PL226157B1

PL226157B1 - Mikrosonda do elektroporacji selektywnej i sposob wytwarzania takiej mikrosondy

Info

Publication number: PL226157B1
Application number: PL409831A
Authority: PL
Inventors: Ryszard Buczyński; Ryszard Buczynski; Dariusz Pysz; Ryszard Stępień; Ryszard Stepien
Original assignee: Inst Tech Materiałów Elektronicznych
Priority date: 2014-10-21
Filing date: 2014-10-21
Publication date: 2017-06-30
Also published as: EP3011995A1; US20170239469A1; JP2017534384A; PL409831A1; EP3011995B1; US10322280B2; WO2016062761A1

Abstract

Mikrosonda do elektroporacji selektywnej, obejmująca co najmniej dwie elektrody metalowe zatopione w pręcie szklanym, charakteryzuje się tym, że pręt szklany (E), wykonany ze szkła pierwszego, ma średnicę od 50 µm do 2 mm, korzystnie od 50 µm do 500 µm; elektrody metalowe (A), wykonane ze stopu metalu, mają postać prętów o średnicy od 1 µm do 100 µm, korzystnie od 20 µm do 30 µm, gdzie końcówki tych prętów są odsłonięte, przy czym szkło pierwsze i stop metalu dobrane są tak, że dylatometryczna temperatura mięknięcia DTM szkła pierwszego jest bardzo zbliżona do temperatury topnienia stopu metalu. Wynalazek obejmuje również sposób wytwarzania takiej mikrosondy.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest mikrosonda do elektroporacji selektywnej wybranych obszarów komórek organów wewnętrznych in vivo oraz pojedynczych komórek in vitro oraz dodatkowo do integracji w jednym urządzeniu dodatkowo: kanału do podawania leków domiejscowo, kanału obrazowego do obserwacji obszaru poddawanego elektroporacji, światłowodu do dostarczania lub odbierania sygnału oświetlającego lub terapeutycznego. Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania takiej mikrosondy.

Elektroporacja jest jedną z metod eksperymentalnie używanych do otwierania błony komórkowej w żywych organizmach oraz dostarczania do wewnątrz substancji biologicznie czynnych lub do pobierania z wewnątrz komórki jej fragmentów, np. DNA. Metoda polega na wytworzeniu lokalnie pola elektromagnetycznego, co powoduje zaburzenie struktury elektronowej w błonie komórkowej i wytworzenie kanałów, przez które mogą przedostawać się cząsteczki do wnętrza komórek [De Vry, Jochen (2010) In vivo electroporation of the central nervous system: A non-viral approach for targeted gene delivery. Progress in Neurobiology 92 (3)]. Elektroporacja jest stosowana jako metoda eksperymentalna do terapii genowej oraz leczenia m.in. chorób nowotworowych, gdzie pole elektryczne pozwala lokalnie na otwieranie błony komórkowej i na precyzyjne dostarczanie leków nowej generacji do zarażonych komórek. Zaletą elektroporacji jest możliwość lokalnego dostarczania do organizmu wysoce toksycznych lekarstw na raka, bez konieczności stosowania chemii ogólnej niszczącej cały organizm [C. Chen, S. W. Smye, M. P. Robinson and J. A. Evans, Membrane electroporation theories: a review, Medical and Biological Engineering and Computing, Volume 44, Numbers 1-2 (2006), 5-14].

W stanie techniki znane są do tej pory wyłącznie makroskopowe sondy z elektrodami w postaci igieł lub płytek makroskopowych, które są stosowane do leczenia powierzchniowego, głównie raka skóry (np. czerniaka), bądź do elektroporacji całych hodowli komórkowych bez selektywności in vitro. Istniejące rozwiązania nie pozwalają na elektroporację jednej wybranej komórki z hodowli in vitro, ani też na elektroporację narządów wewnętrznych w bardzo ograniczonym obszarze. Stosowany dotychczas sposób wytworzenia sond angażuje metody litograficzne, polegające na wielokrotnym trawieniu włókna i nakładaniu warstw metalowych i dielektrycznych. W tych metodach łączy się materiały o różnych strukturach poprzez napylanie i stosuje się proces wyciągania tzw. pocieniania trzonu sond. Wytworzone powyższym sposobem sondy nie są odpowiednio cienkie (minimalnie ok. 1 mm średnicy), aby móc działać selektywnie oraz mają ograniczoną długość. Dodatkowo, jakość otrzymywanych otworów oraz rdzeni przewodzących światło w takich sondach jest niska. Sondy otrzymywane metodą litograficzną wykazują niską odporność termiczną oraz niską odporność na naprężenia i zgięcia, zaś ich funkcjonalność, uwidoczniona np. w transferze leków (poprzez kanały w trzonach takich sond) jest bardzo ograniczona.

Znana jest z publikacji nr US 6 304 784 (B1) elastyczna sonda, wytworzona powyższymi metodami, o średnicy ok. 1 mm, cylindrycznym przekroju poprzecznym, przeznaczona do stymulacji elektrycznej organów wewnętrznych. Sonda zawiera w sobie elektryczne przewody przekazujące sygnał elektryczny do różnych fragmentów sondy, na całej długości jej trzonu.

Podobnie, publikacja nr EP 2 497 419 (A1) ujawnia sposób wytworzenia elastycznej sondy o cylindrycznym przekroju poprzecznym, do stymulacji komórek w mózgu, angażujący metody litograficzne. Sonda według tej publikacji zawiera na swojej powierzchni elektrody, które pokrywane są cienką warstwą materiału izolującego o grubości 0,5 mm.

Z publikacji nr US 2000 198 446 (A1) znana jest sonda o cylindrycznym sztywnym rdzeniu, zawierająca wiele elektrod przebiegających na jej powierzchni oraz sposób otrzymania sondy obejmujący metody litograficzne, zawierający etap pokrycia cienką warstwą materiału izolującego.

Z kolei neurosonda z publikacji nr US 2013 030 274 (A1) zbudowana jest z jednego lub więcej trzonów i zawiera źródło optyczne połączone z co najmniej jednym światłowodem rozciągniętym na całej długości trzonu lub trzonów sondy. Również i w tym wynalazku wykorzystano metodę litograficzną wytwarzania sondy, co wiąże się z wytwarzaniem elektrod na powierzchni materiału półprzewodnikowego, zawierającego falowody i linie metalowe wykonane litograficznie.

Powyższe rozwiązania nie pozwalają na wykorzystanie zjawiska elektroporacji do otwierania błony komórkowej selektywnie, tj. w przypadku pojedynczych komórek lub w ograniczonym niewielkim obszarze, przykładowo do elektroporacji narządów wewnętrznych. W związku z powyższym istnieje potrzeba opracowania takiej sondy, która dzięki mniejszym niż dotąd wymiarom, docierałaby do pojePL 226 157 B1 dynczych komórek lub ograniczonych obszarów w ciele pacjenta i która służyłaby jako narzędzie do elektroporacji selektywnej.

Przedmiotem obecnego wynalazku jest mikrosonda do elektroporacji selektywnej obejmująca co najmniej dwie elektrody metalowe zatopione w pręcie szklanym, charakteryzująca się tym, że pręt szklany wykonany ze szkła pierwszego ma średnicę od 50 μm do 2 mm, korzystniej od 50 μm do 500 μm, elektrody metalowe wykonane ze stopu metalu mają postać prętów o średnicy od 1 μm do 100 μm, korzystniej od 20 μm do 30 μm, gdzie końcówki tych prętów są odsłonięte, przy czym szkło pierwsze i stop metalu dobrane są tak, że dylatometryczna temperatura mięknięcia DTM szkła pierwszego jest bardzo zbliżona do temperatury topnienia stopu metalu.

Korzystnie, stop metalu posiada temperaturę topnienia niższą od dylatometrycznej temperatury mięknięcia DTM szkła pierwszego, korzystnie o nie więcej niż 50°C niższą.

Korzystnie, dylatometryczna temperatura mięknięcia DTM szkła pierwszego wynosi co najwyżej 610°C.

W korzystnej realizacji wynalazku stop metalu jest stopem srebra, korzystnie srebra i cyny, przykładowo jest to stop BAg7(Ag56Sn).

W preferowanym wariancie realizacji mikrosonda według obecnego wynalazku ma kanał powietrzny do dostarczania leków, korzystnie o średnicy od 2 μm do 1500 μm, umieszczony wewnątrz pręta szklanego.

Korzystnie, według obecnego wynalazku ma kanał szklany do przesyłania sygnału optycznego, korzystnie o średnicy od 1 μm do 300 μm, umieszczony wewnątrz pręta szklanego. W takim przypadku kanał szklany jest ze szkła drugiego.

W innym korzystnym przykładzie realizacji, mikrosonda według obecnego wynalazku ma kanał obrazowy do przesyłania obrazu optycznego, korzystnie o średnicy od 50 μm do 1500 μm, umieszczony wewnątrz pręta szklanego.

Korzystnie, kanał obrazowy jest ze szkła drugiego.

W przypadku, gdy kanał szklany albo kanał obrazowy są ze szkła drugiego współczynnik załamania światła nD szkła pierwszego jest niższy niż współczynnik załamania światła nD szkła drugiego, korzystnie o co najmniej 0,001 niższy, korzystniej o co najmniej 0,01 niższy, najkorzystniej o co najmniej 0,5 niższy.

Korzystnie, współczynnik załamania światła nD szkła pierwszego wynosi co najmniej 1,51, zaś współczynnik załamania światła nD szkła drugiego wynosi co najwyżej 2,49.

Korzystnie, współczynnik rozszerzalności cieplnej szkła drugiego i szkła pierwszego są do siebie zbliżone. W jeszcze innym korzystnym przykładzie realizacji, liniowy współczynnik rozszerzalności

-7 -1 cieplnej szkła pierwszego dla zakresu temperatur 20-300°C wynosi 84,0 10^- K^- , zaś dla zakresu temperatur 20-450°C wynosi 89,0 10^-7K^-1.

Korzystnie, liniowy współczynnik rozszerzalności cieplnej szkła drugiego dla zakresu temperatur 20-300°C wynosi 89,7 10^-7K^-1, zaś dla zakresu temperatur 20-450°C wynosi 94,5 10^-7K^-1.

Korzystnie, szkło pierwsze wybrane jest z grupy obejmującej szkło SK222, NC-21A, PBG-89, F2 Schott, KB-03.

Korzystnie, szkło drugie wybrane jest z grupy obejmującej szkło Zr3/XV, NC-32, NC-41, LLF1 Schott, F2 Schott, PBG-08 (PBG81), F2/1,67/2, PBS-57A.

W preferowanym wariancie realizacji zawiera dwie elektrody metalowe o średnicach wynoszących odpowiednio 29 μm i 28 μm, w odległości pomiędzy nimi równej 37 μm, o średnicy kanału szklanego równej 28 μm, przy czym średnica zewnętrzna pręta szklanego wynosi 458 μm.

Korzystnie, mikrosonda według wynalazku zawiera dwie elektrody metalowe o średnicach wynoszących odpowiednio 21 μm i 20 μm, w odległości pomiędzy nimi równej 31 μm, o średnicy kanału szklanego równej 23 μm, przy czym średnica zewnętrzna pręta szklanego wynosi 352 μm.

Wynalazek obejmuje również sposób wytwarzania mikrosondy do elektroporacji selektywnej, w którym wykorzystuje się metodę pocieniania charakteryzujący sie tym, że obejmuje następujące etapy:

a) umieszczenie pręta ze szkła pierwszego z rdzeniem zawierającym stop metalu w kapilarze ze szkła pierwszego,

b) poddanie produktu z etapu a) procesowi pocienienia przy zapewnieniu atmosfery beztlenowej wewnątrz kapilary,

c) przygotowanie preformy obejmującej:

- produkt z etapu b) w ilości co najmniej 2 sztuk oraz

- pręty ze szkła pierwszego, umieszczone razem w rurce ze szkła pierwszego,

PL 226 157 B1

d) poddanie preformy z etapu c) procesowi pocieniania na wieży światłowodowej przy zapewnieniu atmosfery beztlenowej wewnątrz preformy, przy czym szkło pierwsze i stop metalu dobrane są tak, że dylatometryczna temperatura mięknięcia DTM szkła pierwszego jest bardzo zbliżona do temperatury topnienia stopu metalu.

Korzystnie, po etapie d) podłącza się elektrody sondy do zewnętrznego źródła zasilania poprzez mocowanie sondy do płytki podkładowej.

W korzystnym wariancie wykonania dylatometryczna temperatura mięknięcia DTM szkła pierwszego wynosi co najwyżej 610°C.

Korzystnie, stop metalu jest stopem srebra, korzystnie srebra i cyny, przykładowo jest to stop BAg7 (Ag56Sn).

Korzystnie, po etapie d) następuje proces odsłaniania elektrod na końcu mikrosondy metodą trawienia w roztworze kwasu fluorowodorowego, korzystnie stosunek kwasu do wody w roztworze kwasu fluorowodorowego wynosi 1:1, korzystnie czas trawienia wynosi 30 minut.

W korzystnym przykładzie realizacji, użyta w etapie a) kapilara ze szkła pierwszego zostaje wcześniej wytworzona poprzez wyciągnięcie.

Korzystnie, preforma z etapu c) zawiera dodatkowo pręt światłowodowy ze szkła drugiego.

Korzystnie, liniowy współczynnik rozszerzalności cieplnej szkła pierwszego dla zakresu temperatur 20-300°C wynosi 84,0 10^-7K^-1, zaś dla zakresu temperatur 20-450°C wynosi 89,0 10^-7K^-1.

W preferowanym przykładzie realizacji współczynnik załamania światła nD szkła pierwszego jest niższy niż współczynnik załamania światła nD szkła drugiego, korzystnie o co najmniej 0,001 niższy, korzystniej o co najmniej 0,01 niższy, najkorzystniej o co najmniej 0,5 niższy.

Korzystnie, wartość współczynnika załamania światła nD oraz wartość współczynnika rozszerzalności cieplej szkła drugiego i szkła pierwszego są do siebie zbliżone.

Mikrosonda według wynalazku posiada monolityczną strukturę w postaci włókna i może być użyta do zastosowań in vivo przy pomocy igły punkcyjnej oraz do zastosowań in vitro. Parametry mikrosondy według obecnego wynalazku, tj. elastyczność, odporność na temperaturę i naprężenia, są osiągane dzięki doborowi materiałów o dobrych własnościach reologicznych, dopasowanych termicznie, zintegrowanych w procesie pocieniania na wieży światłowodowej, tak, że uzyskuje się stabilną zintegrowaną strukturę mikrosondy bez naprężeń wewnętrznych.

Dzięki niewielkiej odległości miedzy elektrodami, w celu wytworzenia pola elektrycznego potrzebnego do elektroporacji komórek, wystarczy przyłożyć napięcie rzędu kilku V, zamiast napięcia rzędu kilowolt, wymaganego w standardowych makroskopowych urządzeniach do elektroporacji. Dzięki temu mikrosonda według obecnego wynalazku może być zasilana bateryjnie.

Sposób wytwarzania sondy według wynalazku pozwala na masowa produkcję sond o identycznych parametrach geometrycznych. Stosowany proces wyciągania, tzw. pocieniania na wieży światłowodowej pozwala na otrzymanie mikrosond o długości wielu metrów, o identycznych parametrach poprzecznych, które następnie można ciąć na wiele mikrosond o wybranej długości.

Korzystne przykłady wykonania wynalazku

Wynalazek zostanie teraz bliżej przedstawiony w korzystnych przykładach wykonania, z odniesieniem do załączonych rysunków, na których:

figura 1 przedstawia schemat mikrosondy według wynalazku, zawierającej dwie elektrody metalowe A zintegrowane we włóknie szklanym elastycznym, tzw. pręcie szklanym E, figura 2 przedstawia schemat mikrosondy według wynalazku, zawierającej dodatkowe funkcje zintegrowane z mikrosondą przedstawioną na fig. 1, figura 3 przedstawia zdjęcia SEM przekrojów mikrosondy według wynalazku z dwoma elektrodami metalowymi A,

PL 226 157 B1 figura 4 przedstawia poprzeczny przekrój struktury preformy do pocieniania mikrosondy według wynalazku, z dwiema elektrodami metalowymi A, figura 5 przedstawia widok prętów szklanych E z rdzeniem metalowym otrzymanych w wyniku wyciągnięcia (pocienienia), figura 6 przedstawia schemat zasilania mikrosondy według wynalazku, figura 7 przedstawia mikrosondę według wynalazku, z uchwytem umożliwiającym podłączenie prądu i justowanie mechaniczne względem próbki, figura 8 przedstawia połączenie, poprzez klejenie, prętów szklanych E mikrosondy według wynalazku z przewodami elektrycznymi makroskopowymi, _® figury 9a-c przedstawiają wyniki pomiarów elektroporacji komórek CGO-K1 - (ATCC CCL61™) opisanych w przykładzie 3, zaś figury 10a-c przedstawiają wyniki pomiarów elektroporacji komórek H9C2 - komórki mięśnia sercowego szczura opisanych w przykładzie 3.

Na rysunkach użyto następujących oznaczeń: A - elektroda metalowa, B - pręt szklany, C - kanał szklany, D - kanał obrazowy, E - pręt szklany.

Do budowy mikrosond według wynalazku zastosowano następujące materiały:

Konstrukcja mikrosondy: rury i pręty ze szkła pierwszego, tj. szkła SK222 (szkło typu termometrycznego produkcji Krośnieńskich Hut Szkła).

Kanał szklany C: pręty ze szkła drugiego, tj. szkła Zr3/XV (opracowane i wytopione w ITM E). Elektrody metalowe A: pręty o średnicy 2 mm ze stopu BAg7 (Ag56Sn) (producent - Lucas-Milhaupt Gliwice).

Własności materiałów przedstawiono w tabelach 1 i 2.

T a b e l a 1

Własności stopu BAg7 zastosowanego do konstrukcji mikrosond GM1A

Własność	Stop BAg7
Skład [%]	Ag: 56 Cu: 22 Zn: 17 Sn: 5
Temperatura topnienia [°C]	620-650
Gęstość [g/cm³]	9,4
Wytrzymałość na rozciąganie [kg/mm²]	48

T a b e l a 2

Własności szkieł zastosowanych do konstrukcji mikrosond GM1A

Własność	SK222	Zr3/XV
Współczynnik załamania światła nD	1,520	1,609
Liniowy współczynnik rozszerzalności cieplnej dla zakresu: 20-300°C [10’⁷K^_1]	84,0	89,7
20-450°C [10’⁷K¹]	89,0	94,5
Temperatura transformacji Tg [°C]	542	581
Dylatometryczna temperatura mięknięcia DTM [°C]	610	644
Temperatury charakterystyczne w mikroskopie grzewczym Leitz'a: Temperatura [°C] - zaoblenia się próbki	700	680
- przybrania kształtu kuli	820	790
- przybrania kształtu półkuli	950	865

Szkło SK222 i stop BAg7 wybrano ze względu na temperaturę topnienia stopu, która jest niższa o ok 50°C od temperatury pocieniania dla szkła. Zapewnia to płynność metalu w trakcie rozciągania

PL 226 157 B1 kapilary szklanej i ogranicza powstawanie przerw w wyciąganych prętach szklano-metalowych. Sto-7 -1 sunkowo wysoki współczynnik rozszerzalności cieplnej szkła (89 x 10^- K^- dla zakresu 20-450°C) przyczynia się do zmniejszenia naprężeń na granicy szkło-metal. Szkło ZrXV jest dobrane do szkła SK222 pod względem współczynnika załamania światła i współczynnika rozszerzalności cieplej tworząc kanał obrazowy C do przesyłania obrazu optycznego o dobrych własnościach mechanicznych.

Do realizacji obecnego wynalazku możliwy jest dobór innych par szkieł, zgodnych ze sobą pod względem reologicznym. Poniżej zestawienie zgodnych par szkieł, z podaniem ich składu jakościowoilościowego oraz współczynników załamania nD:

Szkła NC-21A i NC-32:

NC-21A

NC-32

Skład SiO2	Stężenie [% mol] 56,84	Skład SiO2	Stężenie [% mol] 54
B2O3	23,19	B2O3	21
A12O3	0,61	Al2O3	0,5
Li₂O	6,23	Li₂O	5
Na₂O	9,51	Na₂O	8,5
K₂O	3,63	K₂O	3
		BaO	5
nD = 1,5273		n_D = 1,5538

Szkła NC-21A i NC-41

NC-21A	NC-41
Skład	Stężenie [% mol]	Skład	Stężenie [% mol]
SiO2	56,84	SiO2	54,5
B2O3	23,19	b₂o₃	22
Al₂O3	0,61	Al₂O₃	1,5
Li₂O	6,23	Li2O	5
Na2O	9,51	Na2O	8
K2O	3,63	K2O	5
		PbO	3
		BaO	1
n_D = 1,5273		n_D = 1,5374

Szkła NC-21A I LLF1 Schott
nD = 1,5273		nD = 1,5481
Szkła NC-21A i F2 Schott
nD = 1,5273		nD = 1,6200
Szkła PBG-89 i PBG-08 (PBG81)
PBG-89		PBG-08 (PBG81)
Skład	Stężenie [% mol]	Skład	Stężenie [% mol]
SiO2	45	SiO2	40
Ga2O3	10	Ga2O3	13
Bi2O₃	10	Bi2O3	10
PbO	28	PbO	30
CdO	3	CdO	7
ZnO	4
nD = 1,9060		nD = 1,9379

PL 226 157 B1

Szkła F2 Schott i i F2/1.67/2

F2	F2/1.67/2 Skład	Stężenie [% mol]
	SiO2	60,7
	Al₂O3	3
	PbO	28
	K₂O	4
	Na2O	4
	AS2O3	0,3
nD= 1,6200	n_D = 1,6543

Szkła KB-03 i PBS-57A

KB-03 Skład	Stężenie [% mol]	PBS-57A Skład	Stężenie [% mol]
B₂O3	62,97	SiO2	53,10
ZnO	6,57	Al₂O3	44,20
CaO	9,53	PbO	0,65
Na₂O	16,16	K₂O	0,86
NaF	4,77	Na2O	0,85
n_D = 1,5415		AS₂O3 n_D = 1,8467	0,33

P r z y k ł a d 1 - Mikrosonda do elektroporacji

W obecnym przykładzie wykonania mikrosonda do elektroporacji, zilustrowana na schemacie fig. 1 oraz zdjęciu SEM na fig. 3, stanowi pręt szklany E ze zintegrowanymi dwoma elektrodami metalowymi A. Alternatywnie mikrosonda posiada większą ilość elektrod metalowych A, co zilustrowano na fig. 2, będących w postaci mikrodrutów i zatopionych w pręcie szklanym E. W zależności od dodatkowego przeznaczenia mikrosondy integruje się w jednej obudowie również inne elementy, jak kanał obrazowy D do przesyłania obrazu optycznego, kanał szklany C do przesyłania sygnału optycznego, czy też kanał powietrzny B do dostarczania leków.

P r z y k ł a d 2 - Wytworzenie mikrosondy typu GM1A zawierającej kanał szklany C do przesyłania obrazu optycznego

Proces wytworzenia mikrosondy przebiegał w kilku etapach:

• Wytworzenie ze szkła SK222 kapilar o średnicy wewnętrznej 2 mm i proporcji średnicy wew/zew ok. 0,5. W tym celu z rur φz/φw 15/11 wyciągnięto rury φζ 10 i po złożeniu z rurą φζ 15 wyciągano docelowe kapilary o wymiarach φz/φw 4,2/2.

• Wyciągnięcie prętów szklanych E z rdzeniem metalowym.

• Pręt ze stopu BAg7 po wypolerowaniu i odtłuszczeniu został umieszczony w zatopionej kapilarze ze szkła SK222. Kapilara została przed rozpoczęciem pocieniania kilkakrotnie odpompowana i przepłukana argonem w celu usunięcia tlenu i uniknięcia utleniania metalu. W trakcie procesu pocieniania zapewniono utrzymanie atmosfery beztlenowej (argon) wewnątrz kapilary. Wyciągnięto pręty (z rdzeniem metalowym) o średnicy zewnętrznej z zakresu 0,3-1,1 mm, przedstawione na fig. 2.

• Wyciągnięcie kanałów szklanych C do przesyłania obrazu optycznego.

• Pręty o strukturze światłowodowej wytworzono metodą „pręt-rura” przez umieszczenie pręta ze szkła Zr3/XV w rurze ze szkła SK222 a następnie pocienieniu preformy do średnicy 0,7 mm.

• Wyciągnięcie prętów ze szkła SK222.

• Przygotowanie preformy.

Struktura preformy do wyciągania sondy składała się z dwóch prętów szklano-metalowych o średnicy 0,7 mm, umieszczonego między nimi pręta światłowodowego o średnicy 0,7 mm oraz prętów ze szkła SK222. Całość umieszczono w rurce ze szkła SK222.

• Pocienianie (wyciąganie) sond.

PL 226 157 B1

Z przygotowanej preformy wyciągano, przy zapewnieniu atmosfery beztlenowej wewnątrz preformy, pręty o średnicy zewnętrznej z zakresu 0,3-0,5 mm. W wyniku powyższego procesu wytworzono mikrosondę, zilustrowaną na fig. 3, o średnicy 350 μm, zawierającą elektrody metalowe A o średnicy 20 μm. Kanał szklany C do przesyłania obrazu optycznego nie znajduje się dokładnie między elektrodami, a jego przemieszczenie nastąpiło na etapie pocieniania preformy i nie ma istotnego znaczenia dla funkcjonalności tak wytworzonej mikrosondy. W wyciągniętych sondach występowały nieliczne przerwania elektrod metalowych A. W wyniku selekcji wybrano kilkanaście sond o długości od 10 do 30 cm zawierających ciągłe pręty metalowe i przeznaczono je do dalszych badań aplikacyjnych.

Parametry wytworzonych mikrosond przedstawiono poniżej w tabeli 3.

T a b e l a 3

Parametry geometryczne sond GM1A

	GM1A/2	GM1A/3
Średnica pręta szklanego E [μιτι]	458	352
Średnice elektrod metalowych A [μιτι]	29 i 28	21 i 20
Odległość między elektrodami metalowymi A [μιτι]	37	31
Średnica kanału szklanego C [μιτι]	28	23

Wytworzone mikrosondy podłączono do zewnętrznego źródła zasilania poprzez mocowanie mikrosond do płytek, w tym mocowanie elektrod metalowych A do standardowych przewodów elektrycznych. Mocowanie mikrosondy do płytki podkładowej przeprowadzono przy użyciu mikroskopu oraz mikromanipulatorów. Użyto kleju epoksydowego. W następnym kroku połączono mikroelektrody z przewodami elektrycznymi makroskopowymi przy pomocy kleju przewodzącego Epo-Tek H20E. Mikrosonda była wygrzewana w piecu w temperaturze 300°C przez 15 min. W tych warunkach klej ulegał stwardnieniu. Klejenie elektrod metalowych A z makroskopowymi przewodami elektrycznymi przedstawiono na fig. 8. Uzyskano wskutek tego sztywne końcówki mikrosond, umożliwiające podłączenie prądu oraz manipulowanie mikrosondą w trakcie eksperymentu. Wykonanie podłączeń elektrycznych mikrosond, przedstawionych na fig. 7, umożliwiło wykonanie pomiarów rezystancji elektrod metalowych A oraz pomiarów napięcia przebicia, zestawionych poniżej w tabeli 4. Pomiar przeprowadzono pod mikroskopem ze względu na konieczność pomiaru długości elektrod metalowych A oraz konieczność precyzyjnego podłączenia napięcia.

T a b e l a 4

Zestawienie wyników pomiarów rezystancji mikroelektrod w mikrosondzie GM1A

Rezystancja [Ω]	Długość elektrody metalowej A (od złącza do złącza) (10^-3) [mm]
33,8	117,98
34,0	118,48
70,8	154,72
41,4	154,87
31,6	98,13
28,3	96,27
86,5	97,03
70,0	94,99

Otrzymane wyniki wskazują na niską rezystancję elektrod metalowych A, co umożliwia uzyskanie różnicy potencjałów pomiędzy dwoma elektrodami metalowymi A bez istnienia niekorzystnych zjawisk cieplnych w mikrosondzie. Możliwe także będzie zastosowanie krótkich impulsów elektrycznych stosowanych w niektórych technikach elektroporacji.

Otrzymane wyniki świadczą o tym, że mikrosonda ma elektrody o jednorodnej średnicy wewnątrz pręta szklanego E. Następnie, wykonano eksperymenty dążące do określenia prądu przebicia. Testy przeprowadzono w roztworze wodnym chlorku sodu od stężenia zerowego do otrzymania rozPL 226 157 B1 tworu nasyconego w temperaturze pokojowej (stężenie 26,5%). Do badania napięcia przebicia użyto zasilacza laboratoryjnego o regulowanym napięciu w zakresie 0-30 V. Przeprowadzone testy wykazały wynik negatywny, co oznacza, że napięcie przebicia było wyższe niż 30 V. Umożliwia to swobodne stosowanie mikrosondy w środowisku wodnym (typowym dla hodowli komórek laboratoryjnych) bez obawy o przebicie i zniszczenie próbek lub mikrosondy.

P r z y k ł a d 3 - Elektroporacja przy użyciu wytworzonej mikrosondy według wynalazku

Wytworzono mikrosondy o długości 10-30 cm o średnicy 350 μm, z dwoma elektrodami metalowymi A o średnicy ok. 20 μm, zilustrowane na fig 1. Elektrody metalowe A odsłoniono metodą trawienia w kwasie fluorowodorowym, gdzie stosunek kwasu do wody w roztworze kwasu fluorowodorowego wynosił 1:1, a proces trawienia trwał 30 minut. Rezystancje zmierzonych mikrosond o długości 20-25 cm wyniosły 3080 Ω. Przeprowadzone testy w roztworach soli wykazały, że napięcie przebicia było wyższe niż 30 V. Przeprowadzono testy elektroporacji z wykorzystaniem wytworzonych mikrosond, w celu otwierania błony komórkowej oraz dostarczania substancji do wnętrza komórek. Do mikrosond przyłożono napięcia o wartościach 3-5 V. Do badań użyto dwóch linii komórkowych: komórek _®

CHO-K1 - (ATCC^® CCL-61™) - wyniki doświadczeń zilustrowano na fig. 9a-c oraz komórek mięśnia sercowego szczura - H9C2. Do weryfikacji zachodzenia zjawiska elektroporacji komórek użyto metody znacznikowej używając barwnika Tryplan Blue. W obu przypadkach linii komórkowych jednoznacznie potwierdzono zachodzenie elektroporacji w pojedynczych komórkach w obszarze oddziaływania mikrosondy. O zajściu elektroporacji świadczy przenikniecie substancji z roztworu do wnętrza komórek. Jest to możliwe do zaobserwowania ze względu na zaistnienie akumulacji wskaźnika w komórce, który barwił ją na niebiesko.

Na figurach 6a-c przedstawiono wyniki pomiarów elektroporacji komórek CHO-K1 - (ATCC® CCL-61™). Podczas eksperymentu odległość pomiędzy elektrodami metalowymi A wyniosła 226,93 μm, pomiędzy ich wewnętrznymi brzegami oraz 277,83 μm pomiędzy ich zewnętrznymi ściankami, grubość elektrod wynosiła 28,62 μm, zaś wartości napięcia i natężenia prądu odpowiednio wyniosły: 1,7-2 V, 1,9 μA. Komórki po elektroporacji (górna elektroda) zabarwione zostały błękitem tryplanowym i wykazują spłaszczoną morfologię, co zilustrowano na fig. 9b. Podczas doświadczenia komórki umieszczone w odległości 300 mikronów od elektrod (fig. 9c) nie uległy elektroporacji i pozostały w stanie nienaruszonym (tzw. komórki kontrolne). Wyniki doświadczeń elektroporacji dla linii komórek mięśnia sercowego szczura - H9C2 zilustrowano na fig. 10a-c. Podczas eksperymentu odległość pomiędzy elektrodami metalowymi A wyniosła 156,46 μm, pomiędzy ich wewnętrznymi brzegami oraz 207,83 μm pomiędzy ich zewnętrznymi ściankami, grubość elektrod metalowych A wynosiła 27,11 μm, zaś wartości napięcia i natężenia prądu odpowiednio wyniosły: 1,7-2 V, 1,9 μA. Fig. 10b przedstawia komórkę po elektroporacji przez górną elektrodę, w której widoczne jest zabarwione jądro. Komórki, które nie uległy elektroporacji (tzw. komórki kontrolne) nie noszą śladów zabarwienia, zgodnie z fig. 10c.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Mikrosonda do elektroporacji selektywnej obejmująca co najmniej dwie elektrody metalowe (A) zatopione w pręcie szklanym (E), znamienna tym, że pręt szklany (E) wykonany ze szkła pierwszego ma średnicę od 50 μm do 2 mm, korzystniej od 50 μm do 500 μm, elektrody metalowe (A) wykonane ze stopu metalu mają postać prętów o średnicy od 1 μm do 100 μm, korzystniej od 20 μm do 30 μm, gdzie końcówki tych prętów są odsłonięte, przy czym szkło pierwsze i stop metalu dobrane są tak, że dylatometryczna temperatura mięknięcia DTM szkła pierwszego jest bardzo zbliżona do temperatury topnienia stopu metalu.
2. Mikrosonda według zastrz. 1, znamienna tym, że stop metalu posiada temperaturę topnienia niższą od dylatometrycznej temperatury mięknięcia DTM szkła pierwszego, korzystnie o nie więcej niż 50°C niższą.
3. Mikrosonda według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że dylatometryczna temperatura mięknięcia DTM szkła pierwszego wynosi co najwyżej 610°C.
4. Mikrosonda według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, znamienna tym, że stop metalu jest stopem srebra, korzystnie srebra i cyny, przykładowo jest to stop BAg7(Ag56Sn).
5. Mikrosonda według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, znamienna tym, że ma kanał powietrzny (B) do dostarczania leków, korzystnie o średnicy od 2 μm do 1500 μm, umieszczony wewnątrz pręta szklanego (E).

PL 226 157 B1
6. Mikrosonda według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, znamienna tym, że ma kanał szklany (C) do przesyłania sygnału optycznego, korzystnie o średnicy od 1 μm do 300 μm, umieszczony wewnątrz pręta szklanego (E).
7. Mikrosonda według zastrz. 6, znamienna tym, że kanał szklany (C) jest ze szkła drugiego.
8. Mikrosonda według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, znamienna tym, że ma kanał obrazowy (D) do przesyłania obrazu optycznego, korzystnie o średnicy od 50 μm do 1500 μm, umieszczony wewnątrz pręta szklanego (E).
9. Mikrosonda według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, znamienna tym, że kanał obrazowy (D) jest ze szkła drugiego.
10. Mikrosonda według zastrz. 7 albo 9, znamienna tym, że współczynnik załamania światła n_Dszkła pierwszego jest niższy niż współczynnik załamania światła nD szkła drugiego, korzystnie o co najmniej 0,001 niższy, korzystniej o co najmniej 0,01 niższy, najkorzystniej o co najmniej 0,5 niższy.
11. Mikrosonda według dowolnego z zastrzeżeń 7, 9 albo 10 znamienna tym, że współczynnik załamania światła nD szkła pierwszego wynosi co najmniej 1,51, zaś współczynnik załamania światła nD szkła drugiego wynosi co najwyżej 2,49.
12. Mikrosonda według dowolnego z zastrzeżeń 7, 9, 10 albo 11, znamienna tym, że współczynnik rozszerzalności cieplnej szkła drugiego i szkła pierwszego są do siebie zbliżone.
13. Mikrosonda według dowolnego z zastrzeżeń od 1 do 12, znamienna tym, że liniowy współczynnik rozszerzalności cieplnej szkła pierwszego dla zakresu temperatur 20-300°C wynosi 84,0 10^-7 K^-1, zaś dla zakresu temperatur 20-450°C wynosi 89,0 10^-7 K^-1.
14. Mikrosonda według dowolnego z zastrzeżeń od 1 do 13, znamienna tym, że liniowy współczynnik rozszerzalności cieplnej szkła drugiego dla zakresu temperatur 20-300°C wynosi 89,7 10^-7K^-1, zaś dla zakresu temperatur 20-450°C wynosi 94,5 10^-7 K^-1.
15. Mikrosonda według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, znamienna tym, że szkło pierwsze wybrane jest z grupy obejmującej szkło SK222, NC-21A, PBG-89, F2 Schott, KB-03.
16. Mikrosonda według dowolnego z zastrzeżeń 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 albo 15, znamienna tym, że szkło drugie wybrane jest z grupy obejmującej szkło Zr3/XV, NC-32, NC-41, LLF1 Schott, F2 Schott, PBG-08 (PBG81), F2/1,67/2, PBS-57A.
17. Mikrosonda według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, znamienna tym, że zawiera dwie elektrody metalowe (A) o średnicach wynoszących odpowiednio 29 μm i 28 μm, w odległości pomiędzy nimi równej 37 μm, o średnicy kanału szklanego (C) równej 28 μm, przy czym średnica zewnętrzna pręta szklanego (E) wynosi 458 μm.
18. Mikrosonda według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, znamienna tym, że zawiera dwie elektrody metalowe (A) o średnicach wynoszących odpowiednio 21 μm i 20 μm, w odległości pomiędzy nimi równej 31 μm, o średnicy kanału szklanego (C) równej 23 μm, przy czym średnica zewnętrzna pręta szklanego (E) wynosi 352 μm.
19. Sposób wytwarzania mikrosondy do elektroporacji selektywnej, w którym wykorzystuje się metodę pocieniania, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) umieszczenie pręta ze szkła pierwszego z rdzeniem zawierającym stop metalu w kapilarze ze szkła pierwszego,

b) poddanie produktu z etapu a) procesowi pocienienia przy zapewnieniu atmosfery beztlenowej wewnątrz kapilary,

c) przygotowanie preformy obejmującej: produkt z etapu b) w ilości co najmniej 2 sztuk oraz pręty ze szkła pierwszego, umieszczone razem w rurce ze szkła pierwszego,

d) poddanie preformy z etapu c) procesowi pocieniania na wieży światłowodowej przy zapewnieniu atmosfery beztlenowej wewnątrz preformy, przy czym szkło pierwsze i stop metalu dobrane są tak, że dylatometryczna temperatura mięknięcia DTM szkła pierwszego jest bardzo zbliżona do temperatury topnienia stopu metalu.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że po etapie d) podłącza się elektrody sondy do zewnętrznego źródła zasilania poprzez mocowanie sondy do płytki podkładowej.
21. Sposób według zastrz. 19 albo 20, znamienny tym, że stop metalu posiada temperaturę topnienia niższą od dylatometrycznej temperatury mięknięcia DTM szkła pierwszego, korzystnie o nie więcej niż 50°C niższą.
22. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń od 19 do 21, znamienny tym, że dylatometryczna temperatura mięknięcia DTM szkła pierwszego wynosi co najwyżej 610°C.

PL 226 157 B1
23. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń od 19 do 22, znamienny tym, że stop metalu jest stopem srebra, korzystnie srebra i cyny, przykładowo jest to stop BAg7 (Ag56Sn).
24. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń od 19 do 23, znamienny tym, że po etapie d) następuje proces odsłaniania elektrod na końcu mikrosondy metodą trawienia w roztworze kwasu fluorowodorowego, korzystnie stosunek kwasu do wody w roztworze kwasu fluorowodorowego wynosi 1:1, korzystnie czas trawienia wynosi 30 minut.
25. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń od 19 do 24, znamienny tym, że użyta w etapie a) kapilara ze szkła pierwszego zostaje wcześniej wytworzona poprzez wyciągnięcie.
26. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń od 19 do 25, znamienny tym, że preforma z etapu c) zawiera dodatkowo pręt światłowodowy ze szkła drugiego.
27. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń od 19 do 26, znamienny tym, że liniowy współczynnik rozszerzalności cieplnej szkła pierwszego dla zakresu temperatur 20-300°C wynosi 84,0 10^-7 K^-1, zaś dla zakresu temperatur 20-450°C wynosi 89,0 10^-7 K^-1.
28. Sposób według zastrzeżenia 26 albo 27, znamienny tym, że liniowy współczynnik rozsze-7 -1 rzalności cieplnej szkła drugiego dla zakresu temperatur 20-300°C wynosi 89,7 10^- K^- , zaś dla zakresu temperatur 20-450°C wynosi 94,5 10^-7 K^-1.
29. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń od 26 do 28, znamienny tym, że współczynnik załamania światła nD szkła pierwszego jest niższy niż współczynnik załamania światła nD szkła drugiego, korzystnie o co najmniej 0,001 niższy, korzystniej o co najmniej 0,01 niższy, najkorzystniej o co najmniej 0,5 niższy.
30. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń od 26 do 29, znamienny tym, że współczynnik załamania światła nD szkła pierwszego wynosi co najmniej 1,51, zaś współczynnik załamania światła nD szkła drugiego wynosi co najwyżej 2,49.
31. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń od 26 do 30, znamienny tym, że wartość współczynnika załamania światła nD oraz wartość współczynnika rozszerzalności cieplej szkła drugiego i szkła pierwszego są do siebie zbliżone.
32. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń od 19 do 31, znamienny tym, że szkło pierwsze wybrane jest z grupy obejmującej szkło SK222, NC-21A, PBG-89, F2 Schott, KB-03.
33. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń od 26 do 32, znamienny tym, że szkło drugie wybrane jest z grupy obejmującej szkło Zr3/XV, NC-32, NC-41, LLF1 Schott, F2 Schott, PBG-08 (PBG81), F2/1,67/2, PBS-57A.