PL226729B1 - Sposób otrzymywania egzo‑poligalakturonazy podczas prowadzenia hodowli pleśni Penicillium chrysogenum - Google Patents
Sposób otrzymywania egzo‑poligalakturonazy podczas prowadzenia hodowli pleśni Penicillium chrysogenumInfo
- Publication number
- PL226729B1 PL226729B1 PL411702A PL41170215A PL226729B1 PL 226729 B1 PL226729 B1 PL 226729B1 PL 411702 A PL411702 A PL 411702A PL 41170215 A PL41170215 A PL 41170215A PL 226729 B1 PL226729 B1 PL 226729B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- medium
- culture
- buffer
- exo
- per
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 title claims description 25
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 title claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 54
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 15
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 7
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 claims description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 4
- 239000001814 pectin Substances 0.000 claims description 4
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 241000207199 Citrus Species 0.000 claims description 2
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000011833 salt mixture Substances 0.000 claims description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000004927 clay Substances 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 14
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydroxypentanal Chemical compound OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000208202 Linaceae Species 0.000 description 2
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 2
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229940040387 citrus pectin Drugs 0.000 description 2
- 239000009194 citrus pectin Substances 0.000 description 2
- 239000012225 czapek media Substances 0.000 description 2
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 108091005960 Citrine Proteins 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 240000000560 Citrus x paradisi Species 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-DTEWXJGMSA-N D-Galacturonic acid Natural products O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-DTEWXJGMSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010001682 Dextranase Proteins 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101001096355 Homo sapiens Replication factor C subunit 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000864371 Penicillium viridicatum Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037855 Replication factor C subunit 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 244000205939 Rhizopus oligosporus Species 0.000 description 1
- 235000000471 Rhizopus oligosporus Nutrition 0.000 description 1
- 101100478212 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) spo4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001136494 Talaromyces funiculosus Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N aldehydo-D-galacturonic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 235000019846 buffering salt Nutrition 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 238000003889 chemical engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011035 citrine Substances 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002879 macerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002803 maceration Methods 0.000 description 1
- 238000003754 machining Methods 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 108020004410 pectinesterase Proteins 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 108010070456 protopectinase Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000005211 surface analysis Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 235000014101 wine Nutrition 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
- -1 β-gluconase Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania egzo-poligalakturonazy (egzo-PG) podczas prowadzenia hodowli pleśni Penicillium chrysogenum (notatum) w systemie okresowym na stałym podłożu (SSF - Solid State Fermentation), enzymu znajdującego zastosowanie w szczególności przy produkcji soków i win.
Znana jest z czasopisma Pakistan Journal of Agricultural Science, 2013, t. 50(3), s. 469-477 optymalizacja parametrów hodowli Penicillium notatum w systemie solid state na otrębach pszennych do produkcji egzo-poligalakturonazy. Optymalne warunki hodowli wyznaczono metodą analizy powierzchni odpowiedzi (RMS) badając parametry w wąskich zakresach, jak czas hodowli (2-4 dni), odczyn początkowy podłoża (2-4), temperatura (25-35°C) oraz źródło azotu (glicyna, NH4CI).
Z czasopisma Process Biochemistry 2007, t. 42, s. 1237-1243 znany jest sposób produkcji egzo-poligalakturonazy przez Penicillium viridicatum RFC3 w systemie solid-state w mieszaninie otrębów pszennych i wytłoków z pomarańczy.
Znany jest sposób hodowli Aspergillus niger i Penicillium spp. EGC5 w celu produkcji egzopoligalakturonazy na mieszaninie otrębów pszennych z wytłokami jabłek z czasopisma Chemical Engineering Research Bulletin 2011, t. 15, s. 1-5. W badaniach zbadano wpływ różnych źródeł węgla, azotu oraz składu otrębów i wytłoków jabłek na wielkość produkcji enzymu.
Znany jest z czasopisma Process Biochemistry 1999, t. 35, s. 69-75 sposób hodowli grzyba Rhizopus oligosporus na syntetycznym podłożu zawierającym agar wzbogacony solami metali. W hodowli zbadano wpływ: obecności soli buforujących warunkujących początkową wartość pH podłoża (4,0-6,3), dodatku witamin, tryptonu oraz peptonu na specyficzną szybkość wzrostu mikroorganizmu.
Z polskiego zgłoszenia patentowego nr P284698 znany jest enzymatyczny środek macerujący i sposób enzymatycznej obróbki włókien lnianych, który zawiera czynną substancję enzymatyczną, produkowaną przez Aspergillus niger 76-1 o numerze kolekcyjnym 1333 i wykazującą czynności następujących enzymów: poligalakturonazy, pektynoesterazy, protopektynazy i pewnych ilości proteazy, β-glukonazy, glukoamylazy i celulazy. Sposób polega na tym, że łodygi lniane poddaje się obróbce mechanicznej, po czym wprowadza do komory roztwarzania, zalewa ciepłą wodą i dozuje środek macerujący w ilości 0,5-2% względem masy surowca. Fermentacja ta zachodzi w temperaturze 39-43°C w ciągu 3-5 godzin, wobec ciągłej cyrkulacji cieczy.
Z polskiego opisu patentowego nr PL 179878 znany jest sposób wytwarzania dekstranazy, który polega na tym, że szczep grzyba strzępkowego Penicillium funiculosum 72 z rodziny Moniliaceae przeszczepia się na sterylne płynne podłoże hodowlane o składzie w procentach wagowych: 2% dekstranu o masie cząsteczkowej ponad 500000, 0,16% NaNO3, 0,075% (NH4)2SO4, 0,375% KH2PO4, 0,0075% FeSO4 x 7H2O, 0,025% MgSO4 x 7H2O, 0,0045% MnSO4 x 4H2O, 0,0044% ZnSO4 x 7H2O, 0,000125% CuSO4 x 5H2O i woda do 100%, o wyjściowym pH=4-4,6, stosując 105 - 5x105 zarodników na 1 ml pożywki i prowadzi hodowlę wstrząsaną w temperaturze 29-31°C w czasie 24-30 godzin przy amplitudzie drgań wstrząsarki 200-240 min-1. Otrzymaną zawiesiną wykiełkowanych konidiów zaszczepia się płynne podłoże hodowlane o opisanym wyżej składzie jakościowym, ilościowym i wyjściowym pH, stosując 4-8% objętościowych zawiesiny młodej grzybni na 1 część objętościową podłoża i prowadzi hodowlę inokulum w temperaturze 29-31°C w czasie 18-24 godzin przy amplitudzie drgań wstrząsarki 200-240 min-1, następnie otrzymanym inokulum zaszczepia się produkcyjne płynne podłoże hodowlane o opisanym wyżej składzie jakościowym, ilościowym i wyjściowym pH, stosując 4-8% objętościowych inokulum na 1 część objętościową podłoża i prowadzi hodowlę produkcyjną w warunkach wgłębnych w temperaturze 29-31°C, w czasie 72-76 godzin, doprowadzając w czasie hodowli sterylne powietrze i mieszając zawartość fermentora, po czym ciecz pohodowlaną oddziela się od biomasy, zatęża, odwirowuje i łączy z 86%-owym glicerolem w stosunku objętościowym 1:1.
Istotą wynalazku jest sposób otrzymywania egzo-poligalakturonazy podczas prowadzenia hodowli pleśni Penicillium chrysogenum, który polega na tym, że w pierwszym etapie przygotowuje się podłoże hodowlane, w tym celu surowiec zawierający substancje pektynowe poddaje się sterylizacji w 121°C przez 20 minut, następnie nasiąka się sterylnym roztworem soli (NH4)2SO4 i MgSO4x7H2O o stężeniu 10 g/l, w proporcji roztworu mieszaniny soli do masy podłoża 1 ml na 3 g podłoża, następnie w drugim etapie szczep Penicillium chrysogenum uaktywniony uprzednio przez przeniesienie na podłoże agarowe, korzystnie wzbogacone pektynami i inkubację w temperaturze 21-24°C przez 1014 dni przeszczepia się na sterylne podłoże hodowlane w ilości 1 ml na 15 gram podłoża hodowlanePL 226 729 B1 go i prowadzi się hodowlę okresową w temperaturze 21-24°C przez co najmniej 5 dni, przy czym pomiędzy 45 a 55 godziną hodowli dodaje się stężony bufor nieorganiczny: bufor fosforanowocytrynianowy lub fosforanowy, w temperaturze otoczenia w ilości 0,5-1,0 ml na 3 g podłoża, tak aby pH hodowli wynosiło od 3,4 do 5,6 po czym po kolejnych 3 dobach izoluje się produkt w postaci białek wykazujących aktywność egzo-poligalakturonazy.
Korzystnie jako podłoże hodowlane stosuje się skórki z owoców cytrusowych o zawartości wagowej pektyn od 2,5 do 5,0%.
Korzystnie izolacja produktu w postaci białek wykazujących aktywność egzo-poligalakturonazy polega na ługowaniu podłoża buforem o pH od 4,8 do 5,2 w ilości co najmniej 6 ml na 1 gram podłoża przez 60-120 minut przy 230-250 obrotach/min. Uzyskany ekstrakt sączy się przez sterylną gazę i wiruje przez 30 min przy 9000 rpm w 4°C. Otrzymany supernatant poddaje się dializie wobec tego samego buforu przez co najmniej 8 h.
Zaletą wynalazku jest to, że podczas prowadzenia hodowli uzyskujemy możliwość określenia dobowo, maksymalnej produkcji białka o aktywności egzo-poligalakturonazy. Zgodnie ze sposobem hodowli według wynalazku produkcja białka o aktywności egzo-poligalakturonazy następuje już w pierwszym dniu, maksimum przypada pomiędzy 48 a 72 godziną po czym aktywność stopniowo maleje. W tym czasie pH podłoża również spada, z 3,8-4,4 pierwszego dnia do wartości ~3,3 w dniu trzecim i pH 3,0 w dniu piątym.
Kontrola pH w hodowli w systemie fermentacji na podłożu stałym jest jednym z kluczowych parametrów dla wydajności procesu, ale też jest bardzo trudna ze względu na charakter procesu ze względu na niekorzystny dla mikroorganizmów wpływ mieszania i trudność pomiaru zmian pH (in situ). W literaturze znany jest sposób utrzymywania odczynu podłoża poprzez dodatek mocznika lub siarczanu(VI) amonu do podłoża na początku hodowli, jednak taka suplementacja nie jest w pełni efektywna ponieważ powoduje zmiany pH podłoża o więcej niż 1 jednostkę w czasie hodowli.
Wytwarzane białka o aktywności egzo-poligalakturonazy są wrażliwe na zmiany pH. Przeprowadzone testy wskazują, że białka te w pH 3,0 tracą aktywność o blisko 40% w ciągu następnych 72 godzin.
Dzięki dodaniu do hodowli stężonego buforu nieorganicznego uzyskujemy podniesienie odczynu hodowli do wartości bliskiej i wyższej od pH podłoża, w dniu maksymalnej produkcji białka o aktywności egzo-poligalakturonazy, tj. w 45-55 godzinie hodowli. Sposób według wynalazku umożliwia w jednym cyklu produkcyjnym otrzymanie egzo-poligalakturonazy, enzymu wykazującego nawet
6.5 krotnie większą aktywność, niż egzo-poligalakturonaza otrzymana w hodowli bez zmiany pH przy zbliżonych wartościach masy białka uzyskanego z 1 grama podłoża.
Sposób według wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach jego realizacji.
P r z y k ł a d 1. Hodowla testowa, bez dodatku stężonego buforu
Szczep Penicillium chrysogenum uaktywniono w czasie 14 dni w temperaturze 21°C, w podłożu Czapek-dox z 0,1% pektyną cytrusową wysterylizowanym w 121°C przez 20 minut. Następnie sporządzono zawiesinę zarodników wykorzystując 30 ml 0,1% roztworu Tween80®. Tak przygotowane inokulum - 1 ml, wykorzystano do zaszczepienia kolby 250 ml zawierającej 15 gram skórek z pom arańczy pokrojonych w kostkę o krawędzi ~5 mm, uprzednio wysterylizowanych w 121°C przez 20 minut i nasiąkanych przez 60 minut 5 ml roztworu soli (NH4)2SO4 i MgSO4 o stężeniu 10 g/l. W odstępach dobowych izolowano produkt fermentacji poprzez ługowanie hodowli buforem cytrynianowofosforanowym o pH 5,1 stosując 6 ml medium na 1 gram podłoża. Ekstrakcję prowadzono przez 60 minut przy 250 obr/min. Uzyskany ekstrakt przesączono przez jałową gazę i odwirowano. Supernatant poddano dializie wobec tego samego buforu, który użyto do ekstrakcji, przez 11 h wymieniając jego objętość 2 razy. Użyto co najmniej 10-krotnego nadmiaru buforu do dializy w porównaniu z dializowaną próbką. Uzyskano dializaty białkowe w których oznaczono stężenia białka (metoda Lowry'ego) wyrażonej w miligramach białka uzyskanych z 1 grama podłoża oraz metodą z odczynnikiem DNS aktywność egzo-PG w 1 ml dializatu, wyrażoną jako liczba gram uwalnianego produktu (kwasu D-galakturonowego) w ciągu 1 min przez 1 ml oczyszczonego ekstraktu.
Uzyskane w hodowlach dobowych dializaty zawierają 2,1-4,3 mg białka/1 g podłoża o aktywności egzo-PG [U/ml]: 27-98. Maksimum aktywności zaobserwowano dla 2 doby hodowli (masa białka
3.5 mg/g podłoża): 198 U/ml.
P r z y k ł a d 2
Szczep Penicillium chrysogenum uaktywniono w czasie 12 dni w temperaturze 24°C, w podłożu Czapek-dox z 0,1% pektyną cytrusową wysterylizowanym w 121°C przez 20 minut. Następnie spo4
PL 226 729 B1 ® rządzono zawiesinę zarodników wykorzystując 30 ml 0,1% roztworu Tween80®. Tak przygotowane inokulum - 1 ml, wykorzystano do zaszczepienia kolby 250 ml zawierającej 15 gram skórek z pom arańczy pokrojonych w kostkę o krawędzi ~5 mm, uprzednio wysterylizowanych w 121°C przez 20 minut i nasiąkanych przez 60 minut 5 ml roztworu soli (NH4)2SO4 i MgSO4 o stężeniu 10 g/l. W drugiej dobie hodowli (48 h) do kolby dodano sterylnie 2,5 ml dwukrotnie bardziej stężonego buforu cytrynianowo-fosforanowego o pH=8,0 i pozostawiono na kolejne 72 h. Dodanie takiej ilości buforu o tym pH było kluczowe do podniesienia pH podłoża do wartości 4,1. Po kolejnych trzech dobach hodowlę wyługowano buforem cytrynianowo-fosforanowym o pH 4,8 stosując 6 ml medium na 1 gram podłoża.
Ekstrakcję prowadzono przez 60 minut przy 250 obr/min. Uzyskany ekstrakt przesączono przez jałową gazę i odwirowano. Supernatant poddano dializie wobec tego samego buforu, który użyto do ekstrakcji, przez 10 h wymieniając jego objętość 2 razy. Użyto co najmniej 10-krotnego nadmiaru buforu do dializy w porównaniu z dializowaną próbką.
Uzyskano dializat enzymatyczny w ilości 4,5 mg białka z 1 g podłoża o aktywności maksymalnej egzo-PG [U/ml] w 5 dniu: 490.
P r z y k ł a d 3
Przygotowano materiał posiewowy analogicznie jak w przykładzie 1. Podłoże produkcyjne stanowiło 15 g skórek z cytryny pokrojonych w kostkę o krawędzi ~3 mm. Skórki nasiąkano 5 ml roztworu (NH4)2SO4 i MgSO4 o stężeniu 10 g/l przez 75 minut. Do tak przygotowanego złoża w kolbie o pojemności 250 ml dodano sterylnie 1 ml inokulum. W drugiej dobie hodowli (45 h) do fermentującego podłoża dodano sterylnie 5 ml buforu fosforanowego 0,2 M o pH 6,5 i pozostawiono na kolejne 72 h. Dodanie takiej ilości buforu o tym pH było kluczowe do podniesienia pH podłoża do wartości 3,85. Po kolejnych dwóch dobach hodowlę wyługowano buforem cytryn ianowo-fosforanowym o pH 5,0 stosując 6 ml medium na 1 gram podłoża. Ekstrakcję prowadzono przez 60 minut przy 230 obr/min. Uzyskany ekstrakt przesączono przez jałową gazę i odwirowano. Supernatant poddano dializie wobec tego samego buforu, który użyto do ekstrakcji, przez 8 h wymieniając jego objętość 2 krotnie w tym czasie. Użyto co najmniej 10-krotnego nadmiaru buforu do dializy w porównaniu z dializowaną próbką.
Uzyskano dializat w ilości 3,9 mg białka z 1 g podłoża o aktywności egzo-PG [U/ml] w 5 dniu: 476.
P r z y k ł a d 4
Przygotowano materiał posiewowy analogicznie jak w przykładzie 1. Podłoże produkcyjne stanowiło 15 g skórek z grejpfruta pokrojonych w kostkę o krawędzi ~5 mm. Skórki nasiąkano 5 ml roztworu (NH4)2SO4 i MgSO4 o stężeniu 10 g/l przez 70 minut. Do tak przygotowanego złoża w kolbie o pojemności 250 ml dodano sterylnie 1 ml inokulum. W drugiej dobie hodowli (45 h) do fermentującego podłoża dodano sterylnie 2,5 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego 0,2:0,4 M o pH 7,5 i pozostawiono na kolejne 72 h. Dodanie takiej ilości buforu o tym pH było kluczowe do podniesienia pH podłoża do wartości 4,5. Po kolejnych trzech dobach hodowlę wyługowano buforem cytrynianowo- fosforanowym o pH 5,2 stosując 6 ml medium na 1 gram podłoża. Ekstrakcję prowadzono przez 60 minut przy 230 obr/min. Uzyskany ekstrakt przesączono przez jałową gazę i odwirowano. Supernatant poddano dializie wobec tego samego buforu, który użyto do ekstrakcji, przez 10 h wymieniając jego objętość 2 krotnie w tym czasie. Użyto co najmniej 10-krotnego nadmiaru buforu do dializy w porównaniu z dializowaną próbką.
Uzyskano dializat enzymatyczny w ilości 3,95 mg białka z 1 g podłoża o aktywności egzo-PG [U/ml]: 635.
P r z y k ł a d 5
Przygotowano materiał posiewowy analogicznie jak w przykładzie 1. Podłoże produkcyjne stanowiło 15 g skórek z pomarańczy pokrojonych w kostkę o krawędzi ~7 mm. Skórki nasiąkano 5 ml roztworu (NH4)2SO4 i MgSO4 o stężeniu 10 g/l przez 75 minut. Do tak przygotowanego złoża w kolbie o pojemności 250 ml dodano sterylnie 1 ml inokulum. W drugiej dobie hodowli (48 h) do fermentującego podłoża dodano sterylnie 5 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego o stężeniu składników 0,2:0,4 M o pH 7,5 i pozostawiono na kolejne 72 h. Dodanie takiej ilości buforu o tym pH było kluczowe do podniesienia pH podłoża do wartości 3,5. Po kolejnych trzech dobach hodowlę wyługowano buforem cytrynianowo-fosforanowym o pH 5,0 stosując 6 ml medium na 1 gram podłoża. Ekstrakcję prowadzono przez 10 minut przy 250 obr/min. Uzyskany ekstrakt przesączono przez jałową gazę i odwirowano. Supernatant poddano dializie wobec tego samego buforu, który użyto do ekstrakcji, przez 10 h wymieniając jego objętość 2 krotnie w tym czasie. Użyto co najmniej 10-krotnego nadmiaru buforu do dializy w porównaniu z dializowaną próbką.
Uzyskano dializat enzymatyczny w ilości 4,5 mg białka z 1 g podłoża o aktywności egzo-PG [U/ml]: 776,0.
PL 226 729 B1
P r z y k ł a d 6
Przygotowano materiał posiewowy analogicznie jak w przykładzie 1. Podłoże produkcyjne stanowiło 15 g skórek z pomarańczy pokrojonych w kostkę o krawędzi ~5 mm. Skórki nasiąkano 5 ml roztworu (NH4)2SO4 i MgSO4 o stężeniu 10 g/l przez 60 minut. Do tak przygotowanego złoża w kolbie o pojemności 250 ml dodano sterylnie 1 ml inokulum. W drugiej dobie hodowli (55 h) do fermentującego podłoża dodano sterylnie 2,5 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego 0,2:0,4 M o pH 8,0 i pozostawiono na kolejne 72 h. Dodanie takiej ilości buforu o tym pH było kluczowe do podniesienia pH podłoża do wartości 4,1. Po kolejnych trzech dobach hodowlę wyługowano buforem cytrynianowo- fosforanowym o pH 4,8 stosując 6 ml medium na 1 gram podłoża. Ekstrakcję prowadzono przez 60 minut przy 230 obr/min. Uzyskany ekstrakt przesączono przez jałową gazę i odwirowano. Supernatant poddano dializie wobec tego samego buforu, który użyto do ekstrakcji, przez 8 h wymieniając jego objętość 2 krotnie w tym czasie. Użyto co najmniej 10-krotnego nadmiaru buforu do dializy w porównaniu z dializowaną próbką.
Uzyskano dializat enzymatyczny w ilości 4,5 mg białka z 1 g podłoża o aktywności egzo-PG [U/ml]: 623.
P r z y k ł a d 7
Przygotowano materiał posiewowy analogicznie jak w przykładzie 1. Podłoże produkcyjne stanowiło 15 g skórek z pomarańczy pokrojonych w kostkę o krawędzi ~5 mm. Skórki nasiąkano 5 ml roztworu (NH4)2SO4 i MgSO4 o stężeniu 10 g/l przez 60 minut. Do tak przygotowanego złoża w kolbie o pojemności 250 ml dodano sterylnie 1 ml inokulum. W drugiej dobie hodowli (51 h) do fermentującego podłoża dodano sterylnie 5 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego 0,2:0,4 M o pH 8,0 i pozostawiono na kolejne 72 h. Dodanie takiej ilości buforu o tym pH było kluczowe do podniesienia pH podłoża do wartości 5,6. Po kolejnych trzech dobach hodowle wyługowano buforem cytrynianowofosforanowym o pH 5,0 stosując 6 ml medium na 1 gram podłoża. Ekstrakcję prowadzono przez 60 minut przy 230 obr/min. Uzyskany ekstrakt przesączono przez jałową gazę i odwirowano. Supernatant poddano dializie wobec tego samego buforu, który użyto do ekstrakcji, przez 8 h wymieniając jego objętość 2 krotnie w tym czasie. Użyto co najmniej 10-krotnego nadmiaru buforu do dializy w porównaniu z dializowaną próbką.
Uzyskano dializat enzymatyczny w ilości 7,6 mg białka z 1 g podłoża o aktywności egzoPG[U/ml]:1277.
Claims (4)
1. Sposób otrzymywania egzo-poligalakturonazy podczas prowadzenia hodowli pleśni Penicillium chrysogenum, znamienny tym, że w pierwszym etapie przygotowuje się podłoże hodowlane, w tym celu surowiec zawierający substancje pektynowe poddaje się sterylizacji w 121 °C przez 20 minut, następnie nasiąka się sterylnym roztworem soli (NH4)SO4 i MgSO4x7H2O o stężeniu 10 g/l, w proporcji roztworu mieszaniny soli do masy podłoża 1 ml na 3 g podłoża, w drugim etapie szczep Penicillium chrysogenum uaktywniony uprzednio przez przeniesienie na podłoże agarowe i inkubację w temperaturze 21-24°C przez 10-14 dni przeszczepia się na sterylne podłoże hodowlane w ilości 1,0 ml na 15 gram podłoża hodowlanego i prowadzi się hodowlę okresową w temperaturze 21-24°C przez co najmniej 5 dni, przy czym pomiędzy 45 a 55 godziną hodowli dodaje się stężony bufor nieorganiczny: bufor fosforanowo-cytrynianowy lub fosforanowy, w temperaturze otoczenia w ilości 0,5-1,0 ml na 3 g podłoża, tak aby pH hodowli wynosiło od 3,4 do 5,6 po czym po kolejnych 3 dobach izoluje się produkt w postaci białek wykazujących aktywność egzo-poligalakturonazy.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako podłoże hodowlane stosuje się skórki z owoców cytrusowych o zawartości wagowej pektyn od 2,5 do 5,0%.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podłoże agarowe wzbogacone jest pektynami.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że izolacja produktu w postaci białek wykazujących aktywność egzo-poligalakturonazy polega na ługowaniu podłoża buforem o pH=4,8-5,2 w ilości co najmniej 6 ml na 1 gram podłoża przez 60-120 minut przy 230-250 obrotów/min, przy czym uzyskany ekstrakt sączy się przez sterylną gazę i wiruje przez 30 min przy 9000 rpm w 4°C, a otrzymany supernatant poddaje się dializie wobec tego samego buforu przez co najmniej 8 h.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL411702A PL226729B1 (pl) | 2015-03-26 | 2015-03-26 | Sposób otrzymywania egzo‑poligalakturonazy podczas prowadzenia hodowli pleśni Penicillium chrysogenum |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL411702A PL226729B1 (pl) | 2015-03-26 | 2015-03-26 | Sposób otrzymywania egzo‑poligalakturonazy podczas prowadzenia hodowli pleśni Penicillium chrysogenum |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL411702A1 PL411702A1 (pl) | 2016-01-18 |
| PL226729B1 true PL226729B1 (pl) | 2017-08-31 |
Family
ID=55072350
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL411702A PL226729B1 (pl) | 2015-03-26 | 2015-03-26 | Sposób otrzymywania egzo‑poligalakturonazy podczas prowadzenia hodowli pleśni Penicillium chrysogenum |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL226729B1 (pl) |
-
2015
- 2015-03-26 PL PL411702A patent/PL226729B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL411702A1 (pl) | 2016-01-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| de Oliveira Mendes et al. | Fermentation liquid containing microbially solubilized P significantly improved plant growth and P uptake in both soil and soilless experiments | |
| Ahmed et al. | Production of gluconic acid by using some irradiated microorganisms | |
| CN107955794B (zh) | 蛹虫草菌种的优质保藏方法 | |
| Adedayo et al. | Pectinolytic activity of Aspergillus niger and Aspergillus flavus grown on grapefruit (citrus Parasidis) peel in solid state fermentation | |
| Madan et al. | Physiology of fungi | |
| CN117402789A (zh) | 一种侧孢芽孢杆菌及其在土壤改良中的应用 | |
| CN114907983B (zh) | 一种红平菇菌丝体液体培养基和一种红平菇菌丝体的发酵方法 | |
| Kuek | Shake-flask culture of Laccaria laccata, an ectomycorrhizal basidiomycete | |
| CN109182151A (zh) | 银杏内生真菌的分离筛选方法 | |
| KR101224039B1 (ko) | 꽃송이버섯의 β-글루칸 함량을 증진하는 재배방법 | |
| Rajmane et al. | Impact of carbon and nitrogen sources on pectinase production of post-harvest fungi. | |
| CN101861796B (zh) | 一种利用有色稻米发酵废糟培养豹斑毒鹅膏的方法 | |
| CN118956612A (zh) | 一种解磷土曲霉及其在抗旱益生中的应用 | |
| CN111944726A (zh) | 一种土壤微生物群调节剂及其制备方法和应用 | |
| PL226729B1 (pl) | Sposób otrzymywania egzo‑poligalakturonazy podczas prowadzenia hodowli pleśni Penicillium chrysogenum | |
| Minussi et al. | Methylxanthines as inducers of pectin lyase in Penicillium griseoroseum cultured on sucrose | |
| CN117730733A (zh) | 一种富含必需氨基酸和多糖的平菇菌丝体的培养方法 | |
| Fermor | Agaricus macrosporus: an edible fungus with commercial potential | |
| Kazi et al. | Keratinolytic activity exhibited in an indigenous non-dermatophytic fungus strain Cochliobolus lunatus isolated from Khairpur Sindh Pakistan | |
| CN107926482A (zh) | 一种利用液体培养基生产蛹虫草子实体的方法 | |
| CN102475033A (zh) | 丰富含硒的灵芝菌丝生产方法 | |
| Jadubansa et al. | Physiology of production of viable biomass and spore inoculum for the biocontrol agent Idriella (Microdochium) bolleyi | |
| CN103571758B (zh) | 土壤溶磷真菌接种剂、制备方法及应用 | |
| CN110305802A (zh) | 一种液态发酵繁殖高孢子产量紫红曲霉的培养基及培养方法 | |
| KR100383078B1 (ko) | 상황버섯 균사체의 유가식 배양을 통한 대량 생산 방법 |