PL222513B1 - Sposób określania sekwencji preferowanych przez białko lub jego domeny wiążące specyficznie sekwencje w hybrydzie DNA-RNA - Google Patents

Sposób określania sekwencji preferowanych przez białko lub jego domeny wiążące specyficznie sekwencje w hybrydzie DNA-RNA

Info

Publication number
PL222513B1
PL222513B1 PL395180A PL39518011A PL222513B1 PL 222513 B1 PL222513 B1 PL 222513B1 PL 395180 A PL395180 A PL 395180A PL 39518011 A PL39518011 A PL 39518011A PL 222513 B1 PL222513 B1 PL 222513B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
dna
rna
protein
domain
zinc finger
Prior art date
Application number
PL395180A
Other languages
English (en)
Other versions
PL395180A1 (pl
Inventor
Janusz Marek Bujnicki
Agata Kamaszewska
Krzysztof Jerzy Skowronek
Original Assignee
Międzynarodowy Inst Biologii Molekularnej I Komórkowej W Warszawie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Międzynarodowy Inst Biologii Molekularnej I Komórkowej W Warszawie filed Critical Międzynarodowy Inst Biologii Molekularnej I Komórkowej W Warszawie
Priority to PL395180A priority Critical patent/PL222513B1/pl
Priority to KR1020137032517A priority patent/KR20140066977A/ko
Priority to DK12735348.0T priority patent/DK2718430T3/en
Priority to ES12735348.0T priority patent/ES2557633T3/es
Priority to EP12735348.0A priority patent/EP2718430B1/en
Priority to CN201280027647.2A priority patent/CN103764820A/zh
Priority to JP2014514834A priority patent/JP6022556B2/ja
Priority to EP20140180902 priority patent/EP2857506A3/en
Priority to CA2837503A priority patent/CA2837503C/en
Priority to PCT/PL2012/050019 priority patent/WO2012169916A2/en
Priority to AU2012267270A priority patent/AU2012267270B2/en
Publication of PL395180A1 publication Critical patent/PL395180A1/pl
Priority to US14/095,351 priority patent/US9353358B2/en
Publication of PL222513B1 publication Critical patent/PL222513B1/pl

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób ustalania sekwencji preferowanych przez białko lub jego domeny wiążące specyficznie sekwencje w hybrydzie DNA-RNA, prezentowany wynalazek ma zastosowanie w genetyce.
Opisana poniżej metoda znajduje zastosowanie do ustalania preferencji substratowych wszelkich białek wiążących specyficzne sekwencje w hybrydzie DNA-RNA. Metoda może stanowić uzupełnienie procedury inżynierii specyficzności takich białek. Białka wiążące hybrydy DNA-RNA w sekwencyjnie specyficzny sposób mogą znaleźć zastosowanie w diagnostyce niektórych wirusów RNA (np. wirusy onkogenne, retrowirusy, zapalenia wątroby typu B, grypy), które replikują się przez przejściowe utworzenie nici DNA na matrycy RNA. Takie białka mogą znaleźć zastosowanie również w inżynierii białek do uzyskiwania enzymów o nowych nieznanych specyficznościach np. w fuzji z nukleazą.
W dokumencie WO2011022427 wskazano metodę (SELEX™) polegającą na tym, że w celu identyfikacji preferowanych sekwencji, kolejno przeprowadza się etapy:
- kontaktowania mieszaniny kwasów nukleinowych z cząsteczką docelową, np. białkiem;
- oddzielania niezwiązanych kwasów nukleinowych od kwasów nukleinowych wiążących się z cząsteczką docelową;
- amplifikacji związanych kwasów nukleinowych; i opcjonalnie
- powtarzania poprzedzających etapów.
Przedmiotem wynalazku jest sposób określenia sekwencji preferowanych przez białko lub domenę białka, które to białko lub domena wiążąca obejmuje palec cynkowy, wiążący specyficznie s ekwencje w hybrydach DNA-RNA, charakteryzujący się tym, że obejmuje:
a) kontaktowanie oczyszczonego białka lub jego domeny z mieszaniną substratów stanowiącą bibliotekę cząsteczek hybryd DNA-RNA zawierających zróżnicowane sekwencje w części centralnej, korzystnie randomizowany fragment 9 lub 10 nukleotydowy, oflankowane stałymi, znanymi sekwencjami i umożliwienie testowanemu białku lub domenie na związanie się z sekwencją, do której ma powinowactwo;
b) oddzielanie niezwiązanych hybryd DNA-RNA poprzez imobilizowanie białka lub jego domeny, ze związaną hybrydą DNA-RNA. na złożu, korzystnie agarozie z glutationem;
c) usuwanie niezwiązanych hybryd;
d) izolowanie rekombinowanego białka wraz ze związanymi z nimi hybrydami DNA-RNA, korzystnie poprzez dodanie buforu zawierającego glutation;
e) amplifikowanie wyizolowanych hybryd za pomocą PCR, korzystnie RT-PCR, przy czym do amplifikacji używa się startery komplementarne do niezmiennych sekwencji znajdujących się na flankach randomizowanego regionu a w trakcie reakcji PCR na jednym starterze dodawana jest sekwencja promotora polimerazy RNA do uzyskania dwuniciowego DNA do transkrypcji in vitro z wykorzystaniem polimerazy RNA;
f) odwrotną transkrypcję z użyciem odwrotnej transkryptazy z usuniętą aktywnością rybonukleazy H oraz startera DNA komplementarnego do końca 3' matrycy RNA w celu uzyskania hybryd DNA-RNA do zawracania do etapu a).
Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja promotora obejm uje sekwencję promotora dla polimerazy RNA T7, a polimerazą RNA jest polimeraza RNA T7.
Korzystnie, białkiem lub jego domeną wiążącą jest białko rekombinowane lub domena rekombinowana, którą jest fuzja rybonukleazy HI oraz palca cynkowego
Korzystnie, białkiem lub jego domeną wiążącą jest fuzja domeny palca cynkowego i domeny transferazy-S glutationowej (GST).
Korzystniej sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że jako palec cynkowy stosuje się Zf-QQR.
Aby ustalić pełny zakres sekwencji rozpoznawanych przez białko wiążące specyficzną sekw encję w hybrydzie DNA-RNA, opracowano modyfikację metody SELEX, przedstawioną w prezentowanym wynalazku, umożliwiającą wielokrotne powtarzanie cykli selekcji sekwencji preferencyjnie wiązanej przez badany ligand (fig. 1). Nowym elementem tego procesu jest sposób amplifikacji i odtworzenia wyselekcjonowanych hybryd DNA-RNA, tak aby można je było wykorzystać w kolejnym cyklu. Polega on na amplifikacji przy użyciu PCR biblioteki oligonukleotydów DNA zawierających w części centralnej sekwencję zdegenerowaną, którą po obu stronach otaczają sekwencje niezmienne, w tym
PL 222 513 B1 sekwencja promotora dla polimerazy RNA T7. Otrzymane DNA służy jako matryca do syntezy nici RNA z wykorzystaniem polimerazy T7. Na uzyskanej w ten sposób puli jednoniciowego RNA przeprowadzana jest odwrotna transkrypcja, w celu uzyskania biblioteki hybryd DNA-RNA. Odwrotna transkryptaza wydłuża starter komplementarny do stałej sekwencji obecnej na końcu 3' RNA. Użycie e nzymu z usuniętą aktywnością rybonukleazy H powoduje, że matrycowe RNA nie jest degradowane, co pozwala na powstanie hybrydy składającej się z w pełni komplementarnego RNA i DNA. Uzyskiwana jest w ten sposób biblioteka hybryd DNA-RNA, gdyż wyjściowa matryca RNA składa się z heterogennych pod względem sekwencji (w centralnej części) cząsteczek. Skuteczność opracowanej modyfikacji metody SELEX potwierdzono z wykorzystaniem palca cynkowego Zf-QQR jako ligandu wiążącego hybrydę DNA-RNA. Zf-QQR jest uzyskanym w wyniku inżynierii palcem cynkowym, który wiąże sekwencję 5'-GGGGAAGAA-3' w nici DNA hybrydy DNA-RNA (Shi i Berg. Specific DNA-RNA hybrid binding by zinc finger proteins. 1995. Science, vol. 268). Do niniejszego przykładu użyto fuzję Zf-QQR z domeną GST (ang. Glutathione S-transferase).
Przykładowe realizacje wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym:
Fig. 1 przedstawia schemat reprezentujący poszczególne etapy jednej rundy zmodyfikowanej procedury SELEX według wynalazku,
Fig. 2 prezentuje sekwencje oligonukleotydowych matryc DNA służących do otrzymywania jednoniciowego RNA w procesie transkrypcji in vitro przy użyciu polimerazy RNA bakteriofaga T7, sekwencja oznaczona literą A nie zawiera miejsca wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR i posiada unikalne miejsce trawienia dla enzymu restrykcyjnego XhoI, sekwencja oznaczona literą B zawiera sekwencję wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR., sekwencja oznaczona jako 9N, w miejscu wiązania przez palec cynkowy zawiera dziewięcionukleotydowy region zdegenerowany (pojedynczy zdegenerowany nukleotyd oznaczono „N”),
Fig. 3 ilustruje sekwencje starterów 1 i 2 DNA stosowanych do amplifikacji dwuniciowego DNA w reakcji PCR, starter 2 był również stosowany w reakcji odwrotnej transkrypcji,
Fig. 4 przedstawia rozdział fragmentów DNA przeprowadzony w 15% denaturującym żelu poliakrylamidowym zawierającym 6 M mocznik, koniec 5' nici DNA o długości 55 nukleotydów oraz startera 2 wyznakowano radioaktywnie izotopem fosforu 33, opis poszczególnych torów w żelu: Tor 1: 0,5 μmola wyznakowanego radioaktywnie izotopem fosforu 33 startera 2, Tor 2: 0,25 μmola produktu odwrotnej transkrypcji, Tor 3: 0,25 μmola oligonukleotydu DNA o długości 55 nukleotydów,
Fig. 5. prezentuje rozdział fragmentów DNA przeprowadzony w 15% natywnym żelu poliakrylamidowym, koniec 5' nici DNA oligonukleotydu o długości 55 oraz startera 2 wyznakowano radioaktywnie izotopem fosforu 33, opis poszczególnych torów w żelu:Tor 1: 0,5 μmola wyznakowanego radioaktywnie izotopem fosforu 33 startera 2, Tor 2: 0,25 μmola produktu odwrotnej transkrypcji, Tor 3: 0,25 μmola produktu odwrotnej transkrypcji trawione 5 jednostkami rybonukleazy H, Tor 4: 0,25 μmola produktu odwrotnej transkrypcji trawione 1 jednostką rybonukleazy H, Tor 5: 0,25 μmola oligonukleotydu DNA o długości 55 nukleotydów,
Fig. 6 ilustruje sekwencje starterów wykorzystywanych do przygotowania konstruktu DNA fuzji genu kodującego domenę GST z genem kodującym palec cynkowy Zf-QQR,
Fig. 7 przedstawia sekwencje genu kodującego fuzję domeny GST z palcem cynkowym Zf-QQR,
Fig. 8. prezentuje wykres słupkowy ilustrujący zmianę proporcji pomiędzy dwuniciowym DNA zawierającym sekwencję miejsca wiązania dla palec cynkowy Zf-QQR (A), a niezawierającym sekwencji wiązanej przez Zf-QQR (B) w kolejnych rundach procedury SELEX („O” oznacza materiał wyjściowy mieszaninę hybrydy A z B w stosunku 1:10000, I-V numery kolejnych rund),
Fig. 9 przedstawia listę 40 sekwencji uzyskanych po zsekwencjonowaniu DNA uzyskanego na matrycy hybrydy DNA-RNA po zakończeniu pięciu rund zmodyfikowanej procedury SELEX przeprowadzonej na ligandzie palcu cynkowym Zf-QQR i sekwencji zawierającej 9-nukleotydowy rejon zdegenerowany i uzyskane sekwencje regionu zmiennego,
Fig. 10. prezentuje logo sekwencyjne uzyskane na podstawie 40 sekwencji przy użyciu progr amu WebLogo,
Fig. 11 ilustruje sekwencje hybryd DNA-RNA wykorzystywanych do oznaczania stałej KD dla palca cynkowego Zf-QQR, gdzie fig. 11a to hybryda z miejscem opisywanym w literaturze, a fig 11b, to Hybryda z sekwencją konsensusową po 5 rundach SELEX, a
PL 222 513 B1
Fig. 12 to wykres zależności ilości, wyrażanej w procentach, zatrzymywanego na filtrze nitrocelulozowym wyznakowanego radioaktywnie fosforem 33 substratu od stężenia palca cynkowego Zf-QQR w mieszaninie reakcyjnej.
Przykład 1
Przygotowanie substratu hybrydy DNA-RNA
Zsyntetyzowano trzy jednoniciowe DNA o długości 78 nukleotydów (fig. 2). Oligonukleotydy posłużyły jako matryca do utworzenia dwuniciowego DNA przy użyciu techniki PCR. Reakcję prowadzono w 50 pl, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 200 pM dNTP mix, po 10 pmoli każdego startera 1 i 2 (fig. 3), ok. 0,1 pmola matrycy i 1 jednostką Phusion polimerazy (New England Biolabs). Warunki reakcji: wstępna denaturacja 98°C 1 min, następnie 15 cykli po 15 s denaturacji w 98°C, 15 s renaturacji w temp. 72°C (co 1 cykl obniżana temperatura renaturacji o 1°C aż do 58°C) i 2 s wydłużania w 72°C, po czym 10 cykli po 15 s denaturacji w 98°C, 15 s renaturacji w temp. 58°C i 2 s wydłużania w 72°C. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i fazę wodną precypitowano przy użyciu 0,5 M octanu sodu pH 4,5 oraz 64% etanolu (stężenia końcowe) w -20°C przez 30 min. Następnie próbkę wirowano przez 30 min 20000 g w 4°C, płukano 500 pl 70% etanolu i ponownie wirowano przez 5 min 20000g w 4°C. Osad suszono i zawieszano w wodzie.
Jednoniciowe RNA uzyskiwano w reakcji transkrypcji wykorzystując obecność sekwencji prom otora dla polimerazy RNA bakteriofaga T7 w dwuniciowym DNA matrycowym przy użyciu zestawu do transkrypcji MEGAshortscript™ T7 (Ambion). Reakcję prowadzono w 10 pl, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 7,5 mM NTP mix, 200-500 ng DNA i 0,5 pl mieszaniny enzymów przez 8 godz. w 37°C. Rozdział produktów po transkrypcji przeprowadzono w 15% denaturującym żelu p oliakrylamidowym zawierającym 6 M mocznik i w buforze TBE (0,1 M Tris pH 8.3, 90 mM kwasu borowego oraz 2 mM EDTA). Po zakończeniu rozdziału żel inkubowano 2 min w roztworze bromku etydyny o końcowym stężeniu 0,5 pg/ml. Prążki uwidaczniano w świetle UV. Wycinano prążek odpowiadający oligonukleotydowi o długości 55 nukleotydów. Wycięte fragmenty żelu umieszczano w probówce typu eppendorf i rozdrabniano. Elucję RNA z żelu prowadzono w 4 °C, przez noc z wytrząsaniem, po dodaniu 500 pl 2 M roztworu octanu amonu pH 5,3 i 1 mM EDTA. Supernatant oddzielano od fragmentów żelu przy użyciu kolumienek Costar Spin X (Corning Life Sciences) i wirowania w temp. pokojowej 1 min 20000 g. Następnie próbkę wtrącano i suszono (opis jak wyżej).
Hybrydę DNA-RNA otrzymywano na matrycy jednoniciowego RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy z usuniętą aktywnością rybonukleazy H. 200 pmoli startera 2 (fig. 3) i 200 pmoli jednoniciowego RNA inkubowano 2 min w 70°C, a następnie 2 min na lodzie. Tak przygotowaną matrycę poddawano odwrotnej transkrypcji. Reakcję prowadzono w 40 pl, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 1 mM dNTP mix, 200 pmoli matrycy z starterem, 40 jednostek RiboLock (Fermentas) i 400 jednostek RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (Fermentas) przez 2 godz. w 42°C. Mieszaninę reakcyjną odczyszczano od buforu oraz dNTP przy użyciu złoża G-25 (Sigma Aldrich).
W celu potwierdzenia, że opracowany protokół prowadzi do uzyskania hybrydy DNA-RNA wykonano odwrotną transkrypcję (opis jak wyżej) przy użyciu wyznakowanego radioaktywnie izotopem fosforu 33 startera 2. Syntezę właściwej wielkości DNA (spodziewana długość to 55 nukleotydów) potwierdzono na podstawie porównania wielkości uzyskanego DNA i oligonukleotydu kontrolnego o wielkości 55 nukleotydów. Rozdział próbek prowadzono w 15% denaturującym żelu poliakrylamidowym zawierającym 6 M mocznik w buforze TBE (fig. 4). Prawidłowe utworzenie hybrydy DNA-RNA potwierdzono prowadząc rozdział produktu odwrotnej transkrypcji, produktów trawienia uzyskanej hybrydy DNA-RNA przez rybonukleazę H oraz oligonukleotydu kontrolnego o wielkości 55 nukleotydów w 15% natywnym żelu poliakrylamidowym w buforze TBE (fig. 5). Trawienie nici RNA hybrydy DNA-RNA prowadzono w 10 pl w buforze od producenta, 1 i 5 jednostek rybonukleazy H (Fermentas) przez 30 min w 37°C.
P r z y k ł a d 2
Klonowanie, ekspresja i oczyszczanie białka fuzji GST z palcem cynkowym Zf-QQR
W celu uzyskania fuzji palca cynkowego z domeną GST, gen kodujący Zf-QQR wklonowano do wektora ekspresyjnego pGEX-4T-1 (Amersham). Zamówiono syntezę genu kodującego palec cynkowy Zf-QQR z firmy Epoch Life Sciences na podstawie sekwencji aminokwasowej z artykułu Shi Y., Berg JM. „Specific DNA-RNA hybrid binding proteins”. Science. 1995. Vol. 268, 282-284). DNA kodujące Zf-QQR amplifikowano przy użyciu techniki PCR. Reakcję prowadzono w 50 pl, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 200 mM dNTP mix, po 50 pmoli każdego startera ZFf i ZFr (fig. 6), ok. 0,1 pg matrycy i 1 jednostką Phusion polimerazy (New England Biolabs). W arunki reakcji:
PL 222 513 B1 wstępna denaturacja 98°C 1 min, następnie 25 cykli po 15 s denaturacji w 98°C, 15 s renaturacji w temp. 60°C i 1 min wydłużania w 72°C. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i precypitowano (opis jak wyżej). DNA kodujące palec cynkowy Zf-QQR oraz DNA wektora pGEX-4T-1 zostało strawione enzymami restrykcyjnymi Smal i XhoI (enzymy pochodziły z firmy Fermentas). Reakcje trawienia przy użyciu Smal prowadzono w buforze IX Yellow zgodnie z zaleceniami producenta, 1 jednostkę enzymu na 1 μg DNA przez 1 godz. w 30°C. Po tym czasie dodawano buforu do końcowego stężenia w reakcji 2X Yellow, 1 jednostkę enzymu Xhol na 1 μg DNA przez 1 godz. w 37°C. Mieszaninę reakcyjną rozdzielano w 0,7% żelu agarozowym w buforze TAE (40 mM Tris-base, 18,8 mM kwas octowy, 1 mM EDTA) i fragmenty odpowiadające oczekiwanym wielkościom reizolowano z żelu przy użyciu zestawu do reizolacji z żelu agarozowego (Gel out, A&A Biotechnology). Następnie 50 ng reizolowanego DNA kodującego palec cynkowy Zf-QQR oraz 25 ng przeciętego wektora pGEX-4T-1 poddano działaniu ligazy DNA bakteriofaga T4 (Fermentas, reakcja prowadzona zgodnie z zaleceniami producenta w dostarczonym buforze) w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Ligazę dezaktywowano termicznie przez inkubację w 75°C przez 10 min. Następnie używano mieszaniny ligacyjnej do transformacji.
100 μl wcześniej przygotowanych bakterii kompetentnych (szczep Escherichia coli Top10: F- mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ801acZ AM15 AlacX74 deoR recA1 araD139 A(araA-leu)7697 galK PSL endA1 nupG [Invitrogen], metody przygotowania komórek kompetentnych za Sambrook J., Firtsh E.F., Maniatis T. „Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2nd edition. 1989. Cold Spring Harbor, N. Y. Cold Spring Harbor laboratory Press” rozmrażano w lodzie, dodawano do nich DNA plazmidowy (10-50 ng na 50 μl komórek bakteryjnych) i pozostawiono w lodzie na 30 min. Po tym czasie, bakterie poddano szokowi termicznemu inkubując w temp. 42°C przez 1 min, a następnie schładzano w lodzie przez 2 min. Komórki inkubowano w temp. 37°C po dodaniu 800 μl płynnego LB (bakto-trypton 1%, ekstrakt drożdżowy 0,5%, NaCl 1%) przez 1 godz. i wysiewano na płytki ze stałym LB (skład jak w yżej, dodatkowo 1,5% (w/v) agar-agar) uzupełnionym końcowym stężeniem 100 μg/ml ampicyliny, inkubowano przez noc w 37°C. Selekcja odpowiednich transformantów zawierających pożądane rekombinanty bazowała na analizie mapy restrykcyjnej, a następnie sekwencjonowano próbki w celu potwierdzenia poprawności sekwencyjnej konstruktu.
Plazmid pGEX-4T-1 z genem kodującym palec cynkowy Zf-QQR transformowano do szczepu E. coli BL21(DE3): F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) X(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) [Promega]. Kilkoma koloniami transformantów zaszczepiano 25 ml płynnej pożywki LB, uzupełnioną 100 μg/ml ampicyliną i 1% glukozą i inkubowano przez noc w temp. 37°C. Następnie zaszczepiano w stosunku 1:50, 500 ml płynnego LB uzupełnionego 100 μg/ml ampicyliną, inkubowano z wytrząsaniem w temp. 37°C przez 2 godz. Po tym czasie dodawano IPTG (końcowe stężenie 1 mM) i inkubowano z wytrząsaniem w 25°C przez 5 godz. Po indukcji hodowle wirowano przy 4000 rpm w temp. 4°C przez 10 min. płukano 2 ml STE, wirowano 10000 g 10 min i osad zamrażano w -20°C. Uzyskany osad z hodowli, zawieszano w 35 ml buforu PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,3, 5 mM DTT), a następnie komórki bakteryjne dezintegrowano za pomocą jednokrotnego przepuszczenia przez prasę Frencha (Constant Systems LTD) przy nadciśnieniu 1360 atmosfer. Lizaty klarowano przez odwirowanie nierozpuszczalnego peletu w ultrawirówce przy 20000 g w temp. 4°C przez 20 min.
1000 μl złoża Gluthathione Sepharose (GE Healthcare) równoważono buforem PBS w probówce typu falkon, po czym wirowano 30 s, 1000 g, 4°C i usuwano supernatant. Do tak przygotowanego złoża, dodawano supernatant pochodzący z odwirowanego lizatu po dezintegracji i inkubowano z łagodnym mieszaniem w temp. pokojowej przez 30-60 min. Po tym czasie wirowano 5 min, 1000 g, w temp. pokojowej i usuwano supernatant, a złoże ze związanym białkiem płukano trzy razy po 5 ml buforu PBS, za każdym razem wirując 5 min przy 1000 g w temp. pokojowej i usuwając supernatant. Następnym etapem była elucja, którą p owtarzano dwa razy, po 200 pl buforu E (50 mM Tris-HCl, 10 mM zredukowanego glutationu pH 8,0, 5 mM DTT), inkubacja 10 min w temp. pokojowej. Po każdej inkubacji wirowano 2 min przy 1000 g w temp. pokojowej i przenoszono supernatant do probówki. Bufor elucyjny zmieniano na bufor do przechowywania (25 mM Tris pH 8,0, 100 mM KCl, 10% glicerol, 2 mM DTT) przy użyciu złoża G-25 (Sigma Aldrich). Tak przygotowane białko przechowywano w temp -20°C.
PL 222 513 B1
Przykład 3
Wiązanie białka z hybrydą DNA-RNA, odpłukanie niezwiązanych cząsteczek i elucja kompleksu białko-hybryda DNA-RNA ze złoża
Reakcję wiązania się palca cynkowego Zf-QQR z hybrydą DNA-RNA przeprowadzano w 40 pl zawierała: 200 pmole hybrydy DNA-RNA, 1 pmol fuzji GST z palcem cynkowym Zf-QQR, 25 mM Tris pH 8,0, 100 mM KCl, 20 pM ZnSO4, 2 mM DTT. Reakcję prowadzono w temp. pokojowej przez 30 min. Po tym czasie mieszaninę dodawano do 7,5 pl złoża Gluthathione Sepharose i inkubowano przez 30 min w Thermomixer compact (Eppendorf), w 22°C, wytrząsając 1400 rpm. W następnym etapie płukano złoże trzy razy po 100 pl buforu P (25 mM Tris pH 8,0, 100 mM KCl, 20 pM ZnSO4, mM DTT), za każdym razem wirując 2 min przy 1000 g w temp. pokojowej i usuwając supernatant. Następnym etapem była elucja, którą powtarzano dwa razy, po 30 pl buforu E z inkubacją 10 min w temp. pokojowej. Po każdej inkubacji wirowano 2 min przy 1000 g w temp. pokojowej i przenoszono supernatant do probówki. 5 pl eluatu zawierającego fuzję GST z palcem cynkowym ze związaną h ybrydą DNA-RNA poddawano reakcji amplifikacji przy użyciu techniki PCR, transkrypcji i odwrotnej transkrypcji (opis jak wyżej). Uzyskana w ten sposób hybryda stanowiła materiał wyjściowy do kolejnej rundy SELEX.
P r z y k ł a d 4
Kontrola SELEX
Wykonano kontrolę opracowanej modyfikacji metody SELEX na mieszaninie hybrydy DNA-RNA zawierającej miejsce wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR (hybryda A, powstaje na matrycy A, fig. 2) i niezawierającej takiego miejsca, w zamian wprowadzono sekwencję trawienie dla XhoI (hybryda B, powstaje na matrycy B, fig. 2). Przeprowadzono pięć rund SELEX na puli sekwencji kontrolnych składających się z mieszaniny, w stosunku 1:10000 hybrydy A do B. W celu rozróżnienia obu sekwe ncji, 100 ng DNA powstałego w wyniku amplifikacji przy użyciu techniki PCR eluatu po każdej rundzie trawiono 2 jednostkami enzymu Xhol przez 16 godz. w 37°C. Produkty trawienia rozdzielano w 15% natywnym żelu poliakrylamidowym w buforze TBE. Po zakończeniu rozdziału żel inkubowano 2 min w roztworze bromku etydyny o końcowym stężeniu 0,5 pg/ml. Prążki uwidaczniano w świetle UV przy użyciu zestawu do cyfrowej archiwizacji zdjęć Fluoro-S Multilmager (BioRad). Zmierzono intensywność prążków odpowiadających wielkościom niestrawionego DNA (78 par zasad) oraz produktów trawienia (55 i 23 par zasad) przy użyciu programu Quantity One (BioRad) i obliczono wzajemne proporcje DNA powstającego na matrycy hybrydy DNA-RNA po każdej rundzie (fig. 8). Po pięciu rundach z wykorzystaniem fuzji GST i palca cynkowego Zf-QQR, proporcje DNA z miejscem wiązania i bez takiego miejsca zmieniły się do 1:1,7. Oznacza to, że w wyniku zastosowania SELEX pulę sekwencji kontrolnych wzbogacono 8500 razy w sekwencję specyficznie wiązaną przez Zf-QQR.
P r z y k ł a d 5
SELEX na bibliotece hybryd DNA-RNA
W następnym etapie, wykorzystano bibliotekę hybryd DNA-RNA zawierającą losową sekwencję centralną (bibliotekę generowano na matrycy 9N, fig. 2) do przeprowadzenia procedury SELEX i ustalenia rzeczywistej preferencji sekwencyjnej palca cynkowego Zf-QQR. 500 ng DNA produktu PCR uzyskanego na matrycy eluatu po piątej rundzie SELEX trawiono 5 jednostkami enzymu Xbal (Fermentas) w buforze od producenta przez 3 godz. w 37°C. Produkty trawienia rozdzielano w 15% natywnym żelu poliakrylamidowym w buforze TBE. Po zakończeniu rozdziału żel inkubowano 2 min w roztworze bromku etydyny o końcowym stężeniu 0,5 pg/ml. Prążki uwidaczniano w świetle UV, wycinano prążek odpowiadający fragmentowi o długości 43 par zasad i izolowano z żelu (opis jak wyżej). W celu uzyskania konkatamerów, 100 ng fragmentów DNA poddano działaniu ligazy DNA bakteriofaga T4 (Fermentas) w buforze od producenta w temperaturze pokojowej przez 3 godz. Ligazę dezaktywowano termicznie przez inkubację w 75°C przez 10 min. 200 ng DNA plazmidowe wektora pUC18 (Fermentas) trawiono enzymem Xbal w buforze od producenta przez 3 godz. w 37°C. Mieszaninę reakcyjną rozdzielano w 0,7% żelu agarozowym w buforze TAE i fragmenty odpowiadające oczekiwanym wielkościom reizolowano z żelu przy użyciu zestawu do reizolacji z żelu agarozowego (Gel out, A&A Biotechnology). Tak przygotowany wektor oraz konkatamery poddano działaniu ligazy DNA bakteriofaga T4 (opis jak wyżej) a następnie transformowano do 100 pl wcześniej przygotowanych bakterii kompetentnych E. coli Top 10 (opis jak wyżej). Komórki wysiewano na płytki ze stałym LB (skład jak wyżej, dodatkowo 1,5% (w/v) agar-agar) uzupełnionym końcowym stężeniem 100 pg/ml ampicyliny, 40 pg/ml X-gal, ImM IPTG i inkubowano przez noc w 37°C. Selekcja odpowiednich transformantów zawierających pożądane rekombinanty bazowała na analizie koloru kolonii, następnie przeprowadzono
PL 222 513 B1 analizę sekwencyjną 12 klonów, które w sumie zawierały 40 fragmentów uzyskanych po procedurze SELEX (fig. 9). Na tej podstawie ustalono, że Zf-QQR wiąże sekwencję konsensusową 5'-GGNCGGNGGG-3', logo sekwencyjne (fig. 10) uzyskano przy użyciu programu WebLogo (Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE WebLogo: A sequence logo generator, Genome Research, 14:1188-1190, (2004); Schneider TD, Stephens RM. 1990. Sequence Logos: A New Way to Display Consensus Sequences. Nucleic Acids Res. 18:6097-6100).
Przykład 6
Wiązanie palca cynkowego Zf-QQR do sekwencji konsensusowej
W celu potwierdzenia, że uzyskana po pięciu rundach SELEX sekwencja konsensusową jest wiązana przez palec cynkowy, wykonano pomiar stałej KD przy wykorzystaniu metody wiązania na filtrze nitrocelulozowym. Wykonano pomiar dla substratu opisanego w literaturze i sekwencji konsensusowej (fig. 11) wyznakowanych radioaktywnie izotopem fosforu 33. Reakcja wiązania zawierała: 2 nM wyznakowanego substratu , 2 gg poli dl-dC niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris pH 8,0, 100 mM KCl, 20 pM ZnSO4 2 mM DTT. Mieszaninę inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej, po czym niezwłocznie przesączano przez filtr nitrocelulozowy i płukano 8 objętościami mieszaniny reakcyjnej buforu 25 mM Tris pH 8,0, 100 mM KCl, 20 gM ZnSO4, 2 mM DTT.
Pomiar intensywności zatrzymanego sygnału pochodzącego od radioaktywnie wyznakowanego substratu dokonywano na audioradiogramie filtru nitrocelulozowego przy użyciu skanera Typhoon Trio oraz oprogramowania ImageQuant TL. Stałe wiązania KD dla obydwu substratów są zbliżone, 188±38 nM dla hybrydy posiadającej miejsce wiązania opisane w literaturze oraz 155±32 nM dla sekwencji konsensusowej (fig. 12).

Claims (5)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób określania sekwencji preferowanych przez białko(a) lub jego(ich) domeny wiążące, które to białko lub domena wiążąca obejmuje palec cynkowy wiążący specyficznie sekwencje w h ybrydach DNA-RNA, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
    a) kontaktowanie oczyszczonego białka lub jego domeny z mieszaniną substratów stanowiącą bibliotekę cząsteczek hybryd DNA-RNA zawierających zróżnicowane sekwencje w części centralnej, korzystnie randomizowany fragment 9 lub 10 nukleotydowy, oflankowane stałymi sekwencjami i umożliwienie testowanemu białku lub domenie na związanie się z sekwencją, do której ma powinowactwo;
    b) oddzielanie niezwiązanych hybryd DNA-RNA poprzez immobilizowanie białka lub jego domeny ze związaną hybrydą DNA-RNA na złożu, korzystnie agarozie z glutationem;
    c) usuwanie niezwiązanych hybryd;
    d) izolowanie rekombinowanego białka razem ze związanymi z nim hybrydami DNA-RNA, korzystnie poprzez dodanie buforu zawierającego glutation;
    e) amplifikowanie wyizolowanych hybryd za pomocą PCR, korzystnie RT-PCR, przy czym do amplifikacji używa się starterów komplementarnych do niezmiennych sekwencji znajdujących się na flankach randomizowanego regionu, a w trakcie reakcji PCR na jednym starterze dodawana jest sekwencja promotora polimerazy RNA do uzyskania dwuniciowego DNA do transkrypcji in vitro z wykorzystaniem polimerazy RNA;
    f) odwrotną transkrypcję z użyciem odwrotnej transkryptazy z usuniętą aktywnością rybonukleazy H oraz startera DNA komplementarnego do końca 3' matrycy RNA w celu uzyskania hybryd DNA-RNA, korzystnie do zawracania do etapu a).
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja promotora obejmuje sekwencję promotora dla polimerazy RNA T7, a polimerazą RNA jest polimeraza RNA T7.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że białkiem lub jego domeną wiążącą jest białko rekombinowane lub domena rekombinowana, którą jest fuzja rybonukleazy HI oraz palca cynkowego.
  4. 4. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-3, znamienny tym, że białkiem lub jego domeną wiążąca jest fuzja domeny palca cynkowego i domeny transferazy-S glutationowej (GST).
  5. 5. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że palcem cynkowym jest Zf-QQR.
PL395180A 2011-06-08 2011-06-08 Sposób określania sekwencji preferowanych przez białko lub jego domeny wiążące specyficznie sekwencje w hybrydzie DNA-RNA PL222513B1 (pl)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL395180A PL222513B1 (pl) 2011-06-08 2011-06-08 Sposób określania sekwencji preferowanych przez białko lub jego domeny wiążące specyficznie sekwencje w hybrydzie DNA-RNA
CN201280027647.2A CN103764820A (zh) 2011-06-08 2012-06-07 序列特异性工程改造的核糖核酸酶h和用于确定dna-rna杂交物结合蛋白序列偏好的方法
DK12735348.0T DK2718430T3 (en) 2011-06-08 2012-06-07 Technically designed sequence-specific ribonuclease H AND METHOD FOR ESTABLISHING SEKVENSPREFERENCEN OF DNA-RNA hybrid binding proteins
ES12735348.0T ES2557633T3 (es) 2011-06-08 2012-06-07 Ribonucleasa H modificada por ingeniería específica de secuencia y el método para determinar la preferencia de secuencia de proteínas de unión de híbrido de ADN-ARN
EP12735348.0A EP2718430B1 (en) 2011-06-08 2012-06-07 Sequence-specific engineered ribonuclease h and the method for determining the sequence preference of dna-rna hybrid binding proteins
KR1020137032517A KR20140066977A (ko) 2011-06-08 2012-06-07 서열-특이적 조작된 리보뉴클레아제 ｈ 및 ｄｎａ－ｒｎａ 하이브리드 결합 단백질의 서열 선호도를 측정하는 방법
JP2014514834A JP6022556B2 (ja) 2011-06-08 2012-06-07 配列特異的な操作されたリボヌクレアーゼｈ、および、ｄｎａ−ｒｎａハイブリッド結合タンパク質の配列優先性を決定する方法
EP20140180902 EP2857506A3 (en) 2011-06-08 2012-06-07 Sequence-specific engineered ribonuclease H and the method for determining the sequence preference of DNA-RNA hybrid binding proteins
CA2837503A CA2837503C (en) 2011-06-08 2012-06-07 Sequence-specific engineered ribonuclease h and the method for determining the sequence preference of dna-rna hybrid binding proteins
PCT/PL2012/050019 WO2012169916A2 (en) 2011-06-08 2012-06-07 Sequence-specific engineered ribonuclease h and the method for determining the sequence preference of dna-rna hybrid binding proteins
AU2012267270A AU2012267270B2 (en) 2011-06-08 2012-06-07 Sequence-specific engineered ribonuclease H and the method for determining the sequence preference of DNA-RNA hybrid binding proteins
US14/095,351 US9353358B2 (en) 2011-06-08 2013-12-03 Sequence-specific engineered ribonuclease H and the method for determining the sequence preference of DNA-RNA hybrid binding proteins

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL395180A PL222513B1 (pl) 2011-06-08 2011-06-08 Sposób określania sekwencji preferowanych przez białko lub jego domeny wiążące specyficznie sekwencje w hybrydzie DNA-RNA

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL395180A1 PL395180A1 (pl) 2012-12-17
PL222513B1 true PL222513B1 (pl) 2016-08-31

Family

ID=47392277

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL395180A PL222513B1 (pl) 2011-06-08 2011-06-08 Sposób określania sekwencji preferowanych przez białko lub jego domeny wiążące specyficznie sekwencje w hybrydzie DNA-RNA

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL222513B1 (pl)

Also Published As

Publication number Publication date
PL395180A1 (pl) 2012-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6960438B2 (ja) 特定のゲノム遺伝子座へのゲノムおよびエピゲノム調節タンパク質のｒｎａ誘導型標的化
Furukawa et al. Identification of specific binding sites for XYR1, a transcriptional activator of cellulolytic and xylanolytic genes in Trichoderma reesei
US9012183B2 (en) Use of template switching for DNA synthesis
JP7061078B2 (ja) 耐熱性の逆転写酵素変異体
JP6075892B2 (ja) 二本鎖ｒｎａエンドリボヌクレアーゼ
CN114990126A (zh) 特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体及应用
EP2718430B1 (en) Sequence-specific engineered ribonuclease h and the method for determining the sequence preference of dna-rna hybrid binding proteins
PL222513B1 (pl) Sposób określania sekwencji preferowanych przez białko lub jego domeny wiążące specyficznie sekwencje w hybrydzie DNA-RNA
Chhetri et al. Recombinant expression, purification and preliminary characterization of the mRNA export factor MEX67 of Saccharomyces cerevisiae
JP2023501817A (ja) 二本鎖ｒｎａの生成方法
WO2017125880A1 (en) Mini-ill rnases, methods for changing specificity of rna sequence cleavage by mini-ill rnases, and uses thereof
WO2015157611A2 (en) Improvements to eukaryotic transposase mutants and transposon end compositions for modifying nucleic acids and methods for production and use in the generation of sequencing libraries
PL222512B1 (pl) Endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNA
Ringel Molecular basis of RNA polymerase III transcription repression by Maf1 & Structure of human mitochondrial RNA polymerase
Yan et al. Method of mRNA display for selecting peptides that bind with target enzyme RNA
SHAHHOSSEINY PURIFICATION OF SACCHAROMYCES CEREVISIAE EIF4E/EIF4G/PABLP COMPLEX WITH CAPPED MRNA
JP2019076084A (ja) 標的タンパク質の可溶化用組成物及びその用途