PL226916B1

PL226916B1 - Aptamer DNA rozpoznajacy ludzkie białko PCNA oraz jego zastosowanie

Info

Publication number: PL226916B1
Application number: PL410572A
Authority: PL
Inventors: Filip Bartnicki; Ewa Kowalska; Wojciech Strzałka
Original assignee: Univ Jagiellonski
Priority date: 2014-12-16
Filing date: 2014-12-16
Publication date: 2017-09-29
Also published as: EP3234142B1; WO2016099310A1; PL410572A1; EP3234142A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest unikatowa sekwencja nukleotydowa aptameru DNA wiążącego ludzkie białko PCNA oraz jej zastosowanie.

PCNA (ang. Proliferating Cell Nuclear Antigen) - jądrowy antygen dzielącej się komórki jest kluczowym białkiem eukariotycznym zaangażowanym w procesy replikacji i naprawy DNA oraz w regulację cyklu komórkowego. Białko to zostało odkryte jako autoantygen reagujący z przeciwciałami obecnymi w surowicy pacjentów cierpiących na układowy toczeń rumieniowaty. Badania krystalograficzne PCNA dowiodły, iż trzy monomery tego białka łączą się ze sobą tworząc strukturę o kształcie pierścienia. Podczas replikacji DNA, PCNA przy udziale kompleksu RFC {ang. Replication Factor C) PCNA jest umieszczane na podwójnej helisie gdzie ślizgając się po DNA służy jako platforma koordynująca pracę białek replikacyjnych.

Aptamery DNA definiuje się jako jednoniciowe cząsteczki kwasu deoksyrybonukleinowego o długości około 40-100 nukleotydów, które charakteryzują się zdolnością do specyficznego wiązania celu molekularnego. Dopasowanie aptameru do określonego celu molekularnego jest możliwe i zależne od tworzonych przez jednoniciową cząsteczkę DNA struktur drugo i trzeciorzędowych.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowej metody identyfikowania ludzkiego białka PCNA, w szczególności poprzez zapewnienie nowej cząsteczki posiadającej wysokie powinowactwo do PCNA.

Nieoczekiwanie okazało się, że określony powyżej cel techniczny może być zrealizowany zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

Przedmiotem wynalazku jest aptamer DNA wykazujący powinowactwo do ludzkiego białka PCNA i posiadający sekwencję nukleotydową:

5'-CATGCTTCCCCAGGGAGATGCCTATGGTCCCCGCGTAGGTGGCAGCTCA-3' albo

5'-CATGCTTCCCCAGGGAGATGCCTATGGTCCCCGCGTAGGTGGCAGCTCAAACCCGATTCGAGGAACATGCGTCGCAAAC-3'.

Dopuszczalna jest pewna zmienność sekwencji DNA według wynalazku, pod warunkiem zachowania jej powinowactwa do PCNA, które umożliwia wiązanie tego białka. W szczególności zakresem wynalazku objęte są warianty wskazanej powyżej sekwencji różniące się co najmniej jedną zasadą purynową lub pirymidynową.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie oligonukleotydu określonego powyżej do wytwarzania cząsteczki posiadającej powinowactwo do PCNA, w szczególności:

- do detekcji PCNA,

- do wiązania PCNA,

- do oczyszczania PCNA,

- do hamowania podziałów komórkowych.

W szczególności oligonukleotydy według wynalazku mogą być stosowane w postaci cząsteczek z przyłączonymi znacznikami, np. biotyną i służyć do znakowania PCNA.

Tego typu cząsteczki mogą być wykorzystane np. do badania oddziaływań pomiędzy białkami znanymi specjaliście technikami biologii molekularnej takimi jak: „pull down”.

W celu lepszego ujawnienia istoty zdefiniowanego powyżej wynalazku niniejszy opis został uzupełniony o następujące figury:

Na Figurze 1 przedstawiono wiązanie ludzkiego białka PCNA przez opracowany aptamer. Ścieżki: M) marker białkowy, 1) białko His-PCNA wykorzystane do eksperymentu, 2) wynik wiązania białka His-PCNA do aptameru anty-PCNA, 3) wynik wiązania białka His-PCNA do aptameru referencyjnego składajądego się z odpowiedniej liczby powtórzeń sekwencji GATC. Próbki rozdzielono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym, a następnie wybarwiono w barwniku Coomassie Brilliant Blue R-250.

Na Figurze 2 przedstawiono oczyszczanie ludzkiego białka PCNA z ekstraktu białkowego przygotowanego z komórek E. coli. Ścieżki: M) marker białkowy, 1) 40 mg ekstraktu białkowego z komórek E. coli, 2) 40 mg ekstraktu białkowego z komórek E. coli zawierającego ludzkie białko PCNA, 3) 4 mg białka PCNA oczyszczonego na złożu chromatograficznym zawierającym aptamer anty-PCNA. Próbki rozdzielono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym, a następnie wybarwiono w barwniku Coomassie Brilliant Blue R-250.

Na Figurze 3 przedstawiono wykrywanie ludzkiego rekombinowanego białka PCNA zawierającego metkę His metodą ELISA z wykorzystaniem aptameru anty-PCNA. Przedstawiony rezultat jest wynikiem uśrednionym z trzech niezależnie powtórzonych eksperymentów.

PL 226 916 B1

Na Figurze 4 przedstawiono cytotoksyczny wpływ aptameru anty-PCNA na komórki nowotworowej linii prostaty LNCaP wykonany przy użyciu testu MTT. Przedstawiony rezultat jest wynikiem uśrednionym z trzech niezależnie powtórzonych eksperymentów.

Na Figurze 5 przedstawiono % białka PCNA będącego w kompleksie z aptamerem anty-PCNA w funkcji stężenia tego aptameru.

Ponadto niniejszy opis został uzupełniony o podane poniżej przykłady realizacji. Nie powinny być one utożsamiane z pełnym zakresem zdefiniowanego powyżej wynalazku.

P r z y k ł a d 1. Uzyskanie aptameru DNA posiadającego powinowactwo do ludzkiego PCNA.

W wyniku badań mających na celu opracowanie cząsteczki ssDNA wykazującej powinowactwo do PCNA ustalono, że aptamer DNA zawierający następującą sekwencję:

5'-CATGTTCCCCAGGGAGATGCCTATGGTCCCCGCGTAGGTGGCAGCTCAAACCCGATTCGAGGAACATGCGTCGCAAAC-3' (Sekw. Id. Nr 1), posiada wysokie powinowactwo do tego białka.

Cząsteczka DNA według wynalazku może być uzyskana dowolną rutynową metodą syntezy DNA znaną specjaliście.

W przykładowej realizacji cząsteczka oligonukleotydowa została uzyskana przy wykorzystaniu techniki syntezy chemicznej w fazie stałej (Zlatev, I., Manoharan, M., Vasseur, J.-J. and Morvan, F. Solid-Phase Chemical Synthesis of 5'-Triphosphate DNA, RNA, and Chemically Modified Oligonucleotides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 2012; 50:1.28.1-1.28.16.)

Uzyskaną cząsteczkę aptameru anty-PCNA o zdefiniowanej powyżej sekwencji, długości 79 nukleotydów, zsyntetyzowaną odpowiednio w ilości 576 mikrogramów zweryfikowano metodą HPLC.

Cząsteczka DNA zawierająca sekwencję według wynalazku może być poddawana dodatkowym modyfikacjom, w szczególności sprzęganiu ze znanymi barwnikami (np. fluorescencyjnymi) lub innymi cząsteczkami (np. biotyną).

Przykładowo, biotynylowany aptamer anty-PCNA w ilości odpowiednio 434 mikrogramów uzyskano poprzez zastosowanie metody zautomatyzowanej syntezy oligonukleotydów biotynylowanych na końcu 5'. (pon, R.T. A Long Chain Biotin Phosphoramidite Reagent for The Automated Synthesis of

5'-Biotinylated Oligonucleotides, Tetrahedron Lett. 1991; 32: 1715-1718). Otrzymany produkt zweryfikowano metodą HPLC.

P r z y k ł a d 2. Wiązanie ludzkiego białka PCNA do złoża chromatograficznego zawierającego aptamer według wynalazku.

μl 50% złoża agarozowego ze sprzęgniętą streptawidyną umieszczono w 1,5 ml probówce typu eppendorf i przepłukano wodą destylowaną. Następnie przepłukano trzykrotnie buforem BW (17,5 g/L NaCl; 50 mM bufor fosforanowy NaH₂PO₄/Na₂HPO₄; 0,1% (v/v) Tween 20; pH 7,5). Przepłukane złoże zawieszono w 300 μl buforu BW po czym dodano 20 μg biotynylowanego na końcu 5' aptameru anty-PCNA lub referencyjnego o sekwencji (ACTG)x20. Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h. Po zakończonej inkubacji przeprowadzono trzykrotne płukanie buforem BW, a następnie dwukrotne płukanie buforem AS (137 mM NaCl; 12,7 mM KCl; 10 mM Na2HPO4; 2 mM KH2PO4; 5 mM MgCl2; 0,1% (v/v) Tween 20; pH 7,4). Po ostatnim płukaniu złoże ze związanym aptamerem zawieszono w 300 μΐ buforu AS po czym dodano rekombinowane ludzkie białko His-PCNA tak, aby jego stężenie wyniosło 1 mg/ml. Złoże inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h. Po zakończonej inkubacji przepłukano czterokrotnie buforem AS. Następnie do złoża dodano bufor GLB (50 mM Tris-HCl; 2% SDS (w/v); 2% błękit bromofenolowy (w/v); 10% glicerol; 200 mM β-merkaptoetanol; pH 6.8) i inkubowano przez 5 min w temperaturze 95°C. Otrzymaną próbkę poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w warunkach denaturujących (SDS-PAGE; metoda Laemmliego) w 12% żelu poliakrylamidowym. Po zakończonym rozdziale białko zostało wybarwione poprzez wykorzystanie barwnika Coomassie Brilliant Blue R-250. Wyniki zostały przedstawione na fig. 1.

P r z y k ł a d 3. Oczyszczanie ludzkiego białka PCNA z białkowego ekstraktu komórkowego E. coli.

μl 50% złoża agarozowego ze sprzęgniętą streptawidyną umieszczono w 1,5 ml probówce typu eppendorf i przepłukano wodą destylowaną. Następnie przepłukano trzykrotnie buforem A (50 mM Tris; 300 mM NaCl, 0,01% (v/v) Tween 20; pH 7,5). Przepłukane złoże zawieszono w 300 μl buforu A po czym dodano 20 μg biotynylowanego na końcu 5' aptameru anty-PCNA. Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h. Po zakończonej inkubacji przeprowadzono trzykrotne płukanie buforem A. Po ostatnim płukaniu złoże ze związanym aptamerem zawieszono w 300 μl buforu A po czym dodano ekstrakt białkowy przygotowany z komórek E. coli zawierający rekombinowane ludz4

PL 226 916 B1 kie białko PCNA tak, aby końcowe stężenie białka całkowitego wyniosło 16 mg/ml. Złoże inkubowano w temperaturze 4°C przez 1 h. Po zakończonej inkubacji złoże przepłukano czterokrotnie buforem A.

Po ostatnim płukaniu złoże ze związanym aptamerem zawieszono w 300 μΐ buforu A po czym dodano ekstrakt białkowy przygotowywany z komórek E. coli zawierający rekombinowane ludzkie biało PCNA tak, aby końcowe stężenie białka całkowitego wyniosło 16 mg/ml. Złoże inkubowano w temperaturze 4°C przez 1 h. Po zakończonej inkubacji złoże przepłukano czterokrotnie buforem A. Następnie białko

PCNA eluowano buforem elucyjnym (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM chlorowodorek guanidyny, pH 7,5). Do preparatu uzyskanego białka dodano buforu GLB (50 mM Tris; 2% SDS (w/v); 2% błękit bromofenolowy (w/v); 10% glicerol; 200 mM β-merkaptoetanol; pH 6.8) i inkubowano przez 5 min w temperaturze 95°C. Otrzymaną próbkę poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w warunkach denaturujących (SDS-PAGE; metoda Laemmliego) w 12% żelu poliakrylamidowym. Po zakończonym rozdziale białko zostało wybarwione poprzez wykorzystanie barwnika Coomassie Brilliant Blue R-250. Wyniki zostały przedstawione na fig. 2.

P r z y k ł a d 4. Oznaczanie ludzkiego białka PCNA metodą ELISA.

Płytkę 96-dołkową do testu ELISA ze zimmobilizowanymi jonami niklu opłaszczono białkiem His-PCNA lub His-GST (0,5 mg białka/studzienkę) w temperaturze 4°C przez 16 h. Następnie płytkę przepłukano trzykrotnie buforem PBST (1x PBS zawierający 0,5% (v/v) Tween 20). W kolejnym etapie płytkę poddano blokowaniu w buforze 1x PBS zawierającym 1% (w/v) albuminę wołową przez 2 h w temperaturze pokojowej. Następnie płytkę przepłukano trzy razy buforem PBST i dodano biotynylowany aptamer anty-PCNA lub aptamer referencyjny (o sekwencji (ACTG)x20) rozpuszczony w buforze AS (137 mM NaCl; 12,3mM KCl; 10 mM Na2HPO4; 2 mM KH2PO4; 5 mM MgCl2; pH 7,4; 0,1% (v/v) Tween 20) tak aby końcowe stężenie aptameru wyniosło 0,1 mg/ml. Inkubację prowadzono przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie płytkę przepłukano trzy razy buforem PBST, a do studzienek dodano streptawidynę sprzęgniętą z peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1:200 w buforze PBS) i prowadzono inkubację przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Płytkę ponownie przepłukano buforem PBST trzy razy, a następnie do studzienek dodano substratu dla peroksydazy chrzanowej. Po zaobserwowaniu niebieskiego zabarwienia reakcję zatrzymano 1M H2SO4 po czym zmierzono absorbancję przy długości fali 450 nm. Uzyskane wyniki przedstawiono na fig. 3.

P r z y k ł a d 5. Hamowanie podziałów komórkowych wybranych linii komórek nowotworowych (fig. 4).

Komórki epitelialnej linii nowotworowej LNCaP (ATCC® CRL-1740™) wysiano na płytkę 96-dołkową w ilości 1000 komórek/dołek. Po 16 h hodowli w inkubatorze (37°C, 5% CO2) do komórek dodano aptamer anty-PCNA lub aptamer referencyjny (o sekwencji (ACTG)20x) (rozpuszczone w świeżym medium hodowlanym RPMI-1640 zawierające 10% surowicę wołową) tak aby ich końcowe stężenie wyniosło 33 μΜ. Po 24 i 48 h hodowli medium wymieniono na świeże zawierające ustaloną ilość analizowanych aptamerów. Po 72 h godzinach wzrostu komórek w obecności aptamerów przeprowadzono test MTT obrazujący aktywność przemian energetycznych w mitochondriach, który odzwierciedla względną żywotność komórek. W tym celu po zakończeniu inkubacji z aptamerami komórki przepłukano buforem PBS, a następnie dodano 100 μΐ świeżego medium hodowlanego zawierającego odczynnik MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, kolor żółty) o końcowym stężeniu 0,5 mg/ml. Po 4 h inkubacji, kryształy nierozpuszczalnego formazanu (kolor ciemno niebieski), które powstały w wyniku redukcji odczynnika MTT, rozpuszczano przy użyciu izopropanolu z dodatkiem 0,04M HCl. Poziom formazanu, który jest wprost proporcjonalny do liczby żywych komórek oznaczano metodą kolorymetryczną przez pomiar absorbancji przy długości fali równej 540 nm.

P r z y k ł a d 6. Wyznaczenie wartości stałej dysocjacji dla kompleksu ludzkie białko PCNA/aptamer DNA anty-PCNA (fig. 5)

Do dziesięciu probówek 1,5 ml typu Eppendorf dodano po 40 μl 50% złoża agarozowego ze sprzęgniętą streptawidyną. Złoże przepłukano wodą destylowaną, a następnie trzykrotnie buforem AS (137 mM NaCl; 12,7 mM KCl; 10 mM Na2HPO4; 2 mM KH2PO4; 5 mM MgCl2; 0,1% (v/v) Tween 20; pH 7,4;). Przepłukane złoże zawieszono w 100 μl buforu AS zawierającego odpowiednią ilość biotynylowanego na końcu 5' wariantu aptameru anty-PCNA (o sekwencji: 5'-CATGCTTCCCCAGGGAGATG CCTATGGTCCCCGCGTAGGTGGCAGCTCA-3') tak, aby podczas dalszej inkubacji z białkiem PCNA stężenia aptameru wyniosło odpowiednio: 0; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; 25,0; 50,0; 75,0 i 100 μΜ. Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h po czym przepłukano pięć razy buforem AS. Następnie, złoże zawieszono w buforze AS zawierającym 100 nM ludzkie białko His-PCNA. Złoże inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h. Następnie, nadsącze przeniesiono do nowych probówek

PL 226 916 B1 typu Eppendorf i dodano buforu GLB (50 mM Tris-HCl; 2% SDS (w/v); 2% błękit bromofenolowy (w/v);

10% glicerol; 200 mM β-merkaptoetanol; pH 6.8) po czym próbki inkubowano przez 5 min w temperaturze 95°C. Otrzymane preparaty poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w warunkach denaturujących (SDS-PAGE; metoda Laemmliego) w 12% żelu poliakrylamidowym. Po zakończonym rozdziale białko zostało wybarwione poprzez wykorzystanie barwnika Coomassie Brilliant Blue R-250. Na podstawie pomiarów densytometrycznych określono % białka PCNA znajdującego się w kompleksie z badanym aptamerem, dla każdej z badanych próbek. Za pomocą programu GraphPad Prism wykorzystując model z jednym specyficznym miejscem wiązania ligandu wyznaczono wartość stałej dysocjacji dla badanego kompleksu która wyniosła 5,08 mM.

Claims

1. Aptamer DNA wykazujący powinowactwo do ludzkiego białka PCNA i posiadający sekwencję nukleotydową:

5'-CATGCTCCCCAGGGAGATGCCTATGGTCCCCGCGTAGGTGGCAGCTCA-3' albo 5'-AACCCGATTCGAGGAA CATGCGTCGCAAAC-3'.

2. Zastosowanie oligonukleotydu posiadającego sekwencję określoną w zastrz. 1 do wytwarzania cząsteczki posiadającej powinowactwo do PCNA, w szczególności:

- do detekcji PCNA,

- do wiązania PCNA,

- do oczyszczania PCNA,

- do hamowania podziałów komórkowych.