PL227182B1

PL227182B1 - Superparamagnetyczne nanoczastki tlenku zelaza z ultracienkimi warstwami polimerowymi, sposób ich wytwarzania i zastosowanie

Info

Publication number: PL227182B1
Application number: PL401706A
Authority: PL
Inventors: Szczepan Zapotoczny; Gabriela Kania; Agnieszka Szpak; Maria Nowakowska
Original assignee: Univ Jagiellonski
Priority date: 2012-11-21
Filing date: 2012-11-21
Publication date: 2017-11-30
Also published as: EP2922577B1; PL401706A1; PL2922577T3; EP2922577A1; WO2014081322A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku są superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza z ultracienkimi warstwami polimerowymi charakteryzujące się tym, że składają się z superparamagnetycznych rdzeni z tlenków żelaza współstrąconych z polikationem oraz hydrofilowej powłoki złożonej z przynajmniej jednej ultracienkiej warstwy polielektrolitu. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania superparamagnetycznych nanocząstek oraz zastosowanie superparamagnetycznych nanocząstek jako środka kontrastowego w obrazowaniu rezonansem magnetycznym i/lub fluorescencyjnym i/lub mikroskopii fluorescencyjnej.

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (ang. Superparamagnetic Iron OxideNanoparticles, SPION) z ultracienkimi warstwami polimerowymi zbudowanych z superparamagnetycznych rdzeni z tlenków żelaza optaszczonych polikationem, oraz hydrofilowej powłoki złożonej z ultracienkich warstw polielektrolitów, zwiększającej biokompatybilność oraz relaksacyjność całej struktury w środowisku wodnym. Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza w wyniku współstrącenia nanocząstek z polikationem. Wynalazek dotyczy także zastosowania superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza do diagnostyki technikami magnetycznego rezonansu jądrowego oraz mikroskopii fluorescencyjnej.

Stosowane powszechnie w obrazowaniu prowadzonym przy użyciu techniki rezonansu magnetycznego (dalej: MRI) środki kontrastowe zawierają kompleksy jonów gadolinowych (Geraldes 2009), co sprawia, że podawany kontrast jest toksyczny i wymaga szybkiego usunięcia z organizmu po przeprowadzonym badaniu. Stosowanie tych preparatów może także prowadzić do rozwoju chorób np. nefrogennego włóknienia układowego, szczególnie u pacjentów cierpiących na ostrą niewydolność nerek. Poszukiwane są zatem inne substancje, które działając jako środki kontrastowe, będą jednocześnie bezpieczne do stosowania u ludzi i zwierząt. Superparamagnetyczne nanocząstki według wynalazku stanowią alternatywę dla obecnie stosowanych środków kontrastowych. Właściwości magnetyczne tych cząstek pozwalają na ograniczenie minimalnej dawki preparatu, którą należy wprowadzić do organizmu pacjenta celem uzyskania podobnego efektu obrazowania jak ten otrzymywany w przypadku stosowanych obecnie substancji paramagnetycznych.

Istnieje wiele metod syntezy superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (Tartaj 2003,Teja 2009, Laurent 2008, Tartaj 2005), jednakże do zastosowań biologicznych najczęściej wykorzystywana jest metoda współstrącania z roztworów wodnych soli żelaza. Zaletami tej metody są: prostota jej wykonania, wysoka wydajność oraz łatwe procedury izolowania materiału, a następnie jego dalszej modyfikacji lub przenoszenia do fazy wodnej. Ograniczeniem metod dostępnych w stanie techniki jest często występująca agregacja otrzymanych nanocząstek. W celu stabilizacji uzyskanych struktur, powierzchnię cząstek pokrywa się m.in. polimerowymi lub małocząsteczkowymi stabilizatorami (Laurent 2008, Gupta 2005). Dodatkowo, asymilacja superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza przez organizm bądź wywołane przez nie reakcje immunologiczne zależą przede wszystkim od rozmiaru nanocząstek. Cząstki o rozmiarze większym od 200 nm są wychwytywane w śledzionie, a następnie usuwane przez komórki układu fagocytarnego. Natomiast superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza o średnicach mniejszych od 10 nm są szybko usuwane z organizmu przez nerki. Zjawiska te skutkują skróceniem czasu cyrkulacji nanocząstek we krwi.

Dla przezwyciężenia wyżej opisanych barier, w rozwiązaniu według wynalazku stosuje się superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza podawane dożylnie o rozmiarze od 10 nm do 200 nm. Nanocząstki tych rozmiarów charakteryzują się najdłuższym czasem cyrkulacji w krwiobiegu. Są one na tyle małe, że zostają pominięte przez komórki układu fagocytarnego, dzięki czemu mogą penetrować głębiej, nawet do małych naczyń włosowatych, co pozwala na osiągnięcie efektywnego rozmieszczenia superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza w docelowych tkankach. Zatem dla zastosowań biomedycznych istotne jest uzyskanie cząstek o małych rozmiarach oraz niskim stopniu ich polidyspersji. Dodatkowo, środki kontrastowe powinny być biokompatybilne, najlepiej biodegradowalne oraz selektywne tzn. charakteryzować się zdolnością do selektywnego wiązania się z określonymi tkankami/komórkami organizmu. Pokrycie nanocząstek odpowiednimi materiałami (opłaszczenie) zwiększa ich biokompatybilność, ale również umożliwia przeprowadzenie odpowiednich modyfikacji chemicznych, przyłączanie wybranych przeciwciał itp. celem zapewnienia wspomnianej selektywności lokowania się w określonych tkankach organizmu (Laurent 2008).

Znane są w stanie techniki kontrasty zawierające bardzo małe superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza oraz superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza (np. ferumoxides, FeREX, czy też ferumoxtran-10) opłaszczane głównie dekstranem lub jego pochodnymi (Geraldes 2009, Laurent 2008). Dekstran to naturalny, biokompatybilny polisacharyd o stosunkowo dużej masie cząsteczkowej zawierający najczęściej pewien udział łańcuchów rozgałęzionych. Zastosowanie dekstranu w przypadku kontrastów dostępnych w stanie techniki ma jednak pewne wady. W procesie opłaszczania w jednej strukturze polimerowej zamykanych jest razem wiele nanocząstek, co prowadzi do uzyskania układów o rozmiarach nawet mikrometrycznych i dużym rozkładzie ich rozmiarów. Takie cząstki są łatwiej wychwytywane przez makrofagi w organizmie, a to skraca czas cyrkulacji kontrastu

PL 227 182 B1 we krwi. Ponadto duży stosunek masy polimeru do masy nanocząstek skutkuje obniżeniem właściwości magnetycznych kontrastu, co powoduje konieczność zwiększenia efektywnej dawki podawanej pacjentowi przed wykonaniem badań diagnostycznych techniką MRI. Wiązanie nanocząstek z warstwą polimeru jest często słabe. W przypadku dekstranu rozcieńczanie prowadzi do desorpcji polimeru z powierzchni nanocząstek, co skutkuje ich agregacją i łatwiejszym wychwytywaniem przez układ immunologiczny (Laurent 2008).

Ponadto, pokrycia dekstranowe są niekorzystne także ze względu na występujące w organizmie przeciwciała antydekstranowe. Podanie zatem kontrastu zawierającego dekstran może indukować cytotoksyczność (Yuan 2008).

W celu wyeliminowania ww. barier, w rozwiązaniu według wynalazku proponuje się zastąpienie dekstranu innym polisacharydem, a mianowicie chitozanem i jego pochodnymi. Chitozan jest polimerem nietoksycznym, biokompatybilnym i biodegradowalnym. Pozyskuje się go w procesie deacetylacji chityny, której źródłem są skorupy krabów, krewetek lub kalmarów. Makrocząsteczki chitozanu zawierają, podobnie jak dekstran, grupy -OH, ale także grupy-NH2, co znacząco poszerza możliwości modyfikacji chitozanu. Niestety, jest on dobrze rozpuszczalny tylko w kwaśnym środowisku, w którym zachodzi protonacja grup aminowych. Może to stanowić istotne ograniczenie w zastosowaniu niemodyfikowanego chitozanu, np. w warunkach obojętnego pH (dla krwi ludzkiej pH=7,4). Chitozan znalazł już zastosowanie w dostarczaniu insuliny (Agnihotri 2004). Jest on również wykorzystywany jako składnik bandaży i innych środków opatrunkowych. Kolejną zaletą chitozanu w porównaniu z innymi naturalnymi polisacharydami jest jego zdolność do chelatowania jonów metali, w wyniku czego powstają trwałe połączenia metal-polimer (Yuan 2008). Z powodzeniem może być on zatem stosowany do stabilizowania superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza, a także może stanowić punkt wyjścia do dalszej selektywnej modyfikacji pokrytych nim nanocząstek.

Polimery, takie jak dekstran i chitozan, zaliczane są do grupy polimerów hydrofilowych. Stanowią one zatem materiał przepuszczalny dla wody, co w kontekście wynalazku stanowi znaczącą zaletę. Pokrycie bowiem superparamagnetycznych rdzeni powłoką z ultracienkich warstw pochodnych chitozanu lub heparyny przyczynia się do przenikania cząsteczek wody przez powłokę, bliżej rdzeni. Dodatkowo dyfuzja tych cząsteczek jest spowalniana przez tą powłokę (Kwak 2003), a zatem kontakt cząsteczki wody z superparamagnetycznym rdzeniem jest dłuży, a to przekłada się na poprawę właściwości magnetycznych na skutek wzrostu relaksacyjności poprzecznej r2.

W stanie techniki znane jest również międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO2009061456, które przedstawia nanocząstki funkcjonalizowane grupami aminowymi, których celem jest przyłączenie kowalencyjne polimeru lub oligomeru hydrofilowego (niejonowego) typu PEG jako klasycznego pokrycia zapewniającego zmniejszoną wykrywalność nanocząstek przez układ immunologiczny organizmu. Użycie polimeru kationowego w niniejszym wynalazku ograniczone jest jedynie do kopolimerów zawierających L-lizynę, które są osadzane jedynie na powierzchni nanocząstek pokrytej uprzednio warstwą złota. W zgłoszeniu tym koniecznym jest zatem wytworzenie warstwy złota pokrywającej nanocząstki magnetyczne, która dopiero umożliwia naniesienie odpowiedniej warstwy polimerowej.

Z kolei zgłoszenie patentu europejskiego nr EP1088315 (A1) opisuje tworzenie nanocząstek polimerowych pokrytych warstwą tlenków żelaza. W stosunku do rozwiązani będącego przedmiotem wynalazku jest to koncepcja zupełnie odwróconej struktury. Zaproponowane rozwiązanie objęte zgłoszeniem patentowym, pomimo osłabienia możliwości chelatujących użytego polimeru (znane ze stanu techniki), pozwala na uzyskanie trwałej dyspersji nanocząstek magnetycznych dzięki zastosowaniu kationowego polimeru, który wbudowują się w strukturą nanocząstki i ją pokrywa. Zastosowane rozwiązanie pozwala w drugim kroku na łatwe pokrycie nanocząstek pożądanym polimerem anionowych bez naruszania trwałości dyspersji, co w przypadku inaczej wykonanych nanocząstek prowadziłoby raczej do ich agregacji i sedymentacji. Takie dwuetapowe podejście do otrzymania anionowo powierzchniowo funkcjonalizowanych nanocząstek nie wynika w oczywisty sposób z przedstawionego stanu techniki.

Amerykańskie zgłoszenie patentowe nr US2004146855 (A1) dotyczy nanocząstek magnetycznych, które są umieszczone w matrycy z usieciowanego materiału (np. skrobia). Z kolei rozwiązanie według wynalazku nie dotyczy pokrywania cienką warstwą polimerów jonowych. W wynalazku objętym amerykańskim opisem patentowym, w pierwszym etapie jony Fe(II) muszą dyfundować do matrycy składającej się z polisacharydów lub tworzyć kompleks z np. chitozanem. W następnym etapie, otrzymany materiał jest utleniany za pośrednictwem azotanów (NO3) w podwyższonej temperaturze (70-80°C). Tak więc idea stojąca u podstaw tego rozwiązania jest zupełnie inna niż ta przedstawiana

PL 227 182 B1 w opisie zgłoszeniowym, gdzie tworzy się ultracienką powłokę polimerową na nanocząstkach w celu uniknięcia tworzenia jakiegokolwiek usieciowanej matrycy polimerowej, która zapobiega tworzeniu się stabilnej dyspersji powlekanych nanocząstek w wodzie. W rozwiązaniu będącym przedmiotem zgłoszenia patentowego stosuje się w tym celu kationową modyfikację polimerów (w tym polisacharydów).

Przedmiotem wynalazku są superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza z ultracienkimi powłokami polimerowymi charakteryzujące się tym, że składają się one z: superparamagnetycznych rdzeni z tlenków żelaza opłaszczonych polikationem, oraz z hydrofilowej powłoki zbudowanej z przynajmniej jednej dodatkowej w stosunku do tej pierwszej otrzymywanej w wyniku współstrącania ultracienkiej powłoki polielektrolitu, przy czym pierwsza/pierwotna ultracienka powloką polielektrolitu, i kolejne nieparzyste powłoki, nałożone na powierzchnię otrzymanych nanocząstek, składają się z polikationu, a średnia wielkość nanocząstek tlenku żelaza z ultracienkimi powłokami polimerowym wynosi 5-200 nm i/lub średnica rdzenia z tlenku żelaza wnosi 5-20 nm i/lub grubość polimerowej powłoki wynosi 0,1-100 nm.

Korzystnie, gdy polikation wybrany jest z grupy obejmującej naturalne lub modyfikowane polisacharydy zawierające dodatnio naładowane grupy, takie jak: amoniowe, pirydyniowe czy fosfoniowe, a najkorzystniej, gdy polikation to chitozan modyfikowany grupami amoniowymi.

Równie korzystnie, gdy druga ultracienka powłokami polielektrolitu i kolejne parzyste powłoki składają się z polianionu. Szczególnie korzystnie, gdy polianion to polimer z grupy obejmującej naturalne lub modyfikowane polisacharydy zawierające ujemnie naładowane grupy funkcyjne, takie jak: sulfonowe, siarczanowe, karboksylowe czy fosforanowe, w tym najkorzystniej, gdy polianion to polimer stanowiący pochodną anionowa chitozanu lub heparyna, a w szczególności karboksymetylochitozan modyfikowany kompleksem trójtlenku siarki lub heparyna.

Korzystnie, gdy nanocząstki tworzą zawiesinę w fazie wodnej. Zaletą rozwiązania według wynalazku jest zwiększenie biokompatybilności oraz relaksacyjności całej struktury nanocząstki w środowisku wodnym związane z występowaniem powłoki złożonej z ultracienkich powłok polielektrolitów. Powłoki polikationu składająca się z chitozanu modyfikowanego grupami amoniowymi nadaje nanocząstce trwały ładunek dodatni, a kolejna nałożona powłoka polielektrolitu nadaje nanocząstce trwały ładunek ujemny. Wpływa to m.in. korzystnie na stabilność zawiesin nanocząstek w wodzie.

Korzystnie, gdy powłoka hydrofilowa jest funkcjonalizowana poprzez dołączenie do niej sondy fluorescencyjnej.

Równie korzystnie, gdy powłokę polielektrolitu posiadającą grupy fluorowane stanowi poli(chlorek N,N-dimetylo-N-4'-winylobenzylo-N-2-(perfluorooktanoilo-N'-metyloimino)etyloamoniowy)-co-(chlorek N,N,N-trimetylo-N-4'-winylobenzyloamoniowy) (AK-St-F).

Zaletą superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza będących przedmiotem wynalazku, które są pokryte chitozanem modyfikowanym kationowo oraz w kolejnym etapie karboksymetylochitozanem modyfikowanym anionowo trójtlenkiem siarki, jest niewielki rozmiar, niski stopień polidyspersji rozmiarów, trwały ładunek powierzchniowy, stabilność w wodzie oraz znacznie lepsze właściwościami magnetyczne (relaksacyjności) niż dostępne w stanie techniki środki kontrastowe.

Otrzymana zawiesina nanocząstek może znaleźć szereg zastosowań biomedycznych. Wymienione wyżej zalety nanocząstek pozwalają na stosowanie ich jako środka kontrastowego w mniejszych dawkach (niższe stężenie żelaza) dla zapewnienia identycznego efektu w obrazie MRI, jak ten uzyskiwany przy użyciu innych dostępnych środków kontrastowych. Wprowadzenie gadolinu na powierzchnię SPION pozwala uzyskiwać obrazy nie tylko T2-zależne, ze względu na obecność tlenku żelaza w strukturze, ale również T1-zależne, co znacznie poprawia kontrast pomiędzy zbieranymi skanami. Gadolin w postaci kompleksów kationów Gd³⁺ z DTPA lub EDTA wprowadza się na powierzchnię nanocząstek poprzez przyłączanie tych grup chelatujących zarówno do powierzchni polimerowej naładowanej dodatnio jak i ujemnie. Pokrycie natomiast powłoką polielektrolitu posiadającego fluorowane grupy pozwala wykorzystać tak zmodyfikowane nanocząstki jako równoczesne środki

19 kontrastowe w obrazowaniu ¹H NMR oraz ¹⁹F NMR, co ze względu na wysoką odpowiedź jąder fluoru w tego typu badaniach również ułatwia śledzenie zmian w uzyskiwanych obrazach. Wprowadzenie atomów fluoru na powierzchnię nanocząstek może się odbyć z wykorzystaniem zarówno polimeru kationowego jak i anionowego, tj. bez względu na znak ładunku powierzchniowego modyfikowanych nanocząstek. Pokrycie powloką heparyny pozwala m.in. na lepsze różnicowanie zdolności obrazowania zmian miażdżycowych śródbłonka. Przyłączenie do powierzchni SPION konkretnego przeciwciała lub aptameru przeciwciała skutkuje natomiast specyficznym wiązaniem nanocząstek z wybraną tkanką/komórką ciała ludzkiego, w tym np. zmienioną zapalnie ścianą naczynia krwionośnego, co również

PL 227 182 B1 poprawia jakość uzyskiwanych zdjęć MRI. Wprowadzenie sondy fluorescencyjnej na powierzchnię SPION daje natomiast możliwość szerszego wykorzystania nanocząstek w diagnostyce medycznej, gdyż takie sfunkcjonalizowane nanocząstki posłużą jako środek diagnostyczny wykorzystywany równocześnie w obrazowaniu rezonansem magnetycznym jak i mikroskopii fluorescencyjnej. Zawiesiny superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza po odpowiednim zmodyfikowaniu powierzchni mogą zostać wykorzystane również do oznaczania lub separacji komórek, naprawy tkanek, dostarczania leków, hipertermii czy magnetofekcji.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania superparamagnetycznych nanocząstek według wynalazku charakteryzujący się tym, że wodny roztwór kationowego polisacharydu stanowią₃ cego amoniową pochodną chitozanu w stężeniu 0,1-10 g/dm łączy się z chlorkami żelaza(II) i żela₃ za(III) do osiągnięcia stężenia jonów żelaza 0,001-0,500 mol/dm³, a następnie przedmuchuje się argonem i miesza w temperaturze 10-60°C, a następnie łączy się z amoniakiem do osiągnięcia przez mieszaninę pH większego niż 8, w którym następuje strącenie superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza o trwałym ładunku dodatnim przy jednoczesnym przedmuchiwaniu mieszaniny argonem i mieszaniu, a po oczyszczeniu powierzchnię superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza o ładunku powierzchniowym dodatnim można pokryć przynajmniej jedną powloką przeciwnie naładowanego polielektrolitu.

₃

Korzystnie, gdy stężenie polisacharydu wynosi 0,5-5 g/dm³. Równie korzystnie, gdy jako sole żelaza(II) i żelaza(III) stosuje się chlorki żelaza(II) i żelaza(III), a sole żelaza(II) i żelaza(III) są w sto₃ sunku molowym równym 1:2 i stężenie jonów żelaza wynosi 0,002-0,200 mol/dm³.

Równie korzystnie, gdy roztwór kationowego polisacharydu zawierający jony żelaza łączy się z zasadą do osiągnięcia przez mieszaninę pH większego niż 9.

Przy wytwarzaniu superparamagnetycznych nanocząsteczek jako metodę osadzenia polianionu na powierzchni o ładunku dodatnim, jak i odkładania kolejnych powłok przeciwnie naładowanych polielektrolitów, stosuje się metodę elektrostatycznej samoorganizacji typu „warstwa-po-warstwie”.

Zastosowanie silnego polikationu, a nie polianionu, we współstrącaniu z nanocząstkami tlenku żelaza jest nowatorskim podejściem w tej metodzie syntezy. W tym przypadku, proces tworzenia nanocząstek może być kontrolowany dzięki tworzeniu się chelatów polimeru z jonami żelaza, podczas gdy stosowanie polianionów zawierających grupy karboksylowe prowadzi zwykle do tworzenia nierozpuszczalnych soli karboksylowych.

Korzystnie zastosowanie chitozanu modyfikowanego kationowo do opłaszczenia superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza nadaje trwały ładunek dodatni powierzchni nanocząstek, którego wartość jest praktycznie niezależna od pH środowiska, do którego te nanocząstki zostaną wprowadzone, co zapewnia stabilność zawiesiny w wodzie. Zastosowanie chitozanu modyfikowanego kationowo do opłaszczenia superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pozwala na prowadzenie procesów modyfikacji powierzchni oraz późniejszego stosowania pokrytych polimerem nanocząstek w środowisku wodnym o szerokim zakresie pH, także obojętnym i zasadowym.

Sposób wytwarzania superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych chitozanem modyfikowanym kationowo według wynalazku ma tę zaletę, że odbywa się w środowisku wodnym i przebiega bez użycia rozpuszczalników organicznych i toksycznych prekursorów oraz trudnych do usunięcia surfaktantów.

Dodatni ładunek na powierzchni nanocząstek może jednakże powodować agregację składników krwi ludzkiej np. erytrocytów, po wprowadzeniu ich jako środka kontrastowego do krwiobiegu. Celem wyeliminowania tego zjawiska i zapewnienia pełnej biokompatybilności kontrastu, superparamagnetyczne nanocząsteczki tlenku żelaza opłaszczone chitozanem modyfikowanym kationowo według wynalazku, korzystnie pokrywa się karboksymetylo-chitozanem modyfikowanym anionowo trójtlenkiem siarki (przykład 6) lub heparyną (przykład 8), wykorzystując metodę osadzania polielektrolitów „warstwa-po-warstwie”. Uzyskuje się w ten sposób stabilną zawiesinę superparamagnetycznych nanocząsteczek tlenku żelaza o trwałym ładunku powierzchniowym ujemnym. Możliwa jest łatwa modyfikacja powierzchni nanocząstek będących podstawą wynalazku oraz kontrolowana zmiana ich ładunku powierzchniowego, a także rozmiaru. Co najważniejsze, proces ten nie prowadzi do zmniejszenia relaksacyjności nanocząstek (przykład 15), która jest istotnym parametrem użytkowym tego wynalazku, a wręcz przeciwnie, zastosowanie polimerów hydrofitowych, którymi są wspomniane wyżej pochodne chitozanu, w postaci powłoki okrywającej superparamagnetyczne rdzenie przyczynia się do znaczącej poprawy tego parametru dla uzyskiwanych zgodnie z wynalazkiem nanocząstek.

PL 227 182 B1

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie superparamagnetycznych nanocząstek według wynalazku jako środka kontrastowego w obrazowaniu rezonansem magnetycznym i/lub fluorescencyjnym i/lub mikroskopii fluorescencyjnej.

Przedmiot wynalazku został uwidoczniony w przykładach wykonania na załączonym rysunku, na którym:

Fig. 1 przedstawia wzór strukturalny makrocząsteczki amoniowej pochodnej chitozanu;

Fig. 2 i 3 przedstawiają zdjęcia TEM nanocząstek z przykładu 2;

Fig. 4 przedstawia zdjęcie TEM nanocząstek z przykładu 6;

Fig. 5 i 6 przedstawiają zdjęcia TEM nanocząstek z przykładu 5;

Fig. 7 i 8 przedstawiają wykresy obrazujące rozkład średnicy rdzeni superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza;

Fig. 9 przedstawia wykres średnic hydrodynamicznych nanocząstek dla koloidów z przykładów 2, 6 i 7;

Fig. 10 przedstawia przykładowe zdjęcie przedstawiające płaszczyzny krystalograficzne uzyskane przy użyciu HREM dla nanocząstek z przykładu 2;

Fig. 11 przedstawia widma IR amoniowej pochodnej chitozanu oraz nanocząsteczek z przykładów 2 i 5;

Fig. 12 przedstawia zdjęcia z mikroskopu sił magnetycznych dla koloidu z przykładu 2

Fig. 13 przedstawia wykres podatności magnetycznej nanocząstek z przykładu 2 w funkcji temperatury;

Fig. 14 przedstawia wykres zależności magnetyzacji (M) od indukcji pola magnetycznego (μ₀Η) koloidu z przykładu 2;

Fig. 15, 16 i 17 przedstawiają preparaty pokazujące oddziaływanie koloidów z przykładów 2 i 6 z krwią ludzką;

Fig. 18, 19 i 20 przedstawiają termogramy zarejestrowane dla chitozanu modyfikowanego kationowo oraz nanocząstek z przykładów 2 i 5;

Fig. 21 przedstawia widma wzbudzenia i emisji nanocząstek tlenku żelaza z przyłączoną do powierzchni fluoreskaminą:

Fig. 22 przedstawia mapy MRI z obserwacji in vivo wpływu nanocząstek tlenku żelaza z przykładu 5 i 6 na wątrobowe mapy czasu relaksacji T2.

Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza według wynalazku otrzymano w wyniku jednoetapowej metody syntezy, polegającej na współstrąceniu jonów żelaza(II) i żelaza(III) z biokompatybilnym polimerem kationowym, chitozanem modyfikowanym kationowo. Syntezę chitozanu modyfikowanego kationowo przeprowadzono zgodnie z metodą opisaną w literaturze (Cho 2006), otrzymując polimer o strukturze przedstawionej na Fig. 1.

W przykładach 1-5 zastosowano chitozan modyfikowany kationowo o stopniu podstawienia

95%, wyznaczonym na podstawie widm magnetycznego rezonansu jądrowego (Bulwan 2009).

P r z y k ł a d 1. Synteza superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych chitozanem modyfikowanym kationowo (ChK)

Do 50 ml roztworu ChK o stężeniu 1 g/l w 0,1M NaCl wprowadzono 0,1622 g FeCl₃^6H₂O i 0,0596 g FeCl₂4H₂O (stosunek stężeń Fe(III):Fe(II) = 2:1) przy pH wynoszącym 1,5. Układ zamknięto, przedmuchując argonem 10 min, sonikowano (sonikator typu SONIC-6 firmy PolSonic), stosując sonikację ciągłą bez chłodzenia układu. Do układu dodano 5 ml 5M MH3 aq i całość sonikowano dodatkowo 30 min przy tych samych warunkach, cały czas przedmuchując argonem. pH mieszaniny po syntezie wyniosło ok. 10. Ciągła sonikacja układu prowadziła do wzrostu temperatury łaźni do ok. 40°C pod koniec procesu. Otrzymaną zawiesinę przefiltrowano przez filtry strzykawkowe o porach 0,2 μm. W celu oczyszczenia zawiesiny pokrytych nanocząstek tlenku żelaza z pozostałości reagentów zastosowano chromatografię magnetyczną. Na kolumnę wypełnioną wełną stalową (ferromagnetyczna), do której przyłożono magnesy neodymowe, wprowadzono 5 ml zawiesiny. Na wypełnieniu kolumny osadziły się nanocząstki, które przemyto 3 ml wody dejonizowanej. Po usunięciu magnesów, wypłukano kolumnę wodą dejonizowaną, zbierając oczyszczone nanocząstki.

P r z y k ł a d 2. Synteza superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych chitozanem modyfikowanym kationowo z wykorzystaniem sonikacji impulsowej z chłodzeniem.

Postępowano analogicznie jak w przykładzie 1 z tą różnicą, że zastosowano sonikację impulsową (impuls o długości 1 s co 5 s) oraz chłodzenie układu lodem (temperatura stała w trakcie procesu ok. 20°C) w łaźni ultradźwiękowej.

PL 227 182 B1

P r z y k ł a d 3. Synteza superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych chitozanem modyfikowanym kationowo z wykorzystaniem sonikacji ciągłej z chłodzeniem.

Postępowano jak w przykładzie 1 z tą różnicą, że zastosowano sonikację ciągłą z chłodzeniem układu jak w przykładzie 2.

P r z y k ł a d 4. Synteza superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych chitozanem modyfikowanym kationowo z wykorzystaniem mieszadła mechanicznego.

Postępowano jak w przykładzie 1 z tą różnicą, że zastosowano mieszanie układu przy użyciu mieszadła mechanicznego (mieszadło mechaniczne EUROSTAR powercontrol-visc P1 firmy IKA-WERKE) zamiast sonikacji. Mieszanie wykonywano przy prędkości 300 obr./min.

P r z y k ł a d 5. Synteza superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych chitozanem modyfikowanym kationowo z wykorzystaniem sonikacji impulsowej z chłodzeniem i zastosowaniem większego stężenia polimeru.

Postępowano jak w przykładzie 2 z tą różnicą, że zastosowano roztwór ChK o stężeniu 3 g/l w 0,1M NaCl.

P r z y k ł a d 6. Opłaszczenie przy użyciu karboksymetylochitozanu modyfikowanego anionowo trójtlenkiem siarki (ChA) nanocząstek pokrytych chitozanem modyfikowanym kationowo.

ml zawiesiny oczyszczonych superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza opłaszczonych chitozanem modyfikowanym kationowo z przykładu 2 poddano sonikacji przez 5 min. Wprowadzono 20 ml roztworu ChA o stężeniu 1 g/l w 0,1M NaCl i kontynuowano sonikację przez 10 min. Oczyszczono zawiesinę nanocząstek pokrytych ChA z nadmiaru polimeru i soli stosując chromatografię magnetyczną jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 7. Opłaszczenie przy użyciu chitozanu modyfikowanego kationowo nanocząstek otrzymanych jak w przykładzie 6, o ładunku powierzchniowym ujemnym.

ml zawiesiny oczyszczonych superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza opłaszczonych ChK, a następnie ChA z przykładu 6 poddano sonikacji przez 5 min. Następnie wprowadzono 10 ml roztworu ChK o stopniu podstawienia 56% i stężeniu 1 g/l w 0,1M NaCl, i kontynuowano sonikację jeszcze przez 10 min. Zawiesinę nanocząstek pokrytych ChK/ChA/ChK oczyszczono z nadmiaru polimeru i soli stosując chromatografię magnetyczną jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 8. Opłaszczenie przy użyciu heparyny nanocząstek pokrytych chitozanem modyfikowanym kationowo.

ml zawiesiny z przykładu 5 (do sporządzenia nanocząstek wykorzystano ChK o stopniu podstawienia 56%) sonikowano przez 5 min, stosując sonikację ciągłą. Następnie, cały czas kontynuując sonikację, wprowadzono 10 ml roztworu heparyny o stężeniu 3g/l w 0,2M NaCl. Tak powstałą mieszaninę sonikowano jeszcze 10 min, kontynuując sonikację ciągłą. Oczyszczono zawiesinę nanocząstek pokrytych heparyną z nadmiaru polimeru i soli stosując chromatografię magnetyczną jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 9. Opłaszczenie przy użyciu poli(chlorek N,N-dimetylo-N-4'-winylobenzylo-N-2-(perfluorooktanoilo-N'-metyloimino)etyloamoniowy)-co-(chlorek N,N,N-trimetylo-N-4'-winylobenzyloamoniowy) (AK-St-F) nanocząstek otrzymanych jak w przykładzie 6, o ładunku powierzchniowym ujemnym.

ml zawiesiny z przykładu 6 sonikowano przez 5 min, stosując sonikację ciągłą. Następnie, cały czas kontynuując sonikację, wprowadzono 10 ml roztworu AK-St-F o stężeniu 3 g/l w 0,2M NaCl. Tak powstałą mieszaninę sonikowano jeszcze 10 min, kontynuując sonikację ciągłą. Oczyszczono zawiesinę nanocząstek pokrytych AK-St-F z nadmiaru polimeru i soli stosując chromatografię magnetyczną jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 10. Oznaczanie żelaza w zawiesinie nanocząstek.

W celu oznaczenia zawartości żelaza w koloidach uzyskanych według procedury opisanej w przykładach 1-5 wykorzystano metodę spektrofotometryczną opartą na tworzeniu barwnych kompleksów żelaza(ll) z fenantroliną. 1 ml badanej próbki zadano 1 ml 1M HCl, podgrzewając w gorącej wodzie w celu roztworzenia nanocząstek tlenku żelaza. Następnie, w celu redukcji Fe(III) do Fe(II), dodano witaminę C w stosunku molowym 1:1 do teoretycznej zawartości żelaza w badanej próbce. W kolejnym etapie rozcieńczono roztwór 50-krotnie i odpipetowano 6,25 ml do kolby na 25 ml, do której dodano również 3 ml 0,2% roztworu wodzianu 1,10-fenantroliny w 0,08M HCl, po czym uzupełniono wodą dejonizowaną do kreski. Po 10 min zmierzono absorbancję roztworu przy długości fali X_max = 512 nm. Z otrzymanych wartości obliczono zawartość żelaza w otrzymanych koloidach (przykłady 1-5) na podstawie uprzednio wyznaczonej krzywej kalibracyjnej dla różnych stężeń Fe(ll).

PL 227 182 B1

Wyniki te wraz z wydajnością 5 otrzymywania superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza ilustruje Tabela 1.

T a b e l a 1

Koloid z przykładu	cFedośw [mg/ml]	cFeteor [mg/ml]	Wydajność syntezy [%]
1	0,189	0,920	20,5
2	0,220	0,915	24,0
3	0,019	0,918	2,1
4	0,159	0,916	17,4
5	0,365	0,915	39,9

P r z y k ł a d 11. Badanie stabilności koloidów w wodzie dejonizowanej.

Przed wykonaniem pomiarów potencjału zeta próbki koloidów sonikowano przez 5 min. Pomiary wykonano na przyrządzie Zetasizer Nano ZS firmy Malvern. Wyniki pomiarów potencjału zeta dla koloidów z przykładów 1-7 zebrano w Tabeli 2.

T a b e l a 2

Koloid z przykładu	Zeta-potencjał [mV]
1	51,2
2	47,3
3	47,0
4	49,3
5	41,8
6	-40,6
7	46,7

Roztwory koloidalne są stabilne, gdy wartości potencjałów zeta cząstek fazy rozproszonej są mniejsze od -30 mV lub większe od 30 mV. Z danych zgromadzonych w Tabeli 2 wynika, że w wyniku syntezy cząstek wg procedur opisanych w przykładach 1-7 uzyskano stabilne koloidy.

Cząstki koloidu uzyskanego jak w przykładzie 6 mają ujemny potencjał zeta, co świadczy o tym, iż zostały one pokryte polimerem anionowym co spowodowało zmianę ładunku powierzchniowego z dodatniego na ujemny. Natomiast cząstki koloidu z przykładu 7 posiadają dodatni potencjał zeta, co świadczy o całkowitym pokryciu polimerem kationowym i odwróceniu ładunku powierzchniowego z ujemnego na dodatni. Eksperyment ten dowodzi, iż opracowany został sposób pozwalający na łatwe, kontrolowane manipulowanie ładunkiem na powierzchni superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza poprzez adsorpcję przeciwnie naładowanych polielektrolitów.

P r z y k ł a d 12. Wyznaczanie rozmiarów rdzeni nanocząstek przy użyciu TEM.

W celu wyznaczenia wielkości nanocząstek koloidy uzyskane wg procedur opisanych w przykładach 2 i 6 poddano sonikacji przez 2 min. Następnie niewielkie objętości tych roztworów naniesiono na błonki węglowe i pod przykryciem pozostawiono do wyschnięcia. Natomiast w celu zobrazowania nanocząstek wykonanych wg procedury opisanej w przykładzie 5 (do syntezy próbki koloidu z przykładu 5 zastosowano w tym przypadku ChK o stopniu podstawienia 56%, który wyznaczono z widm magnetycznego rezonansu jądrowego) koloid ten poddano liofilizacji, a następnie wysuszone nanocząstki rozpuszczono w metanolu i sonikowano przez 2 min. Tak otrzymany preparat naniesiono na błonkę węglową i pod przykryciem pozostawiono do odparowania rozpuszczalnika. Pomiar wykonano przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego Tecnai G2 F20 (200kV) wyposażonego w działo z emisją połową FEG w jasnym polu oraz trybie wysokorozdzielczym (HREM). Zdjęcia koloidu z przykładu 2 przedstawiono na Fig. 2 i 3, koloid z przykładu 6 obrazuje Fig. 4, natomiast nanocząstki z przykładu 5 przedstawiono na Fig. 5 i 6. Na podstawie zdjęć wykonanych w trybie wysokorozdzielczym wyznaczono średnicę nanocząstek z przykładu 2, natomiast rozmiar superparamagnePL 227 182 B1 tycznych nanocząstek tlenku żelaza z przykładu 6 określono wykorzystując zdjęcia TEM w jasnym polu. Każdorazowo dokonano ok. 100 zliczeń wielkości nanocząstek. Wykresy obrazujące rozkład średnicy superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza przedstawiono na Fig. 7 i 8. Na poszczególnych figurach przedstawiono:

• TEM w jasnym polu nanocząstek z przykładu 2 na Fig. 2, • HREM nanocząstek z przykładu 2 na Fig. 3, • TEM w jasnym polu nanocząstek z przykładu 6 na Fig. 4, • TEM w jasnym polu nanocząstek z przykładu 5 w skali 50 nm na Fig. 5, • TEM w jasnym polu nanocząstek z przykładu 5 w skali 100 nm na Fig. 6, • Rozkład wielkości nanocząstek z przykładu 2 na Fig. 7, • Rozkład wielkości nanocząstek z przykładu 6 na Fig. 8.

Nanocząstki z przykładu 2 mają rozmiar 11,9 ± 1,7 nm, natomiast superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza z przykładu 6 charakteryzują się wielkością 10,1 ± 2,9 nm. Znaczny błąd pomiaru w przypadku nanocząstek z przykładu 6 wynika z tego, że zliczeń dokonywano ze zdjęć wykonanych w jasnym polu (mniej dokładnych), gdyż rodzaj próbki nie pozwolił na uzyskanie dobrych obrazów w wysokiej rozdzielczości. Jak można zauważyć z Fig. 5 i 6, zwiększenie ilości polimeru w trakcie współstrącania powoduje zmniejszenie wielkości powstających nanocząstek; na zdjęciach widoczne obiekty o rozmiarach mniejszych niż 10 nm. Agregaty widoczne na Fig. 2-6 powstały w wyniku wymuszonego procedurą pomiarową suszenia próbek procesu agregacji koloidów.

P r z y k ł a d 13. Wyznaczenie średnic hydrodynamicznych nanocząstek.

W celu wyznaczenia średnic hydrodynamicznych nanocząstek koloidy z przykładów 2, 6 i 7 poddano sonikacji przez 5 min. Pomiary wykonano na przyrządzie Zetasizer Nano ZS firmy Malvern wykorzystując dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) mierzone przy 173° w temperaturze 25°C. Uzyskane rezultaty przedstawiono na Fig. 9. Rozkłady wielkości średnic hydrodynamicznych nanocząstek w zawiesinie wodnej wskazują, iż nanocząstki z przykładu 2 oscylują wokół 80 nm, SPION z przykładu 6 wokół 70 nm, a SPION z przykładu 7-160 nm. W związku z wynikami z przykładu 10 można wnioskować, iż jedna nanocząstka utworzona jest z kilku rdzeni zbudowanych z tlenku żelaza o średnicach ok. 10-12 nm połączonych łańcuchem polimerowym.

P r z y k ł a d 14. Określenie struktury krystalograficznej nanocząstek.

Na podstawie zdjęć wykonanych w trybie wysokorozdzielczym nanocząstek z przykładu 2 wyznaczono strukturę krystalograficzną tlenku żelaza tworzącego superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza w syntezach opisanych w przykładach 1-6. Przykładowe zdjęcie przedstawiające płaszczyzny krystalograficzne uzyskane przy użyciu HREM dla koloidu z przykładu 2 zamieszczono na Fig. 10. Wyznaczenia odległości międzypłaszczyznowych dokonano również na podstawie transformaty Fouriera otrzymanych obrazów HREM dla przykładu 2. W Tabeli 3 zamieszczono uzyskane odległości międzypłaszczyznowe wraz z przypisanymi do nich płaszczyznami dla próbki z przykładu 2.

T a b e l a 3

Odległość międzypłaszczyznowa d zmierzona [A]	Odległość międzypłaszczyznowa d dla Fe3O4* [A]	Wskaźniki Millera dla płaszczyzny
4,82	4,85	111
3,06	2,97	220
2,58	2,53	311
2,80	2,81	221
1,68	1,71	422
1,55	1,56	423

* Na podstawie wyliczeń wynikających z parametrów komórki elementarnej dla a = 8,396 A

Fig. 10 przedstawia płaszczyzny (220) dla Fe3O4 (lidaa 2007). Odległości między płaszczyznami krystalograficznymi wynoszą 0,306 nm. Z danych zamieszczonych w Tabeli 3 wynika, iż współstrącanie jonów żelaza(II) i żelaza(III) z chitozanem modyfikowanym kationowo nie zmienia struktury krystalograficznej otrzymanego Fe3O4.

PL 227 182 B1

P r z y k ł a d 15. Określenie rodzaju oddziaływań polimeru z powierzchnią nanocząstek.

Aby określić sposób wiązania polimeru z tlenkiem żelaza wykonano widma w podczerwieni dla próbek z przykładów 2 i 5. Płytkę szklaną z warstwą odbijającą (szkło MirrIR firmy Kevley Technologies) przemyto etanolem, a następnie naniesiono na nią po 20 kropel zawiesiny nanocząstek z przykładów 2 i 5 (w różnych miejscach) odczekując po każdej kropli aż rozpuszczalnik odparuje. Widma IR nanocząsteczek zilustrowane na Fig. 11 (linia B dla nanocząsteczek z przykładu 5 i C dla nanocząsteczek z przykładu 2) zbierano w trybie transrefleksji na spektrometrze FT-IR Varian 670. Widmo IR czystego chitozanu modyfikowanego kationowo (Fig. 11 linia A) uzyskano badając pastylkę z KBr na spektrometrze z transformatą Fouriera EQUINOX 55 firmy Bruker.

Z widm na Fig. 11 wynika, że pasmo przy 1601 cm^-1, przypisane drganiom l-rzędowej grupy aminowej, zanika dla nanocząstek z przykładów 2 i 5. Wskazuje to na chelatację jonów żelaza z nanocząstek przez grupy aminowe polimeru (Wang 2008). Następuje również przesunięcie pasma drgań -1 -1 rozciągających C-O przy 1114 cm^- (ChK) do 1068 cm^- (przykłady 2 i 5), co wskazuje na występowanie oddziaływań także grupy hydroksylowej przy węglu C₃ z nanocząstkami magnetytu (Hemάndez 2009).

P r z y k ł a d 16. Obrazowanie właściwości magnetycznych nanocząstek.

W celu zobrazowania właściwości magnetycznych superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza wykonano pomiary przy użyciu mikroskopii sił magnetycznych. W tym celu wafel krzemowy pocięto na płytki, które umieszczono w roztworze będącym mieszaniną stęż. H2SO4 oraz 30% H2O2 w stosunku objętościowym 1:1 na 30 min w celu ich oczyszczenia. Płytki opłukano dużą ilością wody destylowanej i wysuszono w strumieniu argonu. Koloid z przykładu 2 sonikowano przez 5 min, a następnie rozcieńczono 10-krotnie. 10 μΐ tak przygotowanej próbki naniesiono na wspomniane wyżej płytki, pozostawiono na 15 min., a następnie wysuszono w strumieniu argonu. Pomiar wykonywano przy użyciu mikroskopu sił atomowych zaopatrzonego w kontroler NanoScope IVA (Bruker, USA), wykorzystując ostrze krzemowe pokryte warstwą magnetyczną Co/Cr (Bruker). Pomiaru dokonano w trybie oscylacyjnym (tzw. „tappingmode”) z zastosowaniem trybu tzw. „lift mode” przy obrazowaniu właściwości magnetycznych. Uzyskane zdjęcia z mikroskopu sił magnetycznych dla koloidu z przykładu 2 przedstawiono na Fig. 12 (od lewej: topografia, obrazowanie fazowe, obrazowanie sił magnetycznych). Pomiary magnetyczne wykonano dla różnych odległości pomiędzy ostrzem a badaną próbką (1-75 nm, 2-50 nm, 3-25 nm).

Z Fig. 12 wynika, że koloid z przykładu 2 wykazuje właściwości magnetyczne. Świadczą o tym zmiany kontrastu na zdjęciach po prawej stronie wynikające ze zmniejszania odległości pomiędzy ostrzem a próbką (odległość oddziaływania). Oddziaływania magnetyczne są oddziaływaniami dalekiego zasięgu, dlatego są obserwowane nawet przy dużych odległościach ostrze-próbka (1 na Fig. 12 po prawej stronie). Agregaty obserwowane na zdjęciach powstają w wyniku działania tzw. sił kapilarnych w trakcie suszenie płytki.

P r z y k ł a d 17. Pomiar podatności magnetycznej nanocząstek.

Celem zbadania podatności magnetycznej koloid z przykładu 2 umieszczono w pojemniku Lake ShoreCryotronics Inc. o symbolu 700 SC-10 i poddano badaniom. Składową rzeczywistą podatności magnetycznej jako funkcji zmiennoprądowego pola magnetycznego mierzono przy częstotliwości 189 Hz na nanowoltomierzu Stanford SR 830. Podatność magnetyczna w funkcji temperatury została przedstawiona na Fig. 13 w postaci wykresu zależności składowej rzeczywistej podatności magnetycznej od temperatury dla koloidu z przykładu 2.

Podatność magnetyczna zobrazowana na Fig. 13 ma wartość w przybliżeniu stalą równą ₃

1,4 cm³/g. Dodatnia wartość podatności wskazuje, iż nanocząstki zbudowane są z paramagnetyku.

P r z y k ł a d 18. Pomiary magnetyzacji nanocząstek.

W celu wyznaczenia zależności magnetyzacji (M) od indukcji pola magnetycznego (μ₀Η) koloid z przykładu 2 umieszczono w pojemniku Lake ShoreCryotronics Inc. o symbolu 700 SC-10 i poddano badaniom. Do pomiaru wykorzystano kontroler magnetometru wibracyjnego Lake Shore Model 7300. Próbkę termostatowano w temperaturze 200 K za pomocą kriostatu przepływowego Janis. Wykres powyższej zależności przedstawiono na Fig. 14 (zależność magnetyzacji od indukcji pola magnetycznego dla koloidu z przykładu 2).

Fig. 14 przedstawia typową zależność M=f^₀H) dla substancji superparamagnetycznych. Nie jest obserwowana ani zależność liniowa (paramagnetyki) ani nie występuje histereza charakterystyczna dla substancji ferromagnetycznych. Otrzymana wartość magnetyzacji nasycenia 123 ±12 emu/g Fe jest bliska wartości mierzonej dla magnetytu (Jung 1995), a biorąc pod uwagę całkowitą

PL 227 182 B1 masę opłaszczonych nanocząstek wartość ta wynosi 61 ± 6 emu/g, co jest porównywalne z wartościami zmierzonymi dla podobnych superparamagnetycznych nanocząstek (lidaa 2007).

P r z y k ł a d 19. Wyznaczanie relaksacyjności koloidalnych roztworów nanocząstek.

Pomiarom poddano odpowiednio rozcieńczone wodą dejonizowaną próbki koloidów z przykładów 2, 5 i 6 oraz FeREX-u, komercyjnego środka kontrastowego. Pomiary czasów relaksacji T1 i T2 przeprowadzono na doświadczalnym tomografie magnetycznego rezonansu z horyzontalnym magnesem nadprzewodzącym MR 4,7 T firmy Bruker. W celu uzyskania wartości relaksacyjności r1 i r2 dla poszczególnych koloidów wykorzystano poniższe zależności:

7?ι—/?ι + ij c_Fl, R₂ — R₂ + r₂ · c_Fe gdzie: R1 (R2) - stopień relaksacji podłużnej (poprzecznej);

T1 (T2) - czas relaksacji podłużnej (poprzecznej);

R1⁰ (R2⁰) - stopień relaksacji podłużnej (poprzecznej) dla próbki bez środka kontrastowego;

r1 (r2) - relaksacyjność dla relaksacji podłużnej (poprzecznej);

CFe - stężenie żelaza w badanym środku kontrastowym.

Wyniki zamieszczono w Tabeli 4 przedstawiającej relaksacyjności koloidów z przykładów 5 i 6 oraz FeREX-u.

T a b e l a 4

	CFe^g/ml]	T1 [ms]	T2 [ms]	R1 [1/s]	R2 [1/s]	r1 [s'¹ (pg/ml) ^-1]	r2[s'¹ ^g/ml)'¹]
Woda dejonizowana	0	3945,535	3367,175	0,253	0,297
	2,20	2905,722	106,471	0,344	9,392
Koloid z przykładu 2	1,10	3355,022	336,797	0,298	2,969	0,036 ± 0,008	4,1 ± 0,7
	0,22	3476,840	1071,545	0,288	0,933
	3,65	2676,982	116,599	0,374	8,576
Koloid z przykładu 5	1,82	3135,589	279,195	0,319	3,582	0,031 ± 0,003	2,3 ± 0,2
	0,36	3530,280	1385,030	0,283	0,722
Koloid z przykładu 6	3,02 0,60	2932,147 3564,371	49,522 241,697	0,341 0,281	20,193 4,137	0,028 ± 0,003	6,60 ± 0,05
	2,53	2948,600	150,322	0,339	6,652
FeREX	1,26	3277,343	236,700	0,305	4,225	0,035 ± 0,003	2,5 ± 0,3
	0,25	3818,088	898,820	0,262	1,113

Na podstawie uzyskanych wartości relaksacyjności r1 oraz r2 można wnioskować o przydatności otrzymanych nanocząstek jako kontrastów w pomiarach MRI. Im większa wartość r2 dla danego koloidu, przy podobnej wartości r1 do komercyjnego FeREX-u, tym większe wzmocnienie kontrastu (zaciemnienie pola) w obrazowaniu rezonansem magnetycznym. Uzyskane koloidy w przykładach 2 i 6 wykazują zatem znacznie lepsze właściwości magnetyczne niż badany komercyjny środek kontrastowy.

P r z y k ł a d 20. Wpływ nanocząstek na koagulację erytrocytów.

W celu zbadania oddziaływania koloidów z przykładów 2 i 6 z krwią ludzką na szkiełka podstawowe nakroplono po 4 μl krwi oraz 18 μl odpowiedniego koloidu. Po wymieszaniu nakryto preparaty szkiełkiem nakrywkowym i obserwowano pod mikroskopem optycznym ECLIPSE LV100D firmy Nikon.

PL 227 182 B1

Otrzymane obrazy przedstawiono na Fig. 15-17. Fig. 17 przedstawia samą krew ludzką (a) oraz agregaty powstałe z erytrocytów (b), jako wzorce dla badanych koloidów. Fig. 15 przedstawia koloid z przykładu 6 z krwią, natomiast na Fig. 16 przedstawiono koloid z przykładu 2 (a) bez rozcieńczania, (b) 10-krotnie rozcieńczony, (c) 100-krotnie rozcieńczony, (d) 1000-krotnie rozcieńczony z krwią.

Na podstawie poczynionych obserwacji można wnioskować o możliwym zastosowaniu biologicznym koloidów z przykładów 2 i 6. Koloid z przykładu 2 należy przed podaniem rozcieńczyć, aby uniknąć agregacji erytrocytów. Natomiast koloid z przykładu 6 można stosować nawet w stężonych dawkach, gdyż nie obserwuje się agregatów erytrocytów. Karboksymetylochitozan modyfikowany anionowo trójtlenkiem siarki dobrze związany z powierzchnią nanocząstek o ładunku dodatnim (superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza pokryte chitozanem modyfikowanym kationowo) zapewnia odwrócenie ładunku powierzchniowego na ujemny, a tym samym większą zgodność biologiczną z krwią ludzką.

P r z y k ł a d 21. Wyznaczanie zawartości polimeru w nanocząstkach.

W celu zbadania zawartości ChK we współstrącanych nanocząstkach tlenku żelaza próbki koloidów z przykładów 2 i 5 (do syntezy próbki koloidu z przykładu 5 zastosowano w tym przypadku ChK o stopniu podstawienia 56%) poddano liofilizacji. Tak otrzymane proszki umieszczono w platynowych naczynkach, a te w analizatorze termograwimetrycznym Netzsch STA 449 F1 Jupiter. Pomiar prowadzono w temperaturach 23-81°C z szybkością przyrostu 10°C/min. w atmosferze argonu. Termogramy zarejestrowane dla czystego chitozanu modyfikowanego kationowo oraz nanocząstek z przykładów 2 i 5 przedstawiono na Fig. 18, 19, 20:

• Termogram dla czystego ChK na Fig. 18, • Termogram dla nanocząstek z przykładu 2 na Fig. 19, • Termogram dla nanocząstek z przykładu 5 na Fig. 20.

Z termogramu na Fig. 18 wynika, że w badanych warunkach ubytek masy dla czystego ChK wynosi 93%. Dla próbki z przykładu 2 ubytek masy związany z rozkładem ChK wynosi 30% (Fig. 19), natomiast dla próbki z przykładu 5 wynosi 11% (Fig. 20). Na tej podstawie wyznaczono zawartość ChK w próbkach koloidów z przykładów 2 i 5, otrzymując następujące wartości:

• nanocząstki z przykładu 2 zawierają 32% ChK (0,3/0,93=0,32), • nanocząstki z przykładu 5 zawierają 12% ChK.

Chociaż do syntezy superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza z ChK użyto w przykładzie 5 roztworu o większym stężeniu ChK, jego zawartość w układzie jest mniejsza niż przy zastosowaniu niższego stężenia. Należy jednak pamiętać, iż w tym konkretnym przypadku dla koloidu z przykładu 5 zastosowano polimer o innym stopniu podstawienia grupami amoniowymi, co wpłynęło znacząco na właściwości produktu końcowego.

P r z y k ł a d 22. Nanocząstki tlenku żelaza z przyłączoną do powierzchni sondą fluorescencyjną.

ml zawiesiny z przykładu 5 (do sporządzenia nanocząstek wykorzystano ChK o stopniu podstawienia 56%) wymieszano z 2 ml roztworu fluoreskaminy w acetonie o stężeniu 1 mg/ml. Po 15 min usunięto aceton przedmuchując mieszaninę gazem obojętnym. Następnie oczyszczono nanocząstki stosując chromatografię magnetyczną. W celu potwierdzenia sfunkcjonalizowania dodatnio naładowanej powierzchni SPION sondą fluorescencyjną, którą jest fluoreskamina, zawiesinę oczyszczonych nanocząstek odpowiednio rozcieńczono wodą dejonizowaną. Następnie wykonano widma wzbudzenia (X_em = 500 nm; Fig. 21A) i emisji (X_ex = 395 nm; Fig. 21B) na spektrofluorymetrze LS 55 firmy PerkinElmer.

Na Fig. 21 widoczne są charakterystyczne pasma dla produktu reakcji fluoreskanimy z pierwszorzędowymi grupami aminowymi, które w swej strukturze zawiera ChK, co potwierdza otrzymanie SPION o ładunku powierzchniowym dodatnim sfunkcjonalizowanych sondą fluorescencyjną.

P r z y k ł a d 23. Obserwacja in vivo wpływu nanocząstek tlenku żelaza z przykładu 5 (stopień podstawienia 56%) i 6 na przykładzie wątrobowych map czasu relaksacji T2.

Po umieszczeniu w skanerze myszy BALB/c wykonano pomiar A (Fig. 22). Następnie podano nanocząstki z przykładu 6 w dawce 0,55 mg/kg w 5% roztworze glukozy i wykonano pomiar B (Fig. 22). Po ok. 12 min. podano nanocząstki z przykładu 5 (stosowano ChK o stopniu podstawienia 56%) w dawce 0,55 mg/kg w 5% roztworze glukozy i wykonano pomiar C (Fig. 22). Nanocząstki podawano przez cewnik założony do tętnicy udowej. Do pomiaru użyto sekwencji MSME, TE = 4 ms, TR = 1500 ms, efektywny TR to ok. 2000 ms - co drugi oddech, podwójne bramkowanie, FOV = 22x22 mm, MTX 128x128.

PL 227 182 B1

Jak można zauważyć, każda następna mapa czasu relaksacji T2 obrazuje czas T2 przy niższej wartości. Można zatem wnioskować, iż otrzymane wg przykładów 5 i 6 nanocząstki tlenku żelaza zachowują się w układach in vivo jak środki kontrastowe skracające czas relaksacji T2.

Bibliografia

Agnihotri, S.A., Mallikarjuna, N.N., Aminabhavi, T.M. (2004). Journal of Controlled Release, 100, 5-28.

Bulwan, M., Zapotoczny, S., Nowakowska, M. (2009). Soft Matter, 5, 4726-4732.

Cho, J., Grant, J., Piquette-Miller, M., Allen, C. (2006). Biomacromolecules, 7, 2845-2855. Geraldes, C.F.G.C. S., Laurent, C.F.G.C. (2009). Contrast Media Mol. Imaging, 4, 1-23.

Gupta, A.K., Gupta, M. (2005). Biomaterials, 26, 3995-4021.

Hemάndez, R., Zamora-Mora, V., Sipaja-Ballestero, M., Vega-Baudrit, J., López, D., Mijangos, C.

(2009). Journal of Colloid and Interface Science, 339, 53-59.

lidaa, H., Takayanagia, K., Nakanishib, T., Osakaa, T. (2007). Journal of Colloid and Interface

Science, 314, 274-280.

Jung, C.W., Jacobs, P. (1995). Magnetic Resonance Imaging, 13, 661-674.

Kwak, S., Lafleur, M. (2003). Macromolecules, 36, 3189-3195.

Laurent, S., Forge, D., Port, M., Roch, A., Robic, C., Vander Elst, L., Muller, R.N. (2008).

Chemical Reviews, 108, 2064-2110.

Tartaj, P., del Puerto Morales, M., Veintemillas-Verdaguer, S., Gonzάlez-Carreńo, T., Serna, C.J. (2003). Journal of Physics D: Applied Physics, 36, R182-R197.

Tartaj, P., Morales, M.P., Gonzalez-Carreńo, T., Veintemillas-Verdaguer, S., Serna, C.J. (2005).

Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 290-29, 28-34.

Teja, A.S., Pei-Yoong Koh (2009). Progress in Crystal Growth and Characterization of Materials, 55, 22-45.

Wang, Y., Li, B., Zhou, Y., Jia, D. (2008). Polymers for Advanced Technologies, 19, 1256-1261. Yuan, Q., Venkatasubramanian, R., Hein, S., Mistra, R.D.K. (2008). ActaBiomaterialia, 4, 1024-1037.

Claims

1. Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza z ultracienkimi powłokami polimerowymi, znamienne tym, że składają się one z: superparamagnetycznych rdzeni z tlenków żelaza optaszczonych polikationem, oraz z hydrofitowej powłoki zbudowanej z przynajmniej jednej dodatkowej w stosunku do tej pierwszej otrzymywanej w wyniku współstrącania ultracienkiej powłoki polielektrolitu, przy czym pierwsza/pierwotna ultracienka powłoka polielektrolitu, i kolejne nieparzyste powłoki, nałożone na powierzchnię otrzymanych nanocząstek, składają się z polikationu, a średnia wielkość nanocząstek tlenku żelaza z ultracienkimi powłokami polimerowym wynosi 5-200 nm i/lub średnica rdzenia z tlenku żelaza wnosi 5-20 nm i/lub grubość polimerowej powłoki wynosi 0,1-100 nm.

2. Superparamagnetyczne nanocząstki według zastrz. 1, znamienne tym, że polikation wybrany jest z grupy obejmującej naturalne lub modyfikowane polisacharydy zawierające dodatnio naładowane grupy, takie jak: amoniowe, pirydyniowe czy fosfoniowe.

3. Superparamagnetyczne nanocząstki według zastrz. 2, znamienne tym, że polikation to chitozan modyfikowany kationowymi grupami amoniowymi.

4. Superparamagnetyczne nanocząstki według zastrz. 1, znamienne tym, że druga ultracienka powłoka polielektrolitu i kolejne parzyste powłoki składają się z polianionu.

5. Superparamagnetyczne nanocząstki według zastrz. 4, znamienne tym, że polianion to polimer z grupy obejmującej naturalne lub modyfikowane polisacharydy zawierające ujemnie naładowane grupy funkcyjne, takie jak: sulfonowe, siarczanowe, karboksylowe czy fosforanowe.

6. Superparamagnetyczne nanocząstki według zastrz. 4 lub 5, znamienne tym, że polianion to polimer stanowiący pochodną anionową chitozanu lub heparyna.

7. Superparamagnetyczne nanocząstki według zastrz. 6, znamienne tym, że polimer stanowiący pochodną anionową chitozanu to karboksymetylochitozan modyfikowany kompleksem trójtlenku siarki.

PL 227 182 B1

8. Superparamagnetyczne nanocząstki według zastrz. 1, znamienne tym, że nanocząstki tworzą zawiesinę w fazie wodnej.

9. Superparamagnetyczne nanocząstki według zastrz. 1, znamienne tym, że powłoka hydrofilowa jest funkcjonalizowana poprzez dołączenie do niej sondy fluorescencyjnej.

10. Superparamagnetyczne nanocząstki według zastrz. 1, znamienne tym, że powłoki polielektrolitu posiadające grupy fluorowane stanowi poli(chlorek N,N-dimetylo-N-4'-winylobenzylo-N-2-(perfluorooktanoilo-N'-metyloimino)etyloamoniowy)-co-(chlorek N,N,N-trimetylo-N-4'-winylobenzyloamoniowy).

11. Sposób wytwarzania superparamagnetycznych nanocząstek według zastrz. od 1 do 10, znamienny tym, że wodny roztwór kationowego polisacharydu stanowiącego amoniową po₃ chodną chitozanu w stężeniu 0,1-10 g/dm³ łączy się z chlorkami żelaza(II) i żelaza(III) ₃ do osiągnięcia stężenia jonów żelaza 0,001-0,500 mol/dm³, a następnie przedmuchuje się argonem i miesza w temperaturze 10-60°C, a następnie łączy się z amoniakiem do osiągnięcia przez mieszaninę pH większego niż 8, w którym następuje strącenie superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza o trwałym ładunku dodatnim przy jednoczesnym przedmuchiwaniu mieszaniny argonem i mieszaniu, a po oczyszczeniu powierzchnię superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza o ładunku powierzchniowym dodatnim można pokryć przynajmniej jedną powłoką przeciwnie naładowanego polielektrolitu.

₃

12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stężenie polisacharydu wynosi 0,5-5 g/dm³.

13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że sole żelaza(II) i żelaza(III) stosuje się w stosunku molowym równym 1:2.

14. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stężenie jonów żelaza wynosi 0,002-0,200 mol/dm³.

15. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że roztwór kationowego polisacharydu zawierający jony żelaza łączy się z zasadą do osiągnięcia przez mieszaninę pH większego niż 9.

16. Zastosowanie superparamagnetycznych nanocząstek określonych w zastrz. od 1 do 10 lub wytworzonych sposobem określonym w zastrz. od 11 do 15, jako środka kontrastowego w obrazowaniu rezonansem magnetycznym i/lub obrazowaniu fluorescencyjnym i/lub mikroskopii fluorescencyjnej.