria endorybonukleazy przecinającej hybrydy DNA-RNA w sposób zależny od sekwencji oparta jest na fuzji dwóch białek: rybonukleazy H i palca cynkowego wiążącego hybrydę DNA-RNA. Rybonukleaza HI z Bacillus halodurans jest enzymem, który hydrolizuje nić RNA w hybrydzie DNA-RNA w sposób niezależny od sekwencji, natomiast palec cynkowy Zf-QQR posiada zdolność do wiązania ściśle określonej sekwencji w hybrydzie DNA-RNA. W enzymie do pełnienia funkcji domeny wykazującej aktywność endonukleazową wobec nici RNA w hybrydzie DNA-RNA wybrano fragment genu rnhA z B. halodurans kodujący domenę katalityczną. Jest to fragment od 175 do 488 nukleotydu genu rnhA, co odpowiada rejonowi od 59 do 196 reszty aminokwasowej natywnego białka rybonukleazy HI z B. halodurans. Z natywnego genu usunięto domenę wiążącej hybrydy (dsRHbd, ang. double-stranded RNA/hybrid binding domain), ze względu na jej zdolność do niezależnego od sekwencji wiązana hybryd DNA-RNA. W domenie katalitycznej wprowadzono dodatkowo substytucje trzech aminokwasów w rejonie wiązania substratu: K81A, K89E i K123A. Reszty dodatnio naładowane znajdują się w pobliżu znanego miejsca wiązania substratu. Substytucje w założeniu nie inaktywują enzymu, ale powodują, że do wiązania substratu potrzebna jest dodatkowa domena wiążąca hybrydy DNA-RNA. Domeną, której zadaniem jest nadawanie specyficzności sekwencyjnej nowemu enzymowi jest palec cynkowy Zf-QQR W fuzji wykorzystano fragment genu kodującego palec cynkowy Zf-QQR od 19 do 303 nukleotydu, co odpowiada rejonowi od 7 do 101 reszty aminokwasowej powstającego białka.
Przykładowe realizacje wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym:
Figura 1 przedstawia sekwencję DNA genu rnhA rybonukleazy HI (Gene ID 893801, BH 0863) z Bacillus halodurans;
Figura 2 sekwencję DNA genu palca cynkowego Zf-QQR. Gen syntetyzowano w firmie Epoch Life Science;
Figura 3 sekwencję starterów wykorzystywanych do przygotowania finalnego konstruktu DNA fuzji genu rnhA rybonukleazy HI z B. halodurans z genem palca cynkowego Zf-QQR oraz wprowadzenia substytucji w sekwencji genu;
Figura 4 sekwencję DNA genu kodującego enzym fuzyjny zawierającego fragment rybonukleazy HI z B. halodurans z substytucjami wprowadzającymi zmiany w sekwencji aminokwasowej powstającego białka w pozycjach K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR;
Figura 5 sekwencję aminokwasową enzymu fuzyjnego zawierającego domenę katalityczną rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającą substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR;
Figura 6 sekwencję hybrydy DNA-RNA zawierającego miejsce wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR;
Figura 7 sekwencję hybrydy DNA-RNA niezawierającego miejsce wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR dodawanego do reakcji trawienia, jako niespecyficzny kompetytor;
Figura 8 produkty trawienia powstające w wyniku cięcia substratu hybrydy DNA-RNA zawierającego miejsce wiązania dla palca cynkowego w zależności od obecności jonów magnezu i cynku przez enzym domenę katalityczną rybonukleazy HI z B. halodurans, domenę katalityczną rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A oraz fuzję domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR.
Rozdział produktów trawienia przeprowadzono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym zawierającym 6 M mocznik. Koniec 5' nici RNA w substracie hybrydzie DNA-RNA wyznakowano
PL 222 512 B1 radioaktywnie izotopem fosforu 33, gdzie opis poszczególnych torów w żelu: Tor 1: 0,1 μΜ domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans, 0,5 μΜ substratu, 5 μΜ niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 2mM DTT, 30 min w 37°C, Tor 2: 0,1 μM domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 2mM DTT, 1 godz. w 37°C, Tor 3: 0,1 μM domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCfe, 20 μM ZnSO4, 2mM DTT, 30 min. w 37°C, Tor 4: 0,1 μM domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 μM ZnSO4, 2 mM DTT, 1 godz. w 37°C, Tor 5: 0,1 μM domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO4, 2 mM DTT, 30 min. w 37°C, Tor 6: 0,1 μM domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO4, 2 mM DTT, 1 godz. w 37°C, Tor 7: Marker wielkości 10-100 zasad jednoniciowego RNA znakowane radioaktywnie izotopem fosforu 33 (USB), Tor 8: 0,1 μmola substratu, Tor 9: 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1 godz. w 37°C, Tor 10: 0,2 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 30 min w 37°C, Tor 11: 0,2 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 2mM DTT, 1 godz. w 37°C, Tor 12: 0,2 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl2 i 20 μM ZnSO4, 2mM DTT, 30 min. w 37°C, Tor 13: 0,2 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 μM ZnSO4, 2 mM DTT, 1 godz. w 37°C, Tor 14: 0,2 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO4, 2 mM DTT, 30 min. w 37°C, Tor 15: 0,2 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO4, 2 mM DTT, 1 godz. w 37°C, gdzie gwiazdką (*) oznaczono unikalne miejsce cięcia,
Figura 9 mapowanie miejsca trawienia nici RNA w substracie hybrydzie DNA-RNA zawierającej miejsce wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR przez fuzję domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającą substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR. Rozdział produktów trawienia przeprowadzono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym zawierającym 6 M mocznik. Koniec 5' nici RNA w substracie hybrydzie DNA-RNA wyznakowano radioaktywnie izotopem fosforu 33, opis poszczególnych torów w żelu: Tor 1: 0,1 μM substratu, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO4, 2 mM DTT, 2 godz. w 37°C, Tor 2: Marker wielkości 10-100 zasad jednoniciowego RNA znakowane radioaktywnie izotopem fosforu 33 (USB), Tor 3: 0,1 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,1 μM substratu, 25 μM kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO4, 2 mM DTT, 30 min w 37°C, Tor 4: 0,1 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,1 μM substratu, 25 μM kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO4, 2 mM DTT, 1 godz. w 37°C, Tor 5: 0,1 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,1 μM substratu, 25 μM kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO4, 2 mM DTT, 2 godz. w 37°C, Tor 6: Hydroliza alkaliczna jednoniciowego RNA substratu zawierającego miejsce wiązania dla Zf-QQR,
Figura 10 pozycje cięcia substratu hybrydy DNA-RNA zawierającego miejsce wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR przez fuzję domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającą substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, oznaczono strzałkami nad sekwencją, czarna strzałka oznacza główne miejsce cięcia, szare oznaczają dodatkowe (górna nić RNA, dolna nić DNA, miejsce wiązania dla Zf-QQR oznaczono szarym tłem).
PL 222 512 B1
Przykład 1
Klonowanie fragmentu genu rnhA z Bacillus halodurans do wektora ekspresyjnego pET30b
Uzyskano wektor pET15a z genem rnhA (sekwencja genu Figura 1, Gene ID 893801, BH 0863) z B. halodurans ze źródeł prywatnych. Fragment genu kodujący domenę katalityczną był amplifikowany na matrycy uzyskanego konstruktu przy użyciu techniki PCR. Reakcję prowadzono w 50 gl, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 200 gM dNTP mix, po 50 gmoli każdego startera Bhcatf i Bhcatr (Figura 3), ok. 0,1 gg matrycy i 1 jednostką Phusion polimerazy (New England Biolabs). W arunki reakcji: wstępna denaturacja 98°C 1 min, następnie 25 cykli po 15 s denaturacji w 98°C, 15 s renaturacji w temp. 70°C i 30 s wydłużania w 72°C. DNA kodujące fragment genu rnhA oraz DNA wektora pET30b (firma Novagen) zostało strawione enzymami restrykcyjnymi Ndel i KpnI (enzymy pochodziły z firmy Fermentas, reakcje prowadzono w buforze zgodnie z zaleceniami producenta, 1 jednostkę enzymu na 1 gg DNA przez 1 godz. w 37°C). Mieszaninę reakcyjną zawierającą DNA rozdzielano w 0,7% żelu agarozowym w buforze TAE (40 mM Tris-base, 18,8 mM kwas octowy, 1 mM EDTA) i fragmenty odpowiadające oczekiwanym wielkościom reizolowano z żelu przy użyciu zestawu do reizolacji z żelu agarozowego (Gel out, A&A Biotechnology). Następnie 50 gg reizolowanego fragmentu genu rnhA oraz 25 gg przeciętego wektora pET30b poddano działaniu ligazy DNA bakteriofaga T4 (Fermentas, reakcja prowadzona zgodnie z zaleceniami producenta w dostarczonym buforze) w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Ligazę dezaktywowano termicznie przez inkubację w 75°C przez 10 min. Następnie używano mieszaniny ligacyjnej do transformacji. 100 gl wcześniej przygotowanych bakterii kompetentnych (szczep Escherichia coli Top 10: F- mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ801acZ AM15 A1acX74 deoR recA1 araD139 A(araA-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG [Invitrogen]), metody przygotowania komórek kompetentnych za „Sambrook J., Firtsh E. F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory mannual, 2nd edition. 1989. Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor laboratory Press” rozmrażano w lodzie, dodawano do nich DNA plazmidowy (10-50 ng na 50 gl komórek bakteryjnych) i pozostawiono w lodzie na 30 min. Po tym czasie, bakterie poddano szokowi termicznemu inkubując w temp. 42°C przez 1 min, a następnie schładzano w lodzie przez 2 min. Komórki inkubowano w temp. 37°C po dodaniu 800 pl płynnego LB (bakto-trypton 1%, ekstrakt drożdżowy 0,5%, NaCl 1%) przez 1 godz. i wysiewano na płytki ze stałym LB (skład jak wyżej, dodatkowo 1,5% (w/v) agar-agar) uzupełnionym końcowym stężeniem 30 gg/ml kanamycyny, inkubowano przez noc w 37°C. Selekcja odpowiednich transformantów zawierających pożądane rekombinanty bazowała na analizie mapy restrykcyjnej, a następnie sekwencjonowano próbki w celu potwierdzenia poprawności sekwencyjnej konstruktu.
P r z y k ł a d 2
Klonowanie genu kodującego palec cynkowy Zf-QQR do wektora ekspresyjnego pET28b
Zamówiono syntezę genu kodującego palec cynkowy Zf-QQR z firmy Epoch Life Sciences (sekwencja genu Figura 2) na podstawie sekwencji aminokwasowej z artykułu Shi Y., Berg JM. Specific DNA-RNA hybrid binding proteins. Science. 1995. Vol.268, 282-284”. DNA kodujące Zf-QQR oraz DNA wektora pET28b (firma Novagen) zostało strawione enzymami restrykcyjnymi Ncol i XhoI (enzymy pochodziły z firmy Fermentas, reakcje prowadzono w buforze 2X Yellow zgodnie z zaleceniami producenta, 1 jednostkę enzymu na 1 gg DNA przez 1 godz. w 37°C). Mieszaninę reakcyjną rozdzielano w 0,7% żelu agarozowym w buforze TAE i prążki odpowiadające oczekiwanym wielkościom reizolowano z żelu (opis jak wyżej). Następnie 50 ng reizolowanego genu Zf-QQR oraz 25 ng przeciętego wektora pET28b poddano działaniu ligazy DNA faga T4 (Fermentas, reakcja prowadzona zgodnie z zaleceniami producenta w dostarczonym buforze) w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Ligazę dezaktywowano termicznie przez inkubację w 75°C przez 10 min. Następnie używano mieszaniny ligacyjnej do transformacji (opis jak wyżej).
P r z y k ł a d 3
Klonowanie genu kodującego palec cynkowy Zf-QQR do wektora ekspresyjnego pET30b zawierającego fragment genu rnhA z Bacillus halodurans
Amplifikowano fragment wektora pET28b wraz z genem kodującym Zf-QQR. Reakcję prowadzono w 50 gl, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 200 gM dNTP mix, po 50 gmoli każdego startera BhZf i Kmr (Figura 3), ok. 0,1 gg matrycy i 1 jednostką Phusion polimerazy (New England Biolabs). Warunki reakcji: wstępna denaturacja 98°C 1 min, następnie 25 cykli po 15 s denaturacji w 98°C, 15 s renaturacji w temp. 63°C i 1,5 min wydłużania w 72°C. Amplifikowano fragment wektora pET30b wraz z genem kodującym domenę katalityczną rybonukleazy HI. Reakcję prowadzono w 50 gl, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 200 gM dNTP mix, po 50 gmoli każdego
PL 222 512 B1 startera Bhcatr i Kmf (Figura 3), ok. 0,1 pg matrycy i 1 jednostką Phusion polimerazy (New England Biolabs). Warunki reakcji: wstępna denaturacja 98°C 1 min, następnie 25 cykli po 15 s denaturacji w 98°C, 15 s renaturacji w temp. 70°C i 3,5 min wydłużania w 72°C. Mieszaniny PCR oczyszczono przy użyciu zestawu do oczyszczania reakcji enzymatycznych (Clean Up, A&A Biotechnology). Oczyszczony produkt PCR poddano reakcji z kinazą polinukleotydową bakteriofaga T4 (Fermentas). Reakcję prowadzono w buforze do ligacji, z dodatkiem PEG 4000 o końcowym stężeniu 5% i 0,5 mM ATP przez 30 min w temperaturze 37°C. Następnie kinazę dezaktywowano termicznie przez inkubację w 70°C przez 10 min. DNA z obu reakcji (po 20 ng) łączono i poddano działaniu ligazy DNA bakteriofaga T4 (Fermentas, reakcja prowadzona zgodnie z zaleceniami producenta w dostarczonym buforze) w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Ligazę dezaktywowano termicznie przez inkubację w 75°C przez 10 min. Następnie używano mieszaniny ligacyjnej do transformacji (opis jak wyżej).
P r z y k ł a d 4
Mutageneza genu kodującego enzym fuzyjny wprowadzająca substytucje aminokwasów w pozycjach K81A, K89E i K123A
W wyniku połączenia powstał konstrukt, w którym otwarta ramka odczytu zawierała na początku fragment genu kodujący domenę katalityczną rybonukleazy HI oraz połączony z nim fragment genu kodującego Zf-QQR. Uzyskane DNA posłużyło do wprowadzenia substytucji nukleotydów kodujących reszty aminokwasowe w pozycjach 81, 89 i 123 powstającego białka przy użyciu techniki PCR. Zmiany wprowadzano etapowo, najpierw substytucje w nukleotydach kodujących reszty 81 (zamiana lizyny na alaninę) i 89 (zamiana lizyny na kwas glutaminowy), dopiero po uzyskaniu takiego konstruktu przeprowadzono PCR w celu zamiany nukleotydów kodujących resztę w pozycji 123 (zamiana lizyny na alaninę). Reakcję prowadzono w 50 pl, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 200 pM dNTP mix, po 50 pmoli każdego startera (pozycje 81 i 89 przy użyciu starterów K81Ar i K89Ef oraz pozycja 123 przy użyciu starterów K123Ar i K123Af), ok. 0,1 pg matrycy i 2,5 U Pfu polimerazy. Warunki reakcji: wstępna denaturacja 95°C 2 min, następnie 25 cykli po 15 s denaturacji w 98°C, 15 s renaturacji w temp. 62°C i 6 min wydłużania w 72°C. W wyniku reakcji PCR amplifikowany był cały plazmid ze sklonowanym genem. Mieszaninę reakcyjną rozdzielano w 0,7% żelu agarozowym w buforze TAE i prążki odpowiadające oczekiwanym wielkościom reizolowano z żelu (opis jak wyżej). DNA poddano reakcji kinazowania, ligacji i transformowano do komórek bakteryjnych (opis jak wyżej). Ostateczna sekwencja genu kodującego enzym fuzyjny zawierającego fragment rybonukleazy HI z B. halodurans z substytucjami wprowadzającymi zmiany w sekwencji aminokwasowej powstającego białka w pozycjach K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR oraz sekwencję aminokwasową powstającego białka przedstawiono kolejno na Figurze 4 i Figurze 5.
P r z y k ł a d 5
Ekspresja i oczyszczanie białek metodą chromatografii metalopowinowactwa
Plazmid pET30 z genem kodującego enzym fuzyjny zawierającego fragment rybonukleazy HI z B. halodurans z substytucjami wprowadzającymi zmiany w sekwencji aminokwasowej powstającego białka w pozycjach K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR transformowano do szczepu E. coli ER2566 (F- XfhuA2 [lon] ompT lacZ::T7 gene1 gal sulA11 A(mcr)114::IS10 R(mcr73::miniTn10-Tets)2 R(zgb-210::Tn10)(Tets) endA1 [dcm] [New England Biolabs]). Kilkoma koloniami transformantów zaszczepiano 25 ml płynnej pożywki LB, uzupełnionej kanamycyną i 1% glukozą i inkubowano przez noc w temp. 37°C. Następnie zaszczepiano w stosunku 1:50, 500 ml płynnego LB uzupełnionego kanamycyną, inkubowano z wytrząsaniem w temp. 37°C przez 2 godz. Po tym czasie dodawano IPTG (końcowe stężenie 1 mM) i inkubowano z wytrząsaniem w 37°C przez 5 godz. Po indukcji hodowle wirowano przy 4000 rpm w temp. 4°C przez 10 min. płukano 2 ml STE, wirowano 10000 g 10 min i osad zamrażano w -20°C.Uzyskany osad z hodowli, zawieszano w 35 ml buforu A (50 mM HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl, 10 mM imidazol (pH 8,0), 10% glicerol, 10 mM β-merkaptoetanol), a następnie komórki bakteryjne dezintegrowano za pomocą jednokrotnego przepuszczenia przez prasę Frencha (Constant Systems LTD) przy nadciśnieniu 1360 atmosfer. Lizaty klarowano przez odwirowanie nierozpuszczalnego peletu w ultrawirówce przy 20 000 g w temp. 4°C przez 20 min. 500 pl złoża Ni-NTA Agarose (Sigma Aldrich) równoważono buforem A w probówce typu falkon, po czym wirowano 30 s, 1000 g, 4°C i usuwano supernatant. Do tak przygotowanego złoża, dodawano supernatant pochodzący z odwirowanego lizatu po dezintegracji i inkubowano z łagodnym mieszaniem w 4°C przez 30-60 min. Po tym czasie wirowano 5 min, 1000 g, 4°C i usuwano supernatant, a złoże ze związanym białkiem płukano po 3 ml buforu B (50 mM HEPES (pH 8,0), 3 M NaCl, 10 mM imidazol (pH 8,0), 10% glicerol, 10 mM β-merkaptoetanol) dwa razy i raz C (50 mM
PL 222 512 B1
HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl, 20 mM imidazol (pH 8,0), 10% glicerol, 10 mM β-merkaptoetanol), za każdym razem wirując 5 min przy 1000 g w 4°C i usuwając supernatant. Następnym etapem była elucja, którą powtarzano dwa razy, po 200 pl buforu E (50 mM HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl, 250 mM imidazol (pH 8,0), 10% glicerol, 10 mM β-merkaptoetanol), inkubacja 15 min w Thermomixer compact (Eppendorf), w 4°C, wytrząsając 1000 rpm. Po każdej inkubacji wirowano 30 s przy 5000 g w 4°C i przenoszono supernatant do probówki. Bufor elucyjny zmieniano na bufor do przechowywania (25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 10% glicerol, 2 mM DTT) przy użyciu złoża G-25 (Sigma Aldrich). Supernatant był używany do badań aktywności nukleazowej i przechowywano go w temp -70°C.
Przykład 6
Badanie aktywności nukleazowej enzymu fuzyjnego
Zbadano wpływ obecności jonów magnezu i cynku na aktywność enzymatyczną i specyficzność cięcia domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans i fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR. Badano wpływ obecności 5 mM MgCL i 20 μM ZnSO4. Koniec 5' nici RNA w substracie hybrydzie DNARNA wyznakowano radioaktywnie izotopem fosforu 33. Reakcja trawienia zawierała: 0,5 μM substratu (Figura 6), 5 μM niespecyficznego kompetytora (Figura 7), 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl2 lub/i 20 μM ZnSO4, 2 mM DTT. Do reakcji użyto 0,1 μM domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans oraz 0,2 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR. Reakcje trawienia prowadzono w 37°C i zatrzymywano po 30 min oraz 1 godz. przez dodanie formamidu do końcowego stężenia 50%. Ro zdział produktów trawienia przeprowadzono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym zawierającym 6 M mocznik (Figura 8).
Stwierdzono, że w obecności 20 μM ZnSO4 i przy jednoczesnym braku MgCl2 w reakcji trawienia enzym fuzja domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR przecina nić RNA w unikalnym miejscu. Cięcie w tym miejscu nici RNA nie występuje przy trawieniu takiego substratu przez samą domenę katalityczną rybonukleazy HI z B.halodurans. W celu dokładnego określenia miejsca trawienia nici RNA w substracie hybrydzie DNA-RNA zawierającej miejsce wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR przez fuzję domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającą substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, wykonano ponowne trawienie substratu i rozdzielano produkty w żelu poliakrylamidowym o rozdzielczości pozwalającej na separację fragmentów różniących się o jeden nukleotyd (Figura 9). Koniec 5' nici RNA w substracie hybrydzie DNA-RNA wyznakowano radioaktywnie izotopem fosforu 33. Reakcja trawienia zawierała: 0,1 μM substratu (Figura 6), 25 μM kompetytora (Figura 7), 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO4, 2 mM DTT. Do reakcji użyto 0,1 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR. Reakcje trawienia prowadzono w 37°C i zatrzymywano po 30 min, 1 godz. oraz 2 godz. przez dodanie formamidu do końcowego stężenia 50%. Marker wielkości z fragmentami różniącymi się o jeden nukleotyd wykonano metodą hydrolizy alkalicznej zgodnie z zaleceniami firmy Ambion (http://www.ambion.com/techlib/misc/RNA_sequencing.html). Rozdział produktów trawienia przeprowadzono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym zawierającym 6 M mocznik. Powstające fragmenty o zidentyfikowanej długości naniesiono na sekwencję substratu i ust alono, że główny produkt cięcia posiada długość 53 nukleotydów (Figura 10) i znajduje się w odległości 8 nukleotydów na przeciwnej nici od miejsca wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR.
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNA, znamienna tym, że endorybonukleaza jest białkiem fuzyjnym obejmującym:- pochodną domeny katalitycznej rybonukleazy HI (RNazy HI), z Bacillus halodurans, obejmującą polipeptyd kodowany przez nukleotydy 175 do 588 z genu rnhA przedstawionego w SEQ ID nr: 1,- przy czym pochodna domeny katalitycznej RNazy HI obejmuje przynajmniej jedną substytucję reszty aminokwasowej w rejonie wiązania substratu wybraną spośród: K81A, K89E i K123A w odniesieniu do sekwencji polipeptydu kodowanego przez SEQ ID nr: 1,PL 222 512 B1 która to zmiana(y) zapewnia destabilizację wiązania substratu przez domenę katalityczną RNazy HI lub jej pochodną; oraz- domenę palca cynkowego wiążącą hybrydę DNA-RNA, przy czym domena palca cynkowego ma zdolność do wiązania się ze specyficzną sekwencją w hybrydzie DNA-RNA.
- 2. Endorybonukleaza według zastrz. 1, znamienna tym, że pochodna domeny katalitycznej RNazy HI obejmuje w rejonie wiązania substratu substytucje reszt aminokwasowych K81A i K89E i K123A w odniesieniu do sekwencji polipeptydu kodowanego przez SEQ ID nr: 1.
- 3. Endorybonukleaza według zastrz. 1-2, znamienna tym, że domeną palca cynkowego jest pochodna palca cynkowego Zf-QQR, korzystnie polipeptyd kodowany przez nukleotydy od 19 do 303 z sekwencji Zf-QQR przedstawionej w SEQ ID Nr: 2.RysunkiAtggcaaagtcaaaatactatgtcgtatggaatggacggaagcccggcatttatacgagctggtctgcatgtgaagctcaagtaaaag gatataccggcgccaaatttaaatcctatccttccaaggaagaagcagaggctgcttttagaggagaagaggcaacaccgaagcttgc aaaagaggagattatttgggagagcctgtctgtagatgttggcagccaagggaatcccggaattgtggaatataaaggcgttgatacga aaacgggagaagtcctttttgaacgagagccgattccgatcgggacaaacaatatgggtgagtttctcgcgatcgttcacgggcttcgtt accttaaggaacggaacagtcgtaagccgatctattctgattcccagacggcaatcaaatgggtgaaggataaaaaagcaaaatcgac cctcgtgcgcaatgaagaaacagcgcttatttggaagcttgtagatgaagcggaggagtggctaaacactcatacatatgaaacgccc atcttaaaatggcagaccgataagtggggggaaattaaggccgattacgggagaaaataaFigura 1Ccatggaaaaactgcgtaacggttctggtgacccgggtaaaaaaaaacagcacgcgtgcccggaatgcggtaaatctttctctcagtc ttctaacctgcagaaacaccagcgtacccacaccggtgaaaaaccgtacaaatgtccagaatgtggcaaaagctttagtcaaagttcta atcttcaaaaacatcaacgcacgcataccggcgagaagccatataagtgtccggagtgcggcaaaagcttctcccgctctgatcacctc cagcgtcatcagcgcactcatcagaacaaaaaactcgagFigura 2PL 222 512 B1Bhcatf: GACGCATATGGCAAAAGAGGAGATTATTTGGG Bhcatr: GTGGTACCTTTTCTCCCGTAATCGGC BhZf: GGTTCTGGTGACCCGGGKmf: GGGATCGCAGTGGTGAGTAACKmr: CGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGK81 Ar: TTCACCCATGCGATTGCCGTCTGGGAATCAGK89Ef: GGATAAAAAAGCAGAATCGACCCTCGTGCGCK123Ar: TAAGATGGGCGTTTCATAGGTATGK123Af: GCATGGCAGACCGATAAGTGFigura 3Atggcaaaagaggagattatttgggagagcctgtctgtagatgttggcagccaagggaatcccggaattgtggaatataaaggcgttg atacgaaaacgggagaagtcctttttgaacgagagccgattccgatcgggacaaacaatatgggtgagtttctcgcgatcgttcacggg cttcgttaccttaaggaacggaacagtcgtaagccgatctattctgattcccagacggcaatcgcatgggtgaaggataaaaaagcaga atcgaccctcgtgcgcaatgaagaaacagcgcttatttggaagcttgtagatgaagcggaggagtggctaaacactcatacctatgaaa cgcccatcttagcatggcagaccgataagtggggggaaattaaggccgattacgggagaaaaggttctggtgacccgggtaaaaaaa aacagcacgcgtgcccggaatgcggtaaatctttctctcagtcttctaacctgcagaaacaccagcgtacccacaccggtgaaaaacc gtacaaatgtccagaatgtggcaaaagctttagtcaaagttctaatcttcaaaaacatcaacgcacgcataccggcgagaagccatataa gtgtccggagtgcggcaaaagcttctcccgctctgatcacctccagcgtcatcagcgcactcatcagaacaaaaaactcgagcaccac caccaccaccacFigura 4MAKEEIIWESLSVDVGSQGNPGIVEYKGVDTKTGEVLFEREPIPIGTNNMGEFLA1VHGLRYLKERNSRKPIYSDSQTAIAWVKDKKAESTLVRNEETALIWKLVDEAEEWLNTH
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL395179A PL222512B1 (pl) | 2011-06-08 | 2011-06-08 | Endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNA |
| ES12735348.0T ES2557633T3 (es) | 2011-06-08 | 2012-06-07 | Ribonucleasa H modificada por ingeniería específica de secuencia y el método para determinar la preferencia de secuencia de proteínas de unión de híbrido de ADN-ARN |
| EP12735348.0A EP2718430B1 (en) | 2011-06-08 | 2012-06-07 | Sequence-specific engineered ribonuclease h and the method for determining the sequence preference of dna-rna hybrid binding proteins |
| DK12735348.0T DK2718430T3 (en) | 2011-06-08 | 2012-06-07 | Technically designed sequence-specific ribonuclease H AND METHOD FOR ESTABLISHING SEKVENSPREFERENCEN OF DNA-RNA hybrid binding proteins |
| KR1020137032517A KR20140066977A (ko) | 2011-06-08 | 2012-06-07 | 서열-특이적 조작된 리보뉴클레아제 ｈ 및 ｄｎａ－ｒｎａ 하이브리드 결합 단백질의 서열 선호도를 측정하는 방법 |
| JP2014514834A JP6022556B2 (ja) | 2011-06-08 | 2012-06-07 | 配列特異的な操作されたリボヌクレアーゼｈ、および、ｄｎａ−ｒｎａハイブリッド結合タンパク質の配列優先性を決定する方法 |
| CN201280027647.2A CN103764820A (zh) | 2011-06-08 | 2012-06-07 | 序列特异性工程改造的核糖核酸酶h和用于确定dna-rna杂交物结合蛋白序列偏好的方法 |
| PCT/PL2012/050019 WO2012169916A2 (en) | 2011-06-08 | 2012-06-07 | Sequence-specific engineered ribonuclease h and the method for determining the sequence preference of dna-rna hybrid binding proteins |
| AU2012267270A AU2012267270B2 (en) | 2011-06-08 | 2012-06-07 | Sequence-specific engineered ribonuclease H and the method for determining the sequence preference of DNA-RNA hybrid binding proteins |
| CA2837503A CA2837503C (en) | 2011-06-08 | 2012-06-07 | Sequence-specific engineered ribonuclease h and the method for determining the sequence preference of dna-rna hybrid binding proteins |
| EP20140180902 EP2857506A3 (en) | 2011-06-08 | 2012-06-07 | Sequence-specific engineered ribonuclease H and the method for determining the sequence preference of DNA-RNA hybrid binding proteins |
| US14/095,351 US9353358B2 (en) | 2011-06-08 | 2013-12-03 | Sequence-specific engineered ribonuclease H and the method for determining the sequence preference of DNA-RNA hybrid binding proteins |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL395179A PL222512B1 (pl) | 2011-06-08 | 2011-06-08 | Endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL395179A1 PL395179A1 (pl) | 2012-12-17 |
| PL222512B1 true PL222512B1 (pl) | 2016-08-31 |
Family
ID=47392276
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL395179A PL222512B1 (pl) | 2011-06-08 | 2011-06-08 | Endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL222512B1 (pl) |
-
2011
- 2011-06-08 PL PL395179A patent/PL222512B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL395179A1 (pl) | 2012-12-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7379572B2 (ja) | 短縮ガイドＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）を用いたＲＮＡ誘導型ゲノム編集の特異性の増大 | |
| US9005935B2 (en) | Methods and compositions for DNA fragmentation and tagging by transposases | |
| JP6075892B2 (ja) | 二本鎖ｒｎａエンドリボヌクレアーゼ | |
| JP6552969B2 (ja) | 定方向進化のためのライブラリーの作製方法 | |
| US20240368630A1 (en) | A novel rna-programmable system for targeting polynucleotides | |
| EP2718430B1 (en) | Sequence-specific engineered ribonuclease h and the method for determining the sequence preference of dna-rna hybrid binding proteins | |
| EP2247607B1 (en) | Enzyme | |
| US6893854B2 (en) | Nuclease | |
| EP3405571A1 (en) | Mini-ill rnases, methods for changing specificity of rna sequence cleavage by mini-ill rnases, and uses thereof | |
| JP4889647B2 (ja) | 新規なエンドリボヌクレアーゼ | |
| JP7612678B2 (ja) | 海洋性ｄｎａポリメラーゼｉ | |
| CN112877308B (zh) | 一种具有反转录酶活性的dna聚合酶i大片段及其编码基因、制备方法和应用 | |
| Zheng et al. | Endonuclease activity of RecJ from extremely alkaliphilic Bacillus alcalophilus | |
| US20170107501A1 (en) | Deoxyribonuclease Enzymes | |
| KR100673836B1 (ko) | 스태필로써머스 마리너스 유래의 내열성 ｄｎａ 연결효소 | |
| JP2006180886A (ja) | Ｄｎａポリメラーゼの製造方法 | |
| JP2014221028A (ja) | 二本鎖デオキシリボ核酸にニックを導入する方法及びニッキング酵素活性を有するタンパク質 | |
| JP2001299348A (ja) | Ｄｎａポリメラーゼ活性と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ヘテロダイマー酵素およびその製法 | |
| PL222513B1 (pl) | Sposób określania sekwencji preferowanych przez białko lub jego domeny wiążące specyficznie sekwencje w hybrydzie DNA-RNA | |
| PL220789B1 (pl) | Warianty endonukleazy restrykcyjnej MwoI o zmienionej specyficzności substratowej |