PL221182B1 - Zastosowanie medyczne 3-(tiofen-2-ylo)-1,2,4-triazolo-5-tionu - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie medyczne pochodnej s-triazolu, o wzorze ogólnym 1 do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia toksoplazmozy.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie medyczne 3-(tiofen-2-ylo)-1,2,4-triazolo-5-tionu do wytwarzania leku do leczenia toksoplazmozy.

Pochodna s-triazolu jest antagonistą receptora mGluR5 [Biorg. Med. Chem. Lett 2010, 20,

7521-7524]. Wykazuje także aktywność przeciwbakteryjną [Indian J Heterocy Ch 2009, 19, 79-80; Chemical Papers (1993), 47(2), 114-21].

Znane są z literatury niskocząsteczkowe pochodne heterocykliczne, które wykazują aktywność przeciwpasożytniczą wobec chorobotwórczego pasożyta Toxoplasma gondii. Należą do nich pochodne 2-imidazolo-5-amino-1,3,4-tiadiazolu podstawione przy atomie azotu grupy aminowej para-podstawionym pierścieniem fenylowym oraz seria ich acyklicznych prekursorów [Eur. J. Med. Chem. 2010, 45, 3685].

W wyniku badań okazało się, że związek 3-(tiofen-2-ylo)-1,2,4-triazoło-5-tionu wykazuje silne hamowanie proliferacji pierwotniaka T. gondii in vitro. Toxoplasma gondii to wewnątrzkomórkowy pasożyt atakujący zarówno zwierzęta (ptaki i ssaki), jak i ludzi. Szacuje się, że około 1/3 wszystkich mieszkańców globu jest jego nosicielami [Int. J. Parasitol. 2000, 30, 1217]. Jednakże znacznej liczby zakażeń nie odnotowuje się, gdyż toksoplazmoza u zdrowych ludzi przebiega zwykle bezobjawowo, w większości przypadków w sposób niewymagający zastosowania jakiejkolwiek terapii, bądź interwencji medycznej. Źródłem zarażenia jest najczęściej żywność: surowe, bądź niedogotowane mięso, warzywa, owoce i woda [Adv. Food Nutr. Res. 2010, 60, 1]. Ponadto u kobiet ciężarnych, które w trakcie trwania ciąży uległy pierwotnemu zarażeniu, może dojść do przekazywania pierwotniaków na rozwijający się płód (toksoplazmoza wrodzona) [Parasitology 2011, 9, 1; J. Pediatr. Health Care 2011, 25, 355]. Istnieje także możliwość nabycia infekcji drogą jatrogenną wraz z transfuzjami krwi, preparatami krwiopochodnymi, czy podczas transplantacji narządów [Ann. Biol. Clin. 2012, 70, 323; Transpl. Immunol. 2007, 18, 193; Pol. Merkuriusz Lekarski 2008, 24, 275].

Zarażenie pierwotniakiem wiąże się z poważnymi skutkami utraty zdrowia rozwijającego się płodu, jak również osób z dysfunkcją układu odpornościowego (nosiciele wirusa HIV, pacjenci z zespołem AIDS, chorobą nowotworową, po przeszczepach, pacjenci z immunosupresją) [Clin. Microbiol. Infect. 2002, 8, 634; Ocul. Immunol. Inflamm. 2011, 19, 91; Neurol. Sci. 2012, online first, DOI 10.1007/s 10072-012-0960-x]. Noworodki z toksoplazmozą wrodzoną charakteryzują się występowaniem zmian patologicznych w obrębie układu nerwowego, wśród których należy wymienić zapalenie mózgu, małogłowie, wodogłowie, zwapnienia wewnątrzczaszkowe, jak również zmiany w obrębie narządu wzroku (zapalenie siatkówki i naczyniówki) i innych narządów wewnętrznych (powiększenie wątroby i śledziony). W wielu przypadkach objawy kliniczne obserwowane są dopiero w późniejszym okresie dzieciństwa (upośledzenie umysłowe, zaburzenia narządów wzroku i słuchu) [Zdrowie publiczne 2010, 120, 80; Kosmos - problemy nauk biologicznych, 2005, 54, 77; Przewodnik Lekarza 2008, 2, 44].

Toksoplazmoza u osób z obniżoną odpornością objawia się bólami głowy, poczuciem dezorientacji, bólami w klatce piersiowej, odkrztuszaniem krwią oraz problemami z oddychaniem. W niektórych przypadkach choroba może być nawet śmiertelna. Ponadto, istnieje ryzyko wystąpienia trwałych uszkodzeń narządu wzrokowego lub mózgu, np. zapalenia mózgu [Am. J. Ophthalmol. 1986, 101, 248; Pol. Merkuriusz Lekarski 2008, 24, 275; Kosmos - problemy nauk biologicznych, 2005, 54, 77].

Najczęściej stosowaną metodą leczenia toksoplazmozy jest tzw. terapia skojarzona, która polega na podawaniu pirymetaminy w skojarzeniu z sulfadiazyną z jednoczesną suplementacją kwasem folinowym [Toxoplasmosis. Med. 2005, 33, 120; Drugs 1997, 53, 40; Antimicrob. Agents Chemother. 2008, 52, 1269; Drug Discovery Today 2005, 10, 121]. Wyjątek stanowią zarażone kobiety ciężarne poniżej 6-go m-ca ciąży, którym podaje się spiromycynę wykazującą wysokie powinowactwo do łożyska, ale niestety słabe działanie protekcyjne [Zdrowie Publiczne 2010, 120, 80]. W terapii toksoplazmozy ocznej, oprócz standardowego połączenia pirymetaminy z sulfonamidami, stosowane są również trimetoprim z sulfametoksazolem, atowakwon, azytromycyna oraz przeciwzapalne leki steroidowe [Int. J. Med. Sci. 2009, 6, 140]. Niestety, tradycyjne leczenie toksoplazmozy niesie ze sobą liczne skutki uboczne. W trakcie leczenia mogą wystąpić zarówno objawy hematologiczne (niedokrwistość megaloblastyczna, małopłytkowość, leukopenia), jak i zaburzenia neurologiczne (bóle i zawroty głowy, niezborność, napady drgawek, bezsenność i depresja), czy też zmiany na skórze i błonach śluzowych (zapalenia skóry, nieprawidłowa pigmentacja, osutka, zapalenie języka). Może też wystąpić: suchość w jamie ustnej, zaburzenia żołądkowo-jelitowe, gorączka, uszkodzenie szpiku kostnego, teratogenność,

PL 221 182 B1 kamienica nerkowa, oporność [Int. J. Med. Sci. 2009, 6, 140; Wiad. Parazytol. 2011, 57, 87; [Mutat. Res. 1998, 415, 69; Toxicol. Lett. 1982, 10, 51; Antimicrob. Agents Chemother. 2008, 52, 1269; Drugs 2004, 64, 245; Ann. Allergy Asthma Immunol. 2008,100, 91]. Ponadto, ze względu na wąski zakres terapeutyczny pirymetaminy (0,08-0,6 μg/ml krwi) trudno jest ustalić właściwą dawkę leku. Jak donosi Lipka i wsp. [Wiad. Parazytol. 2011, 57, 87], tylko u 58,3% leczonych dzieci odnotowano odpowiednie poziomy pirymetaminy w surowicach, zaś 29,2% wykazywało wartość niższą, niż sugerowana dawka lecznicza, a 12,5% badanych wybiegało ponad tą normę.

W wyniku badań okazało się, że związek będący 3-(tiofeno-2-ylo)-1,2,4-triazolo-5-tionem wykazuje silne hamowanie proliferacji pierwotniaka T.gondii in vitro oraz brak znaczącej cytotoksyczności względem komórek żywicielskich. Niska toksyczność związku sprawia, że może być stosowany w medycynie i weterynarii do wytwarzania leku w terapii toksoplazmozy. Pochodna s-triazolu może mieć różne postacie farmaceutyczne jak: tabletki, proszki, granulki, syropy, roztwory do wstrzykiwań stosując znane metody otrzymywania wraz z dodatkami.

Niżej zamieszczono wyniki badań związku o zastosowaniu według wynalazku.

Ocena wpływu 3-(tiofeno-2-ylo)-1,2,4-triazolo-5-tionu na żywotność komórek linii L929 i linii HeLa - test MTT

Zasada testu MTT

Oznaczenie żywotności komórek linii L929 i HeLa wykonano przy użyciu testu MTT, zgodnie z Normą Europejską: ISO 10993-5:2009(E), Biological evaluation of medical devices, Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Test MTT oparty jest na przekształceniu żółtej soli MTT (bromku 3-[4,5-dimetylotiazolo-2-ilo]-2,5-difenylotetrazoliowego) do fioletowo-niebieskiego, nierozpuszczalnego formazanu. Za tę konwersję odpowiedzialne są NADPH lub NADH, produkowane przez enzym dehydrogenazę mitochondrialną obecną w aktywnych metabolicznie komórkach. Stężenie niebieskiego produktu jest wprost proporcjonalne do liczby żywych komórek w próbce i może być mierzone spektrofotometrycznie.

Część doświadczalna

Na płytkę 96-dołkową (Nunc^TC), nanoszono komórki (L929 ATTC-Catalog No. CCL-1^TM - lub HeLa - ATTC-Catalog No. CCL-2^TM) o gęstości 1 x 10⁴/100 μΐ/dołek, zawieszone w podłożu hodowlanym IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium - CytoGen) i inkubowano je (37°C, 10% CO₂) przez 24 h. Po inkubacji usuwano podłoże znad komórek i dodawano po 100 μΐ odpowiednich rozcieńczeń badanego związku oraz dla porównania sulfadiazynę (Sigma), których końcowe stężenia wynosiły: 1, 5, 10, 50, 100 i 500 μg/ml. Oceniano także wpływ rozpuszczalnika na żywotność komórek, w końcowym stężeniu w mikrohodowli: 0,002; 0,01; 0,02; 0,1; 0,2; 1% DMSO. Kontrolę stanowiły komórki hodowane w pełnym podłożu hodowlanym IMDM.

Po dodaniu ww. związków komórki inkubowano 24 h w 37°C, 10% CO₂. Po tym czasie hodowle obserwowano pod mikroskopem i wykonywano zdjęcia. Następnie znad monolayeru ściągano podłoże, a do każdego dołka na płytce dodawano po 50 μl MTT (C = 1 mg/ml, Sigma) i inkubowano (37°C i 5% CO₂). Po 2 h płytki wirowano (200 x g, 10 min), a kryształy formazanu rozpuszczano dodając po 150 μl DMSO/studzienkę. Barwę produktu stabilizowano dodając po 25 μl buforu glicynowego. Poziom absorbancji mierzono za pomocą czytnika ELISA, przy długości fali λ = 550 nm.

Poziom istotności p wyznaczono nieparametrycznym testem U Manna-Whitney'a za pomocą programu SigmaStat. Wyniki przy poziomie istotności p<0,05 uznano za znamienne statystycznie. Wartości CC₃₀ (cytotoxic concentration 30 - stężenie powodujące efekt cytotoksyczny dla 30% badanych komórek) wyznaczono na podstawie analizy zależności zastosowanych stężeń badanego związku i stopnia przeżywalności komórek (Statistica 10 PL).

Wyniki

W doświadczeniu oceniono wpływ testowanego związku na żywotność komórek żywicielskich linii L929 i HeLa przy pomocy testu MTT. Za kontrolę przyjęto hodowle komórkowe inkubowane w podłożu IMDM, bez dodatku badanego związku i rozpuszczalnika (DMSO). Żywotność komórek obliczono według wzoru:

wartość absorbancji próby badanej Żywotność = -—— ---—— ---x 100% wartość absorbancji próby kontrolnej

T. gondii należy do obligatoryjnych pasożytów wewnątrzkomórkowych, a jego namnażanie zachodzi tylko w żywych komórkach żywicielskich. Z tego względu do badania wpływu związku na wewnątrzkomórkowe namnażanie się pierwotniaka wybrano tylko te stężenia, przy których żywotność

PL 221 182 B1 komórek linii L929 wynosiła >70%. Według normy ISO 109935:2009 (E), dany związek można uznać za nietoksyczny dla komórek, jeśli nie powoduje on spadku żywotności komórek poniżej 70%, dlatego też wyznaczono wartość CC₃₀ odczytując ją z krzywej zależności przeżywania komórek [%] od zastosowanych stężeń sulfadiazyny i badanego związku [pg/ml], wykreślonej na podstawie danych zamieszczonych odpowiednio w Tab. 2 i Tab. 3.

Ze względu na konieczność rozpuszczania badanego związku w DMSO, w pierwszym etapie doświadczenia zbadano wpływ zastosowanych stężeń rozpuszczalnika na żywotność komórek linii L929. Ustalono, iż stężenia DMSO użyte w doświadczeniu nie mają istotnego wpływu na żywotność i morfologię komórek linii L929 (Tab. 1).

T a b e l a 1

Przeżywalność komórek linii L929 w poszczególnych stężeniach DMSO ± odchylenie standardowe

Stężenie DMSO [%]	1	0,2	0,1	0,02	0,01	0,002
komórki żywe	87,42*	92,42	93,89	92,63	95,89	96,67
[%]	±3,45	±11,69	±12,86	±7,13	±6,22	±3,23

* p<0,05

Równolegle do testu MTT prowadzono obserwację mikroskopową mikrohodowli inkubowanych z różnymi stężeniami DMSO. Obserwacja komórek pod mikroskopem, potwierdziła brak zmian cytopatycznych w hodowlach ze stężeniem DMSO do 1%. Następnie oceniono wpływ sulfadiazyny na żywotność komórek linii L929. Ustalono, iż dawka CC₃₀ w przypadku sulfadiazyny wynosi >500 pg/ml (Tab. 2)

T a b e l a 2

Przeżywalność komórek linii L929 w poszczególnych stężeniach sulfadiazyny ± odchylenie standardowe

Stężenie [pg/ml]	500	100	50	10	5	1	CC30 [pg/ml]
komórki żywe	88,74*	98,17	93,95	94,36	95,91	99,18	>500
[%]	±2,74	±0,74	±5,87	±5,31	±1,86	±3,08

* p<0,05

Podczas analizy mikroskopowej, nie zaobserwowano zmian w morfologii komórek inkubowanych z różnymi stężeniami komercyjnie dostępnego leku.

Następnie przebadano wpływ badanego związku na żywotność komórek L929 i komórek HeLa. Wyznaczono stężenia CC30 dla obu linii komórkowych (Tab. 3).

T a b e l a 3

Przeżywalność komórek linii L929 i HeLa w zakresie stężeń 3-(tiofeno-2-ylo)-1,2,4-triazolo-5-tionu 1-500 pg/ml ± odchylenie standardowe

Stężenie [pg/ml]		500	100	50	10	5	1	CC30 [pg/ml]
	%	41,68*	80,13*	88,65*	93,45	92,91*	100,38	233,56
	żywych kom. L929	±5,10	±3,99	±8,12	±7,98	±0,64	±3,01
	%	87,92*	99,02	102,59	91,29*	89,25*	95,97	>500
	żywych kom. HeLa	±4,71	±8,61	±4,19	±2,96	±2,15	±2,77

* p<0,05

Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że 3-(tiofeno-2-ylo)-1,2,4-triazolo-5-tion wykazuje bardzo niską cytotoksyczność. Stężenie cytotoksyczne CC₃₀ w kierunku linii komórek L929 wynosiło 233,56 pg/ml, zaś w kierunku linii HeLa było wyższe niż 500 pg/ml.

Badanie wpływu 3-(tiofeno-2-ylo)-1,2,4-triazolo-5-tionu na namnażanie się T. gonidii w komórkach linii L929 (test inkorporacji trytowanego uracylu).

PL 221 182 B1

Wpływ badanego związku na wewnątrzkomórkowe namnażanie się pierwotniaka T. gondii szczepu RH w komórkach linii L929 przebadano za pomocą testu wbudowywania uracylu znakowanego trytem. Kontrolę doświadczenia stanowiły komórki fibroblastów mysich zarażone pierwotniakiem i inkubowane w podłożu hodowlanym bez leku (zmierzoną wartość proliferacji przyjęto jako 100%). Wyznaczono wartość IC₅₀ (inhibitory concentration 50 - stężenie powodujące zahamowanie namnażania się pierwotniaka o 50%).

Zasada reakcji

Test inkorporacji ³H-uracylu polega na pomiarze poziomu radioaktywności pierwiastka trytu (³H), który wraz z uracylem jest wychwytywany i wbudowywany do łańcucha RNA T. gondii. Mniejsza liczba zliczeń przez czytnik scyntylacyjny w porównaniu do kontroli świadczy o hamowaniu namnażania się pierwotniaka w mikrohodowli.

Część doświadczalna

24-godzinną hodowlę komórek L929 (1 x 10⁴/ml) zarażono tachyzoitami T. gondii szczepu RH w stosunku 1 komórka żywicielska : 10 komórek pierwotniaka (2 x 10⁴/50 pl/ studzienkę). Mikrohodowle inkubowano 2h w 37°C, 10% CO2, umożliwiając pierwotniakowi wniknięcie do komórek i utworzenie wakuoli pasożytniczej. Po tym czasie dodano po 50 pl badanego związku, uzyskując końcowe stężenia: 1, 5, 10, 50 i 100 pg/ml, a do równoległych mikrohodowli - DMSO i sulfadiazynę, przygotowując ich następujące rozcieńczenia: 1,5, 10, 50, 100 i 500 pg/ml. Płytki inkubowano 48 h (37°C, 10% CO2), a następnie do każdej studzienki dodawano ³H-uracylu (1 pCi/ 50 pl), po czym kontynuowano inkubację przez 24 h w warunkach jw. Po tym czasie płytki zamrożono w -20°C. Przed przystąpieniem do odczytu testu płytkę rozmrażano, a zawartość studzienek zbierano na bibułę (PrintedFiltermat A), którą pozostawiano do wyschnięcia. Do pomiaru poziomu promieniowania β użyto czytnika scyntylacyjnego (WALLAC), uprzednio nasączając bibuły płynem scyntylacyjnym (BetaplateScint, PerkinElmer). Poziom istotności p wyznaczono n ieparametrycznym testem U Manna-Whitney'a za pomocą programu SigmaStat. Wyniki przy poziomie istotności p<0,05 uznano za znamienne statystycznie. Wartości IC50 wyznaczono na podstawie analizy zależności zastosowanych stężeń badanego związku i stopnia wewnątrzkomórkowego namnażania się pasożyta (Statistica 10 PL).

Wyniki badań

W pierwszym etapie doświadczenia przebadano wpływ rozpuszczalnika na proliferację T. gondii w komórkach linii L929 (Tab. 4).

T a b e l a 4

Intensywność proliferacji T. gondii w komórkach linii L929 hodowanych w obecności różnych stężeń DMSO ± odchylenie standardowe

Stężenie DMSO [%]	1	0,2	0,1	0,02	0,01	0,002
proliferacja pierwotniaka	67,79*	91,31	102,49	100,65	98,33	92,42
[%]	±19,92	±28,12	±19,35	±15,96	±9,68	±37,43

* p<0,05

Spadek namnażania pierwotniaka zaobserwowano jedynie w stężeniu 1% DMSO.

Kontrolę dodatnią doświadczeń nad wpływem badanego związku stanowiła mikrohodowla z sulfadiazyną (Tab. 5).

T a b e l a 5

Intensywność proliferacji T. gondii w komórkach linii L929 hodowanych w obecności różnych stężeń sulfadiazyny ± odchylenie standardowe

Stężenie [pg/ml]	500	100	50	10	5	1	IC50 [pg/ml]
proliferacja	66,36*	71,53*	78,73*	82,14	79,18*	90,37*	>500
pierwotniaka [%]	±9,42	±8,94	±8,29	±11,26	±6,29	±11,65

p<0,05

Wartość IC₅₀ dla sulfadiazyny wykroczyła poza zakres badanych stężeń.

PL 221 182 B1

Oceniono wpływ badanego związku (Tab. 6) na namnażanie się pierwotniaka w hodowlach komórek linii L929. Wartości stężeń IC₅₀ odczytano z wykresów wykonanych na podstawie danych zamieszczonych w poniższej tabeli.

T a b e l a 6

Intensywność proliferacji T. gondii w komórkach linii L929 hodowanych w obecności

3-(tiofeno-2-ylo)-1,2,4-triazolo-5-tionu w zakresie stężeń 1-100 pg/ml ± odchylenie standardowe

Stężenie [pg/ml]	100	50	10	5	1	IC50 [pg/ml]
	34,17*	49,16*	75,35*	73,79*	86,46*	63,00
	±3,54	±4,24	±10,43	±14,05	±9,37

* p<0,05

Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że 3-(tiofeno-2-ylo)-1,2,4-triazolo-5-tion wykazuje hamowanie proliferacji T. gondii przy stężeniu wyrażonym jako IC₅₀ wynoszącym 63,00 pg/ml. W badanym zakresie stężeń uzyskana wartość IC₅₀ jest w przybliżeniu ośmiokrotnie niższa niż stosowanego leku sulfadiazyny (IC₅₀ > 500 pg/ml). Ponadto, przy stężeniu 63,00 pg/ml badany związek był nietoksyczny (komórki linii L929 i HeLa) i utrzymywał tę właściwość aż do stężenia 233,56 pg/ml = CC₃₀ (fibroblasty L929) oraz > 500 pg/ml = CC₃₀ (komórki nabłonkopodobne HeLa).

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie medyczne pochodnej s-triazolu, o wzorze 1 do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia toksoplazmozy.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym pochodną s-triazolu stosuje się do wytwarzania leku w postaci kapsułki, tabletki, proszku, granulek, syropu lub roztworu do wstrzykiwań.