PL226431B1

PL226431B1 - Cząsteczka miRNA do zastosowania do wytwarzania leku do zmniejszania reakcji zapalnej lub zapobiegania zwiększaniu się reakcji zapalnej organizmu

Info

Publication number: PL226431B1
Application number: PL405125A
Authority: PL
Inventors: Anna Łukasik; Piotr Zielenkiewicz; Zofia Szweykowska-Kulińska; Leszek Pączek
Original assignee: Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk; Univ Im Adama Mickiewicza W Poznaniu
Priority date: 2013-08-23
Filing date: 2013-08-23
Publication date: 2017-07-31
Also published as: RS58431B1; LT3035941T; SI3035941T1; DK3035941T3; ES2702638T3; CY1121427T1; PL405125A1; PT3035941T; EP3035941A1; EP3035941B1; WO2015026249A8; WO2015026249A1; US20160272966A1; HRP20182115T1; HUE041520T2

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka miRNA do zastosowania do wytwarzania leku do zmniejszania reakcji zapalnej lub zapobiegania zwiększaniu się reakcji zapalnej organizmu. Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowej metody terapeutycznej opierającej się na cząsteczkach miRNA, które poprzez oddziaływanie z mRNA czynnika związanego z aktywacją neutralnej sfingomielinazy (FAN), zmniejszają odpowiedź zapalną organizmu, w różnego rodzaju schorzeniach immunologicznych.

MicroRNA (miRNA) stanowią klasę jednoniciowych, regulatorowych RNA, ewolucyjnie zachowanych wśród wielu znanych gatunków [1-4]. Te, małe (18-24 nukleotydów), niekodujące cząsteczki uczestniczą w post-transkrypcyjnej regulacji ekspresji genów poprzez promowanie cięcia lub też hamowanie translacji docelowego mRNA [5, 6]. MiRNA jako dojrzałe formy sekwencji powstają w kilkuetapowym procesie, w który zaangażowanych jest wiele specyficznych enzymów. Poszczególne etapy procesowania prekursorów miRNA różnią się nieznacznie w przypadku organizmów roślinnych i zwierzęcych [7-9], jednakże ostatni etap procesu dojrzewania cząsteczki jest wspólny w obu przypadkach. Mianowicie, dupleks miRNA:miRNA* jest rozcinany - jedna z jego nici (nić *) jest w większości przypadków degradowana, natomiast druga nić (antysensowna do nici *) jest ładowana na multi-kompleks RISC (RNA Induced Silencing Complex), który wiąże się specyficznie do transkryptu mRNA [7, 9-12]. Poprzez wspomniane wiązanie, miRNA regulują negatywnie ekspresję genów targetowych kontrolując tym samym rozwój, apoptozę, proliferację, różnicowanie i inne ważne funkcje komórek w żywych organizmach [7, 8, 13]. Znanych jest wiele doniesień łączących profile ekspresji konkretnych miRNA z różnymi stanami fizjologicznymi, patologicznymi, tumorogenezą czy nawet odpowiedzią pacjenta na leczenie. Z tego też względu te małe cząsteczki wykorzystywane są w medycynie jako markery diagnostyczne i prognostyczne, a ponadto znalazły zastosowanie w wielu nowoczesnych terapiach [14-17]. W kontekście medycznym, miRNA są również dobrze znane ze swojego zaangażowania w regulację odpowiedzi układu immunologicznego, odporności organizmu czy procesów zapalnych. Ich wpływ na niniejsze procesy związany jest między innymi ze ścieżką sygnalizacyjną interferonu i cytokin, z regulacją rozwoju i różnicowania limfocytów B, T, makrofagów, monocytów, komórek NK oraz granulocytów, czy też aktywacją niektórych z wymienionych komórek odpowiedzi swoistej i nieswoistej organizmu [18-21]. Wspomniane już limfocyty T i B, a także czynniki takie jak czynnik alfa martwicy nowotworów (TNF-α) odgrywają ważną, wręcz krytyczną, rolę w niektórych chorobach autoimmunologicznych - np. reumatoidalnym zapaleniu stawów, łuszczycy, miażdżycy czy stwardnieniu rozsianym [22-29]. Obecnie znanych jest kilka efektywnych sposobów leczenia chorób autoimmunologicznych, takich jak terapia anty-TNF-α. Jednakże, ze względu na ich istotne działania niepożądane (w tym zwiększoną podatność na infekcje), prowadzone są dalsze poszukiwania i prace nad nowymi terapiami pozwalającymi uniknąć czy choćby zmniejszyć ich skutki uboczne [30, 31]. Jednym z takich ostatnio zaproponowanych, potencjalnych celów terapeutycznych w leczeniu chorób autoimmunologicznych jest białko FAN (czynnik związany z aktywacją neutralnej sfingomielinazy), kodowane przez gen NSMAF [32]. Polipeptyd ten jest adaptorową cząsteczką, która poprzez interakcję z domeną NSD receptora TNF-R1 moduluje ekspresję genów indukowanych przez czynnik TNF-α, a dokładniej genów kodujących białka zapalne, takie jak interleukina 6 (IL-6), czy chemokiny, np. CCL5, CCL9, CCL20 oraz CXCL-2 [32-34]. Badania przeprowadzane na myszach pokazały, iż u osobników ze znokautowanym genem NSMAF, TNF-a-indukowana ekspresja wspomnianych prozapalnych cząsteczek była selektywnie zmieniona. Skutkowało to zaburzeniem rekrutacji populacji leukocytów we wtórnych narządach limfatycznych, obserwowane poprzez redukcję ilości makrofagów, neutrofili, dendrytów i komórek limfoidalnych w śledzionie [32, 34].

Poza wszelkimi terapiami z użyciem leków, znane są również domowe sposoby radzenia sobie z różnego rodzaju stanami zapalnymi i odpowiedziami immunologicznymi [35-37]. Jedną ze skuteczniejszych i starszych metod jest stosowanie kapusty głowiastej (Brassica oleracea var. capitata), a konkretniej okładów z jej liści czy też picie wyciśniętego z nich soku. Kapusta ze względu na swoje szczególne właściwości wykorzystana była w medycynie naturalnej głównie przy bólach reumatycznych, zapaleniu żył i naczyń chłonnych, stłuczeniach, zwichnięciach, stanach zapalnych piersi czy problemach gastryczno-jelitowych. Jej „wachlarz” zastosowań jest jednak znacznie szerszy i obejmuje zarówno leczenie chorób zewnętrznych, jak i wewnętrznych [38-40]. Jak sugerują najnowsze badania, wpływ spożywanych roślin na organizm ludzki może nie być wyłącznie związany z zawartymi w nich minerałami, antyoksydantami, witaminami czy też składem polipeptydowym, ale także z obecPL 226 431 B1 nością małych cząsteczek RNA, a dokładnie miRNA. W pracach Zhang'a i innych oraz Wang'a i innych przedstawione zostały dowody na obecność i stabilność roślinnych miRNA we krwi ludzkiej [41, 42]. Ponadto, Zhang i inni wykazali, iż jedna z wykrytych przez nich cząsteczek, MIR168a, może negatywnie regulować ekspresję genu białka adaptorowego 1 receptora lipoprotein niskiej gęstości (LDLRAP1) [41]. Wspomniane doniesienia, mówiące o między-gatunkowej regulacji ekspresji ludzkich genów za pomocą roślinnego miRNA, otwierają nowe drzwi dla medycyny naturalnej i sposobów leczenia wielu znanych schorzeń.

W zgłoszeniu patentowym CN102887948 (opubl. 2013-01-23) opisano antybakteryjny i immunoregulujący lek polipeptydowy. Peptyd apoE-mimetyczny ApoE23 opisany jest sekwencją 1. Testy in vivo i in vitro wykazały, że apoE mimetyczny peptyd może obniżyć LPS-indukowaną ekspresję TNF-a, IL-6 oraz IL-10 w komórkach THP-1 i ludzkich jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej, wyraźnie zmniejszając śmiertelność myszy z septicopyemia, zmniejsza stężenie TNF-α, IL-6 i LPS w osoczu krwi myszy z septicopyemia, łagodzi stany zapalne płuc, wątroby, jelita cienkiego i śledziony u myszy ze septicopyemia, oraz może zabijać Escherichia coli, pałeczkę ropy błękitnej oraz lekooporne na wszystkie dostępne leki bakterie Acinetobacter baumannii i gronkowca złocistego. ApoE mimetyczny peptyd może być wykorzystany do wytwarzania leków polipeptydowych, immunoregulacyjnych leków polipeptydowych oraz leków przeciw septicopyemia w przypadku opornych, niewrażliwych na wszystkie dostępne leki, pałeczki Gram-ujemne oraz bakterie Gram-ujemne.

W zgłoszeniu patentowym WO2012153854 (opubl. 2012-11-15) opisano nowe środki do modulowania ekspresji genów cytokin-chemokin związanych z zapaleniem i infekcją. W szczególności wynalazek dostarcza antysensowny nukleotyd, który zawiera sekwencję komplementarną do 3'UTR CCL2, CCL20, CX3CL1, IL-23A, CD69, NF-kB p65, TNF-α, Fam89a, Grk5, skramblazy fosfolipidowej 1, Runx1, semaforyny 4A, Steap4, limfotoksyny ss Psmb10 lub genu TLR2 indukowanego przez IL-1ss, i który jest zdolny do modulowania ekspresji genu; sensowny oligonukleotyd zawierający sekwencję komplementarną do endogennego antysensownego produktu transkrypcji zawierającego sekwencję komplementarną do genu 3'UTR i, który jest zdolny do modulowania ekspresji genu; środek, który zapobiega i/lub leczy stan zapalny lub infekcję oraz zawiera sensowny lub antysensowny nukleotyd.

Zgłoszenie patentowe AU2012201409 (opubl. 2012-03-29) dotyczy hamowania czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-α) z udziałem iRNA poprzez wyciszanie ekspresji mRNA receptorów powierzchniowych komórki TNF, lub przez wyciszanie ekspresji mRNA 5 TNF-α enzymu konwertującego (TACE/ADAM17). Wyciszenie takich celów TNF-α jest przede wszystkim przydatne do leczenia pacjentów z TNF-a-zależnymi zaburzeniami lub posiadających ryzyko rozwoju TNF-a-zależnych zaburzeń, takich jak zaburzenia oczne - suche oko, alergiczne zapalenie spojówek, czy zapalenie oka, a także takie jak zapalenie skóry, zapalenie błony śluzowej nosa, czy na przykład astmy.

Zgłoszenie patentowe WO201 21 1 5469 (opubl. 2012-08-30) dotyczy funkcjonalnej, przeciwzapalnej kompozycji spożywczej do stosowania doustnego, a w szczególności dotyczy sposobu wyodrębniania z ziarna i owoców składników aktywnych, skutecznych w zapobieganiu zapaleniu i łagodzenia objawów. Przeciwzapalna kompozycja spożywcza zawiera ekstrakt do stosowania doustnego. W tym celu, kompozycję według wynalazku, wytwarza się przez uzyskanie wyciągu z Morus alba L. (morwy), black turtle beans (czarnej fasoli), cebuli, oraz zmieszanie wymienionych ekstraktów w odpowiednim stosunku. W ten sposób przygotowana kompozycja może być zastosowana jako składnik przeciwzapalny w środkach przeciwbólowych, i jest skuteczna w zapobieganiu i łagodzeniu objawów zapalenia stawów, gdyż wykazuje w odpowiednim zakresie większe działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne, łagodzi skutki obrzęku, działa hamująco na ostre i chroniczne stany zapalne, działa hamująco na ekspresję lipoksygenazy, cyklooksygenazy-2, indukowanej syntazy tlenku azotu (iNOS) i kolagenazy typu I, które stanowią enzymy pro-zapalne, oraz działa hamująco na wytwarzanie czynnika martwicy nowotworów-alfa (TNF-α), interleukiny 1 beta (IL-1SS), interleukiny 6 (IL-6) i prostaglandyny, które stanowią czynniki pro-zapalne.

Zgłoszenie patentowe KR101090177 (opubl. 2011-12-06) dotyczy aptameru RNA o antagonistycznym działaniu do IL-32 służącym do tłumienia ekspresji TNF-alfa i do opracowania środka terapeutycznego do leczenia chorób zapalnych. Aptamer RNA posiada sekwencję SEQ. ID No. 7 i wiąże się do IL-32 jako antagonista. Aptamer RNA blokuje funkcję wewnętrznej IL-32. RNA aptamer posiada wysokie powinowactwo do IL-32. Aptamer RNA jest stosowany do opracowania środka terapeutycznego do leczenia chronicznego zapalenia, takiego jak reumatyczne zapalenie stawów.

PL 226 431 B1

W zgłoszeniu patentowym JP2003267880 (opubl. 2003-09-25) opisano otrzymanie kompozycji o przedwalergicznym i przeciwzapalnym działaniu, która ma doskonałą trwałość i cenę, jest bezpieczna, oraz ma doskonałe działanie przeciwalergiczne, ponadto działa na alergiczne zapalenie błony śluzowej nosa, pyłkowicę, itp. i jest przydatna jako środek przeciwzapalny i przeciwalergiczny. Środek hamujący produkcję interleukiny 4 zawiera jarmuż i/lub ekstrakt z jarmużu.

Zgłoszenie patentowe WO03070897 (opubl. 2003-08-28) dotyczy metod i odczynników przydatnych w modulowaniu ekspresji genu nadrodziny TNF oraz receptora nadrodziny TNF, w rozmaitych zastosowaniach, włączając m.in. zastosowanie terapeutyczne i diagnostyczne. W szczególności, wynalazek dotyczy małych cząsteczek kwasu nukleinowego, takich jak, krótkie interferujące RNA (siRNA), dsRNA, miRNA, shRNA, RNAi, zdolne do przeprowadzenia interferencji RNA (RNAi) przeciw ekspresji genu nadrodziny TNF oraz receptora nadrodziny TNF i/lub jego aktywności. Małe cząsteczki kwasu nukleinowego są przydatne w leczeniu wstrząsu septycznego, reumatoidalnego zapalenia stawów, HIV i AIDS, łuszczycy, chorób zapalnych i autoimmunologicznych zaburzeń oraz wielu innych chorób czy zaburzeń będących odpowiedzią na modulację ekspresji TNF i/lub receptora TNF czy jego aktywności.

W zgłoszeniu patentowym US2008279862 (opubl. 2008-11-13) przedstawiono metody leczenia chorób zapalnych i zaburzeń odporności. Opisano metody leczenia chorób zapalnych i zaburzeń odporności inhibitorami IL-1 i TNF oraz inhibitorami aktywności limfocytów B lub limfocytów T.

W zgłoszeniu patentowym US2012301484 (opubl. 2012-11-29) opisano nowe białka regulatorowe limfocytów T. Jedno z białek, oznaczone jako PD-L3 jest podobne do członków rodziny PD-L1 oraz kostymuluje CD3 alfa proliferację limfocytów T in vitro. Inne białko, typu TNF, zostało także zidentyfikowane jako nadregulowane pod wpływem stymulacji [alpha]CD3/[alpha]GITR. Białko to zostało oznaczone jako Treg-sTNF. Ujawniono białka, przeciwciała, aktywowane limfocyty T oraz sposoby ich zastosowania. W szczególności przedstawiono sposoby wykorzystania tych białek i związków, korzystnie przeciwciał, które wiążą lub modulują (agonizują lub antagonizują) aktywność tych białek, jako modulatory immunologiczne, stosowane przy leczeniu nowotworów, chorób autoimmunologicznych, alergiach, infekcjach i stanach zapalnych, np. stwardnieniu rozsianym.

W zgłoszeniu patentowym DE4006768 (opubl. 1991-09-05) przedstawiono czynnik przeciwreumatyczny (I) otrzymany z soku z liści kapusty, który także zawiera oliwę z oliwek, tak by nadać mieszaninie właściwą konsystencję. Korzystnie, gdy jest w formie maści, zawierającej poza oliwą z oliwy emulgator oraz środki konserwujące. Korzystnie, gdy kompozycja zawiera 10-80% wag. ekstraktu z liści/sok i 10-80% wag. oliwy z oliwek; idealnie gdy maść zawiera całościowo 5 do 80% (10 do 40%) wag. oliwy z oliwek i emulgatora. Korzystnie, gdy oliwa z oliwek jest wytłaczana na zimno.

W zgłoszeniu patentowym P-397846 (opubl. 2003-07-18) opisano sposób leczenia chorób związanych z TNFa, obejmujący podawanie inhibitorów THFa, włączając przeciwciała TNFa.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowej metody leczenia schorzeń, która poprzez zastosowanie cząsteczek miRNA pozwoli zmniejszyć reakcję zapalną organizmu w różnego rodzaju schorzeniach immunologicznych. W niniejszym wynalazku cząsteczki miRNA reprezentowane są przez odpowiednio bol-miR172a lub bol-miR172b pochodzące z Brassica oleracea var. capitata (kapusta głowiasta). Dotychczasowe doniesienia dotyczące wykorzystania kapusty głowiastej w leczeniu rozmaitych stanów chorobowych, nie wiązały jej leczniczych właściwości z obecnością cząsteczek miRNA. Dla potrzeby niniejszego wynalazku przeprowadzono bioinformatyczną predykcję ludzkich genów docelowych dla cząsteczek miRNA pochodzących z kapusty głowiastej. Wcześniej natomiast, dokonano analizy wyników głębokiego sekwencjonowania miRNA z dojrzałych liści Brassica oleracea var. capitata, mającej na celu potwierdzenie obecności, a także względne wyznaczenie ilości cząsteczek miRNA w badanych organach kapusty.

Na podstawie wspomnianej bioinformatycznej predykcji genów docelowych, wykazano, iż obecne w sporych ilościach cząsteczki bol-miR172a oraz bol-miR172b mogą oddziaływać z mRNA białka FAN regulując negatywnie jego ekspresję. Białko FAN, pośredniczy w odpowiedziach zapalnych poprzez interakcję z receptorem 1 czynnika alfa martwicy nowotworów (TNF-R1), z tego też względu jest potencjalnym celem terapeutycznym m.in. w chorobach autoimmunologicznych [32, 34]. Przeprowadzony na potrzeby wynalazku, test in vitro oceniający funkcje limfocytów T i B pod wpływem określonych mitogenów pokazał, iż obecność cząsteczki bol-miR172a lub bol-miR172b (w odpowiednim stężeniu) zmniejsza proliferację limfocytów B. Ocena fenotypowa komórek MNC z krwi obwodowej potwierdziła ponadto występowanie limfocytów T pomocniczych przy obecności nadmienionego miRNA, czy też jednoczesnej obecności tegoż miRNA oraz mitogenu.

PL 226 431 B1

Pomimo istniejącego stanu techniki oraz wiedzy dotyczącej miRNA, dotychczasowe badania nie przedstawiają dowodów na wpływ roślinnych cząsteczek miRNA na regulację procesów zapalnych zachodzących w organizmie ludzkim, ani sposobów wykorzystania tychże cząsteczek w celach terapeutycznych.

Realizacja tak określonego celu, a także zebranie dowodów na to, iż specyficzne cząsteczki miRNA odpowiadają za niektóre lecznicze właściwości roślin z których pochodzą, zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka miRNA pochodzenia roślinnego lub jej syntetyczny ekwiwalent, wybrana spośród cząsteczki miR172a albo miR172b, gdzie cząsteczka miR172a określona jest sekwencją SEQ. ID No. 1 a cząsteczka miR172b sekwencją SEQ. ID No. 2, do zastosowania do wytwarzania leku do zmniejszania reakcji zapalnej lub zapobiegania zwiększaniu się reakcji zapalnej organizmu.

Korzystnie, gdy cząsteczka zawiera co najmniej 6 z 7 nukleotydów obecnych w regionie „seed”, korzystnie 2-8 nukleotyd od 5' końca cząsteczki, określanym sekwencją SEQ. ID No. 3 oraz posiada co najmniej 70% podobieństwa sekwencyjnego względem SEQ. ID No. 1 lub SEQ. ID No. 2.

Korzystnie, gdy jej długość wynosi 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 albo 28 nukleotydów.

Korzystnie, gdy cząsteczka zawiera 2' lub 3'-O-metylację rybozy ostatniego nukleotydu z 3' końca.

Korzystnie, gdy jest zastosowana do zmniejszenia proliferacji limfocytów B.

Korzystnie, gdy jest zastosowana do zmniejszenia poziomu białka FAN.

Korzystnie, gdy poprzez oddziaływanie z mRNA kodującym białko FAN negatywnie reguluje jego ekspresję i zmniejsza proliferację limfocytów B.

Korzystnie, gdy poprzez oddziaływanie z mRNA kodującym białko FAN negatywnie reguluje jego ekspresję i zmniejsza jego poziom.

Korzystnie, gdy reakcja zapalna jest zmniejszana lub zapobiega się jej zwiększaniu poprzez zmniejszanie proliferacji limfocytów B.

Korzystnie, gdy reakcja zapalna jest zmniejszana lub zapobiega się jej zwiększaniu poprzez zmniejszanie poziomu białka FAN.

Załączone figury pozwalają na lepsze zrozumienie istoty wynalazku:

Figura 1 przedstawia miejsce wiązania się cząsteczki bol-miR172a (oznaczonej jako „Query”) do cząsteczki mRNA białka FAN (oznaczonej jako „Ref”) - „|” wskazuje na pełną komplementarność między nukleotydami, „:” odpowiada parom G:U, natomiast „-” reprezentuje przerwę w przyrównaniu. Wyliczona ocena komplementarności miRNA:mRNA („Score”) to 177, z kolei energia swobodna dupleksu („Energy”) równa jest -24.16 kcal/mol.

Figura 2 przedstawia wyniki oceny in vitro funkcji limfocytów T i B, przy czym Fig. 2a przedstawia wpływ obecności fitohemaglutyniny (PHA) oraz cząsteczki bol-miR172a (w różnych stężeniach) na proliferację limfocytów T, Fig. 2b przedstawia wpływ obecności Staphylococcus aureus (szczep Cowan, SAC) oraz cząsteczki bol-miR172a (w różnych stężeniach) na proliferację limfocytów B, Fig. 2c przedstawia wpływ obecności przeciwciał monoklonalnych anty-CD3 (OKT3) oraz cząsteczki bolmiR172a (w różnych stężeniach) na proliferację limfocytów T, a Fig. 2d przedstawia wpływ obecności cząsteczki bol-miR172a (w różnych stężeniach) na proliferację limfocytów B w przypadku ich autostymulacji. Przedstawione wyniki są wartościami średnimi wyliczonymi z trzech powtórzeń.

Figura 3 przedstawia wyniki oceny fenotypowej komórek MNC dokonanej metodą cytometrii przepływowej, przy czym Fig. 3a przedstawia wynik oceny komórek MNC inkubowanych z miRNA oraz miRNA i mitogenem PHA przez 3 godziny, Fig. 3b przedstawia wynik oceny komórek MNC inkubowanych z miRNA oraz miRNA i mitogenem PHA przez 6 godzin, a Fig. 3c przedstawia wynik oceny komórek MNC inkubowanych z miRNA oraz miRNA i mitogenem PHA przez 24 godziny. Przedstawione wyniki stanowiące odsetek komórek CD25+ w populacji komórek CD3+ są wartościami średnimi wyliczonymi z trzech oznaczeń.

Poniżej przedstawiono przykładowe sposoby wykonania zdefiniowanego powyżej wynalazku.

PRZYKŁADY

P r z y k ł a d 1

Głębokie sekwencjonowanie cząsteczek miRNA obecnych w dojrzałych liściach kapusty głowiastej

Wykorzystując metodę opisaną przez Szarzyńską i innych [43] wyizolowano, z dojrzałych liści kapusty głowiastej (Brassica oleracea var. capitata, kultywar Balbro), w trzech niezależnych powtórze6

PL 226 431 B1 niach, całkowitą frakcję RNA wzbogaconą w sRNA. Następnie przeprowadzono, zgodne z zaleceniami producenta, głębokie sekwencjonowanie technologią Illumina HiSeq. Otrzymane trzy zestawy surowych danych poddano analizie bioinformatycznej, mającej na celu usunięcie zanieczyszczeń, eliminację niepotrzebnych odczytów oraz identyfikację zachowanych i nowych cząsteczek miRNA. Relatywne ilości poszczególnych miRNA zidentyfikowanych w liściach kapusty szacowano na postawie wartości średnich, wyliczonych ze znormalizowanych ilości odczytów tychże miRNA we wszystkich trzech zestawach danych. Dane otrzymane z głębokiego sekwencjonowania zdeponowane są w bazie Gene Expression Omnibus (GEO) pod numerem GSE45578 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo//query/acc.cgi?acc=GSE45578).

P r z y k ł a d 2

Wyznaczenie potencjalnych ludzkich genów docelowych dla miRNA pochodzących z Brassica oleracea

Sekwencje miRNA z Brassica oleracea, użyte do predykcji ich potencjalnych genów docelowych, pobrano z publicznie dostępnej bazy PMRD (Plant MiroRNA Data Base, http://bioinformatics.cau.edu.cn/PMRD/) [44] oraz z wyników głębokiego sekwencjonowania miRNA z liści kapusty głowiastej. Za referencyjną bazę genów docelowych posłużyły zestaw ludzkich sekwencji regionów 3' UTR, 5' UTR oraz CDS mRNA dostępnych na stronie UCSC Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu/) [45] oraz w bazie NCBI CCDS (www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi) [46]. Do niniejszej predykcji bioinformatycznej wykorzystano program miRanda (www.microrna.org/microrna/getDownloads.do), którego procedura poszukiwania genów docelowych opiera się na komplementarności sekwencji oraz termodynamicznej stabilności dupleksu miRNA:mRNA [47]. Wśród wyników zwróconych przez program, znalazły się tylko takie sekwencje, których ocena komplementarności miRNA:mRNA nie była niższa niż 130 (ang. score), natomiast minimalna energia swobodna struktury była mniejsza niż -17 kcal/mol. Otrzymane wyniki posortowano według oceny komplementarności i energii swobodnej struktury. Następnie zebrano identyfikatory przewidzianych sekwencji docelowych i zmapowano je na bazę UniProt (www.uniprot.org), w celu uzyskania nazw i annotacji funkcjonalnych białek przez nie kodowanych. Otrzymany w ten sposób zbiór danych przeanalizowano manualnie i wybrano najbardziej interesujący dla wynalazku gen docelowy miRNA172 z kapusty głowiastej - mRNA białka FAN, określony sekwencją SEQ. ID No 4.

P r z y k ł a d 3

Ocena in vitro funkcji limfocytów T i B (test proliferacji) ₅

Kultury limfocytów założono w 96-oczkowej płaskodennej płytce hodowlanej (stężenie 1x10⁵komórek na studzienkę) i indukowano specyficznymi mitogenami: przeciwciała monoklonalne antyCD3 (OKT3, 1 pg/ml), fitohemaglutynina (PHA, 20 pg/ml), zawiesina Staphylococcus aureus, szczep Cowan (0.004%). Następnie do każdej studzienki dodano odpowiednią objętość miRNA w celu uzyskania jego stężeń: 15 pM, 30 pM i 60 pM. Kontrolne hodowle zawierały równoważną ilość środowiska hodowlanego. Hodowle inkubowano 72 godziny w temperaturze 37°C, w wilgotnej atmosferze z 5% CO₂. Następnie dodano znakowaną trytem tymidynę i dalej inkubowano 17 godzin w w/w warunkach. Hodowle komórek z wbudowaną w DNA tymidyną zebrano z płytki na bibułę filtracyjną przy pomocy automatycznego harvestera i umieszczono w liczniku scyntylacyjnym w celu zliczenia komórek.

P r z y k ł a d 4

Izolacja komórek MNC

Komórki jednojądrzaste (ang. mononuclear cells, MNC) wyizolowano z krwi obwodowej zdrowych dawców krwi przez wirowanie w gradisolu (ficolu) (1077 g/l), a następnie policzono w kamerze Bϋrkera z użyciem płynu Tkirka jako medium. Wyizolowane MNC rozcieńczono do stężenia 1 mln/ml w środowisku hodowlanym [płyn Parkera z dodatkiem L-glutaminy (2 mM), 3-3-merkaptoetanolu, Hepes (0,23%), płodowej surowicy bydlęcej (PCS, 10%) i gentamycyny (0,1 mg/ml)].

P r z y k ł a d 5

Oznaczenie fenotypu komórek MNC z krwi obwodowej pod wpływem mitogenu PHA i miRNA

Ocena receptora CD25 (podjednostka a receptora dla interleukiny-2) w populacji komórek MNC wyizolowanych z krwi obwodowej zdrowych dawców krwi z zastosowaniem gradisolu L (1077 g/l). Komórki jednojądrzaste (MNC) w stężeniu 10⁶/ml inkubowano przez 3 h, 6 h i 24 h z miRNA w stężeniu 30 pM/ml po stymulacji PHA (fitohemaglutynina, mitogen aktywujący populację limfocytów T) w stężeniu 20 i 30 pg/ml (firma Sigma). Badania wykonano z zastosowaniem immunofluorescencji i cytometrii przepływowej (aparat FACSCalbiur firmy Becton-Dickinson). Fenotyp komórek znakowano

PL 226 431 B1 z użyciem przeciwciał monoklonalnych: CD25-FITC i CD3-PE (firma Becton-Dickinson) za pomocą immunofluorescencji dwukolorowej. Komórki po hodowli inkubowano z przeciwciałami przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez dostępu światła. Po inkubacji i 2-krotnym płukaniu komórek w roztworze PBS + 0,1% FCS zawieszono je w 500 μΐ płynu FACSFlow (firma Becton-Dickinson) i zastosowano cytometrię przepływową. Akwizycję, magazynowanie danych i ich analizę wykonano z zastosowaniem programu CellQuest firmy Becton-Dickinson. Wyniki przedstawiono jako odsetek komórek CD25+ w populacji komórek CD3+ (limfocyty T).

OPISY WYNIKÓW

Identyfikacja cząsteczek miRNA w dojrzałych liściach kapusty głowiastej

W celu zidentyfikowania zestawu cząsteczek miRNA w dojrzałych liściach Brassica oleracea var. capitata dokonano głębokiego sekwencjonowania trzech przygotowanych uprzednio bibliotek małych RNA. Analiza bioinformatyczna uzyskanych w ten sposób surowych danych pozwoliła na wyznaczenie 261 zachowanych miRNA wraz z ich szacunkową ilością. Wśród sekwencji najczęściej występujących znalazły się sekwencje cząsteczek miR172a (SEQ. ID No. 1) oraz miR172b (SEQ. ID No. 2), będące celem niniejszego wynalazku.

Predykcja najlepszych ludzkich genów docelowych dla miRNA zidentyfikowanych u Brassica oleracea

W dalszych etapach realizacji wynalazku przeprowadzono predykcję genów docelowych dla cząsteczek miRNA z Brassica oleracea. Wśród wyników zwróconych przez program miRanda, posortowanych zgodnie z oceną komplementarności sekwencji miRNA:mRNA oraz najmniejszą energią swobodną struktury, najciekawszym dla celów wynalazku, a zarazem powiązanym z procesami zapalanymi organizmu, proponowanym genem docelowym było mRNA białka FAN (SEQ. ID No. 4). Cząsteczki określone sekwencją SEQ. ID No 1 oraz SEQ. ID No 2, których celem była nadmieniona sekwencja, to występujące obficie w liściach kapusty głowiastej miR172a oraz miR172b. Hybrydyzacja tych miRNA zachodzi, według zastosowanej metody, w regionie CDS mRNA białka FAN (oznaczonej jako CCDS6173.1). Komplementarność sekwencji miRNA oraz nadmienionego regionu mRNA białka FAN wyznaczone zostało na 89.4%. Ocena komplementarności tychże sekwencji wynosiła 177, natomiast energia swobodna struktury równa była -24.16 kcal/mol (Fig. 1).

Wpływ cząsteczek miRNA oraz mitogenów na proliferację limfocytów T i B

Ocena in vitro funkcji limfocytów T i B związana z ich autostymulacją lub wystąpieniem specyficznych mitogenów takich jak - przeciwciała monoklonalne anty-CD3 (OKT3), fitohemaglutynina (PHA) oraz Staphylococcus aureus (szczep Cowan, SAC), wykazała iż obecność bol-miR172a lub bolmiR172b w stężeniu 30 pM/mol powoduje zmniejszenie proliferacji limfocytów B w przypadku ich autostymulacji czy wpływie zastosowanego mitogenu (Fig. 2a, b, c i d).

Ocena fenotypowa komórek MNC metodą cytometrii przepływowej

Analiza cytometryczna komórek MNC z krwi obwodowej, inkubowanych przez 3, 6 i 24 godziny z bol-miR172a (stężenie 30 pM/mol), potwierdziła obecność nieznacznie zmiennego odsetka populacji limfocytów T pomocniczych w stosunku do kontroli, a także obecność określonego odsetka tychże komórek w przypadku zastosowania bol-miR172a oraz mitogenu PHA (w stężeniu 30 μg/mol) (Fig. 3a, b i c).

Podsumowując:

Test in vitro oceniający funkcje limfocytów T i B pod wpływem określonych mitogenów wykazał, iż obecność cząsteczki bol-miR172a lub bol-miR172b (w odpowiednim stężeniu) zmniejsza proliferację limfocytów B. Ocena fenotypowa komórek MNC z krwi obwodowej potwierdziła ponadto występowanie limfocytów T pomocniczych przy obecności nadmienionego miRNA, czy też jednoczesnej obecności tegoż miRNA oraz mitogenu. Oznacza to iż cząsteczki bol-miR172a lub bol-miR172b mają zdolności modulujące proliferację limfocytów B. Jednocześnie, cząsteczki te nie wpływają znacząco na populację limfocytów T pomocniczych. Mechanizm odpowiedzialny za wspomniane działania cząsteczki bol-miR172a lub bol-miR172b związany jest z jej oddziaływaniem z cząsteczką mRNA białka FAN.

PL 226 431 B1

LISTA SEKWENCJI

SEQ. ID No. 1 miR172a, cząsteczka RNA, długość 21 nukleotydów

AGAAUCUUGAOGAUGCłJGCAłJ

SEQ. ID No. 2 miR172b, cząsteczka RNA, długość 21 nukleotydów

AGAAUCUUGAUGAUGCUGCAU

SEQ. ID No. 3 region „seed” cząsteczki miR172, sekwencja RNA, długość 7 nukleotydów

GAAUCUU

SEQ. ID No. 4 mRNA białka FAN pochodzącego z Homo sapiens, wariant 1 transkryptu, cząsteczka RNA, długość 3582 nukleotydów

GCCGGAGTCCCCACGCGAGGATGCTGCGGTGAGCGCGGCCGGGACGCCGCGT

CGGGCTCTCGGCCGCCCAGCGGCGCCGCAGGGGAAGCCAGGCCGGCAGCCGC

GCGCTCCCCAGCCGGCCACCAATCCCGCCCTCCCCGGCTCCTCCGGACCTCCTC

GGCAGGCGGCGGCGGGGCCTGCCTGTGCGCTCTGCGCCCGCCCGCGCCTACCC

TCCATGGCGTTTATCCGGAAGAAGCAGCAGGAGCAGCAGCTGCAGCTCTACTC

C AAGG AG AG ATTTTCCTTGCTGCTGCTTA ACH GGAGG AGTACTACTTTGAAC A

GCATAGAGCCAATCACATTTTGCACAAGGGCAGTCACCATGAAAGGAAAATCA

GAGGCTCCTTAAAAATATGTTCAAAATCGGTGATTTTTGAACCAGATTCAATAT

CCCAGCCCATCATCAAGATTCCTTTGAGAGACTGTATAAAAATAGGAAAGCAT

GGAGAAAATGGAGCCAATAGACACTTCACAAAGGCAAAATCTGGGGGTATTT

CACTCATTTTCAGTCAGGTATATTTCATTAAAGAACATAATGTTGTTGCACCAT

ATAAAATAGAAAGGGGCAAAATGGAATATGTTTTTGAA TTGGATGTTCCCGGG

AAAGTGGAAGATGTTGTGGAGACGTTGCTTCAGCTTCACAGAGCATCCTGCCT

TGACAAATTGGGTGACCAAACCGCCATGATAACAGCTATTTTGCAGTCTCGTTT

AGCTAGAACATCATTTGACAAAAACAGGTTCCAAAACATTTCTGAAAAGCTGC

ACATGGAATGCAAAGCAGAAATGGTGACGCCTCTGGTGACTAATCCTGGACAC

GTGTGCATCACGGACACAAACCTGTATTTTCAGCCCCTCAACGGCTACCCGAA

ACCTGTGGTCCAGATAACACTCCAAGATGTCCGCCGCATCTACAAAAGGAGGC

ACGGCCTCATGCCTCTGGGCTTGGAAGTATTTTGCACAGAAGATGATCTGTGTT

CCGACATCTACCTAAAGTTCTATGAACCTCAAGATAGAGATGATCTCTATTTTT

ACATTGCCACATACCTAGAGCACCATGTGGCGGAGCACACTGCTGAGAGCTAC

ATGCTGCAGTGGCAGCGTGGACACCTTTCCAACTATCAGTACCTCCTTCACCTC

AACAACCTGGCCGACCGCAGCTGCAACGACCTCTCCCAGTACCCTGTGTTTCC

ATGGATAATACATGATTATTCCAGCTCAGAACTAGATTTGTCAAATCCAGGAA

CCTTCCGGGATCTCAGTAAGCCAGTAGGGGCCCTAAATAAGGAACGGCTGGAG

PL 226 431 B1

AGACTACTGACACGCTACCAGGAAATGCCTGAACCAAAGTTCATGTATGGGAG TCACTACTCTTCCCCGGGTTATGTACTTTTTrATCTTGTTAGGATTGCACCAGAG TATATGCTGTGCCTGCAGAATGGAAGATTTGATAATGCAGATAGAATGTTCAA CAGT ATrGCAGAAACTTGGAAAAACTGTCTGGA TGGTGCAACGGATm AAAG AGTIAA TTCCAGAA T TCTATGGTGATGATGTG AGCITTCTAGTCAATAGCCTGA AGTI 'GGATTI 'GGGAAAGAGACAAGG AGGACAGATGGTTGACGACGTGGAGCT

GGAA AGCAA TTATG TGTC1G AACACCTFCACGAGTGGATTGATCTΆ ATATTTG GCIACAAACAAAAAGGG AGTGATGCAGTTGGGOCCCATAATGT 'ATTTC A TCCC CTGACCTATGAAGGAGGTGTAGACTTGAACAGCA1CCAGGA1CCTGATGAGAA GGTAGCCATGCTTACGCAAATCl 'TGGA A ΤΠ GGGCAGAC ACC AA AACAACTAT

Uf ! U V ΛΟ acctccagttataatgcttctatggcagattccccaggtgaagagtcttttgaa

GACCTGACCGAAGA AAGCAAAACAC1GGCCTGGAATAAC ATC ACGAAACTGC

AGTTACACGAGCAC 1 'ATAAAATCCACAAAGA AGC AGTTACTGGAATCACGGTC

TCTCGCAATGGATCTTCAGTATTCACAACATCCCAAGATTCCACCTTGAAGATG rrrTCTAAAGAATCAAAAATGCTACAAAGAAGTATATCATTTTCAAATATGGCT

TTATCGTCTTGTTTACTTTTACCAGGAGATGCCACTGTCATAACTTCTTCATGGG

ATAATAATGTCTATTTTTATTCCATAGCATTTGGAAGACGCCAGGACACGTTAA

TGGGACATGATGATGCTGTTAGTAAGATCTGTTGGCAI GACAACAGGCIΑΤΑ T

TC TGCA TCG1 GGGACTCTACAGlGAAGG TG TGGTCTGGTGTTCCTGCAGAGAT

GCCAGGCACCAAAAGACACCACTTTGACTTGCTGGCCGAGCTGGAACATGATG

TCAGTGTAGATACAATCAGT TTAAATGCTGCAAGCACACTGTTAGTTTCCGGCA

CCAAAGAAGGCACAGTGAATATTTGGGACCTCACAACGGCCACCTTAATGCAC

CAGATTCCATGCCATTCAGGGATTGTATGTGACACTGCTTTTAGCCCAGATAGT

CGCCATGTCCTCAGCACAGGAACAGATGGCTGTCTTAATGTCATTGATGTGCA gacaggaatgctcatctcctccatgacatcagatoagccccagaggtgctttg

TCTGGGATGGAAATTCCGTTTTATCTGGCAGTCAGTCTGGTGAACTGCTCGTTT

GGGACCTCCTTGGAGCA AAAA TCAGTGAG AG AA TACAGGGCCACACAGGTGC

TGTGACATGTATATGGATGAATGAACAGTGTAGCAGTATCATCACAGGAGGGG

AAGACAGACAAATTATATTCTGGAAATTGCAGTATTAAGTGCCTrTTCCTCTCC

TGAATATTAAATTGAACTCTATTTAATGCATTTTTAAACCAAACTTTTAAACGG

ACTGGTGAATGTGCAATGTTAGTAA Tl ‘AGAAGTTTTACCACATGG AA AA ΤΓΤθΤ

GGTTTTAAACTTTCTAAATCATGGTGACTTCATTGAAAGCCATTAGTTGCTATT

CTCTTAGGGCAGATAAAATGCGGCTGTGTTAGGAAAAACATGTTACAĆTGTAA

GGCAGATGATCGTCCCCGTATGATGATTG TCAGAAGACAGGACTAAG TAGCAG

AGAA TAGCTAAGAGATAAATTOGGCTGGGGA AAC TTGTCAGAAAGCAC TGAA

CAATTAAGAAATTTTCCAAGAAAATGTGCAGTATTCTCTGCTACTTCTGAATCT

GTTTTGTCTTCCTAATCTATCACAATTGCCACCCATCGGGTnTGGGTGTGTGTT

TTCATAGCGTGGTTACTTTCTATAATGCTGTACCCAGATTCTAAGAACCTGGAG

AAGGATTAGCAGTTCTTAGTAAGTTTACTGTGTATAGGAACGGTTTGTATTTCA

TTACAGCTATrC ATCTTTTCTACATTAAAAATAT mTCTCTAAAGAAAAAAAA

AAAAAAA

PL 226 431 B1

BIBLIOGRAFIA:

1. Pillai RS: MicroRNA function: multiple mechanisms for a tiny RNA? RNA 2005, 11 (12): 1753-1761.

2. Ying SY, Chang DC, Lin SL: The microRNA (miRNA): overview of the RNA genes that modulate gene function. Molecular biotechnology 2008, 38 (3): 257-268.

3. Niwa R, Slack FJ: The evolution of animal microRNA function. Current opinion in genetics & development 2007, 17 (2): 145-150.

4. Zhang Y, Zhang R, Su B: Diversity and evolution of MicroRNA gene clusters. Science in China Series C, Life sciences /Chinese Academy of Sciences 2009, 52 (3): 261-266.

5. Hu W, Coller J: What comes first: translational repression or mRNA degradation? The deepening mystery of microRNA function. Cellresearch 2012, 22 (9): 1322-1324.

6. Djuranovic S, Nahvi A, Green R: miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science 2012, 336 (6078): 237-240.

7. Bartel DP: MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell

2004, 116 (2): 281-297.

8. Chen X: MicroRNA biogenesis and function in plants. FEBS letters 2005, 579 (26): 5923-5931.

9. Kim VN, Han J, Siomi MC: Biogenesis of small RNAs in animals. Nature reviews Molecular cell biology 2009, 10 (2): 126-139.

10. Khraiwesh B, Arif MA, Seumel GI, Ossowski S, Weigel D, Reski R, Frank W: Transcriptional control of gene expression by microRNAs. Cell 2010, 140 (1): 111-122.

11. Sontheimer EJ: Assembly and function of RNA silencing complexes. Nature reviews Molecular cell biology 2005, 6 (2): 127-138.

12. Naqvi AR, Sarwat M, Hasan S, Roychodhury N: Biogenesis, functions and fate of plant microRNAs. Journal of cellular physiology 2012, 227 (9): 3163-3168.

13. Wienholds E, Plasterk RH: MicroRNA function in animal development. FEBS letters

2005, 579 (26): 5911-5922.

14. Catuogno S: Recent Advance in Biosensors for microRNAs Detection in Cancer. Cancers 2011,3 (2): 1877-1898.

15. Hammond SM: RNAi, microRNAs, and human disease. Cancer chemotherapy and pharmacology 2006, 58 Suppl 1: s 63-68.

16. Hammond SM: MicroRNAs as oncogenes. Current opinion in genetics & development

2006, 16 (1): 4-9.

17. Esteller M: Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews Genetics 2011, 12 (12): 861-874.

18. Xiao C, Rajewsky K: MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell 2009, 136 (1): 26-36.

19. Hukowska-Szematowicz B, Tokarz-Deptula B, Deptula W: MicroRNA (miRNA) and the immune system. Centr Eur J Immunol 2012, 37 (4): 387-390.

20. Liu G, Abraham E: MicroRNAs in immune response and macrophage polarization. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 2013, 33 (2): 170-177.

21. Filkova M, Jungel A, Gay RE, Gay S: MicroRNAs in rheumatoid arthritis: potential role in diagnosis and therapy. BioDrugs: clinical immunotherapeutics, biopharmaceuticals and gene therapy 2012, 26 (3): 131-141.

22. Boissier MC, Semerano L, Challal S, Saidenberg-Kermanac'h N, Falgarone G: Rheumatoid arthritis: from autoimmunity to synovitis and joint destruction. Journal of autoimmunity 2012, 39 (3): 222-228.

23. Simoni Y, Diana J, Ghazarian L, Beaudoin L, Lehuen A: Therapeutic manipulation of natural killer (NK) T cells in autoimmunity: are we close to reality? Clinical and experimental immunology 2013, 171 (1): 8-19.

24. Fournier C: Where do T cells stand in rheumatoid arthritis? Joint, bone, spine: revue du rhumatisme 2005, 72 (6): 527-532.

PL 226 431 B1

25. Rickert RC, Jellusova J, Miletic AV: Signaling by the tumor necrosis factor receptor superfamily in B-cell biology and disease. Immunological reviews 2011, 244 (1): 115-133.

26. Stinissen P, Raus J, Zhang J: Autoimmune pathogenesis of multiple sclerosis: role of autoreactive T lymphocytes and new immunotherapeutic strategies. Critical reviews in immunology 1997, 17 (1): 33-75.

27. Krueger JG, Bowcock A: Psoriasis pathophysiology: current concepts of pathogenesis. Annals of the rheumatic diseases 2005, 64 Suppl 2: ii30-36.

28. Campbell KA, Lipinski MJ, Doran AC, Skaflen MD, Fuster V, McNamara CA: Lymphocytes and the adventitial immune response in atherosclerosis. Circulation research 2012, 110 (6): 889-900.

29. Youinou P, Jamin C, Saraux A: B-cell: a logical target for treatment of rheumatoid arthritis. Clinical and experimental rheumatology 2007, 25 (2): 318-328.

30. Huseyin TE Ozer, Ozbalkan Z: Clinical Efficacy of TNF-a Inhibitors: An Update. International Journal of Clinical Rheumatology 2010, 5 (1): 101-115.

31. Croft M, Benedict CA, Ware CF: Clinical targeting of the TNF and TNFR superfamilies. Nature reviews Drug discovery 2013, 12 (2): 147-168.

32. Montfort A, Martin PG, Levade T, Benoist H, Segui B: FAN (factor associated with neutral sphingomyelinase activation), a moonlighting protein in TNF-R1 signaling. Journal of leukocyte biology 2010, 88 (5): 897-903.

33. Palin K, Bluthe RM, McCusker RH, Levade T, Moos F, Dantzer R, Kelley KW: The type 1 TNF receptor and its associated adapter protein, FAN, are required for TNFalpha-induced sickness behavior. Psychopharmacology 2009, 201 (4): 549-556.

34. Montfort A, de Badts B, Douin-Echinard V, Martin PG, Iacovoni J, Nevoit C, Therville N, Garcia V, Bertrand MA, Bessieres MH et al: FAN stimulates TNF(alpha)-induced gene expression, leukocyte recruitment, and humoral response. J Immunol 2009, 183 (8): 5369-5378.

35. Challem J: The Inflammation Syndrome: The Complete Nutritional Program to Prevent and Reverse Heart Disease, Arthritis, Diabetes, Allergies, and Asthma: John Wiley & Sons; 2003.

36. Pizzorno JEJ, Murray MT, Joiner-Bey H: The Clinician's Handbook of Natural Medicine: Elsevier Health Sciences; 2008.

37. Torkos S: The Canadian Encyclopedia of Natural Medicine: John Wiley & Son; 2012.

38. Carper J: Apteka żywności. Nowe i niezwykłe odkrycia leczniczego działania żywności: Vesper; 2008.

39. Górnicka J: Apteka natury: poradnik zdrowia: ziołolecznictwo, akupresura, masaż shiatsu: AWM; 1997.

40. Munns A: Cabbage leaves: cabbage leaves can help inflammation of any body part. BMJ 2003, 327 (7412): 451.

41. Zhang L, Hou D, Chen X, Li D, Zhu L, Zhang Y, Li J, Bian Z, Liang X, Cai X et al. Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1: evidence of cross-kingdom regulation by microRNA. Cellresearch 2012, 22 (1): 107-126.

42. Wang K, Li H, Yuan Y, Etheridge A, Zhou Y, Huang D, Wilmes P, Galas D: The complex exogenous RNA spectra in human plasma: an interface with human gut biota? PloS one 2012, 7 (12): e51009.

43. Szarzynska B, Sobkowiak L, Pant BD, Balazadeh S, Scheible WR, Mueller-Roeber B, Jarmolowski A, Szweykowska-Kulinska Z: Gene structures and processing of Arabidopsis thaliana HYL1-dependent pri-miRNAs. Nucleic acids research 2009, 37 (9): 3083-3093.

44. Zhang Z, Yu J, Li D, Liu F, Zhou X, Wang T, Ling Y, Su Z: PMRD: plant microRNA database. Nucleic acids research 2010, 38 (Database issue): D806-813.

45. Kent WJ, Sugnet CW, Furey TS, Roskin KM, Pringle TH, Zahler AM, Haussler D: The human genome browser at UCSC. Genome research 2002, 12 (6): 996-1006.

46. Pruitt KD, Harrow J, Harte RA, Wallin C, Diekhans M, Maglott DR, Searle S, Farrell CM, Loveland JE, Ruef BJ et al: The consensus coding sequence (CCDS) project: Iden12

PL 226 431 B1 tifying a common protein-coding gene set for the human and mouse genomes.

Genome research 2009, 19 (7): 1316-1323.

47. Enright AJ, John B, Gaul U, Tuschl T, Sander C, Marks DS: MicroRNA targets in Drosophila. Genome biology 2003, 5 (1): R1.

Claims

1. Cząsteczka miRNA pochodzenia roślinnego lub jej syntetyczny ekwiwalent, wybrana spośród cząsteczki miR172a albo miR172b, gdzie cząsteczka miR172a określona jest sekwencją SEQ. ID No. 1 a cząsteczka miR172b sekwencją SEQ. ID No. 2, do zastosowania do wytwarzania leku do zmniejszania reakcji zapalnej lub zapobiegania zwiększaniu się reakcji zapalnej organizmu.

2. Cząsteczka według zastrz. 1, która zawiera co najmniej 6 z 7 nukleotydów obecnych w regionie „seed”, korzystnie 2-8 nukleotyd od 5' końca cząsteczki, określanym sekwencją SEQ. ID. No. 3, oraz posiada co najmniej 70% podobieństwa sekwencyjnego względem SEQ. ID No. 1 lub SEQ. ID No. 2.

3. Cząsteczka według zastrz. 2, której długość wynosi 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 albo 28 nukleotydów.

4. Cząsteczka według zastrz. 1 albo 2, która zawiera 2' lub 3'-O-metylację rybozy z ostatniego nukleotydu z 3' końca.

5. Cząsteczka według zastrz. 1 albo 2, do zmniejszenia proliferacji limfocytów B.

6. Cząsteczka według zastrz. 1 albo 2, do zmniejszenia poziomu białka FAN.

7. Cząsteczka według zastrz. 1 albo 2, która poprzez oddziaływanie z mRNA kodującym białko

FAN negatywnie reguluje jego ekspresję i zmniejsza proliferację limfocytów B.

8. Cząsteczka według zastrz. 1 albo 2, która poprzez oddziaływanie z mRNA kodującym białko

FAN negatywnie reguluje jego ekspresję i zmniejsza jego poziom.

9. Cząsteczka według zastrz. 1 albo 2, gdzie reakcja zapalna jest zmniejszana lub zapobiega się jej zwiększaniu poprzez zmniejszanie proliferacji limfocytów B.

10. Cząsteczka według zastrz. 1 albo 2, gdzie reakcja zapalna jest zmniejszana lub zapobiega się jej zwiększaniu poprzez zmniejszanie poziomu białka FAN.