PL221181B1

PL221181B1 - Zastosowanie medyczne pochodnych 1,4-dipodstawionego tiosemikarbazydu

Info

Publication number: PL221181B1
Application number: PL400583A
Authority: PL
Inventors: Agata Siwek; Katarzyna Dzitko
Original assignee: Univ Łódzki; Univ Medyczny W Lublinie
Priority date: 2012-08-30
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2016-03-31
Also published as: PL400583A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie pochodnych 1,4-dipodstawionego tiosemikarbazydu o wzorze o ogólnym 1, gdzie R1 oznacza 4-metylo-1,2,3-tiadiazol-5-yl, 2-metylofuran-3-yl lub tiofen-2yl, zaś R2 oznacza 2-bromofenyl, 2,4-difluorofenyl, etyl, 2-metylofenyl lub 4-fluorofenyl do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia toksoplazmozy.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie medyczne pochodnych 1,4-dipodstawionego tiose₁ mikarbazydu o wzorze 1, gdzie R oznacza 4-metylo-1,2,3-tiadiazol-5-yl, 2-metylofuran-3-yl lub tiofen₂

2yl, zaś R oznacza 2-bromofenyl, 2,4-difluorofenyl, etyl, 2-metylofenyl lub 4-fluorofenyl do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia toksoplazmozy.

Pochodne 1,4-dipodstawionego tiosemikarbazydu znane są i opisane w literaturze, jako wykazujące aktywność przeciwbakteryjną. [Eur J Med Chem (2011), 46(11), 5717-5726].

Znane z literatury [Eur. J. Med. Chem. 2010, 45, 3685] pochodne 1 ,4-dipodstawionego tiosemikarbazydu, które wykazują aktywność przeciwpasożytniczą wobec chorobotwórczego pasożyta Toxoplasma gondii. Należą do nich pochodne tiosemikarbazydu podstawionego w pozycji 1 podstawnikiem imidazolowym, zaś w pozycji 4 para-podstawionym fenylowym.

W wyniku prowadzonych badań okazało się, że wysoką zdolność do hamowania proliferacji pierwotniaka Toxoplasma gondii in vitro wykazują pochodne 1,4-dipodstawionego tiosemikarbazydu ₁ o wzorze ogólnym 1, gdzie R oznacza 4-metylo-1,2,3-tiadiazol-5-yl, 2-metylofuran-3-yl lub tiofen-2yl, ₂ zaś R oznacza 2-bromofenyl, 2,4-difluorofenyl, etyl, 2-metylofenyl lub 4-fluorofenyl. Związki o zastosowaniu według wynalazku pokazano na rysunku i oznaczono jako wzory 1a-1e.

Jak się okazało związki o zastosowaniu według wynalazku będące pochodnymi 1,4-dipodstawionego tiosemikarbazydu wykazują silne hamowanie proliferacji pierwotniaka Toxoplasma gondii in vitro.

Toxoplasma gondii to wewnątrzkomórkowy pasożyt atakujący zarówno zwierzęta (ptaki i ssaki), jak i ludzi. Szacuje się, że około 1/3 wszystkich mieszkańców globu jest jego nosicielami [Int. J. Parasitol. 2000, 30, 1217]. Jednakże znacznej liczby zarażeń nie odnotowuje się, gdyż toksoplazmoza u zdrowych ludzi przebiega zwykle bezobjawowo, w większości przypadków w sposób niewymagający zastosowania jakiejkolwiek terapii, bądź interwencji medycznej. Źródłem zarażenia jest najczęściej żywność: surowe, bądź niedogotowane mięso, warzywa, owoce i woda [Adv. Food Nutr. Res. 2010, 60, 1].

Ponadto u kobiet ciężarnych, które w trakcie trwania ciąży uległy pierwotnemu zarażeniu, może dojść do przekazywania pierwotniaków na rozwijający się płód (toksoplazmoza wrodzona) [Parasitology 2011, 9, 1; J. Pediatr. Health Care 2011, 25, 355]. Istnieje także możliwość nabycia infekcji drogą jatrogenną, wraz z transfuzjami krwi, preparatami krwiopochodnymi, czy podczas transplantacji narządów [Ann. Biol. Clin. 2012, 70, 323; Transpl. Immunol. 2007, 18, 193; Pol. Merkuriusz Lekarski 2008, 24,275].

Toksoplazmoza u osób z obniżoną odpornością objawia się bólami głowy, poczuciem dezorientacji, bólami w klatce piersiowej, odkrztuszaniem krwią oraz problemami z oddychaniem. W niektórych przypadkach choroba może być nawet śmiertelna. Ponadto, istnieje ryzyko wystąpienia trwałych uszkodzeń narządu wzrokowego lub mózgu, np. zapalenia mózgu [Am. J. Ophthalmol. 1986, 101, 248; Pol. Merkuriusz Lekarski 2008, 24, 275; Kosmos-problemy nauk biologicznych, 2005, 54, 77].

Najczęściej stosowaną metodą leczenia toksoplazmozy jest tzw. terapia skojarzona, która polega na podawaniu pirymetaminy w skojarzeniu z sulfadiazyną z jednoczesną suplementacją kwasem folinowym [Toxoplasmosis. Med. 2005, 33, 120; Drugs 1997, 53, 40; Antimicrob. Agents Chemother. 2008, 52, 1269; Drug Discovery Today 2005, 10, 121]. Wyjątek stanowią zarażone kobiety ciężarne poniżej 6-go m-ca ciąży, którym podaje się spiromycynę wykazującą wysokie powinowactwo do łożyska, ale niestety słabe działanie protekcyjne [Zdrowie Publiczne 2010, 120, 80]. W terapii toksoplazmozy ocznej, oprócz standardowego połączenia pirymetaminy z sulfonamidami, stosowane są również trimetoprim z sulfametoksazolem, atowakwon, azytromycyna oraz przeciwzapalne leki steroidowe [Int. J. Med. Sci. 2009, 6, 140]. Niestety, tradycyjne leczenie toksoplazmozy niesie ze sobą liczne skutki uboczne. W trakcie leczenia mogą wystąpić zarówno objawy hematologiczne (niedokrwistość megaloblastyczna, małopłytkowość, leukopenia), jak i zaburzenia neurologiczne (bóle i zawroty głowy, niezborność, napady drgawek, bezsenność i depresja), czy też zmiany na skórze i błonach śluzowych (zapalenia skóry, nieprawidłowa pigmentacja, osutka, zapalenie języka). Może też wystąpić: suchość w jamie ustnej, zaburzenia żołądkowo-jelitowe, gorączka, uszkodzenie szpiku kostnego, teratogenność, kamienica nerkowa, oporność [Int. J. Med. Sci. 2009, 6, 140; Wiad. Parazytol. 2011, 57, 87; [Mutat. Res. 1998, 415, 69; Toxicol. Lett. 1982, 10, 51; Antimicrob. Agents Chemother. 2008, 52, 1269; Drugs 2004, 64, 245; Ann. Allergy Asthma Immunol. 2008, 100, 91]. Ponadto, ze względu na wąski zakres terapeutyczny pirymetaminy (0,08-0,6 μg/ml krwi) trudno jest ustalić właściwą dawkę leku. Jak donosi Lipka i wsp. [Wiad. Parazytol. 2011, 57, 87], tylko u 58,3% leczonych dzieci odnotowano

PL 221 181 B1 odpowiednie poziomy pirymetaminy w surowicach, zaś 29,2% z wykazywało wartość niższą niż sugerowana dawka lecznicza, a 12,5% badanych wybiegało ponad tą normę.

Istota wynalazku polega na tym, że związki o wzorze 1, gdzie R i R mają wyżej podane znaczenie, stosuje się do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia toksoplazmozy. Pochodna s-triazolu może mieć różne postacie farmaceutyczne jak: tabletki, proszki, granulki, syropy, roztwory do wstrzykiwań stosując znane metody otrzymywania wraz z dodatkami.

Związki o zastosowaniu według wynalazku będące pochodnymi 1,4-dipodstawionego tiosemikarbazydu wykazują silne hamowanie proliferacji pierwotniaka Toxoplasma gondii in vitro oraz brak znaczącej cytotoksyczności względem komórek żywicielskich.

Związki 1,4-dipodstawione pochodne tiosemikarbazydu badano pod kątem ich wpływu na żywotność komórek linii L929 i linii HeLa-test MTT.

Zasada testu MTT

Oznaczenie żywotności komórek linii L929 i HeLa wykonano przy użyciu testu MTT, zgodnie z Normą Europejską: ISO 10993-5:2009(E), Biological evaluation of medical devices, Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Test MTT oparty jest na przekształceniu żółtej soli MTT (bromku 3-[4,5-dimetylotiazolo-2-ilo]-2,5-difenylotetrazoliowego) do fioletowo-niebieskiego, nierozpuszczalnego formazanu. Za tę konwersję odpowiedzialne są NADPH lub NADH, produkowane przez enzym dehydrogenazę mitochondrialną obecną w aktywnych metabolicznie komórkach. Stężenie niebieskiego produktu jest wprost proporcjonalne do liczby żywych komórek w próbce i może być mierzone spektrofotometrycznie.

Część doświadczalna

Na płytkę 96-dołkową (Nunc^TC), nanoszono komórki (L929 ATTC-Catalog No. CCL-1™ - lub HeLa-ATTC-Catalog No. CCL-2™) o gęstości 1 x 10⁴/100 μl/dołek, zawieszone w podłożu hodowlanym IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium-CytoGen) i inkubowano je (37°C, 10% CO₂) przez 24 h. Po inkubacji usuwano podłoże znad komórek i dodawano po 100 μl odpowiednich rozcieńczeń badanego związku oraz dla porównania sulfadiazynę (Sigma), których końcowe stężenia wynosiły: 1, 5, 10, 50, 100 i 500 μg/ml. Oceniano także wpływ rozpuszczalnika na żywotność komórek, w końcowym stężeniu w mikrohodowli: 0,002; 0,01; 0,02; 0,1; 0,2; 1% DMSO. Kontrolę stanowiły komórki hodowane w pełnym podłożu hodowlanym IMDM.

Po dodaniu ww. związków komórki inkubowano 24 h w 37°C, 10% CO₂. Po tym czasie hodowle obserwowano pod mikroskopem i wykonywano zdjęcia. Następnie znad monolayeru ściągano podłoże, a do każdego dołka na płytce dodawano po 50 pi MTT (C = 1 mg/ml, Sigma) i inkubowano (37°C i 5% CO₂). Po 2 h płytki wirowano (200 x g, 10 min), a kryształy formazanu rozpuszczano dodając po 150 μl DMSO/studzienkę. Barwę produktu stabilizowano dodając po 25 μl buforu glicynowego. Poziom absorbancji mierzono za pomocą czytnika ELISA, przy długości fali λ = 550 nm.

Poziom istotności p wyznaczono nieparametrycznym testem U Manna-Whitney'a za pomocą programu SigmaStat. Wyniki przy poziomie istotności p < 0,05 uznano za znamienne statystycznie. Wartości CC₃₀ (cytotoxic concentration 30 - stężenie powodujące efekt cytotoksyczny dla 30% badanych komórek) wyznaczono na podstawie analizy zależności zastosowanych stężeń badanego związku i stopnia przeżywalności komórek (Statistica 10 PL).

Wyniki

W doświadczeniu oceniono wpływ testowanych związków na żywotność komórek żywicielskich linii L929 i HeLa przy pomocy testu MTT. Za kontrolę przyjęto hodowle komórkowe inkubowane w podłożu IMDM, bez dodatku badanych związków i rozpuszczalnika (DMSO). Żywotność komórek obliczono według wzoru:

. Wartość absorbancji próby badanej

Żywotność = —-——------—;-:—: x 100%

Wartość absorbancji próby kontrolnej

T. gondii należy do obligatoryjnych pasożytów wewnątrzkomórkowych, a jego namnażanie zachodzi tylko w żywych komórkach żywicielskich. Z tego względu do badania wpływu związków na wewnątrzkomórkowe namnażanie się pierwotniaka wybrano tylko te stężenia, przy których żywotność komórek linii L929 wynosiła > 70%.

Według normy ISO 109935:2009 (E), dany związek można uznać za nietoksyczny dla komórek, jeśli nie powoduje on spadku żywotności komórek poniżej 70%, dlatego też wyznaczono wartość CC₃₀

PL 221 181 B1 odczytując ją z krzywej zależności przeżywania komórek [%] od zastosowanych stężeń związków oraz sulfadiazyny [pg/ml], wykreślonej na podstawie danych zamieszczonych odpowiednio w tab. 2 i tab. 3.

Ze względu na konieczność rozpuszczania związków w DMSO, w pierwszym etapie doświadczenia zbadano wpływ zastosowanych stężeń rozpuszczalnika na żywotność komórek linii L929. Ustalono, iż stężenia DMSO użyte w doświadczeniu nie mają istotnego wpływu na żywotność i morfologię komórek linii L929 (tab. 1).

Tab. 1 Przeżywalność komórek linii L929 w poszczególnych stężeniach DMSO ± odchylenie standardowe

Stężenie DMSO [%]	1	0,2	0,1	0,02	0,01	0,002
Komórki żywe	87,42*	92,42	93,89	92,63	95,89	96,67
[%]	± 3,45	± 11,69	± 12,86	± 7,13	± 6,22	± 3,23

* p < 0,05

Równolegle do testu MTT prowadzono obserwację mikroskopową mikrohodowli inkubowanych z różnymi stężeniami DMSO. Obserwacja komórek pod mikroskopem potwierdziła brak zmian cytopatycznych w hodowlach ze stężeniem DMSO do 1%. Oceniono także wpływ leku powszechnie stosowanego w leczeniu toksoplazmozy-sulfadiazyny na żywotność komórek linii L929. Ustalono, iż dawka CC₃₀ w przypadku sulfadiazyny wynosi > 500 μg/ml (tab. 2). Podczas analizy mikroskopowej nie zaobserwowano zmian w morfologii komórek inkubowanych z różnymi stężeniami komercyjnie dostępnego leku.

Tab. 2. Przeżywalność komórek linii L929 w poszczególnych stężeniach sulfadiazyny ± odchylenie standardowe

Stężenie [pg/ml]	500	100	50	10	5	1	CC30 ^g/ml]
komórki żywe	88,74*	98,17	93,95	94,36	95,91	99,18	> 500
[%]	± 2,74	± 0,74	± 5,87	± 5,31	± 1,86	± 3,08

* p < 0,05

Przebadano wpływ związków na żywotność komórek L929 i komórek HeLa, wyznaczając stężenia CC₃₀ dla obu linii komórkowych (Tab. 3).

Tab. 3. Przeżywalność komórek linii L929 i HeLa w zakresie stężeń 1,4-dipodstawionych pochodnych tiosemikarbazydu 1-500 μg/ml ± odchylenie standardowe

Stężenie ^g/ml]		500	100	50	10	5	1	CC30 ^g/ml]
1	2	3	4	5	6	7	8	9
1a	% żywych kom.	41,45*	79,53*	90,88*	97,51*	99,14*	102,36*	242,56
L929	± 5,16	± 5,82	± 6,71	± 5,98	± 0,82	± 3,89
	% żywych kom.	67,54*	123,75*	110,88*	89,25*	87,96*	92,85*	> 500
	HeLa	± 4,36	± 7,44	± 3,52	± 2,03	± 1,16	± 3,45
1b	% żywych kom.	48,02*	89,55*	99,04*	95,89*	92,87*	96,54*	285,52
L929	± 10,12	± 3,44	± 10,02	± 0,39	± 0,23	± 0,69
	% żywych kom.	82,65*	116,24*	105,09*	92,47*	89,90*	96,55*	> 500
	HeLa	± 2,79	± 6,12	±1,82	± 2,76	± 0,97	± 5,69
	% żywych kom.	80,40*	92,17*	90,49*	94,05*	94,44*	104,05*	> 500
1c	L929	± 2,74	± 2,31	± 2,99	± 5,13	± 2,62	± 0,12
	% żywych kom.	73,16*	70,29*	80,44*	88,34*	87,55*	93,63*	492,27
	HeLa	± 2,66	± 8,05	± 3,42	± 2,05	± 4,28	± 6,63
1d	% żywych kom.	30,28*	78,22*	84,54*	91,93*	94,01*	95,27*	187,51
L929	± 0,86	± 1,61	± 1,43	± 5,21	± 1,78	± 9,52
	% żywych kom	71,98*	101,89	99,97*	93,02*	88,79*	96,98*	> 500
	HeLa	± 4,34	± 3,71	± 2,94	± 2,10	± 3,06	± 2,74

PL 221 181 B1

Ciąg dalszy tab. 3

1	2	3	4	5	6	7	8	9
1e	% żywych kom. L929	39,76* ± 5,83	67,00* ±11,38	79,05* ± 2,89	97,32* ± 4,98	99,51* ± 5,16	102,52* ± 2,69	210,04
% żywych kom. HeLa	65,75* ± 7,77	105,06* ± 4,47	105,72* ± 5,90	95,06* ± 4,89	93,37* ± 4,43	98,12* ± 0,97	476,66

*p< 0,05

Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że 1,4-dipodstawione pochodne tiosemikarbazydu wykazują bardzo niską cytotoksyczność. Stężenie cytotoksyczne CC₃₀ w kierunku linii komórek L929 wynosiło odpowiednio: 242,56 μg/ml (dla związku 1a), 285,52 μο/ml (dla związku 1b), wyższe niż 500 μο/ml (dla związku 1c), 187,51 μο/ml (dla związku 1d), 210,04 μο/ml (dla związku 1e), zaś w kierunku linii komórek HeLa wynosiło 492,27 pg/ml (dla związku 1c) i 476,66 (dla związku 1e). Natomiast dla związków 1a, 1b, 1d było wyższe niż 500 μg/ml.

Badanie wpływu 1,4-dipodstawionych pochodnych tiosemikarbazydu na namnażanie się T. gonidii w komórkach linii L929 (test inkorporacji trytowanego uracylu).

Wpływ 1,4-dipodstawionych pochodnych tiosemikarbazydu na wewnątrzkomórkowe namnażanie się pierwotniaka T. gondii szczepu RH w komórkach linii L929 przebadano za pomocą testu wbudowywania uracylu znakowanego trytem. Kontrolę doświadczenia stanowiły komórki fibroblastów mysich zarażone pierwotniakiem i inkubowane w podłożu hodowlanym bez leku (zmierzoną wartość proliferacji przyjęto jako 100%). Wyznaczono wartość IC₅₀ (inhibitory concentration 50-stężenie powodujące zahamowanie namnażania się pierwotniaka o 50%).

Zasada reakcji ₃

Test inkorporacji ³H-uracylu polega na pomiarze poziomu radioaktywności pierwiastka-trytu ₃ ( H), który wraz z uracylem jest wychwytywany i wbudowywany do łańcucha RNA T. gondii. Mniejsza liczba zliczeń przez czytnik scyntylacyjny w porównaniu do kontroli świadczy o hamowaniu namnażania się pierwotniaka w mikrohodowli.

Część doświadczalna

24-godzinną hodowlę komórek L929 (1 x 10⁴/ml) zarażono tachyzoitami T. gondii szczepu RH w stosunku 1 komórka żywicielska: 10 komórek pierwotniaka (2 x 10⁴/50 μ^ studzienkę). Mikrohodowle inkubowano 2 h w 37°C, 10% CO₂, umożliwiając pierwotniakowi wniknięcie do komórek i utworzenie wakuoli pasożytniczej. Po tym czasie dodano po 50 μl badanego związku, uzyskując końcowe stężenia: 1-500 μg/ml, a do równoległych mikrohodowli - DMSO i sulfadiazynę, przygotowując ich następujące rozcieńczenia: 1, 5, 10, 50, 100 i 500 μg/ml. Płytki inkubowano 48h (37°C, 10% CO₂), a następnie ₃ do każdej studzienki dodawano H-uracylu (1 μ^/ 50 μθ, po czym kontynuowano inkubację przez 24 h w warunkach jw. Po tym czasie płytki zamrożono w -20°C. Przed przystąpieniem do odczytu testu płytkę rozmrażano, a zawartość studzienek zbierano na bibułę (PrintedFiltermat A), którą pozostawiano do wyschnięcia. Do pomiaru poziomu promieniowania β użyto czytnika scyntylacyjnego (WALL AC), uprzednio nasączając bibuły płynem scyntylacyjnym (BetaplateScint, PerkinElmer).

Poziom istotności p wyznaczono nieparametrycznym testem U Manna-Whitney'a za pomocą programu SigmaStat. Wyniki przy poziomie istotności p < 0,05 uznano za znamienne statystycznie. Wartości IC50 wyznaczono na podstawie analizy zależności zastosowanych stężeń badanego związku i stopnia wewnątrzkomórkowego namnażania się pasożyta (Statistica 10 PL).

Wyniki

W pierwszym etapie doświadczenia przebadano wpływ rozpuszczalnika na proliferację T. gondii w komórkach linii L929 (tab. 4).

Tab. 4 Intensywność proliferacji T. gondii w komórkach linii L929 hodowanych w obecności różnych stężeń DMSO ± odchylenie standardowe

Stężenie DMSO [%]	1	0,2	0,1	0,02	0,01	0,002
proliferacja pierwotniaka	67,79*	91,31*	102,49*	100,65*	98,33*	92,42*
[%]	± 19,92	± 28,12	± 19,35	± 15,96	± 9,68	±3 7,43

p< 0,05

PL 221 181 B1

Spadek namnażania pierwotniaka zaobserwowano jedynie w stężeniu 1% DMSO.

Kontrolę dodatnią doświadczeń nad wpływem badanego związku stanowiła mikrohodowla z sulfadiazyną, lekiem od dawna stosowanym w terapii toksoplazmozy (tab. 5).

W tabeli nr 5 dla porównania aktywności związków według wynalazku ze znanym i stosowanym lekiem zamieszczono dane o jego działaniu przeciwko T. gondii, zaś w tabeli nr 6 wskazano dane z aktywności związków według wynalazku. Jak wynika z danych związki według wynalazku wykazują wyższą skuteczność niż znany lek.

Tab. 5 Intensywność proliferacji T. gondii w komórkach linii L929 hodowanych w obecności różnych stężeń sulfadiazyny ± odchylenie standardowe

Stężenie [pg/ml]	500	100	50	10	5	1	IC50 [pg/ml]
Proliferacja pierwotniaka	66,36*	71,53*	78,73*	82,14*	79,18*	90,37*	> 500*
[%]	± 9,42	± 8,94	± 8,29	± 11,26	± 6,29	± 11,65

* p< 0,05

Wartość IC50 dla sulfadiazyny wykroczyła poza zakres badanych stężeń.

Oceniono wpływ 1,4-dipodstawionych pochodnych tiosemikarbazydu (tab. 6) na namnażanie się pierwotniaka w hodowlach komórek linii L929. Wartości stężeń IC50 odczytano z wykresów wykonanych na podstawie danych zamieszczonych w poniższej tabeli.

Tab. 6 Intensywność proliferacji T. gondii w komórkach linii L929 hodowanych w obecności 1,4-dipodstawionych pochodnych tiosemikarbazydu w zakresie stężeń 1-500 pg/ml ± odchylenie standardowe

Stężenie [pg/ml]	500	100	50	10	5	1	IC50 [pg/ml]
1a	nb.	36,52*	63,82*	83,84	84,64	90,03	74,93
		± 5,16	± 5,32	± 19,01	±15,68	±14,61
1b	nb.	37,20*	88,34	103,21	85,76	84,59	92,28
		± 7,47	± 14,40	± 19,27	±19,71	±16,61
1c	1,91*	57,59*	66,49*	60,61*	75,74	98,00	191,04
	±0,71	± 15,02	± 11,38	± 9,56	±14,62	±19,53
1d	nb.	8,10*	58,78*	112,25	107,95	98,24	59,00
		± 2,78	± 11,49	± 22,91	±24,88	±23,83
1e	nb.	nb.	12,62*	44,71*	74,94*	96,14	33,17
			±4,78	± 16,60	± 7,00	±14,54

*p < 0,05; nb. - nie badano

Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że 1,4-dipodstawione pochodne tiosemikarbazydu wykazują hamowanie proliferacji T. gondii przy stężeniu wyrażonym jako IC₅₀ niższym niż stosowanego leku sulfadiazyny (IC₅₀ > 500 μg/ml).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie pochodnych 1,4-dipodstawionego tiosemikarbazydu o wzorze ogólnym 1, ₁ gdzie R¹ oznacza 4-metylo-1,2,3-tiadiazol-5-yl, 2-metylofuran-3-yl lub tiofen-2yl, zaś R oznacza 2-bromofenyl, 2,4-difluorofenyl, etyl, 2-metylofenyl lub 4-fluorofenyl do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia toksoplazmozy.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym pochodne 1,4-dipodstawionego tiosemikarbazydu stosuje się do wytwarzania leku w postaci tabletki, proszku, granulek, kapsułek, syropu, roztworu do wstrzykiwań.