PL226816B1 - Sposób otrzymywania 25-hydroksylowanych pochodnych sterolowych, wtym 25-hydroksy-7-dehydrocholesterolu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób biokatalitycznego otrzymywania 25-hydroksylowanych pochodnych sterolowych o wzorze IIa, wzorze llb, wzorze lIc i wzorze Ile, w tym 25-hydroksy-7-dehydrocholesterolu o wzorze lId, na drodze regioselektywnego utleniania (hydroksylacji) pochodnych sterolowych o wzorze la, wzorze Ib, wzorze Ic, wzorze Id, wzorze le za pomocą bakteryjnej dehydrogenazy C25 steroidowej (S25DH) lub bakteryjnych preparatów enzymatycznych o aktywności S25DH.

Związki sterolowe pełnią w organizmie ludzkim bardzo ważne funkcje regulatorowe, dlatego przemysł farmaceutyczny stale poszukuje efektywnych i prostych metod ich otrzymywania różnych ich pochodnych.

Obecnie otrzymywanie 25-hydroksylowanych pochodnych steroli odbywa się na drodze złożonej i kosztownej syntezy chemicznej.

Przykładowo, w czasopiśmie Steroids 2009, 74 (1), 81-7 opisano metody syntezy 25-hydroksycholesterolu i 25-hydroksy siarczanu cholesterolu z zastosowaniem dioksiranów. Ujawniono, że zastosowanie w syntezie in situ etylo(trifluorometylo)dioksiranu (ETDO) pozwoliło na osiągnięcie najwyższego stopnia efektywności i regioselektywności. Dla 25-hydroksy siarczanu cholesterolu całkowita wydajność syntezy wyniosła 24%.

Znane są też alternatywne sposoby otrzymywania pochodnych steroli metodami spełniającymi wymogi „green chemistry”, jak na przykład regioselektywna hydroksylacja steroli z wykorzystaniem biokatalizatorów.

Bakteria Sterolibaterium denitrificans Chol-1S (DSM: 13999) została wyizolowana przez S. Tarlera i E. B. M. Dennera z kultury bakterii denitryfikujących stosowanych w oczyszczaniu ścieków sanitarnych. Sposób izolacji i hodowli oraz pełną charakterystykę bakterii Sterolibaterium denitrificans Chol-1S przedstawili oni w czasopiśmie International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2003, 53, 1085-1091.

Z czasopisma Journal of Biological Chemistry, 2007, 282, 13240-13249 znany jest sposób pozyskiwania z bakterii Sterolibaterium denitrificans Chol-1S ekstraktu komórkowego zawierającego enzym dehydrogenazy C25 steroidowej (S25DH), a z czasopisma Journal of Biological Chemistry, 2012, 287, 36905-36916 znany jest sposób izolacji tego enzymu w warunkach beztlenowych.

Z kolei w Journal of Biological Chemistry, 2007, 282, 13240-13249 wykazano regioselektywność tego enzymu, a w artykule „Molybdoenzyme that catalyzes the anaerobic hydroxylation of a tertiary carbon atom in the side chain of cholesterol”, opublikowanym w Journal of Biological Chemistry, 2012, 287, 36905-36916 ujawniono spektrum substratowe złożone z pięciu substratów: cholest-4-en-3-onu, cholest-4,6-dien-3-onu, 5-cholestan-33-ol-7-onu i cholest-5-en-3-olu (cholesterolu) oraz określono skład mieszaniny reakcyjnej, który opiera się na stosowaniu w celu solubilizacji powyższych substratów 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny w stężeniu do 20-28% (w/v) w obecności 1% 1,4-dioxanu i 100 mM buforu fosforanowego pH 7,5.

W literaturze opisano szereg rozwiązań dotyczących biokatalitycznego utleniania pochodnych cholesterolu i witaminy D.

W czasopiśmie Plant Physiology, 2011, 157 (1), 426-40 wskazano możliwość syntezy 25-hydroksy steroli przy użyciu transgenicznych roślin Arabidopsis thaliana i Solanum tuberosum. W wyniku wprowadzenia do genomu roślinnego genu mysiej hydroksylazy 25-cholesterolowej d

(NM_009890) otrzymano 11,1 ± 3,7 mg kg^-1 (ang. f. w.) 25-hydroksycholesterolu.

Jednak najwięcej doniesień literaturowych można znaleźć dla enzymów należących do rodziny cytochromów P450.

W artykule w Journal of Lipid Research 2011, 52 (8), 1447-9 i 52 (8), 1509-16 wspomina się o możliwości zastosowania enzymu CYP3A4 w syntezie 25-hydroksycholesterolu , brak jest jednak udokumentowanego wykorzystania enzymu w takiej syntezie. Podobna sytuacja jest w przypadku enzymu CYP105A1 - co opublikowano w FEBS Journals, 2010, 277 (19), 3999-4009.

Z artykułu „Vitamin D 25-hydroxylase - Four decades of searching, are we there yet?”, opubl. w Archives of Biochemistry and Biophysics, 2012, 1, 523(1), 30-6 wiadomo, że w syntezę 25-hydroksy-witaminy D3 zaangażowane są enzymy należące do cytochromów P450, jak: CYP27A1, CYP2R1, CYP2J2/3, CYP3A4, CYP2D25 i CYP2C11.

W artykule Biochemical and Biophysical Research Communications, 2013, 434 (2), 311-5 przedstawiono sposób syntezy 25-hydroksy-witaminy D2 stosując jako substrat ergosterol oraz naświetlanie

PL 226 816 B1

UVB w obecności rekombinowanych komórek Saccharomyces cerevisiae z nadekspresją ludzkiego

CYP2R1. Zrekombinowane komórki zawieszano w buforze z glukozą lub β-cyklodekstryną, a w wyniku naświetlania i reakcji enzymatycznej dla odpowiedniego prekursora witaminowego otrzymywano 25-hydroksy-witaminę D3 lub 25-hydroksy-witaminę D2.

W zgłoszeniach patentowych WO 2011/067144 i US 2012/0231495 ujawniono wytwarzanie 25-hydroksy-7-dehydrocholesterolu i 25-hydroksy-ergosterolu z użyciem zrekombinowanych komórek drożdży, z nadekspresją genów eukariotycznych 25-hydroksylaz steroidowych (EC 1.14.99.38) różnych gatunków zwierząt: C25 HI (świnia; SEQ. ID NO.5), C25 H3 (pies: SEQ.ID.NO: 8), Ecab HY lub Ecab 25OH_opt2.0 (koń: SEQ ID NOS: 25 and 26), ConHYD opt 20 (SEQ ID NO: 30), Rnor HY (szczur: SEQ ID NO: 23), Sscr HY (SEQ ID NO: 28), Sscr opt 20 (SEQ ID NO : 27), Sscr Pompon (SEQ ID NO: 5).

Brak regioselektywności enzymów wykazano w czasopiśmie Drug Metabolism and Disposition, 2013; 41 (5), 1112-24 dla mysiej i ludzkiej CYP27B1. Aktywność enzymu CYP27B1 prowadzi do tworzenia pochodnych hydroksylowanych przy 17, 22, 23, 24, 26 atomie węgla, zaś największe powinowactwo do aktywności w kierunku 25-OH wykazuje względem 20-hydroksy-witaminy D3.

W czasopiśmie Molecular and Cellular Endocrinology, 2014, 5, 383(1-2), 181-92 wykazano również aktywność CYP27B1 w kierunku tworzenia 1a-hydroksywitaminy D₂.

W zgłoszeniu patentowym WO 2007/138894 opisano zastosowanie hydroksylazy witaminy D3 z Pseudonocardia autotrophica do produkcji 25-hydroksywitaminy D3 i 1,25-dihydroksy-witaminy D3. W wynalazku tym pomimo opracowania systemu nadekspresji synteza enzymatyczna zależna jest od kosztownego NADPH (fosforanu dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego).

W procesach biokatalitycznych zagadnieniem ważnym z punktu widzenia przemysłowej stosowalności rozwiązania jest opracowanie takiego składu wodnej mieszaniny reakcyjnej (układu reakcyjnego, środowiska reakcyjnego), która pozwala uzyskać pełną rozpuszczalność w mieszaninie wodnej substratu sterolowego przy relatywnie wysokim jego stężeniu, jak również zachować wysoką aktywności stosowanego w procesie enzymu. Równocześnie skład mieszaniny powinien charakteryzować się możliwie niskim kosztem.

W zgłoszeniu patentowym US 2004/0152153 przedstawiono zastosowanie cyklodekstryn do tworzenia wodnej emulsji kompleksu cholesterolu. Wskazano wyższość β-cyklodekstryny nad formami α i γ przy tworzeniu emulsji 50g/l kompleksu cholesterolu w wodzie. Taka forma solubilizacji jest jednak mało korzysta dla enzymów.

Z kolei według zgłoszenia patentowego EP 0289636, do rozpuszczania różnych steroli (w tym cholesterolu) stosowano mieszaninę złożoną z glicerolu (50%) z estrami sacharozy i kwasów tłuszczowych (4%). Pozwala to na uzyskanie zsolubilizowanego sterolu o stężeniu do 2% wagowych, a co więcej wszystkie składowe mieszaniny są relatywnie tanie i dostępne. Niestety wysokie stężenie glicerolu w enzymatycznej mieszaninie reakcyjnej silnie ogranicza dyfuzję, a co za tym idzie efektywną pracę enzymu.

Natomiast w czasopiśmie Journal of Drug Targeting, 2004, 12 (7), 415-24 zaproponowano zastosowanie sprzężenie sterolu z podtlenkiem etylenu). Zapewnia to dobrą rozpuszczalność sterolu w wodzie, brak toksyczności oraz stabilności. Niestety, rodzi problem w określeniu dokładnego stężenia substratu i monitorowaniu przebiegu reakcji gdyż pegylowany sterol trudno analizować metodami standardowymi, jak HPLC (ang. High Pressure Liquid Chromatography), a poza tym po zakończeniu reakcji produkt wymaga dodatkowego etapu oczyszczenia na drodze hydrolizy.

W literaturze opisano kilka sposobów komponowania mieszaniny reakcyjnej, do badania aktywności enzymów sterolowych. Na przykład według Journal of Biological Chemistry, 2010, 285, 47, 36352-60 osiągnięto stężenie 0,5-1 mM cholest-4-en-3-onu w obecności 2% metyl^-cyklodekstryny stosując ultradźwięki. Należy jednak zaznaczyć, że w badaniach nie potwierdzono stabilności tej mieszaniny reakcyjnej w czasie. Z kolei według czasopisma Molecular Microbiology, 2009, 74 (5), 1031-1043 do rozpuszczenia 0,2 mM cholesterolu zastosowano 0,05% Triton X-100.

Przedstawione przykłady ze stanu techniki w znaczącej większości są rozwiązaniami nie mogącymi być zastosowane na skalę przemysłową. Problemami w wykorzystaniu znanych procesów do produkcji wielkoskalowej 25-hydroksy-7-dehydrocholesterolu czy innych 25-hydroksylowanych pochodnych sterolowych są: brak regioselektywności enzymów bądź słaba wydajność procesu, zaś w przypadku enzymów regioselektywnych w systemach nadekspresji, konieczne jest zastosowanie kosztownego ko-substratu, jakim jest NAD(P)H.

PL 226 816 B1

Wiadomo jest, że podniesienie wydajności procesów biokatalitycznych można osiągnąć w przypadku niektórych enzymów przez ich immobilizację. Z literatury znane są procedury immobilizacji enzymów na różnorodnych nośnikach. Przykładowo w artykule opublikowanym w Microporous and Mesoporous Materials 2013, 170, 75-82 przedstawiono metodę immobilizacji enzymu inwertazy na mezoporowatych krzemionkach typu SBA-15 z grupami aminowymi zarówno dla nośników sypkich jak i monolitycznych. W artykule z czasopisma Journal of Biotechnology 2014, 192, 400-409 opisano procedurę immobilizacji dehydrogenazy etylobenzenowej na modyfikowanym powierzchniowo nośniku granocelowym. W artykule z czasopisma Enzyme and Microbial Technology 2011, 49, 555-9 przedstawiono sposób immobilizacji hydroksylazy epoksydowej z Aspergillus Niger na nośniku Eupergit®C. Przykład immobilizacji D-hydantoinazy z Burkholderia cepacia na modyfikowanych nośnikach agarozowych z serii Sepharose można znaleźć w czasopiśmie Biotechnology and Bioprocess Engineering 2011, 16, 611-616.

Celem wynalazku jest dostarczenie takiego biokatalitycznego sposobu otrzymywania 25-hydroksy-7-dehydrocholesterolu oraz innych 25-hydroksylowanych pochodnych sterolowych bakteryjnym enzymem dehydrogenazy C25 steroidowej z Sterolibacterium denitrificans Chol-1S, który pozwoli na wytworzenie z używanych w procesie substratów regioselektywnie, jednego, czystego produktu ze stopniem konwersji bliskim 100% w obecności relatywnie jak najmniej kosztownego reutleniacza.

Celem wynalazku jest również dostarczenie takiego układu reakcyjnego do realizacji biokatalitycznego sposobu otrzymywania 25-hydroksy-7-dehydrocholesterolu oraz innych 25-hydroksylowanych pochodnych sterolowych bakteryjnym enzymem dehydrogenazy C25 steroidowej z Sterolibacterium denitrificans Chol-1S, który pozwoli na wysoki stopień solubilizacji sterolu w reakcyjnej wodnej mieszaninie, a przy tym na efektywną konwersję użytego substratu z wysoką wydajnością i na łatwe odseparowanie produktu z mieszaniny poreakcyjnej.

Dehydrogenaza C25 steroidowa (heterotrimer: AFF61325.1, AFF61326.1, AFF61327.1), jest enzymem molibdenowym katalizującym natywnie (tzn. w bakterii Sterolibacterium denitrificans w czasie mineralizacji cholesterolu) reakcję hydroksylacji cholest-4-ne-3-onu i cholest-1,4-dienu-3-onu do 25-hydroksy-cholest-4-ne-3-onu i 25-hydroksy-cholest-1,4-dienu-3-onu.

W kontekście niniejszego wynalazku „dehydrogenaza C25 steroidowa” lub „preparat enzymatyczny” o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej katalizuje reakcję hydroksylacji związków sterolowych, na przykład wskazanych wyżej substratów natywnych, do 25-hydroksylowanego produktu, odpowiadającego rodzajowi użytego substratu - co pokazano poniżej na schemacie przykładowej reakcji hydroksylacji związku sterolowego z wykorzystaniem jako reutleniacza enzymu heksacyjanożelazianu (III) potasu (K3[Fe(CN)6]) lub tetrafluoroboranu ferrocenu (III) [Fe(cp)2]BF4, który w reakcji ulegają redukcji odpowiednio do heksacyjanożelazianu (II) potasu (K4[Fe(CN)6]) lub ferrocenu(II) ([Fe(cp)₂]), gdzie S25DH^ox i S25DH^red oznaczają formę enzymu odpowiednio utlenioną i zredukowaną.

W kontekście niniejszego wynalazku „dehydrogenaza C25 steroidowa” lub „preparat enzymatyczny” o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej to enzym lub preparat, który katalizuje reakcję hydroksylacji związków sterolowych o wzorze la, wzorze Ib, wzorze lc, wzorze Id, wzorze le, do 25-hydroksylowanego produktu o wzorze lIa, wzorze llb, wzorze lIc, wzorze lId, wzorze Ile, odpowiadającego rodzajowi użytego związku, co pokazano na załączonym rysunku na schematycznych reakcjach hydroksylacji, gdzie:

- fig. 1 przedstawia schemat reakcji hydroksylacji związku o wzorze la (cholest-4-en-3-on) do związku o wzorze lIa (25-hydroksy-cholest-4-en-3-on),

- fig. 2 przedstawia schemat reakcji hydroksylacji związku o wzorze Ib (cholest-4,6-dien-3-on) do związku o wzorze llb (25-hydroksy-cholest-4,6-dien-3-on),

PL 226 816 B1

- fig. 3 przedstawia schemat reakcji hydroksylacji związku o wzorze Ic (cholest-1,4-dien-3-on) do związku o wzorze lIc (25-hydroksy-cholest-1,4-dien-3-on),

- fig. 4 przedstawia schemat reakcji hydroksylacji związku o wzorze Id (7-dehydrocholesterol) do związku o wzorze lId (25-hydroksy-7-dehydrocholesterol),

- fig. 5 przedstawia schemat reakcji hydroksylacji związku o wzorze le (bursztynian lub trimetyloglicynian cholesterolu) do związku o wzorze Ile (25-hydroksy-bursztynianu cholesterolu lub 25-hydroksy-trimetyloglicynian cholesterolu), przy czym R we wzorach le i Ile oznacza resztę bursztynianową lub trimetyloglicynianową.

W kontekście niniejszego wynalazku przez „preparat enzymatyczny” należy rozumieć zarówno czysty enzym jak i enzym nieoczyszczony, zawierający inne białka, ale wykazujący wobec substratów wyłącznie aktywność dehydrogenazy C25 steroidowej.

Termin „proces biokatalityczny” dotyczy w kontekście tego wynalazku każdego procesu prowadzonego w obecności aktywności enzymatycznej dehydrogenazy C25 steroidowej, czy to w postaci oczyszczonej, nieoczyszczonej, ekstraktu komórkowego, zawiesiny, formy rozpuszczonej w roztworze, formy immoblizowanej, czy całych komórek bakteryjnych pod warunkiem, że wykazują one wobec substratów jedynie aktywność dehydrogenazy C25 steroidowej.

W kontekście tego wynalazku termin „regioselektywny” jest rozumiany, jako związek hydroksylowany przy 25 atomie węgla związku steroidowego.

Stwierdzono nieoczekiwanie, że preparat enzymatyczny o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej (S25DH) pochodzącej z bakterii Sterolibacterium denitrificans Chol-1S, jest w stanie w obecności substancji będącej dla niego reutleniaczem (akceptorem elektronowym) prowadzić regioselektywną hydroksylację pochodnych sterolowych o wzorach la, Ib, Ic, Id, le do 25-hydroksylowanych pochodnych sterolowych o wzorach lIa, llb, lIc, Ile, w tym do 25-hydroksy-7-dehydrocholesterolu o wzorze lId, przy stężeniach substratów do 2,5 mM, przez okres do 30 dni, w wodno-organicznym beztlenowym lub odtlenionym obojętnym gazem środowisku reakcji, buforowanym do pH 6-8, zawierającym czynnik solubilizujący i rozpuszczalnik organiczny. Zgodnie z wynalazkiem, sposób otrzymywania 25-hydroksylowanych pochodnych sterolowych o wzorze IIa, wzorze llb, wzorze lIc, wzorze Ile, w tym 25-hydroksy-7-dehydrocholesterolu o wzorze lId, na drodze regioselektywnej hydroksylacji pochodnych sterolowych o wzorze la, wzorze Ib, wzorze Ic, wzorze Id, wzorze le preparatem enzymatycznym o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej (S25DH) pochodzącej z bakterii Sterolibacterium denitrificans Chol-1S, charakteryzuje się tym, że proces regioselektywnej hydroksylacji substratów o wzorze la lub wzorze Ib lub wzorze Ic lub wzorze Id lub wzorze le prowadzi się w środowisku wodno-organicznym, w obecności reutleniacza, w temperaturze 15-45°C, a zwłaszcza do 30°C, z użyciem preparatu enzymatycznego, wykazującego aktywność dehydrogenazy C25 steroidowej (S25DH) pochodzącej z bakterii Sterolibacterium denitrificans Chol-1S, homogenicznego lub immobilizowanego kowalencyjnie na nośniku stałym.

Korzystnie, proces prowadzi się w warunkach beztlenowych lub pod obojętnym gazem utrzymując biokatalityczną aktywność preparatu enzymatycznego o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej przez okres do 30 dni.

W sposobie według wynalazku, stosuje się mieszaninę reakcyjną, która zawiera bufor, korzystnie fosforanowy, zapewniający pH w zakresie 6-8, a zwłaszcza 7,5, wodny roztwór 2-hydroksypropyl-β-cylkodekstryny o stężeniu 4-20% (w/v), zwłaszcza 4-15% (w/v), a najlepiej 8% (w/v), oraz 2-metoksyetanol w ilości 1-10% (v/v), zwłaszcza 1,25% (v/v) lub glikol propylowy w ilości 1-10% (v/v), zwłaszcza 3% (v/v). Taka kompozycja solubilizuje (rozpuszcza) używane substraty w stężeniu do 0,7 g/l to jest do 2,5 mM.

Korzystnie, jako bufor stosuje się w mieszaninie reakcyjnej ortofosforany potasu lub sodu lub Tris/PO4.

Przy realizacji sposobu wynalazku, jako nośnika stałego do kowalencyjnego immobilizowania preparatu enzymatycznego używa się nośnika nierozpuszczalnego w środowisku reakcji, zwłaszcza nośnika z krystalicznej celulozy modyfikowanej grupami funkcyjnymi o zakończeniach aminowych lub modyfikowanego nośnika polimerowego typu ECH lub EAH Sepharose^TM 4B, epoksy-Sepharose^TM 6B, Eupergit®C lub najlepiej nośnika krzemionkowego typu SBA-15 w formie proszkowej lub monolitycznej sfunkcjonalizowanego grupami aminowymi.

Korzystne jest również, gdy wspomniany nośnik preparatu enzymatycznego stanowi złoże kolumnowe.

PL 226 816 B1

W sposobie według wynalazku, jako reutleniacz stosuje się związki takie jak heksacyjanożelazian (III) potasu K3[Fe(CN)6] lub tetrafluoroboran ferrocenu (III) [Fe(cp)2]BF4.

Korzystnie jest stosować K3[Fe(CN)6], gdyż jest tani i lepiej rozpuszczalny w wodzie oraz podobnie jak tetrafluoroboran ferrocenu (III) podlega odtwarzaniu przez utlenienie, zwłaszcza elektrochemiczne z zastosowaniem elektrod; roboczej i przeciwelektrody, korzystnie platynowych.

Jednak w przypadku szczególnych zastosowań, gdzie obecność śladowych ilości cyjanków jest niewskazana, korzystne jest zastąpienie K3[Fe(CN)6] przez [Fe(cp)2]BF4.

Ponieważ podczas procesu hydroksylacji substratu następuje redukcja reutleniacza, a szybkość procesu biokatalitycznego zależy od stężenia utlenionej formy reutleniacza, korzystne jest zapewnienie jego wysokiego stężenia w całym okresie reakcji. Osiąga się to poprzez prowadzenie procesu przy wysokim początkowym stężeniu łatwo rozpuszczalnego w wodzie K₃[Fe(CN)₆] wynoszącym od 1-100 mM, szczególnie 10-20 mM, a najlepiej 12-15 mM, zaś w przypadku stosowania reutleniacza w postaci [Fe(cp)2]BF4 proces prowadzi się przy jego stężeniu początkowym przynajmniej 0,1 mM, a zwłaszcza 0,2-2 mM.

W procesie hydroksylacji substratu, prowadzonym z elektrochemicznym odtwarzaniem reutleniacza, niezależnie od stężenia substratu, dla reutleniacza w postaci K3[Fe(CN)6] stosuje się stężenie przynajmniej 1 mM, a zwłaszcza 2-15 mM, korzystnie 12 mM, zaś dla reutleniacza w postaci [Fe(cp)2]BF4 stosuje się stężenie przynajmniej 0,1 mM, a zwłaszcza 0,2-2 mM, korzystnie 2 mM.

Ponadto, korzystnie jest gdy w procesie hydroksylacji substratu, prowadzonym bez odtwarzania reutleniacza, stosuje się reutleniacz w takiej ilości by stosunek jego stężenia molowego do stężenia molowego substratu wynosił przynajmniej 2:1, przy czym górną granicą stężenia reutleniacza jest jego rozpuszczalność w medium reakcyjnym.

Sposobem według wynalazku można uzyskiwać pochodne sterolowe będące cennym produktem dla przemysłu chemicznego, a zwłaszcza farmaceutycznego i kosmetycznego.

Wynalazek w przykładach realizacji objaśniono szczegółowo poniżej.

Przykładowe przygotowanie preparatu enzymatycznego

Przykładowa procedura przygotowania preparatu enzymatycznego poprzedzona jest dwoma etapami prowadzącymi do pozyskania natywnego preparatu enzymatycznego z aktywnością S25DH: hodowla bakteryjna oraz izolacja z masy bakteryjnej preparatu enzymatycznego o aktywności S25DH.

Hodowlę bakterii Sterolibaterium denitrificans Chol-1S prowadzi się w środowisku beztlenowym przykładowo według procedury opisanej w artykule Journal of Biological Chemistry, 2007, 282, 13240-13249. Zakończenie hodowli następuje w końcowym etapie logarytmicznej fazy wzrostu bakterii i odbywa się poprzez zwirowanie masy bakteryjnej i zamrożenie w celu długotrwałego przechowywania.

Preparat enzymatyczny o aktywności S25DH oczyszcza się (izoluje) z bakterii wzrastających na pożywce z azotanem jako akceptorem elektronów oraz cholesterolem jako donorem elektronów według procedury opisanej w Journal of Biological Chemistry, 2012, 287, 36905-36916.

Przykładowa immobilizacja enzymu

Przy realizacji niniejszego wynalazku, jako nośnika stałego do kowalencyjnego immobilizowania preparatu enzymatycznego, używa się nierozpuszczalnego w środowisku reakcji, nośnika z krystalicznej celulozy modyfikowanej grupami funkcyjnymi albo modyfikowanego nośnika polimerowego typu ECH lub EAH Sepharose^TM 4B, epoksy-Sepharose^TM 6B, Eupergit®C albo nośnika krzemionkowego typu SBA-15 w formie proszkowej lub monolitycznej sfunkcjonalizowanego grupami aminowymi.

Przedstawiona poniżej procedura immobilizacji preparatu na sypkim krzemionkowym nośniku może być łatwo rozszerzona do wyższej skali.

Proces immobilizacji rozpoczyna się etapem aktywacji grup aminowych nośnika aldehydem glutarowym: 1 ml nośnika przepłukuje się 0,1 M buforem fosforanowym o pH 7,0 i pozostawia w około 10 ml tego buforu na czas ok. 10-20 minut (cały czas lekko miesza/wstrząsa się zawiesiną w celu zapobiegnięcia sedymentacji nośnika). Następnie nośnik odwirowuje się i po odwirowaniu zawiesza w 2,5% roztworze aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,0 i pozostawia na czas aktywacji na wytrząsarce. Czas aktywacji nośnika wynosi od 0,5 do 2 godzin. Aktywację prowadzi się w temperaturze od 15 do 30°C, w szczelnie zamkniętym naczyniu w trybie delikatnego wytrząsania. Po zakończeniu aktywacji w celu wypłukania niezwiązanego z nośnikiem aldehydu glutarowego nośnik kilkukrotnie (4-7 razy) przepłukuje się wodą destylowaną. Po odmyciu aldehydu zaktywowany nośnik dwukrotnie przepłukuje się 0,1 M buforem fosforanowym o pH 7,0.

PL 226 816 B1

Do tak przygotowanego i osuszonego nośnika dodaje się preparat enzymatyczny, czysty enzym natywny lub enzym rekombinowany w formie roztworu w ilości 0,8 ml enzymu (o stężeniu białka 0,3 mg/ml) na 1 ml nośnika przy czym preparat enzymatyczny wzbogaca się reutleniaczem K3[Fe(CN)6] w ilości dającej stężenie 4,5 mM.

Proces immobilizacji prowadzono w warunkach tlenowych przy łagodnym, cyklicznym mieszaniu roztworu preparatu enzymatycznego i nośnika. Cały proces immobilizacji trwał 16 godzin. Początkowy etap procesu wiązania enzymu do złoża (ok. 30 min) prowadzi się w temperaturze pokojowej, po czym mieszaninę nośnika z preparatem enzymatycznym umieszcza się w warunkach chłodniczych, w temperaturze od 4 do 12°C co zapobiegało temperaturowej dezaktywacji enzymu.

Po procesie immobilizacji oddzielono nośnik (np. przez odwirowanie) od pozostałości niezwiązanego białka. W tym celu przepłukiwano go 2 do 5 razy 0,1 M buforem fosforanowym o pH 7,0 a następnie dwukrotnie 0,5 M buforem Tris/HCI o pH 7,8. Powyższą serię przepłukań zakończono dwukrotnym przemyciem zimmobilizowanego preparatu enzymatycznego buforem roboczym tj. 0,1 M buforem fosforanowym pH 7,5. Mając na celu zapobieżenie utracie aktywności zimmobilizowanego preparatu enzymatycznego serię płukań nośnika po procesie immobilizacji przeprowadza się w warunkach chłodniczych w temperaturze od 4 do 12°C przy użyciu buforów schłodzonych do temperatury 4-12°C i wzbogaconych w K₃[Fe(CN₆)] na poziomie 1 mM do 2 mM. Zimmobilizowany preparat enzymatyczny przechowuje się w 0,1 M buforze fosforanowym pH 7,5 zawierającym 2 mM K3[Fe(CN6)] w temperaturze 4-12°C, aż do użycia w reakcji. W celu określenia odzysku aktywności w procesie immobilizacji w znany, np. z literatury sposób (np. Chemical Society Reviews 2013, 42, 6223) porównuje się aktywność oznaczoną, tj. aktywnością enzymu pozostałą na nośniku po procesie immobilizacji („A oznaczona”) z aktywnością preparatu enzymatycznego przed immobilizacją („A dodana”).

Przykładowy układ reakcyjny

Proces biokatalityczny według wynalazku może być realizowany w znanym reaktorze okresowym, pokazanym na rysunku na fig. 6, z odtwarzaniem reutleniacza za pomocą układu elektrochemicznego albo bez odtwarzania reutleniacza. Proces przykładowo realizuje się w opisanych poniżej warunkach.

W przykładowym układzie reakcyjnym zawierającym reaktor okresowy, realizację procesu według wynalazku, tj. hydroksylację substratu, prowadzi się w mieszanie reakcyjnej, która zawiera bufor zapewniający pH w zakresie 6-8, wodny roztwór 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny o stężeniu najlepiej 8% (w/v), oraz 2-metoksyetanol w korzystnej ilości 1,25% (v/v) lub glikol propylowy w korzystnej ilości 3% (v/v).

W układzie reakcyjnym jako reutleniacz stosuje się heksacyjanożelazian (III) potasu K3[Fe(CN)6] lub tetrafluoroboran ferrocenu (III) [Fe(cp)2]BF4.

Korzystnie jest stosować K3[Fe(CN)6], gdyż jest tani i lepiej rozpuszczalny oraz podobnie jak tetrafluoroboran ferrocenu (III) może podlegać odtwarzaniu przez utlenienie, zwłaszcza elektrochemicznemu, z zastosowaniem platynowej elektrody roboczej i przeciwelektrody.

Jednak w przypadku szczególnych zastosowań, gdzie obecność śladowych ilości cyjanków jest niewskazana, korzystne jest zastąpienie K3[Fe(CN)6] przez [Fe(cp)2]BF4.

Ponieważ podczas procesu hydroksylacji substratu następuje redukcja reutleniacza, a szybkość procesu zależy od stężenia formy utlenionej, korzystnie jest zapewnienie jego wysokiego stężenia w całym okresie reakcji. Osiąga się to poprzez wysokie początkowe stężenie szczególnie łatwo rozpuszczalnego w wodzie K3[Fe(CN)6] od 1-100 mM, przykładowo ustalając je na poziomie 12-15 mM. Natomiast dla reutleniacza w postaci [Fe(cp)2]BF4 stosuje się stężenie przynajmniej 0,1 mM, a korzystnie 2 mM.

Drugim sposobem zapewnienia wysokiego stężenia reutleniacza jest stopniowe dodawanie sypkiego reutleniacza w przypadku, gdy jego stężenie w reaktorze spadnie co można łatwo sprawdzić poprzez analizę kolorymetryczną (zanik koloru żółtego) lub spektrofotometryczną (zmniejszenie absorbancji przy λ = 420 nm, Δε = 1040 M^- cm^-).

Trzecim rozwiązaniem jest zastosowanie utleniania zredukowanej formy in situ za pomocą układu elektrochemicznego.

Przykładowa izolacja reagentów z mieszaniny reakcyjnej

Po zakończeniu przykładowej reakcji produkt hydroksylacji znajduje się w wodno-organicznej mieszaninie reakcyjnej zawierającej następujące zanieczyszczenia:

- enzym,

- nieprzereagowany substrat,

PL 226 816 B1

- utleniony i zredukowany akceptor elektronowy (reutleniacz),

- 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstrynę (solubilizator),

- organiczny rozpuszczalnik (dioksan, glikol propylenowy lub 2-metoksyetanol),

- bufor (np. fosforanowy lub Tris/HCI).

Produkt wydziela się w znany sposób, zgodnie z regułami sztuki chemicznej. Jeżeli reakcja była prowadzona z enzymem immoblilizowanym na złożu sypkim, w pierwszym kroku odseparowuje się go od mieszaniny przez filtracje lub wirowanie. W kolejnym etapie izolacji oddziela się akceptor elektronowy (reutleniacz). W przypadku zastosowania K3[Fe(CN)6], niezależnie od stopnia utlenienia heksacyjanożelaziany (II) i (III) tworzą z jonami Fe²⁺ nierozpuszczalne w wodzie osady (tzw. błękit Turnbulla i błękit Pruski). Reakcję tą wykorzystuje się do usunięcia formy utlenionej akceptora. Dodanie nadmiaru jonów Fe²⁺ (np. w formie nasyconego roztworu FeSO4) i usunięcie osadu poprzez szybkie odwirowanie daje transparenty roztwór. Wydzielenie reagentów organicznych z roztworu wodnego najkorzystniej przeprowadza się stosując ekstrakcję. Ekstrakcję przeprowadza się do fazy stałej (SPE, solid phase extraction) lub metodą ciecz-ciecz (przykładowo z octanem etylu, chloroformem; jednokrotna ekstrakcja w stosunku 1:1 faza wodna: faza organiczna).

Przeprowadzone eksperymenty wskazują, że stosowana w reakcji cyklodekstryna nie utrudnia przeniesienia produktu/substratu do fazy organicznej, ale częściowo także rozpuszcza się w fazie organicznej, co stanowi zanieczyszczenie produktu po odparowaniu rozpuszczalnika stosowanego w ekstrakcji.

Metoda ekstrakcji SPE ma tą przewagę nad ekstrakcją ciecz-ciecz, że pozwala oddzielić od reagentów organicznych 2-hydroksypropyl-p-cyklodekstrynę. Pozostałe składniki mieszaniny reakcyjnej: jonowy akceptor elektronowy, enzym, jony fosforanowe, potasowe lub Tris, rozpuszczalnik organiczny oraz woda również zostają odizolowane, nie ulegając rozpuszczeniu w fazie hydrofobowej złoża SPE. Ze złoża odzyskuje się zatem czysty substrat/produkt.

W tym celu na złoże SPE (przykładowo złoża polimerowego) (po etapie kondycjonowania przeprowadzonego zgodnie z regułami sztuki) nanosi się mieszaninę reakcyjną a następnie przepłukuje ją 40% (w/v) wodnym roztworem izopropanolu w ilości co najmniej 1 objętości mieszaniny reakcyjnej, a korzystnie 5 objętościami nałożonej mieszaniny reakcyjnej. Aby dokonać ekstrakcji związków sterolowych z fazy stałej, po wysuszeniu złoża powietrzem przeprowadza się elucję rozpuszczalnikiem organicznym (chloroformem) w ilości 1-4 objętości stosowanego złoża. Ślady wody z eluatu osusza się bezwodnym MgSO4. Końcowym etapem jest odparowanie rozpuszczalnika organicznego od hydroksylowanego produktu.

W przypadku niekompletnej konwersji substratu, po odparowaniu rozpuszczalnika od substratu/produktu przeprowadza się preparatywną chromatografię kolumnową na krzemionkowym adsorbencie, używając mieszaniny n-heksan : eter dietylowy : kwas octowy w stosunku 78-88:30-20:2, jako ciekłej fazy ruchomej. W trakcie elucji kolejne frakcje kontroluje się TLC (cienkowarstwową chromatografią cieczową, używając tego samego solwentu do rozwinięcia płytek i stosując, jako sposób detekcji np. naniesienia pary jodu lub ogrzewanie płytki (120°C) spryskanej roztworem 50% (v/v) H2SO4 w metanolu. Odparowanie rozpuszczalnika organicznego z odpowiednich frakcji wycieku z kolumny pozwala na uzyskanie czystych składników mieszaniny.

Przykładowy reaktor mieszalnikowy

Proces biokatalityczny według wynalazku może być realizowany w znanym reaktorze okresowym, pokazanym na rysunku na Fig. 6, która przedstawia schemat jego budowy. Poszczególne elementy reaktora oznaczono na rysunku następująco:

- platynowa przeciwelektroda (elektroda pomocnicza),

- platynowa elektroda robocza,

- elektroda odniesienia,

- teflonowa pokrywka reaktora z uszczelnieniem,

- wpust z zaworem do wprowadzania substratu i pobierania próbek,

- pręcik mieszadła magnetycznego,

- mieszadło z termostatowaną płytą,

- spiek szklany,

- potencjostat generujący napięcie pomiędzy elektrodą 1 i 2, mierzone względem elektrody 3.

Reaktor ten pozwala w jednym trybie pracy prowadzić proces z odtwarzaniem reutleniacza za pomocą układu elektrochemicznego, a w drugim trybie pracy - bez odtwarzania reutleniacza.

PL 226 816 B1

Reaktor ma postać szklanego naczynia o kształcie walca z płaskim dnem, zamkniętego od góry pokrywką 4 z uszczelnieniami. W naczyniu umieszczona jest platynowa elektroda robocza 2 w formie zwoju luźno zwiniętego drutu platynowego.

Korzystne jest, aby elektroda robocza 2 miała możliwie dużą powierzchnię i była umieszczona w naczyniu w taki sposób, aby była omywana przez mieszaninę reakcyjną. W naczyniu umieszczona jest ponadto elektroda odniesienia 3. Jako elektrody odniesienia 3 używa się nasyconej elektrody chlorosrebrowej lub nasyconej elektrody kalomelowej. Elektroda 3 jest oddzielona od właściwej mieszaniny reakcyjnej znanym kluczem elektrolitycznym, wypełnionym nasyconym roztworem chlorku potasu (nie pokazanym na rysunku). Immobilizowany kowalencyjnie preparat enzymatyczny znajduje się w naczyniu reakcyjnym na luźnym złożu katalitycznym w postaci zawiesiny.

Naczynie reaktora ma port 5 do wprowadzania składników mieszaniny reakcyjnej, pobierania próbek oraz opróżniania reaktora po zakończeniu reakcji. W naczyniu reakcyjnym znajduje się mieszadełko 6, umożliwiające mieszanie mieszaniny reakcyjnej w trakcie reakcji. Mieszanie korzystnie zrealizuje się za pomocą mieszadełka 6 magnetycznego, umieszczonego na mieszadle magnetycznym 7, napędzającym mieszadełko 6.

W odrębnym naczyniu, połączonym z zasadniczym naczyniem reakcyjnym rurką szklaną umieszczona jest elektroda wspomagająca (przeciwelektroda) 1. Elektroda wspomagająca 1 zbudowana jest z kawałka drutu platynowego. Połączenie naczynia, w którym znajduje się elektroda wspomagająca 1 z naczyniem reakcyjnym jest wykonane w taki sposób, aby roztwory z obu naczyń nie ulegały wymieszaniu, co uzyskano przez umieszczenie w rurce łączącej oba naczynia niezbyt gęstego spieku szklanego lub zwitka waty szklanej 8. Naczynie reakcyjne jest zbudowane w taki sposób, aby zapewnić przedmuchanie mieszaniny reakcyjnej gazem obojętnym.

Proces według wynalazku może być realizowany także w znanym reaktorze przepływowym, pracującym w reżimie przepływowym jednoprzejściowym albo z recyrkulacją. Jednak korzystnie jest realizować go w układzie reaktorowym przepływowym (jednoprzejściowym lub recyrkulacyjnym), zawierającym reaktor przepływowy z biokatalizatorem immobilizowanym np. na złożu kolumnowym oraz z odtwarzaniem reutleniacza w przepływowej celce elektrochemicznej albo bez odtwarzania reutleniacza.

Przykłady otrzymywania sposobem według wynalazku 25-hydroksylowanych pochodnych sterolowych, w tym 25-hydroksy-7-dehydrocholesterolu:

P r z y k ł a d 1 (referencyjny)

Synteza 25-hydroksy-cholest-4-en-3-onu na drodze biokatalitycznego utleniania cholest-4-en-3-onu z zastosowaniem homogenicznego preparatu enzymatycznego S25DH z bakterii Sterolibacterium denitrificans w układzie woda/cyklodekstryna/dioksan, której schemat pokazano na fig. 1.

Reakcję prowadzono w warunkach anaerobowych w mieszalnikowym reaktorze okresowym (zamykanej probówce) o objętości 1,5 ml z zastosowaniem K3[Fe(CN)6] jako akceptora elektronowego (reutleniacza).

Do reaktora mieszalnikowego umieszczonego w atmosferze beztlenowej wprowadzono 0,04 ml 1 M buforu fosforanowego o pH 7,5, 0,2 ml 40% propylowanej-3-cyklodekstryny rozpuszczonej w wodzie tak, aby uzyskać końcowe stężenie 20%, 0,005 ml 1 M K3[Fe(CN)6], 0,135 ml wody oraz 0,005 ml roztworu substratu (20 g/l w dioksanie) tak, aby początkowe stężenie substratu wynosiło 0,25 g/l. Reakcję zainicjowano dodając 0,015 ml preparatu enzymatycznego o aktywności 0,035 mU/ml i 0,015 mU/mg. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 0,4 ml. Reakcję prowadzono w temperaturze 30°C na wytrząsaniu 800 rpm. Monitorowanie przebiegu reakcji realizowane było przez 4 godziny na podstawie analizy HPLC produktu w pobieranych próbkach. Reakcja była prowadzona przez 24 h, po których to zaobserwowano 100% konwersję substratu do produktu, co pozwoliło uzyskać 0,1 mg produktu. Stężeniowy profil przebiegu reakcji opisanej w przykładzie pokazano na wykresie (Fig. 7).

P r z y k ł a d 2

Synteza 25-hydroksy-cholest-4-en-3-onu na drodze biokatalitycznego utleniania cholest-4-en-3-onu w warunkach tlenowych z zastosowaniem homogenicznego preparatu enzymatycznego S25DH z bakterii Sterolibacterium denitrificans w układzie woda/cyklodekstryna/2-metoksyetanol, której schemat pokazano na Fig. 1.

Reakcja prowadzona była w warunkach aerobowych w mieszalnikowym reaktorze okresowym (zamykanej probówce) o objętości 1,5 ml z zastosowaniem K3[Fe(CN)6] jako akceptora elektronowego (reutleniacza).

PL 226 816 B1

Do reaktora mieszalnikowego umieszczonego w atmosferze tlenowej wprowadzono 0,04 ml 1 M buforu fosforanowego o pH 7,5, 0,08 ml 40% propylowanej-3-cyklodekstryny rozpuszczonej w wodzie tak, aby uzyskać końcowe stężenie 8%, 0,005 ml 1 M K3[Fe(CN)6], 0,255 ml wody oraz 0,005 ml roztworu substratu (20 g/l w 2-metolsyetanolu) tak, aby początkowe stężenie substratu wynosiło 0,25 g/l. Reakcję zainicjowano dodając 0,015 ml preparatu enzymatycznego o aktywności 0,035 mU/ml i 0,015 mU/mg. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 0,4 ml. Reakcję prowadzono w temperaturze 30°C na wytrząsaniu 800 rpm. Monitorowanie przebiegu reakcji realizowane było przez 4 godziny na podstawie analizy HPLC produktu w pobieranych próbkach. Reakcja była prowadzona przez 24 h, po których to zaobserwowano 100% konwersję substratu do produktu, co pozwoliło uzyskać 0,124 mg produktu. Stężeniowy profil przebiegu reakcji opisanej w przykładzie pokazano na wykresie (Fig. 8).

P r z y k ł a d 3

Synteza 25-hydroksy-7-dehydrocholesterolu na drodze biokatalitycznego utleniania 7-dehydrocholesterolu w warunkach tlenowych z zastosowaniem homogenicznego preparatu enzymatycznego S25DH z bakterii Sterolibacterium denitrificans w układzie woda/cyklodekstryna/2-metoksyetanol, której schemat pokazano na Fig. 4.

Reakcja prowadzona była w warunkach aerobowych w mieszalnikowym reaktorze okresowym (pokazanym na Fig. 6) o objętości 15 ml, z wyłączonym elektrochemicznym układem do odtwarzania akceptora, z zastosowaniem K3[Fe(CN)6], jako akceptora elektronowego (reutleniacza).

Do reaktora mieszalnikowego umieszczonego w atmosferze tlenowej wprowadzono 0,8 ml 1 M buforu fosforanowego o pH 7,5, 1,6 ml 40% propylowanej-3-cyklodekstryny rozpuszczonej w wodzie tak, aby uzyskać końcowe stężenie 8%, 0,1 ml 1 M K3[Fe(CN)6], 4,6 ml wody oraz 0,1 ml roztworu

7-dehydrocholesterolu (25 g/l w 2-metoksyetanolu) tak, aby początkowe stężenie substratu wynosiło ok 0,3 g/l. Reakcję zainicjowano dodając 0,8 ml preparatu enzymatycznego o aktywności 2,4 mU/ml i 0,5 mU/mg zawieszonego w 100 mM buforze fosforanowym (pH 7,5) zawierającym 4 mM K3[Fe(CN)6]. Reakcję prowadzono w temperaturze 22-30°C. Przebieg reakcji był monitorowany na podstawie analizy HPLC przez 300 godzin. W tych warunkach enzym zachował aktywność katalityczną przynajmniej przez 48 h. Reakcja doprowadziła do uzyskania 0,52 mg produktu. Stężeniowy profil przebiegu reakcji opisanej w przykładzie pokazano na wykresie (Fig. 9).

P r z y k ł a d 4

Synteza 25-hydroksy-7-dehydrocholesterolu na drodze biokatalitycznego utleniania 7-dehydrocholesterolu w warunkach beztlenowych z zastosowaniem homogenicznego preparatu enzymatycznego S25DH z bakterii Sterolibacterium denitrificans w układzie woda/cyklodekstryna/2-metoksyetanol, której schemat pokazano na Fig. 4.

Reakcja prowadzona była w warunkach anaerobowych w mieszalnikowym reaktorze okresowym jak w przykładzie 3, z zastosowaniem K3[Fe(CN)6], jako akceptora elektronowego (reutleniacza).

Do reaktora mieszalnikowego umieszczonego w warunkach anaerobowych wprowadzono 0,8 ml 1 M buforu fosforanowego o pH 7,5, 1,6 ml 40% propylowanej-3-cyklodekstryny rozpuszczonej w wodzie tak, aby uzyskać końcowe stężenie 8%, 0,1 ml 1 M K3[Fe(CN)6], 4.6 ml wody oraz 0,1 ml roztworu 7-dehydrocholesterolu (25 g/l w 2-metoksyetanolu) tak, aby początkowe stężenie substratu wynosiło ok 0,3 g/l. Reakcję zainicjowano dodając 0,8 ml preparatu enzymatycznego o aktywności 2,4 mU/ml i 0,5 mU/mg zawieszonego w 100 mM buforze fosforanowym (pH 7,5) zawierającym 4 mM K3[Fe(CN)6], Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 8 ml. Reakcję prowadzono w temperaturze 22-30°C. Przebieg reakcji był monitorowany na podstawie analizy HPLC przez 300 godzin.

W tych warunkach enzym zachował aktywność katalityczną przynajmniej przez 190 h. Reakcja doprowadziła do uzyskania 1,3 mg produktu. Stężeniowy profil przebiegu reakcji opisanej w przykładzie pokazano na wykresie (Fig. 10).

P r z y k ł a d 5

Synteza 25-hydroksy-cholest-4,6-dien-3-onu na drodze biokatalitycznego utleniania cholest-4,6-dien-3-onu w warunkach beztlenowych z zastosowaniem homogenicznego preparatu enzymatycznego S25DH z bakterii Sterolibacterium denitrificans w układzie woda/cyklodekstryna/2-metoksyetanol, której schemat pokazano na Fig. 2.

Reakcja prowadzona była w warunkach anaerobowych w mieszalnikowym reaktorze okresowym (zamykanej probówce) o objętości 1,5 ml z zastosowaniem K3[Fe(CN)6], jako akceptora elektronowego (reutleniacza).

PL 226 816 B1

Do reaktora mieszalnikowego umieszczonego w atmosferze beztlenowej wprowadzono 0,04 ml 1 M buforu fosforanowego o pH 7,5, 0,08 ml 20% propylowanej-3-cyklodekstryny rozpuszczonej w wodzie tak, aby uzyskać końcowe stężenie 4%, 0,005 ml 1 M K3[Fe(CN)6], 0,250 ml wody oraz 0,005 ml roztworu substratu (20 g/l w 2-metolsyetanolu) tak, aby początkowe stężenie substratu wynosiło 0,25 g/l. Reakcję zainicjowano dodając 0,02 ml preparatu enzymatycznego o aktywności 0,126 mU/ml i 0,056 mU/mg. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 0,4 ml. Reakcję prowadzono w temperaturze 30°C na wytrząsaniu 800 rpm. Monitorowanie przebiegu reakcji realizowane było przez 4 godziny na podstawie analizy HPLC produktu w pobieranych próbkach. Reakcja była prowadzona przez 24 h, po których to zaobserwowano 100% konwersję substratu do produktu uzyskując 78 μg produktu. Stężeniowy profil przebiegu reakcji opisanej w przykładzie pokazano na wykresie (Fig. 11).

P r z y k ł a d 6

Synteza 25-hydroksy-cholest-1,4-dien-3-onu na drodze biokatalitycznego utleniania cholest-1,4-dien-3-onu w warunkach beztlenowych z zastosowaniem homogenicznego preparatu enzymatycznego S25DH z bakterii Sterolibacterium denitrificans w układzie woda/cyklodekstryna/2-metoksyetanol, której schemat pokazano na Fig. 3.

Reakcja prowadzona była w warunkach anaerobowych w mieszalnikowym reaktorze okresowym (zamykanej probówce) o objętości 1,5 ml z zastosowaniem K3[Fe(CN)6], jako akceptora elektronowego (reutleniacza).

Do reaktora mieszalnikowego umieszczonego w atmosferze beztlenowej wprowadzono 0,04 ml 1 M buforu fosforanowego o pH 7,5, 0,14 ml 40% propylowanej-3-cyklodekstryny rozpuszczonej w wodzie tak, aby uzyskać końcowe stężenie 14%, 0,005 ml 1 M K3[Fe(CN)6], 0,19 ml wody oraz 0,005 ml roztworu substratu (20 g/l w 2-metolsyetanolu) tak, aby początkowe stężenie substratu wynosiło 0,25 g/l. Reakcję zainicjowano dodając 0,02 ml preparatu enzymatycznego o aktywności 0,126 mU/ml i 0,056 mU/mg. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 0,4 ml. Reakcję prowadzono w temperaturze 30°C na wytrząsaniu 800 rpm. Monitorowanie przebiegu reakcji realizowane było przez 4 godziny na podstawie analizy HPLC produktu w pobieranych próbkach. Reakcja była prowadzona przez 24 h, po których to zaobserwowano 100% konwersję substratu do produktu uzyskując 91 μg produktu. Stężeniowy profil przebiegu reakcji opisanej w przykładzie pokazano na wykresie (Fig. 12).

P r z y k ł a d 7

Synteza 25-hydroksy-7-dehydrocholesterolu na drodze biokatalitycznego utleniania 7-dehydrocholesterolu w warunkach beztlenowych z zastosowaniem immobilizaowanego preparatu enzymatycznego S25DH z bakterii Sterolibacterium denitrificans w układzie woda/cyklodekstryna/2-metoksyetanol, której schemat pokazano na Fig. 4.

Reakcja prowadzona była w warunkach anaerobowych w mieszalnikowym reaktorze okresowym jak w przykładzie 3, z zastosowaniem K3[Fe(CN)6], jako akceptora elektronowego (reutleniacza).

Do reaktora mieszalnikowego umieszczonego w atmosferze beztlenowej wprowadzono 0,8 ml 1 M buforu fosforanowego o pH 7,5, 1,6 ml 40% propylowanej-3-cyklodekstryny rozpuszczonej w wodzie tak, aby uzyskać końcowe stężenie 8%, 0,1 ml 1 M K3[Fe(CN)6], 4,4 ml wody oraz 0,1 ml roztworu 7-dehydrocholesterolu (25 g/l w 2-metoksyetanolu) tak, aby początkowe stężenie substratu wynosiło ok 0,35 g/l. Reakcję zainicjowano dodając mieszaninę do 1 ml odsączonego immoblilizowanego preparatu enzymatycznego o aktywności 0,5 mU/ml i 0,1 mU/mg. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 8 ml. Reakcję prowadzono w temperaturze 22-30°C. Przebieg reakcji był monitorowany na podstawie analizy HPLC przez 450 godzin. W tych warunkach enzym zachował aktywność katalityczną przynajmniej przez 400 h. Reakcja doprowadziła do uzyskania 0,69 mg produktu. Stężen iowy profil przebiegu reakcji opisanej w przykładzie pokazano na wykresie (Fig. 13).

P r z y k ł a d 8

Synteza 25-hydroksy-cholest-4-en-3-onu na drodze biokatalitycznego utleniania cholest-4-en-3-onu w warunkach anaerobizowanych z zastosowaniem homogenicznego preparatu enzymatycznego S25DH z bakterii Sterolibacterium denitrificans w układzie woda/cyklodekstryna/dioksan w reaktorze okresowym z zasilaniem substratem z zastosowaniem odtwarzania elektrochemicznego, której schemat pokazano na Fig. 1.

Reakcja była prowadzona pod płaszczem z argonu w mieszalnikowym reaktorze okresowym (pokazanym na Fig. 6) o objętości 15 ml, z włączonym elektrochemicznym układem do odtwarzania akceptora z zastosowaniem K3[Fe(CN)6], jako akceptora elektronowego (reutleniacza).

PL 226 816 B1

Do reaktora mieszalnikowego umieszczonego w atmosferze argonu wprowadzono 8 ml 100 mM buforu Tris/HCI o pH 7,5 zawierającego 20% propylowanej-3-cyklodekstryny i 12,5 mM K₃[Fe(CN)₆]. Następnie do reaktora dodano 100 pl dioksanu zawierającego stężony substrat, cholest-4-en-3-on, uzyskując końcowe stężenie 0,65 mM. Reakcję zainicjowano dodając do reaktora 0,5 mg czystego enzymu homogenicznego o aktywności 15 mU/mg. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 8 ml. Reakcję prowadzono w temperaturze 30°C, a układ mieszano za pomocą mieszalnika magnetycznego. Przebieg reakcji był monitorowany na podstawie analizy HPLC oraz prądu reutleniania przez 6 godzin. W trakcie reakcji 4 krotnie uzupełniano przekonwertowany substrat dotrzymując 0,5 ml porcje roztworu substratu w dioksanie do reaktora. Po 6 godzinach wyłączono odtwarzanie elektrochemiczne i pozostawiono reaktor w 30°C przez kolejne 18 godzin. Po 24 h reakcji uzyskano 100% konwersję substratu co doprowadziło do uzyskania 2,19 mg produktu. Profil przebiegu reakcji opisanej w przykładzie pokazano na wykresie (Fig. 14).

P r z y k ł a d 9

Synteza 25-hydroksy-cholest-1,4-dien-3-onu na drodze biokatalitycznego utleniania cholest-1,4-dien-3-onu w układzie przepływowym w warunkach beztlenowych z zastosowaniem immobilizowanego preparatu enzymatycznego S25DH z bakterii Sterolibacterium denitrificans w układzie woda/cyklodekstryna/2-metoksyetanol, której schemat pokazano na fig. 3.

Reakcja prowadzona była w warunkach anaerobowych w monolitycznym reaktorze przepływowym o objętości 1,5 ml z zastosowaniem K3[Fe(CN)6], jako akceptora elektronowego (reutleniacza).

Złoże reaktora (monolityczne krzemionkowe z grupami aminowymi) było przepłukiwane mieszanką reakcyjną podawaną z podajnika tłokowego z prędkością 0,1 ml/min. Mieszanina reakcyjna składała się z 100 mM buforu K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5, w którym rozpuszczono 12,5 mM K3[Fe(CN)6], 8% propylowanej-3-cyklodekstryny, do którego dodano roztwór cholest-1,4-dien-3-onu w 2-metoksyetanolu osiągając odpowiednio stężenie 0,65 mM dla substratu i 1,25% dla 2-metoksyetanolu.

Proces reakcyjny, prowadzony w temperaturze pokojowej, rozpoczęto od przepłukania układu reaktorowego 5 ml mieszaniny reakcyjnej w celu wypłukania buforu, w którym był przechowywany katalizator oraz ustalenia warunków stacjonarnych procesu. Następnie osobno przepuszczono 10 ml mieszaniny przez układ z prędkością przepływu 0,1 ml/min uzyskując ok 7,5% konwersję w pierwszym przebiegu, 6,7% w drugim, i trzecim, 4% w czwartym, 4,7% w piątym i 4,95% w szóstym. Ostatnią porcję z reaktora wypłukano mieszaniną buforu z 7 mM K3[Fe(CN)6]. Strumień wylotowy w czasie 6 cyklu charakteryzował się średnią konwersją na poziomie 33,5% tj. stężeniem produktu na poziomie 0,076 g/l. Po odjęciu strat związanych z próbkowaniem reaktora w czasie eksperymentu uzyskano 0,43 mg produktu.

Testy przeprowadzone w ciągu kolejnych 48 h dla immobilizowanego złoża przechowywanego w warunkach chłodniczych bez dostępu tlenu nie wykazały znaczącego spadku aktywności katalizatora, który charakteryzował się podobną średnią konwersją przy pierwszym przebiegu mieszaniny reakcyjnej. Po 7 dniach użytkowania katalizatora i przechowywania go pomiędzy procesami w warunkach beztlenowych zachowuje on przynajmniej 50% aktywności początkowej. Profil przebiegu reakcji opisanej w przykładzie pokazano na wykresie (Fig. 15).

P r z y k ł a d 10

Synteza 25-hydroksy-cholest-4-en-3-onu na drodze biokatalitycznego utleniania cholest-4-en-3-onu w warunkach beztlenowych z zastosowaniem homogenicznego preparatu enzymatycznego S25DH z bakterii Sterolibacterium denitrificans w układzie woda/cyklodekstryna/glikol propylowy, której schemat pokazano na Fig. 1.

Reakcja prowadzona była w warunkach anaerobowych w mieszalnikowym reaktorze okresowym (zamykanej probówce) o objętości 1,5 ml z zastosowaniem K3[Fe(CN)6], jako akceptora elektronowego (reutleniacza).

Do reaktora mieszalnikowego umieszczonego w atmosferze beztlenowej wprowadzono 0,04 ml 1 M buforu fosforanowego o pH 7,5, 0,08 ml 40% propylowanej-3-cyklodekstryny rozpuszczonej w wodzie tak, aby uzyskać końcowe stężenie 8%, 0,005 ml 1 M K3[Fe(CN)6], 0,22 ml wody oraz 0,015 ml roztworu substratu (10 g/l w glikolu propylenowym) tak, aby początkowe stężenie substratu wynosiło 0,47 g/l. Reakcję zainicjowano dodając 0,04 ml preparatu enzymatycznego o aktywności 0,023 mU/ml (0,00435 mU/mg). Reakcję prowadzono w temperaturze 30°C na wytrząsaniu 800 rpm. Reakcja była prowadzona przez 48 h, po których zaobserwowano 16% konwersję substratu do produktu, co pozwoliło na uzyskanie 0,031 mg 25-hydroksy-cholest-4-en-3-onu. Stężeniowy profil przebiegu reakcji opisanej w przykładzie pokazano na wykresie (Fig. 16).

PL 226 816 B1

P r z y k ł a d 11

Synteza 25-hydroksy-bursztynianu cholesterolu na drodze biokatalitycznego utleniania bursztynianu cholesterolu w warunkach beztlenowych z zastosowaniem homogenicznego preparatu enzymatycznego S25DH z bakterii Sterolibacterium denitrificans w układzie woda/cyklodekstryna/2-metoksyetanol, której schemat pokazano na Fig. 5.

Reakcja prowadzona była w warunkach anaerobowych w mieszalnikowym reaktorze okresowym (zamykanej probówce) o objętości 1,5 ml z zastosowaniem K3[Fe(CN)6], jako akceptora elektronowego (reutleniacza).

Do reaktora mieszalnikowego umieszczonego w atmosferze beztlenowej wprowadzono 0,04 ml 1 M buforu fosforanowego o pH 7,5, 0,08 ml 40% propylowanej-p-cyklodekstryny rozpuszczonej w wodzie tak, aby uzyskać końcowe stężenie 8%, zawierającej 2,5 mg/ml Tris-bursztynianu cholesterolu), tak by początkowe stężenie substratu wynosiło 0,5 g/l, 0,005 ml 1 M K3[Fe(CN)6], 0,159 ml wody oraz 0,036 ml 2-metoksyetanolu (stężenie końcowe 9%). Reakcję zainicjowano dodając 0,08 ml preparatu enzymatycznego o aktywności 0,035 mU/ml (0,015 mU/mg). Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 0,4 ml. Reakcję prowadzono w temperaturze 30°C na wytrząsaniu 800 rpm. Reakcja była monitorowana przez 455 godzin na podstawie analizy HPLC produktu w pobieranych próbkach. W 93 godzinie reakcji zaobserwowano znaczący spadek stężenia substratu, dlatego reaktor zasilono dodatkową porcją substratu (0,08 ml roztworu 2,5 mg/ml substratu w 40% cyklodekstrynie). W 291 godzinie reakcji (12 dzień) dodano 0,005 ml 1 M K3[Fe(CN)6], Reakcja była prowadzona przez blisko 19 dni, po których to zaobserwowano 50% konwersję substratu do produktu, co pozwoliło uzyskać 0,194 mg produktu. Stężeniowy profil przebiegu reakcji opisanej w przykładzie pokazano na wykresie (Fig. 17).

Claims (15)

1. Sposób otrzymywania 25-hydroksylowanych pochodnych sterolowych o wzorze lIa, wzorze llb, wzorze lIc, wzorze Ile, w tym 25-hydroksy-7-dehydrocholesterolu o wzorze lId, na drodze regioselektywnej hydroksylacji pochodnych sterolowych o wzorze la, wzorze Ib, wzorze Ic, wzorze Id, wzorze le preparatem enzymatycznym o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej (S25DH) pochodzącej z bakterii Sterolibacterium denitrificans Chol-1S, znamienny tym, że proces regioselektywnej hydroksylacji substratów o wzorze la lub wzorze Ib lub wzorze Ic lub wzorze Id lub wzorze le prowadzi się w środowisku wodno-organicznym, w obecności reutleniacza, w temperaturze 15-45°C, a zwłaszcza do 30°C, z użyciem preparatu enzymatycznego, wykazującego aktywność dehydrogenazy C25 steroidowej (S25DH) pochodzącej z bakterii Sterolibacterium denitrificans Chol-1S, homogenicznego lub immobilizowanego kowalencyjnie na nośniku stałym nierozpuszczalnym w środowisku reakcji.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biokatalityczną aktywność preparatu enzymatycznego o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej utrzymuje się w środowisku reakcji w warunkach beztlenowych lub pod obojętnym gazem przez okres do 30 dni.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się w nim mieszaninę reakcyjną, która zawiera bufor, korzystnie fosforanowy, zapewniający pH w zakresie 6-8, a zwłaszcza 7,5, wodny roztwór 2-hydroksypropyl-p-cyklodekstryny o stężeniu 4-20% (w/v), zwłaszcza 4-15%(w/v), a najlepiej 8% (w/v), oraz 2-metoksyetanol w ilości 1-10% (v/v), zwłaszcza 1,25% (v/v) lub glikol propylowy w ilości 1-10% (v/v), zwłaszcza 3% (v/v).

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się przy stężeniu substratu w środowisku reakcji wynoszącym do 2,5 mM.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako bufor stosuje się ortofosforany potasu lub sodu lub Tris/PO4.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako nośnika stałego do kowalencyjnego immobilizowania preparatu enzymatycznego, używa się nośnika z krystalicznej celulozy modyfikowanej grupami funkcyjnymi.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako nośnika stałego do kowalencyjnego immobilizowania preparatu enzymatycznego, używa się modyfikowanego nośnika polimerowego typu ECH lub EAH Sepharose™ 4B, epoksy-Sepharose^TM 6B, Eupergit®C.

PL 226 816 B1

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako nośnika stałego do kowalencyjnego immobilizowania preparatu enzymatycznego, używa się nośnika krzemionkowego typu SBA-15 w formie proszkowej lub monolitycznej sfunkcjonalizowanego grupami aminowymi.

9. Sposób według zastrz. 6 albo 7, albo 8, znamienny tym, że nośnik preparatu enzymatycznego stanowi złoże kolumnowe.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako reutleniacz stosuje się heksacyjanożelazian (III) potasu K3[Fe(CN)6] lub tetrafluoroboran ferrocenu (III) [Fe(cp)2]BF4.

11. Sposób według zastrz. 1 albo 10, znamienny tym, że reutleniacz zredukowany podczas procesu hydroksylacji odtwarza się na drodze utleniania, korzystnie elektrotechnicznego.

12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że elektrochemiczne odtwarzanie reutleniacza prowadzi się z zastosowaniem elektrody roboczej i przeciwelektrody, korzystnie platynowych.

13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że początkowe stężenie reutleniacza w postaci K3[Fe(CN)6] w mieszaninie reakcyjnej ustala się w zakresie od 1-100 mM, szczególnie 10-20 mM, a najlepiej 12-15 mM, zaś reutleniacza w postaci [Fe(cp)2]BF4 przynajmniej 0,1 mM, a zwłaszcza 0,2-2 mM.

14. Sposób według zastrz. 1 albo 11, znamienny tym, że w procesie hydroksylacji substratu, prowadzonym z elektrochemicznym odtwarzaniem reutleniacza, niezależnie od stężenia substratu, stosuje się dla reutleniacza w postaci K3[Fe(CN)6] stężenie przynajmniej 1 mM, zwłaszcza 2-15 mM, a najlepiej 12 mM, zaś dla reutleniacza w postaci [Fe(cp)2]BF4 stosuje się stężenie przynajmniej 0,1 mM, a zwłaszcza 0,2-2 mM, korzystnie 2 mM.

15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w procesie hydroksylacji substratu, prowadzonym bez odtwarzania reutleniacza, stosuje się reutleniacz korzystnie w takiej ilości, by stosunek jego stężenia molowego do stężenia molowego substratu wynosił przynajmniej 2:1, przy czym górną granicą stężenia reutleniacza jest jego rozpuszczalność w medium reakcyjnym.