PL227253B1

PL227253B1 - Method for producing butane-2,3-diol

Info

Publication number: PL227253B1
Application number: PL412465A
Authority: PL
Inventors: Aneta Białkowska; Ewa Gromek; Halina Kalinowska; Celina Kubik; Barbara Sikora; Mirosława Szczęsna-Antczak; Mirosława Szczesna-Antczak; Marianna Turkiewicz; Marzena Jędrzejczak-Krzeptowska; Marzena Jedrzejczak-Krzeptowska
Original assignee: Politechnika Łódzka
Priority date: 2015-05-25
Filing date: 2015-05-25
Publication date: 2017-11-30
Also published as: PL412465A1

Abstract

Sposób wytwarzania 2,3-butanodiolu(2,3-BD) drodze hodowli unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożu zawierającym źródło węgla, polega na tym, że stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii sporządzony z mieszaniny roztworu wodnego alkoholu poliwinylowego zawierającego alginian sodu oraz zawiesiny komórek bakterii, którą po odpowietrzeniu pod próżnią, wkrapla się do roztworu wodnego chlorku wapnia. Następnie utworzone sferyczne formy żelu wprowadza się do roztworu wodnego aldehydu glutarowego i w końcu otrzymany żel przenosi się do roztworu wodnego glicyny. Natomiast hodowlę unieruchomionych komórek bakterii prowadzi się w podłożu zawierającym hydrolizat enzymatyczny wysłodków buraczanych lub hydrolizat wytłoków jabłkowych, ekstrakt drożdżowy, chlorek amonu. Odmiana sposóbu wytwarzania 2,3-BD w drodze hodowli unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożu zawierającym źródło węgla, polega także na tym, że stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii sporządzony z mieszaniny roztworu wodnego alkoholu poliwinylowego zawierającego alginian sodu oraz zawiesiny komórek bakterii, którą, po odpowietrzeniu pod próżnią, wkrapla się do schłodzonego oleju, następnie kilkakrotnie zamraża i rozmraża. Natomiast hodowlę unieruchomionych komórek bakterii prowadzi się w podłożu zawierającym melasę buraczaną lub hydrolizat wytłoków jabłkowych, ekstrakt drożdżowy, chlorek amonu, z dokarmianiem czystą glukozą dodawaną w trakcie hodowli. Hydrolizaty enzymatyczne wysłodko w buraczanych lub wytłoków jabłkowych otrzymuje się w wyniku działania na wysłodki lub wytłoki wieloenzymowym preparatem z Aspergillus niger IBT 90.The method of producing 2,3-butanediol (2,3-BD) by culturing an immobilized bacterial strain of Bacillus licheniformis NCIMB 8059 in a medium containing a carbon source consists in using a preparation of the immobilized bacterial strain prepared from a mixture of an aqueous solution of polyvinyl alcohol containing sodium alginate and a suspension of bacterial cells, which, after deaerating under vacuum, is added dropwise to an aqueous solution of calcium chloride. Then, the formed spherical gel forms are introduced into an aqueous solution of glutaraldehyde and finally the obtained gel is transferred to an aqueous solution of glycine. However, the cultivation of immobilized bacterial cells is carried out in a medium containing enzymatic hydrolyzate of beet pulp or apple pomace hydrolyzate, yeast extract, and ammonium chloride. A variation of the method of producing 2,3-BD by culturing an immobilized bacterial strain of Bacillus licheniformis NCIMB 8059 in a medium containing a carbon source also involves the use of a preparation of an immobilized bacterial strain prepared from a mixture of an aqueous solution of polyvinyl alcohol containing sodium alginate and a suspension of bacterial cells. , which, after deaerating under vacuum, is added dropwise to the cooled oil, then frozen and thawed several times. However, the culture of immobilized bacterial cells is carried out in a medium containing beet molasses or apple pomace hydrolyzate, yeast extract, ammonium chloride, with pure glucose added during the culture. Enzymatic hydrolysates of beet pulp or apple pomace are obtained by treating the pulp or pomace with a multi-enzyme preparation from Aspergillus niger IBT 90.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 2,3-butanodiolu (2,3-BD) w hodowli unieruchomionych komórek bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059.The present invention relates to a method of producing 2,3-butanediol (2,3-BD) in the culture of immobilized cells of Bacillus licheniformis NCIMB 8059 bacteria.

Znaną metodą immobilizowania enzymów i mikroorganizmów jest ich pułapkowanie w materiale polimerowym. W tym celu często używane są: agar, karagen, poliakryloamid, alkohol poliwinylowy (PVA) i światłoutwardzalne polimery. Szczególnie żele PVA wyróżniają się dużą trwałością i elastycznością.A known method of immobilizing enzymes and microorganisms is to trap them in a polymeric material. For this purpose, agar, carrageenan, polyacrylamide, polyvinyl alcohol (PVA) and light-cured polymers are often used. PVA gels in particular are distinguished by high durability and flexibility.

Z opisu patentowego US 5034324 i opisu zgłoszenia patentowego EP 0303122 jest znany sposób wytwarzania sferycznych, uwodnionych kriożeli zawierających unieruchomione mikroorganizmy, polegający na wkraplaniu mieszaniny zawierającej roztwór PVA, roztwór alginianu sodu i zawiesinę komórek bakterii do roztworu CaCl2, a następnie poddaniu utworzonych sferycznych form najlepiej trzem cyklom zamrażania/rozmrażania. Temperatura zamrażania nie powinna być wyższa niż -5°C, a rozmrażania - pokojowa.From the patent description US 5034324 and the patent application EP 0303122 there is known a method of producing spherical, hydrated cryogels containing immobilized microorganisms, consisting in dropping a mixture containing PVA solution, sodium alginate solution and bacterial cell suspension into a CaCl2 solution, and then subjecting the formed spherical forms to preferably three freeze / thaw cycles. Freezing temperature should not be higher than -5 ° C, and for defrosting - room temperature.

W czasopiśmie Biomolecular Engineering (2001) 17, 55-63 opisano sposób przygotowania unieruchomionych w sferycznym kriożelu PVA komórek Bacillus subtilis, wykorzystywanych do wytwarzania proteinazy serynowej, polegający na wkraplaniu zawiesiny bakterii w roztworze PVA z dodatkiem alginianu sodu lub celulozy bakteryjnej do oziębionego oleju roślinnego, a następnie kilkakrotne zamrażanie i rozmrażanie całego układu.The Biomolecular Engineering (2001) 17, 55-63 journal describes a method of preparing Bacillus subtilis cells immobilized in PVA spherical cryogel, used for the production of serine proteinase, by dripping a bacterial suspension in PVA solution with sodium alginate or bacterial cellulose into chilled vegetable oil, and then freezing and thawing the entire system several times.

W czasopiśmie Biotechnology Techniques (1997) 11(2), 67-70 ujawniono sposób immibilizacji enzymów w nośniku sferycznym otrzymywanym na bazie PVA sieciowanego aldehydem glutarowym (GA). W sposobie tym prawdopodobnie jedna grupa karbonylowa GA łączy się z dwiema grupami - OH PVA tego samego łańcucha, a druga wchodzi w taką samą reakcję z sąsiednim łańcuchem tworząc sieć lub kowalencyjnie wiąże się z grupą aminową materiału biologicznego (białka, komórki). Pozostające wolne grupy karbonylowe GA były blokowane glicyną.The journal Biotechnology Techniques (1997) 11 (2), 67-70 discloses a method of immobilizing enzymes in a spherical support prepared on the basis of PVA cross-linked with glutaraldehyde (GA). In this method, probably one GA carbonyl group combines with two groups - OH PVA of the same chain, and the other reacts in the same way with an adjacent chain to form a network or covalently binds to the amino group of biological material (proteins, cells). The remaining GA free carbonyl groups were blocked with glycine.

Znane jest wytwarzanie 2,3 butanodiolu (2,3-BD) w drodze hodowli komórek drobnoustrojów unieruchomionych w karagenie, alginianie wapnia, żelu LentiKats. Biożele LentiKats otrzymuje się z 10% PVA przez wkraplanie roztworu polimer/biokatalizator na odpowiednią powierzchnię, a następnie kontrolowane odparowanie.It is known to produce 2,3-butanediol (2,3-BD) by culturing microbial cells immobilized in carrageenan, calcium alginate, LentiKats gel. LentiKats biogels are prepared with 10% PVA by dropping a polymer / biocatalyst solution onto a suitable surface followed by controlled evaporation.

W czasopiśmie Journal of Fermentation Technology (1980) 58(2), 123-127 opisano produkcjęProduction is described in the Journal of Fermentation Technology (1980) 58 (2), 123-127

2,3-BD w drodze hodowli unieruchomionych w karagenie komórek bakterii Enterobacter aerogenes na podłożu zawierającym glukozę. Po 24 godzinach hodowli na podłożu zawierającym 50 g/l glukozy stężenie 2,3-BD wynosiło 11 g/l.2,3-BD by culturing carrageenan cells of Enterobacter aerogenes bacteria on a glucose-containing medium. After 24 hours of cultivation in medium containing 50 g / L glucose, the concentration of 2,3-BD was 11 g / L.

Z czasopisma Enzyme Microbial Technology (1986) 8(7), 409-41 1 jest znany sposób ciągłej produkcji 2,3-BD w drodze hodowli komórek Klebsiella pneumoniae pułapkowanych w alginianie wapnia na podłożu z serwatką. Maksymalna produktywność wynosiła 2,3 g/1 • godzina.From the journal Enzyme Microbial Technology (1986) 8 (7), 409-41 1 there is known a method for the continuous production of 2,3-BD by culturing Klebsiella pneumoniae cells trapped in calcium alginate on a whey medium. The maximum productivity was 2.3 g / l • hour.

W czasopiśmie Annals of the New York Academy od Sciences (1984) 434(7), 454-458 ujawniono sposób wytwarzania 2,3-BD w drodze hodowli szczepu bakterii Enterobacter sp. immobilizowanego z wykorzystaniem alginianu wapnia, żelatyny, celulozy oraz nylonu, na podłożu zawierającym ksylozę. Podczas kolejnych dziesięciu 24-godzinnych hodowli w podłożu zawierającym 50 g/l ksylozy tworzyło się około 9 g/l 2,3-BD.The journal Annals of the New York Academy from Sciences (1984) 434 (7), 454-458 discloses a method of producing 2,3-BD by culturing a bacterial strain of Enterobacter sp. Immobilized using calcium alginate, gelatin, cellulose and nylon on xylose-containing medium. During the next ten 24-hour cultivations, approximately 9 g / L of 2,3-BD was formed in medium containing 50 g / L of xylose.

Z czasopisma Applied Microbiology and Biotechnology (2013) 97: 6715-6723 jest znany sposób wytwarzania 2,3-BD w drodze hodowli komórek bakterii Bacillus licheniformis i Paenibacillus polymyxa unieruchamionych na nośniku w postaci żelu LentiKats , na podłożu z glukozą w hodowlach okresowych trwających 86 godzin tworzyło się 72,6 g/l 2,3-BD na podłożu zawierającym 180 g/l glukozy, a w dokarmianych glukozą - 144,7 g/l po około 127 godzinach hodowli.From the journal Applied Microbiology and Biotechnology (2013) 97: 6715-6723 there is a known method of producing 2,3-BD by culturing cells of Bacillus licheniformis and Paenibacillus polymyxa bacteria immobilized on a LentiKats gel carrier on a glucose medium in batch cultures lasting 86 hours, 72.6 g / l of 2,3-BD was formed on the medium containing 180 g / l glucose, and in the fed with glucose - 144.7 g / l after about 127 hours of cultivation.

Najczęściej jako źródło węgla w podłożu do wytwarzania 2,3-BD stosuje się glukozę, a znaczący wzrost produkcji butanodiolu uzyskuje się w hodowlach z dokarmianiem.Glucose is most commonly used as the carbon source in the medium for the production of 2,3-BD, and a significant increase in the production of butanediol is achieved in fed cultures.

W celu obniżenia kosztów produkcji do podłoża wprowadza się bogate w cukry odpady przemysłu rolno-spożywczego.In order to reduce production costs, the agri-food industry wastes rich in sugar are introduced into the substrate.

W czasopiśmie Bioprocess Engineering (2000) 23, 613-620 ujawniono wykorzystanie surowej i odbarwionej melasy buraczanej, serwatki oraz hydrolizatów odpadów pochodzących z przerobu kukurydzy do produkcji 2,3-BD w drodze hodowli okresowej bakterii Enterobacter sp. NajwięcejThe Bioprocess Engineering (2000) 23, 613-620 journal discloses the use of raw and discolored beet molasses, whey and corn waste hydrolysates for the production of 2,3-BD by batch culture of Enterobacter sp.

2,3-BD tworzyło się w podłożach z hydrolizatem skrobi oraz serwatką - około 9 g/l, odpowiednio po 125 i 200 godzinach.2,3-BD was formed in the starch hydrolyzate and whey media - about 9 g / l after 125 and 200 hours, respectively.

PL 227 253 B1PL 227 253 B1

Z czasopisma Bioresource Technology (2003) 89: 125-131 jest znane zastosowanie hydrolizatów skrobi kukurydzianej do produkcji 2,3-BD w hodowli bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059.The use of corn starch hydrolysates for the production of 2,3-BD in the culture of Bacillus licheniformis NCIMB 8059 bacteria is known from the journal Bioresource Technology (2003) 89: 125-131.

W hodowli na podłożu zawierającym 30 g/l substratu produktywność wynosiła 0,58 g/l • godzina.When grown in a medium containing 30 g / l of substrate, the productivity was 0.58 g / l • hour.

Zaletą surowców stanowiących odpady przemysłu rolno-spożywczego jest obecność w nich czynników wzrostu, ale zawierają one również inhibitory, ograniczające możliwość wprowadzania ich do podłoży w wysokich stężeniach.The advantage of raw materials constituting waste from the agri-food industry is the presence of growth factors in them, but they also contain inhibitors, limiting the possibility of introducing them into the substrates in high concentrations.

W czasopiśmie Applied Microbiology and Biotechnology (2010) 87(3): 965-970) opisano wykorzystanie melasy z kolb kukurydzianych, będącej odpadem w procesie wytwarzania ksylitolu, do produkcji 2,3-BD w hodowli z dokarmianiem komórek Klebsiella pneumoniae. Maksymalne nagromadzenie 2,3-BD, 78,9 g/l, uzyskano po 61 godzinach procesu, przy produktywności 1,3 g/l • godzina i wydajności 81,4%.Applied Microbiology and Biotechnology (2010) 87 (3): 965-970) describes the use of waste corn cob molasses in the xylitol production process for 2,3-BD production in a fed culture with Klebsiella pneumoniae cells. The maximum accumulation of 2,3-BD, 78.9 g / l, was obtained after 61 hours of the process, with a productivity of 1.3 g / l • hour and a yield of 81.4%.

Znane jest, z czasopisma Process Biochemistry (2010) 45: 613-616, wykorzystanie kwasowego hydrolizatu kolb kukurydzianych w podłożu do produkcji 2,3-BD w hodowli z dokarmianiem tym hydrolizatem szczepu Klebsiella oxytoca ACCC 10370 W trakcie fermentacji trwającej 60 godzin zostało zużyte 71,7 g/l cukrów (w tym 58,4 g/l ksylozy), a nagromadzenie 2,3-BD wynosiło 35,7 g/l.It is known, from the journal Process Biochemistry (2010) 45: 613-616, the use of acid hydrolyzate of corn cobs in a medium for 2,3-BD production in culture with supplementation with this hydrolyzate of Klebsiella oxytoca strain ACCC 10370 During fermentation lasting 60 hours 71 was used 7 g / L sugars (including 58.4 g / L xylose) and the accumulation of 2,3-BD was 35.7 g / L.

W czasopiśmie Applied Microbiology and Biotechnology (1991) 34: 582-585, opisano proces produkcji 2,3-BD w hodowli z dokarmianiem szczepu Klebsiella oxytoca na podłożu z zatężonym i częściowo oczyszczonym sokiem z trzciny cukrowej, o stężeniu sacharozy 280 g/l. Po 49 godzinach hodowli nagromadzenie 2,3-BD wynosiło 118 g/l.In the journal Applied Microbiology and Biotechnology (1991) 34: 582-585, a 2,3-BD production process is described in a fed culture with Klebsiella oxytoca in a medium with concentrated and partially purified sugarcane juice with a sucrose concentration of 280 g / l. After 49 hours of cultivation, the accumulation of 2,3-BD was 118 g / L.

Wiadomo także, z czasopisma Zeitschrift far Naturforschung C. (2001) 56: (9-10): 787-91, że w hodowlach Klebsiella pneumoniae na podłożu zawierającym jedynie sok z trzciny cukrowej (180 g sacharozy/l) i fosforan amonowy, podczas 35-godzinnego procesu tworzyło się ponad 70 g/lIt is also known from the journal Zeitschrift far Naturforschung C. (2001) 56: (9-10): 787-91 that in cultures of Klebsiella pneumoniae on a medium containing only sugarcane juice (180 g sucrose / l) and ammonium phosphate, while During the 35 hour process, more than 70 g / l was formed

2,3-BD. Wynik ten był podobny do otrzymywanego na podłożu z glukozą, wzbogaconym wieloma składnikami odżywczymi.2,3-BD. This result was similar to that obtained on glucose medium, enriched with many nutrients.

W czasopiśmie Bioresource Technology (2010) 101: 1961-1967 opisano wytwarzanie 2,3-BD w hodowlach szczepu Serratia marcescens w podłożu zawierającym sacharozę i dokarmianym sacharozą. Po 42 godzinach hodowli uzyskano 139,92 g/l 2,3-BD przy produktywności 3,49 g/1 • godzina i wydajności 94,67%.Bioresource Technology (2010) 101: 1961-1967 describes the production of 2,3-BD in cultures of Serratia marcescens in a sucrose-containing medium fed with sucrose. After 42 hours of cultivation, 139.92 g / l of 2,3-BD was obtained with a productivity of 3.49 g / l • hour and a yield of 94.67%.

Jako alternatywne źródło sacharydów do produkcji 2,3-BD przez Klebsiella pneumoniae stosuje się także, zgodnie z informacją w czasopiśmie Bioresource Technology (2010) 101: 8342--8347, topinambur (Jerusalem artichoke) w formie mieszaniny hydrolizatu łodyg w połączeniu (w celu zwiększenia stężenia cukrów) z niehydrolizowanymi bulwami. Na podłożu tym tworzyło się 80,5 g/l 2,3 BD w czasie 68 godzin (produktywność 1,18 g /I • godzina).According to Bioresource Technology (2010) 101: 8342-8347, Jerusalem artichoke (Jerusalem artichoke) is also used as an alternative source of saccharides for the production of 2,3-BD by Klebsiella pneumoniae in the form of a stalk hydrolyzate mixture in combination (to sugar concentration) with non-hydrolyzed tubers. This medium produced 80.5 g / l 2.3 BD within 68 hours (productivity 1.18 g / l • hour).

W czasopiśmie Applied Microbiology and Biotechnology (1986) 25: 197-202 przedstawiono wykorzystanie soku z topinambura, bez hydrolizy zawartej w nim inuliny, do otrzymywania 2,3-BD w hodowli okresowej Paenibacillus polymyxa. Przy początkowym stężeniu cukru 160 g/l, po 55 godzinach hodowli uzyskiwano równą 44 g/l 2,3-BD (produktywność wynosiła 0,8 g/l • godzina).Applied Microbiology and Biotechnology (1986) 25: 197-202 describes the use of Jerusalem artichoke juice without hydrolysis of its inulin for the preparation of 2,3-BD in a Paenibacillus polymyxa batch culture. At an initial sugar concentration of 160 g / L, after 55 hours of cultivation, the yield was 44 g / L 2,3-BD (productivity was 0.8 g / L • hour).

W czasopiśmie Applied Microbiology and Biotechnology (2009) 84(4): 659-665 ujawniono wykorzystanie glicerolu jako źródła węgla w hodowlach Klebsiella pneumoniae, prowadzących do wytworzenia 2,3-BD. Otrzymywano 49,2 g/l 2,3-BD z 138,3 g/l glicerolu, w czasie 280 godzin.Applied Microbiology and Biotechnology (2009) 84 (4): 659-665 discloses the use of glycerol as a carbon source in cultures of Klebsiella pneumoniae, leading to the production of 2,3-BD. 49.2 g / L of 2,3-BD are obtained from 138.3 g / L glycerol, during 280 hours.

Szczepy Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca oraz Serratia marcescens będące dobrymi producentami 2,3-BD, należą do grupy oportunistycznych patogenów. Spośród mikroorganizmów posiadających status GRAS, zdolności do wytwarzania znaczących ilości 2,3-BD wykazują szczepy Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens i Paenibacillus polymyxa.Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca and Serratia marcescens strains, being good 2,3-BD producers, belong to the group of opportunistic pathogens. Among the microorganisms with GRAS status, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens and Paenibacillus polymyxa strains show the ability to produce significant amounts of 2,3-BD.

Najwyższy poziom produkcji 2,3-BD osiągnięto w hodowlach z dokarmianiem szczepu Bacillus licheniformis DSM 8785 (zarówno wolnego, jak i pułapkowanego w żelach LentiKats) na bardzo bogatym podłożu z glukozą [czasopismo Applied Microbiology and Biotechnology (2013) 97: 6715-6723], Uzyskano 144 g/l 2,3-BD po 127 godzinach fermentacji (produktywność 1,14 g/l • godzina)The highest level of 2,3-BD production was achieved in cultures with supplementation of the Bacillus licheniformis strain DSM 8785 (both free and trapped in LentiKats gels) on a very rich medium with glucose [the journal Applied Microbiology and Biotechnology (2013) 97: 6715-6723] , 144 g / l of 2,3-BD were obtained after 127 hours of fermentation (productivity 1.14 g / l • hour)

Również wysokie nagromadzenie 2,3-BD (115,7 g/l) osiągnięto w hodowli z dokarmianiem termofilnego szczepu Bacillus licheniformis na podłożu z glukozą [czasopismo Biotechnology for Biofuels, (2013), 6: 123]. Przy użyciu 260 g/l glukozy uzyskano 115,7 g/l 2,3-BD podczas 48-godzinnej fermentacji.Also, a high accumulation of 2,3-BD (115.7 g / l) was achieved in a fed culture with a thermophilic strain of Bacillus licheniformis in a glucose medium [journal Biotechnology for Biofuels, (2013), 6: 123]. Using 260 g / L of glucose resulted in 115.7 g / L of 2,3-BD in the 48-hour fermentation.

W czasopiśmie Bioresource Technology (2012) 124: 237-244 opisano otrzymywanie 2,3-BD w hodowlach szczepu Paenibacillus polymyxa DSM 365 na podłożu z ekstraktem drożdżowym i sacharozą. W podłożu zawierającym 212,5 g/l sacharozy w hodowlach z dokarmianiem w czasie 54 godzin tworzyło się 111 g/l 2,3-BD.Bioresource Technology (2012) 124: 237-244 describes the preparation of 2,3-BD in cultures of the Paenibacillus polymyxa DSM 365 strain in a medium with yeast extract and sucrose. In the medium containing 212.5 g / L of sucrose, 111 g / L of 2,3-BD was formed in the cultures with supplemental feeding over a period of 54 hours.

PL 227 253 B1PL 227 253 B1

Sposób wytwarzania 2,3-BD w drodze hodowli unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożu zawierającym źródło węgla, w którym stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii sporządzony z mieszaniny roztworu wodnego PVA zawierającego alginian sodu i zawiesiny komórek bakterii w drodze ogrzewania roztworu PVA i alginianu sodu w autoklawie temperaturze 121°C w czasie 20 minut, ochłodzenia do temperatury 30°C, zmieszania z zawiesiną bakterii, odpowietrzenia pod próżnią wkroplenia tej mieszaniny do roztworu wodnego CaCl2 i pozostawienia w nim w czasie 24 godziny, następnie wprowadzenia utworzonych sferycznych form żelu do wodnego roztworu aldehydu glutarowego na czas 24 godziny, przeniesienia do roztworu wodnego glicyny także na czas 24 godziny i w końcu odmycia solą fizjologiczną z dodatkiem CaCl2, przechowywany w soli fizjologicznej z dodatkiem CaCl2, według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 sporządzony z mieszaniny zawiesiny komórek bakterii o stężeniu 10⁹-10¹⁰/ml i 5-8% (w/v) wodnego roztworu PVA o masie cząsteczkowej 20000-80000 Da zawierającego 1-2% (w/v) alginianu sodu, zawierającej 0,5 ml zawiesiny komórek bakterii na 10 ml roztworu PVA z alginianem, którą po odpowietrzeniu pod próżnią wkrapla się do roztworu wodnego CaCl2 o stężeniu 1-2% (w/v) stosowanego w ilości 100-200 ml na 10,5 ml tej mieszaniny, następnie utworzone sferyczne formy żelu wprowadza się do roztworu wodnego aldehydu glutarowego o stężeniu 0,5-2,0% (w/v) i o pH 3, użytego w ilości 10-20 ml na 10,5 ml mieszaniny zawiesiny komórek bakterii i roztworu i w końcu otrzymany żel przenosi się do 0,4 M roztworu wodnego glicyny, który używa się w ilości 250 ml na 10,5 ml mieszaniny zawiesiny komórek bakterii i roztworu PVA. Hodowlę unieruchomionych komórek bakterii prowadzi się w podłożu zawierającym w 1 l pożywki: hydrolizat enzymatyczny wysłodków buraczanych w ilości zapewniającej obecność 10 g czystej glukozy lub hydrolizat wytłoków jabłkowych w ilości zapewniającej obecność 25 g czystej glukozy, 2 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g NH4CI, stosując 2-3 g unieruchomionych komórek bakterii na 25 ml podłoża, w temperaturze 37°C, okresowo w czasie 12-36 godzin. Hydrolizaty enzymatyczne wysłodków buraczanych i wytłoków jabłkowych otrzymuje się w wyniku działania na wysłodki lub wytłoki wieloenzymowym preparatem z Aspergillus niger IBT 90 zawierającym 36,2 U/ml celulazy, 73,2 U/ml ksylanazy, 123,2 U/ml pektynazy, 207,5 U/ml enzymów amylolitycznych i 74,5 U/ml inwertazy, przy czym stosuje się 1 ml preparatu wieloenzymowego na 20 g suchej masy wysłodków lub wytłoków.A method of producing 2,3-BD by culturing an immobilized bacterial strain of Bacillus licheniformis NCIMB 8059 in a carbon source medium, which uses a preparation of the immobilized strain of bacteria made from a mixture of an aqueous solution of PVA containing sodium alginate and a suspension of bacterial cells by heating the PVA solution and of sodium alginate in an autoclave at 121 ° C for 20 minutes, cooling to 30 ° C, mixing with a bacterial suspension, deaerating under vacuum, dropping this mixture into an aqueous CaCl2 solution and leaving it for 24 hours, then introducing the formed spherical gel forms to the aqueous solution of glutaraldehyde for 24 hours, transfer to the aqueous glycine solution also for 24 hours and finally washing with saline with the addition of CaCl2, stored in saline with the addition of CaCl2, according to the invention, it is characterized by the use of a preparation of an immobilized strain of bacteria Ba cillus licheniformis NCIMB 8059 prepared from a mixture of bacterial cell suspension at a concentration of 10 ⁹ -10 ¹⁰ / ml and 5-8% (w / v) aqueous PVA solution with a molecular weight of 20,000-80,000 Da containing 1-2% (w / v) alginate sodium, containing 0.5 ml of bacterial cell suspension per 10 ml of PVA solution with alginate, which, after deaeration in a vacuum, is added dropwise to an aqueous solution of CaCl2 with a concentration of 1-2% (w / v) used in the amount of 100-200 ml per 10, 5 ml of this mixture, then the formed spherical gel forms are introduced into a 0.5-2.0% (w / v) aqueous glutaraldehyde solution at pH 3, used in the amount of 10-20 ml per 10.5 ml of the suspension mixture of the bacterial cells and the solution and finally the obtained gel is transferred to a 0.4 M glycine aqueous solution, which is used in an amount of 250 ml per 10.5 ml of the mixture of the bacterial cell suspension and PVA solution. The cultivation of immobilized bacterial cells is carried out in a medium containing in 1 l of the medium: beet pulp enzymatic hydrolyzate in an amount ensuring the presence of 10 g of pure glucose or apple pomace hydrolyzate in an amount ensuring the presence of 25 g of pure glucose, 2 g of yeast extract, 2.5 g of NH4Cl using 2-3 g of immobilized bacterial cells per 25 ml of medium at 37 ° C, periodically over a period of 12-36 hours. Enzymatic hydrolysates of beet pulp and apple pomace are obtained by treating the pulp or pomace with a multi-enzyme preparation with Aspergillus niger IBT 90 containing 36.2 U / ml cellulase, 73.2 U / ml xylanase, 123.2 U / ml pectinase, 207, 5 U / ml of amylolytic enzymes and 74.5 U / ml of invertase, whereby 1 ml of multenzyme preparation is used per 20 g of dry weight of pulp or pomace.

Sposób wytwarzania 2,3-BD w drodze hodowli unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożu zawierającym źródło węgla, w którym stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii sporządzony z mieszaniny roztworu wodnego PVA zawierającego alginian sodu i zawiesiny komórek bakterii w drodze ogrzewania roztworu PVA i alginianu sodu w autoklawie temperaturze 121°C w czasie 20 minut, ochłodzenia do temperatury 30°C, zmieszania z zawiesiną bakterii, odpowietrzenia pod próżnią wkroplenia do oziębionego oleju roślinnego, następnie kilkakrotnego zamrażania i rozmrażania, oddzielenia utworzonych sferycznych form żelu z unieruchomionymi komórkami od oleju i przemycia detergentem i solą fizjologiczną z dodatkiem CaCl2, przechowywany w soli fizjologicznej z dodatkiem CaCl2 w temperaturze 4°C lub w formie wysuszonej, według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 sporządzony z mieszaniny zawiesiny komórek bakterii o stężeniu 10⁹-10¹⁰/ml i 5-8 % (w/v) wodnego roztworu PVA o masie cząsteczkowej 20000-80000 Da zawierającego 1-2% (w/v) alginianu sodu, zawierającej 0,5 ml zawiesiny komórek bakterii na 10 ml roztworu PVA, którą po odpowietrzeniu pod próżnią wkrapla się do oleju schłodzonego do temperatury 0°C, następnie zamraża 3-5-krotnie do temperatury co najmniej -25°C na czas 10-24 godziny i rozmraża w temperaturze pokojowej. Hodowlę unieruchomionych komórek bakterii prowadzi się w podłożu zawierającym w 1 l pożywki: melasę buraczaną w ilości zapewniającej obecność 80 g czystej sacharozy lub hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych w ilości zapewniającej obecność 43 g czystej glukozy, 32 g ekstraktu drożdżowego, 6,2 g NH4Cl, z dokarmianiem czystą glukozą dodawaną w trakcie hodowli 3-4 razy w porcjach po 50 g/l podłoża, stosując 2-3 g unieruchomionych komórek bakterii na 25 ml podłoża, w temperaturze 37°C, okresowo w czasie 120-190 godzin. Hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych sporządza się jak opisano powyżej.A method of producing 2,3-BD by culturing an immobilized bacterial strain of Bacillus licheniformis NCIMB 8059 in a carbon source medium, which uses a preparation of the immobilized strain of bacteria made from a mixture of an aqueous solution of PVA containing sodium alginate and a suspension of bacterial cells by heating the PVA solution and of sodium alginate in an autoclave at 121 ° C for 20 minutes, cooling to 30 ° C, mixing with a bacterial suspension, deaeration under vacuum, dropping into chilled vegetable oil, then repeated freezing and thawing, separating the formed spherical gel forms with immobilized cells from the oil and washing with detergent and saline with the addition of CaCl2, stored in saline with the addition of CaCl2 at a temperature of 4 ° C or in a dried form, according to the invention, it is characterized by the use of a preparation of the immobilized bacterial strain Bacillus licheniformis NCIMB 8059 prepared from meat a suspension of bacterial cells with a concentration of 10 ⁹ -10 ¹⁰ / ml and 5-8% (w / v) of an aqueous PVA solution with a molecular weight of 20,000-80,000 Da containing 1-2% (w / v) of sodium alginate, containing 0.5 ml of bacterial cell suspension per 10 ml of PVA solution, which, after deaeration under vacuum, is added dropwise to the oil cooled to 0 ° C, then frozen 3-5 times to the temperature of at least -25 ° C for 10-24 hours and thawed in room temperature. The cultivation of immobilized bacterial cells is carried out in a medium containing in 1 l of the medium: beet molasses in an amount ensuring the presence of 80 g of pure sucrose or enzymatic hydrolyzate of apple pomace in an amount ensuring the presence of 43 g of pure glucose, 32 g of yeast extract, 6.2 g of NH4Cl, supplementation with pure glucose added during cultivation 3-4 times in portions of 50 g / l of medium, using 2-3 g of immobilized bacterial cells per 25 ml of medium, at 37 ° C, periodically during 120-190 hours. The apple pomace enzyme hydrolyzate is prepared as described above.

W poniższej tabeli 1 przedstawiono profil monosacharydów w hydrolizatach wytłoków jabłkowych (J) i w hydrolizatach wysłodków buraczanych wykorzystywanych w produkcji 2 ,3-BD.Table 1 below shows the monosaccharide profile in apple pomace hydrolysates (J) and beet pulp hydrolysates used in the production of 2,3-BD.

PL 227 253 B1PL 227 253 B1

T a b e l a 1T a b e l a 1

Cukier Sugar Hydrolizaty wytłoków jabłkowych Apple pomace hydrolysates Hydrolizaty wysłodków buraczanych Hydrolysates of beet pulp % suchej masy % dry weight % w puli monosacharydów % in the monosaccharide pool % suchej masy % dry weight % w puli monosacharydów % in the monosaccharide pool Glukoza Glucose 20,1 20.1 28,8 28.8 18,0 18.0 30,5 30.5 Arabinoza Arabinose 1,6 1.6 2,3 2.3 15,6 15.6 26,4 26.4 Kwas galakturonowy Galacturonic acid 4,8 4.8 6,9 6.9 14,6 14.6 24,7 24.7 Galaktoza Galactose 1,0 1.0 1,4 1.4 3,9 3.9 6,6 6.6 Fruktoza Fructose 39,9 39.9 57,1 57.1 3,5 3.5 5,9 5.9 Ksyloza Xylose 1,7 1.7 2,4 2.4 1,7 1.7 2,9 2.9 Mannoza Mannose 0,5 0.5 0,7 0.7 1,3 1.3 2,2 2.2 Ramnoza Rhamnosis 0,1 0.1 0,1 0.1 0,4 0.4 0,7 0.7 Suma Sum 69,8 69.8 100 100 59,0 59.0 100 100

Po rozpoczęciu fermentacji z użyciem nośnika z pułapkowanymi w nim komórkami bakterii następuje namnażanie bakterii w nośniku, a następnie częściowe uwalnianie komórek i namnażanie w pożywce. Po osiągnięciu odpowiedniego OD₆₆₀ (6-8) w cieczy hodowlanej, preparat może być z niej usunięty i po odmyciu solą fizjologiczną (zawierającą 0,1 g/l CaCl2) wykorzystany w kolejnych hodowlach jako stabilne inokulum, bez konieczności uaktywniania szczepu na skosach i w prehodowlach i bez strat jego uzdolnień do produkcji 2,3-BD. Właściwy stan fizjologiczny komórek w żelu jest utrzymywany dzięki przenoszeniu ich do świeżych podłoży i odnawianiu się populacji. Po okresie dłuższego (kilkumiesięcznego) przechowywania preparatów w soli fizjologicznej w temperaturze 4°C, czas osiągnięcia odpowiedniego namnożenia komórek w nośniku i podłożu podczas pierwszej hodowli wynosi do 48 godzin. Nośnik z unieruchomionymi komórkami usuwa się po uzyskaniu odpowiedniego namnożenia bakterii w podłożu lub po zakończeniu hodowli i używa jako inokulum w kolejnych fermentacjach, lub przechowuje w soli fizjologicznej (zawierającej 0,1 g/l CaCl2) w temperaturze 4°C.After commencing fermentation with the carrier trapped with bacterial cells, multiplication of the bacteria in the carrier takes place, followed by partial release of cells and multiplication in the medium. After reaching the appropriate OD ₆₆₀ (6-8) in the culture liquid, the preparation can be removed from it and, after washing with physiological saline (containing 0.1 g / l CaCl2), used in subsequent cultures as a stable inoculum, without the need to activate the strain on the slants and pre-breeding and without losing his ability to produce 2,3-BD. The proper physiological state of the cells in the gel is maintained by transferring them to fresh media and renewing the population. After longer (several months) storage of the preparations in physiological saline at 4 ° C, the time to achieve the appropriate proliferation of cells in the carrier and medium during the first cultivation is up to 48 hours. The carrier with the immobilized cells is removed after sufficient bacterial growth in the medium or after completion of the culture and used as an inoculum in subsequent fermentations, or stored in physiological saline (containing 0.1 g / L CaCl2) at 4 ° C.

Sposób według wynalazku ilustrują poniższe przykłady.The process according to the invention is illustrated by the following examples.

P r z y k ł a d 1P r z k ł a d 1

0,5 ml zawiesiny komórek bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059, o stężeniu około 10¹⁰/ml zmieszano z 10 ml sterylnego 6% (w/v) wodnego roztworu PYA o masie cząsteczkowej 72 kDa i stopniu hydrolizy 97,5-99,5%, zawierającego 1,2% (w/v) alginianu sodu, przygotowanego w autoklawie w temperaturze 121°C w czasie 20 minut i następnie ochłodzonego do temperatury 30°C. Po dokładnym wymieszaniu i odpowietrzeniu mieszaninę wkroplono do 100 ml 2% (w/v) roztworu wodnego chlorku wapnia. Utworzone sferyczne formy żelu o wymiarach 3-4 mm pozostawiono w roztworze w ciągu doby. Następnie, po przemyciu solą fizjologiczną, przeniesiono je do 15 ml 1% (w/v) roztworu wodnego aldehydu glutarowego (GA) (pH 3) na okres 24 godzin.0.5 ml of a suspension of Bacillus licheniformis NCIMB 8059 bacterial cells at a concentration of approximately 10 ¹⁰ / ml was mixed with 10 ml of sterile 6% (w / v) aqueous PYA solution with a molecular weight of 72 kDa and a degree of hydrolysis of 97.5-99.5% , containing 1.2% (w / v) sodium alginate, autoclaved at 121 ° C for 20 minutes and then cooled to 30 ° C. After thorough mixing and deaeration, the mixture was added dropwise to 100 ml of a 2% (w / v) aqueous solution of calcium chloride. The formed spherical gel forms with dimensions of 3-4 mm were left in the solution for 24 hours. Then, after washing with saline, they were transferred to 15 ml of 1% (w / v) aqueous glutaraldehyde (GA) solution (pH 3) for a period of 24 hours.

W celu zablokowania pozostałych wolnych grup aldehydowych w GA, nośnik umieszczono w 250 ml 0,4 M roztworze glicyny na 24 godziny. Otrzymany preparat przemyto sterylną solą fizjologiczną z dodatkiem 0,1 g/l CaCl2 i przetrzymywano w tym roztworze w temperaturze 4°C do czasu jego użycia. Unieruchomiony szczep bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 wykorzystano w kolejnych hodowlach okresowych w podłożach zawierających w 1 l pożywki: hydrolizat enzymatyczny wysłodków buraczanych w ilości odpowiadającej 10 g glukozy, 2 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g NH4CI, stosując 2,6 g unieruchomionych komórek bakterii na 25 ml podłoża, w temperaturze 37°C, kolejno w czasie 48, 20, 20, 24, 24, 18, 18 i 24 godzin oraz w hodowlach okresowych w podłożach zawierających w 1 l pożywki: hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych w ilości odpowiadającej 25 g glukozy, 2 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g NH4CI, stosując 2,6 g unieruchomionych komórek bakterii na 25 ml podłoża, w temperaturze 37°C, kolejno w czasie 44, 21, 19,19,19 i 22 godzin.In order to block the remaining free aldehyde groups in GA, the support was placed in 250 ml of 0.4 M glycine solution for 24 hours. The obtained preparation was washed with sterile physiological saline with the addition of 0.1 g / l CaCl2 and kept in this solution at a temperature of 4 ° C until its use. The immobilized bacterial strain Bacillus licheniformis NCIMB 8059 was used in successive batch cultures in media containing in 1 l of medium: beet pulp enzymatic hydrolyzate in an amount corresponding to 10 g glucose, 2 g yeast extract, 2.5 g NH4Cl, using 2.6 g of immobilized bacterial cells per 25 ml of medium at 37 ° C, successively for 48, 20, 20, 24, 24, 18, 18 and 24 hours and in batch cultures in media containing in 1 liter of medium: enzymatic hydrolyzate of apple pomace in an amount corresponding to 25 g glucose, 2 g yeast extract, 2.5 g NH4Cl, using 2.6 g of immobilized bacterial cells per 25 ml of medium at 37 ° C, successively at 44, 21, 19, 19, 19 and 22 hours.

Hydrolizaty enzymatyczne wysłodków buraczanych i wytłoków jabłkowych otrzymywano w wyniku działania na wysłodki lub wytłoki wieloenzymowym preparatem z Aspergillus niger IBT 90 zawierającym 36,2 U/ml celulazy, 73,2 U/ml ksylanazy, 123,2 U/ml pektynazy, 207,5 U/ml enzymów amylo6Enzymatic hydrolysates of beet pulp and apple pomace were obtained by treating the pulp or pomace with a multi-enzyme preparation with Aspergillus niger IBT 90 containing 36.2 U / ml cellulase, 73.2 U / ml xylanase, 123.2 U / ml pectinase, 207.5 U / ml of amyl enzymes6

PL 227 253 B1 litycznych i 74,5 U/ml inwertazy, przy czym stosowano 1 ml preparatu wieloenzymowego na 20 g suchej masy wysłodków lub wytłoków.And 74.5 U / ml of invertase, whereby 1 ml of multenzyme preparation was used per 20 g of dry weight of pulp or pomace.

W poniższej tabeli 2 przedstawiono wyniki produkcji 2,3-BD w kolejnych hodowlach unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożach zawierających hydrolizat enzymatyczny wysłodków buraczanych (B).Table 2 below shows the results of 2,3-BD production in consecutive cultures of the immobilized Bacillus licheniformis NCIMB 8059 bacterial strain in media containing beet pulp enzyme hydrolyzate (B).

T a b e l a 2T a b e l a 2

Nr hodowli Kennel no I AND II II III III IV IV V V VI VI VII VII VIII VIII Czas hodowli [godziny] Breeding time [hours] 48 48 20 twenty 20 twenty 24 24 24 24 18 18 18 18 24 24 Stężenie 2,3-BD [g/l] The concentration of 2,3-BD [g / l] 11,30 11.30 8,7 8.7 9,3 9.3 9,8 9.8 10,2 10.2 9,2 9.2 9,9 9.9 9,1 9.1 Produktywność [g 2,3-BD/l x godzina] Productivity [g 2,3-BD / l x hour] 0,23 0.23 0,43 0.43 0,46 0.46 0,41 0.41 0,425 0.425 0,5 0.5 0,55 0.55 0,38 0.38

W poniższej tabeli 3 przedstawiono wyniki produkcji 2,3-BD w kolejnych hodowlach unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożach zawierających hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych (J).Table 3 below shows the results of 2,3-BD production in consecutive cultures of the immobilized Bacillus licheniformis NCIMB 8059 bacterial strain in media containing apple pomace enzyme hydrolyzate (J).

T a b e l a 3T a b e l a 3

Nr hodowli Kennel no I AND II II III III IV IV V V VI VI Czas hodowli [godziny] Breeding time [hours] 44 44 21 21 19 19 19 19 19 19 22 22 Stężenie 2,3-BD [g/l] The concentration of 2,3-BD [g / l] 16,80 16.80 16,90 16.90 12,36 12.36 16,20 16.20 15,10 15.10 16,30 16.30 Produktywność [g 2,3 BD/l x godzina] Productivity [g 2.3 BD / l x hour] 0,38 0.38 0,8 0.8 0,65 0.65 0,85 0.85 0,79 0.79 0,74 0.74

P r z y k ł a d 2P r z k ł a d 2

0,5 ml zawiesiny komórek bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 o stężeniu około 10¹⁰/ml zmieszano z 10 ml sterylnego 12% (w/v) wodnego roztworu PVA o masie cząsteczkowej 72 kDa i stopniu hydrolizy 97,5-99,5%, zawierającego 0,025% (w/v) alginianu sodu, przygotowanego w autoklawie w temperaturze 121°C, w czasie 20 minut i następnie ochłodzonego do temperatury 30°C. Po dokładnym wymieszaniu i odpowietrzeniu mieszaninę wkroplono do naczynia zawierającego około 200 ml oleju jadalnego oziębionego do temperatury 0°C. Utworzone sferyczne formy żelu pozostawi ano w naczyniu i wraz z nim umieszczano w zamrażarce (-25°C) na okres 23 godzin. Po upływie tego czasu pojemnik wyjęto i rozmrożono żel pozostawiając go przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Cykl zamrażania/rozmrażania przeprowadzano 5-krotnie.0.5 ml of a suspension of Bacillus licheniformis NCIMB 8059 bacterial cells at a concentration of about 10 ¹⁰ / ml was mixed with 10 ml of a sterile 12% (w / v) aqueous PVA solution with a molecular weight of 72 kDa and a degree of hydrolysis of 97.5-99.5%, containing 0.025% (w / v) sodium alginate, prepared in an autoclave at 121 ° C for 20 minutes and then cooled to 30 ° C. After thorough mixing and deaeration, the mixture was added dropwise to a vessel containing about 200 ml of cooking oil chilled to 0 ° C. The formed spherical gel forms were left in the vessel and placed with it in a freezer (-25 ° C) for a period of 23 hours. After this time, the container was removed and the gel was thawed by leaving it for 1 hour at room temperature. The freeze / thaw cycle was performed 5 times.

Otrzymane preparaty przechowywano w soli fizjologicznej (4°C) z dodatkiem 0,1 g/l CaCl2 do czasu użycia. Unieruchomiony szczep bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 użyto w kolejnych hodowlach okresowych w podłożach zawierających w 1 l pożywki: hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych w ilości odpowiadającej 25 g glukozy, 2 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g NH4CI, stosując 2,6 g unieruchomionych komórek bakterii na 25 ml podłoża, w temperaturze 37°C, w czasie 24, 19, 22 i 22 godziny.The obtained preparations were stored in physiological saline (4 ° C) with the addition of 0.1 g / l CaCl2 until use. Immobilized bacterial strain Bacillus licheniformis NCIMB 8059 was used in successive batch cultures in media containing in 1 l of medium: apple pomace enzymatic hydrolyzate in an amount corresponding to 25 g of glucose, 2 g of yeast extract, 2.5 g of NH4Cl, using 2.6 g of immobilized bacterial cells per 25 ml of medium at 37 ° C for 24, 19, 22 and 22 hours.

Hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych otrzymano jak w przykładzie 1.Apple pomace enzyme hydrolyzate was prepared as in Example 1.

W poniższej tabeli 4 przedstawiono wyniki produkcji 2,3-BD w kolejnych hodowlach unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożach zawierających hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych (J).Table 4 below shows the results of 2,3-BD production in consecutive cultures of the immobilized Bacillus licheniformis NCIMB 8059 bacterial strain in media containing apple pomace enzyme hydrolyzate (J).

T a b e l a 4T a b e l a 4

Nr hodowli Kennel no I AND II II III III IV IV Czas hodowli [godziny] Breeding time [hours] 24 24 19 19 22 22 22 22 Stężenie 2,3-BD [g/l] The concentration of 2,3-BD [g / l] 16,51 16.51 17,10 17.10 16,95 16.95 16,30 16.30 Produktywność [g 2,3-BD/l x godzina] Productivity [g 2,3-BD / l x hour] 0,69 0.69 0,9 0.9 0,77 0.77 0,74 0.74

PL 227 253 B1PL 227 253 B1

Unieruchomiony szczep bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 poddano także trzem hodowlom (użyto także w trzech hodowlach) z dokarmianiem glukozą (3x50 g/l podłoża) w podłożu o zoptymalizowanym składzie (bez składnika fosforanowego), zawierających w 1 l pożywki: hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych w ilości odpowiadającej 43 g glukozy (hodowla I i II w tabeli 5) lub melasę buraczaną w ilości odpowiadającej 80 g sacharozy (hodowla III w tabeli 5), 32 g ekstraktu drożdżowego, 6,2 g NH4CI, stosując 2,6 g unieruchomionych komórek bakterii na 25 ml podłoża, w temperaturze 37°C, w czasie odpowiednio 168 (hodowla I), 162 godziny (hodowla II) i 120 godzin (hodowla III), (do 48 godziny hodowle wstrząsane (130 rpm), od 48 godziny - stacjonarne; usunięcie nośnika po 48 godzinach).The immobilized bacterial strain Bacillus licheniformis NCIMB 8059 was also subjected to three cultures (also used in three cultures) with glucose supplementation (3x50 g / l medium) in the medium with optimized composition (without phosphate component), containing in 1 l of the medium: apple pomace enzyme hydrolyzate in 43 g glucose (culture I and II in table 5) or beet molasses 80 g sucrose (culture III in table 5), 32 g yeast extract, 6.2 g NH4Cl using 2.6 g immobilized bacterial cells per 25 ml of medium at 37 ° C for 168 hours (culture I), 162 hours (culture II) and 120 hours (culture III), respectively (up to 48 hours shake cultures (130 rpm), from 48 hours - stationary ; removal of the carrier after 48 hours).

W poniższej tabeli 5 przedstawiono wyniki produkcji 2,3-BD w hodowlach z dokarmianiem unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożu o optymalnym składzie, zawierającym hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych (hodowla I i II) lub melasę buraczaną (hodowla III).Table 5 below shows the results of 2,3-BD production in cultures with supplementation of the immobilized strain of Bacillus licheniformis NCIMB 8059 in a medium of optimal composition containing enzymatic hydrolyzate of apple pomace (cultures I and II) or beet molasses (culture III).

T a b e l a 5T a b e l a 5

Nr hodowli Kennel no I AND II II III III Czas hodowli [godzina] Breeding time [hour] 168 168 162 162 120 120 Stężenie glukozy*/sacharozy** i cukrów redukujących*** w podłożu wyjściowym [g/l] Concentration of glucose * / sucrose ** and reducing sugars *** in the starting medium [g / l] 43* 120*** 43 * 120 *** 43* 120*** 43 * 120 *** QQ** Q*** QQ ** Q *** Zasilanie glukozą (50 g/l) (godzina fermentacji) Glucose feed (50 g / l) (fermentation hour) 24, 42, 48 24, 42, 48 24, 48, 72 24, 48, 72 18, 24, 42 18, 24, 42 Stężenie 2,3-BD [g/l] The concentration of 2,3-BD [g / l] 100,20 100.20 114,00 114.00 90,00 90.00 Produktywność [g 2,3-BD/l x godzina] Productivity [g 2,3-BD / l x hour] 0,59 0.59 0,70 0.70 0,75 0.75

W hodowlach w podłożu o zoptymalizowanym składzie, zawierającym wyjściowo tylko hydrolizat wytłoków jabłkowych lub melasę jako źródło węgla oraz ekstrakt drożdżowy i NH4CI, w wyniku dokarmiania glukozą (3x50 g/l) szczep Bacillus licheniformis NCIMB 8059 wytwarzał od 90 do 114 g/lIn cultures in a medium with an optimized composition, initially containing only apple pomace hydrolyzate or molasses as a carbon source, yeast extract and NH4Cl, as a result of feeding with glucose (3x50 g / l), the Bacillus licheniformis NCIMB 8059 strain produced from 90 to 114 g / l

2,3-BD. Nośnik z unieruchomionymi komórkami był usuwany po około 48 godzinach od rozpoczęcia fermentacji i po odmyciu solą fizjologiczną (z 0,1 g/l CaCl2) był używany w kolejnych hodowlach z zasilaniem, bez strat uzdolnień szczepu do produkcji 2,3-BD.2,3-BD. The carrier with the immobilized cells was removed approximately 48 hours after the start of fermentation and after washing with saline (with 0.1 g / L CaCl2) was used in subsequent fed cultures without compromising the ability of the strain to produce 2,3-BD.

Claims

1. Method of producing 2,3-BD by culturing an immobilized strain of Bacillus licheniformis NCIMB 8059 in a medium containing a carbon source, in which a preparation of the immobilized strain of bacteria is used, made from a mixture of an aqueous solution of polyvinyl alcohol containing sodium alginate and a suspension of bacterial cells, by heating the polyvinyl alcohol and sodium alginate solution in an autoclave at a temperature

121 ° C for 20 minutes, cooling to 30 ° C, mixing with the bacterial suspension, deaerating under vacuum, dropping this mixture into an aqueous solution of calcium chloride for 24 hours, then introducing the formed spherical gel forms into the aqueous solution of glutaraldehyde for the duration of 24 hours, transfer to an aqueous solution of glycine also for 24 hours and finally washing with saline with the addition of calcium chloride, stored in saline with the addition of calcium chloride, characterized by the use of a preparation of the immobilized bacterial strain Bacillus licheniformis NCIMB 8059 made from a mixture of cell suspension bacteria with a concentration of 10 ⁹ -10 ¹⁰ / ml and 5-8% (w / v) of an aqueous solution of polyvinyl alcohol with a molecular weight of 20,000-80,000 Da containing 1-2% (w / v) of sodium alginate, containing 0.5 ml of suspension of bacteria cells per 10 ml of polyvinyl alcohol with alginate solution, which, after deaeration in a vacuum, is dropped into the aqueous solution of calcium chloride with a concentration of 1-2% (w / v) used in the amount of 100-200 ml per 10.5 ml of this mixture, then the formed spherical gel forms are introduced into an aqueous solution of glutaraldehyde with a concentration of 0.5-2.0 % (w / v) and at a pH of 3, used in the amount of 10-20 ml per 10.5 ml of the mixture of bacterial cell suspension and polyvinyl alcohol solution, and finally the obtained gel is transferred

PL 227 253 B1 to 0.4 M glycine water solution, which is used in the amount of 250 ml per 10.5 ml of the mixture of bacterial cell suspension and polyvinyl alcohol solution, while the cultivation of immobilized bacterial cells is carried out in a medium containing 1 l of the medium: hydrolyzate enzyme beet pulp in an amount ensuring the presence of 10 g of pure glucose or apple pomace hydrolyzate in an amount ensuring the presence of 25 g of pure glucose, 2 g of yeast extract, 2.5 g of ammonium chloride, using 2-3 g of immobilized bacterial cells per 25 ml of medium, in temperature of 37 ° C, periodically for 12-36 hours.

2. The method according to p. A method according to claim 1, characterized in that enzymatic hydrolysates of beet pulp or apple pomace are obtained by treating pulp or pomace with a multi-enzyme preparation from Aspergillus niger IBT 90 containing 36.2 U / ml cellulase, 73.2 U / ml xylanase, 123.2 U / ml of pectinase, 207.5 U / ml of amylolytic enzymes and 74.5 U / ml of invertase, whereby 1 ml of a multi-enzyme preparation is used per 20 g of dry weight of pulp or pomace.

Method for the production of 2,3-BD by culturing the immobilized strain of bacteria Bacillus licheniformis NCIMB 8059 in a medium containing a carbon source, in which a preparation of the immobilized strain of bacteria is used, made from a mixture of an aqueous solution of polyvinyl alcohol containing sodium alginate and a suspension of bacterial cells, by heating the solution of polyvinyl alcohol and sodium alginate in an autoclave at 121 ° C for 20 minutes, cooling to 30 ° C, mixing with the bacterial suspension, deaerating under vacuum, dropping into the chilled vegetable oil, then freezing and thawing several times, separating the formed spherical gel forms with immobilized cells from oil and washing with detergent and saline with the addition of calcium chloride, stored in physiological saline with the addition of calcium chloride at 4 ° C or in a dried form, characterized by the use of a preparation of an immobilized strain of Bacillus lich eniformis NCIMB 8059 prepared from a mixture of a suspension of bacterial cells with a concentration of 1 0 ⁹ -10 ¹⁰ / ml and 5-8% (w / v) of an aqueous solution of polyvinyl alcohol with a molecular weight of 20,000-80,000 Da containing 1-2% (w / v) sodium alginate, containing 0.5 ml of bacterial cell suspension per 10 ml of polyvinyl alcohol solution, which, after deaeration under vacuum, is dropped into the oil cooled to 0 ° C, then frozen 3-5 times to a temperature of at least -25 ° C for 10-24 hours and thawed at room temperature, while the culture of immobilized bacterial cells is carried out in a medium containing in 1 liter of medium: beet molasses in an amount ensuring the presence of 80 g of pure sucrose or apple pomace hydrolyzate in an amount ensuring the presence of 43 g of pure glucose, 32 g of yeast extract, 6.2 g of ammonium chloride, with supplementation with pure glucose added during cultivation 3-4 times in portions of 50 g / l of medium, using 2-3 g of immobilized bacterial cells per 25 m 1 substrate, at the temperature of 37 ° C, periodically for 120-190 hours.

4. The method according to p. 3. A method according to claim 3, characterized in that the enzymatic hydrolyzate of apple pomace is obtained by treating the pomace with a multi-enzyme preparation of Aspergillus niger IBT 90 containing 36.2 U / ml cellulase, 73.2 U / ml xylanase, 123.2 U / ml pectinase, 207 , 5 U / ml of amylolytic enzymes and 74.5 U / ml of invertase, whereby 1 ml of multenzyme preparation is used per 20 g of dry matter of pomace.