PL227253B1 - Sposób wytwarzania 2,3-butanodiolu - Google Patents

Sposób wytwarzania 2,3-butanodiolu

Info

Publication number
PL227253B1
PL227253B1 PL412465A PL41246515A PL227253B1 PL 227253 B1 PL227253 B1 PL 227253B1 PL 412465 A PL412465 A PL 412465A PL 41246515 A PL41246515 A PL 41246515A PL 227253 B1 PL227253 B1 PL 227253B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
immobilized
aqueous solution
polyvinyl alcohol
medium
mixture
Prior art date
Application number
PL412465A
Other languages
English (en)
Other versions
PL412465A1 (pl
Inventor
Aneta Białkowska
Ewa Gromek
Halina Kalinowska
Celina Kubik
Barbara Sikora
Mirosława Szczęsna-Antczak
Mirosława Szczesna-Antczak
Marianna Turkiewicz
Marzena Jędrzejczak-Krzeptowska
Marzena Jedrzejczak-Krzeptowska
Original Assignee
Politechnika Łódzka
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Politechnika Łódzka filed Critical Politechnika Łódzka
Priority to PL412465A priority Critical patent/PL227253B1/pl
Publication of PL412465A1 publication Critical patent/PL412465A1/pl
Publication of PL227253B1 publication Critical patent/PL227253B1/pl

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Sposób wytwarzania 2,3-butanodiolu(2,3-BD) drodze hodowli unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożu zawierającym źródło węgla, polega na tym, że stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii sporządzony z mieszaniny roztworu wodnego alkoholu poliwinylowego zawierającego alginian sodu oraz zawiesiny komórek bakterii, którą po odpowietrzeniu pod próżnią, wkrapla się do roztworu wodnego chlorku wapnia. Następnie utworzone sferyczne formy żelu wprowadza się do roztworu wodnego aldehydu glutarowego i w końcu otrzymany żel przenosi się do roztworu wodnego glicyny. Natomiast hodowlę unieruchomionych komórek bakterii prowadzi się w podłożu zawierającym hydrolizat enzymatyczny wysłodków buraczanych lub hydrolizat wytłoków jabłkowych, ekstrakt drożdżowy, chlorek amonu. Odmiana sposóbu wytwarzania 2,3-BD w drodze hodowli unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożu zawierającym źródło węgla, polega także na tym, że stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii sporządzony z mieszaniny roztworu wodnego alkoholu poliwinylowego zawierającego alginian sodu oraz zawiesiny komórek bakterii, którą, po odpowietrzeniu pod próżnią, wkrapla się do schłodzonego oleju, następnie kilkakrotnie zamraża i rozmraża. Natomiast hodowlę unieruchomionych komórek bakterii prowadzi się w podłożu zawierającym melasę buraczaną lub hydrolizat wytłoków jabłkowych, ekstrakt drożdżowy, chlorek amonu, z dokarmianiem czystą glukozą dodawaną w trakcie hodowli. Hydrolizaty enzymatyczne wysłodko w buraczanych lub wytłoków jabłkowych otrzymuje się w wyniku działania na wysłodki lub wytłoki wieloenzymowym preparatem z Aspergillus niger IBT 90.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 2,3-butanodiolu (2,3-BD) w hodowli unieruchomionych komórek bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059.
Znaną metodą immobilizowania enzymów i mikroorganizmów jest ich pułapkowanie w materiale polimerowym. W tym celu często używane są: agar, karagen, poliakryloamid, alkohol poliwinylowy (PVA) i światłoutwardzalne polimery. Szczególnie żele PVA wyróżniają się dużą trwałością i elastycznością.
Z opisu patentowego US 5034324 i opisu zgłoszenia patentowego EP 0303122 jest znany sposób wytwarzania sferycznych, uwodnionych kriożeli zawierających unieruchomione mikroorganizmy, polegający na wkraplaniu mieszaniny zawierającej roztwór PVA, roztwór alginianu sodu i zawiesinę komórek bakterii do roztworu CaCl2, a następnie poddaniu utworzonych sferycznych form najlepiej trzem cyklom zamrażania/rozmrażania. Temperatura zamrażania nie powinna być wyższa niż -5°C, a rozmrażania - pokojowa.
W czasopiśmie Biomolecular Engineering (2001) 17, 55-63 opisano sposób przygotowania unieruchomionych w sferycznym kriożelu PVA komórek Bacillus subtilis, wykorzystywanych do wytwarzania proteinazy serynowej, polegający na wkraplaniu zawiesiny bakterii w roztworze PVA z dodatkiem alginianu sodu lub celulozy bakteryjnej do oziębionego oleju roślinnego, a następnie kilkakrotne zamrażanie i rozmrażanie całego układu.
W czasopiśmie Biotechnology Techniques (1997) 11(2), 67-70 ujawniono sposób immibilizacji enzymów w nośniku sferycznym otrzymywanym na bazie PVA sieciowanego aldehydem glutarowym (GA). W sposobie tym prawdopodobnie jedna grupa karbonylowa GA łączy się z dwiema grupami - OH PVA tego samego łańcucha, a druga wchodzi w taką samą reakcję z sąsiednim łańcuchem tworząc sieć lub kowalencyjnie wiąże się z grupą aminową materiału biologicznego (białka, komórki). Pozostające wolne grupy karbonylowe GA były blokowane glicyną.
Znane jest wytwarzanie 2,3 butanodiolu (2,3-BD) w drodze hodowli komórek drobnoustrojów unieruchomionych w karagenie, alginianie wapnia, żelu LentiKats. Biożele LentiKats otrzymuje się z 10% PVA przez wkraplanie roztworu polimer/biokatalizator na odpowiednią powierzchnię, a następnie kontrolowane odparowanie.
W czasopiśmie Journal of Fermentation Technology (1980) 58(2), 123-127 opisano produkcję
2,3-BD w drodze hodowli unieruchomionych w karagenie komórek bakterii Enterobacter aerogenes na podłożu zawierającym glukozę. Po 24 godzinach hodowli na podłożu zawierającym 50 g/l glukozy stężenie 2,3-BD wynosiło 11 g/l.
Z czasopisma Enzyme Microbial Technology (1986) 8(7), 409-41 1 jest znany sposób ciągłej produkcji 2,3-BD w drodze hodowli komórek Klebsiella pneumoniae pułapkowanych w alginianie wapnia na podłożu z serwatką. Maksymalna produktywność wynosiła 2,3 g/1 • godzina.
W czasopiśmie Annals of the New York Academy od Sciences (1984) 434(7), 454-458 ujawniono sposób wytwarzania 2,3-BD w drodze hodowli szczepu bakterii Enterobacter sp. immobilizowanego z wykorzystaniem alginianu wapnia, żelatyny, celulozy oraz nylonu, na podłożu zawierającym ksylozę. Podczas kolejnych dziesięciu 24-godzinnych hodowli w podłożu zawierającym 50 g/l ksylozy tworzyło się około 9 g/l 2,3-BD.
Z czasopisma Applied Microbiology and Biotechnology (2013) 97: 6715-6723 jest znany sposób wytwarzania 2,3-BD w drodze hodowli komórek bakterii Bacillus licheniformis i Paenibacillus polymyxa unieruchamionych na nośniku w postaci żelu LentiKats , na podłożu z glukozą w hodowlach okresowych trwających 86 godzin tworzyło się 72,6 g/l 2,3-BD na podłożu zawierającym 180 g/l glukozy, a w dokarmianych glukozą - 144,7 g/l po około 127 godzinach hodowli.
Najczęściej jako źródło węgla w podłożu do wytwarzania 2,3-BD stosuje się glukozę, a znaczący wzrost produkcji butanodiolu uzyskuje się w hodowlach z dokarmianiem.
W celu obniżenia kosztów produkcji do podłoża wprowadza się bogate w cukry odpady przemysłu rolno-spożywczego.
W czasopiśmie Bioprocess Engineering (2000) 23, 613-620 ujawniono wykorzystanie surowej i odbarwionej melasy buraczanej, serwatki oraz hydrolizatów odpadów pochodzących z przerobu kukurydzy do produkcji 2,3-BD w drodze hodowli okresowej bakterii Enterobacter sp. Najwięcej
2,3-BD tworzyło się w podłożach z hydrolizatem skrobi oraz serwatką - około 9 g/l, odpowiednio po 125 i 200 godzinach.
PL 227 253 B1
Z czasopisma Bioresource Technology (2003) 89: 125-131 jest znane zastosowanie hydrolizatów skrobi kukurydzianej do produkcji 2,3-BD w hodowli bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059.
W hodowli na podłożu zawierającym 30 g/l substratu produktywność wynosiła 0,58 g/l • godzina.
Zaletą surowców stanowiących odpady przemysłu rolno-spożywczego jest obecność w nich czynników wzrostu, ale zawierają one również inhibitory, ograniczające możliwość wprowadzania ich do podłoży w wysokich stężeniach.
W czasopiśmie Applied Microbiology and Biotechnology (2010) 87(3): 965-970) opisano wykorzystanie melasy z kolb kukurydzianych, będącej odpadem w procesie wytwarzania ksylitolu, do produkcji 2,3-BD w hodowli z dokarmianiem komórek Klebsiella pneumoniae. Maksymalne nagromadzenie 2,3-BD, 78,9 g/l, uzyskano po 61 godzinach procesu, przy produktywności 1,3 g/l • godzina i wydajności 81,4%.
Znane jest, z czasopisma Process Biochemistry (2010) 45: 613-616, wykorzystanie kwasowego hydrolizatu kolb kukurydzianych w podłożu do produkcji 2,3-BD w hodowli z dokarmianiem tym hydrolizatem szczepu Klebsiella oxytoca ACCC 10370 W trakcie fermentacji trwającej 60 godzin zostało zużyte 71,7 g/l cukrów (w tym 58,4 g/l ksylozy), a nagromadzenie 2,3-BD wynosiło 35,7 g/l.
W czasopiśmie Applied Microbiology and Biotechnology (1991) 34: 582-585, opisano proces produkcji 2,3-BD w hodowli z dokarmianiem szczepu Klebsiella oxytoca na podłożu z zatężonym i częściowo oczyszczonym sokiem z trzciny cukrowej, o stężeniu sacharozy 280 g/l. Po 49 godzinach hodowli nagromadzenie 2,3-BD wynosiło 118 g/l.
Wiadomo także, z czasopisma Zeitschrift far Naturforschung C. (2001) 56: (9-10): 787-91, że w hodowlach Klebsiella pneumoniae na podłożu zawierającym jedynie sok z trzciny cukrowej (180 g sacharozy/l) i fosforan amonowy, podczas 35-godzinnego procesu tworzyło się ponad 70 g/l
2,3-BD. Wynik ten był podobny do otrzymywanego na podłożu z glukozą, wzbogaconym wieloma składnikami odżywczymi.
W czasopiśmie Bioresource Technology (2010) 101: 1961-1967 opisano wytwarzanie 2,3-BD w hodowlach szczepu Serratia marcescens w podłożu zawierającym sacharozę i dokarmianym sacharozą. Po 42 godzinach hodowli uzyskano 139,92 g/l 2,3-BD przy produktywności 3,49 g/1 • godzina i wydajności 94,67%.
Jako alternatywne źródło sacharydów do produkcji 2,3-BD przez Klebsiella pneumoniae stosuje się także, zgodnie z informacją w czasopiśmie Bioresource Technology (2010) 101: 8342--8347, topinambur (Jerusalem artichoke) w formie mieszaniny hydrolizatu łodyg w połączeniu (w celu zwiększenia stężenia cukrów) z niehydrolizowanymi bulwami. Na podłożu tym tworzyło się 80,5 g/l 2,3 BD w czasie 68 godzin (produktywność 1,18 g /I • godzina).
W czasopiśmie Applied Microbiology and Biotechnology (1986) 25: 197-202 przedstawiono wykorzystanie soku z topinambura, bez hydrolizy zawartej w nim inuliny, do otrzymywania 2,3-BD w hodowli okresowej Paenibacillus polymyxa. Przy początkowym stężeniu cukru 160 g/l, po 55 godzinach hodowli uzyskiwano równą 44 g/l 2,3-BD (produktywność wynosiła 0,8 g/l • godzina).
W czasopiśmie Applied Microbiology and Biotechnology (2009) 84(4): 659-665 ujawniono wykorzystanie glicerolu jako źródła węgla w hodowlach Klebsiella pneumoniae, prowadzących do wytworzenia 2,3-BD. Otrzymywano 49,2 g/l 2,3-BD z 138,3 g/l glicerolu, w czasie 280 godzin.
Szczepy Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca oraz Serratia marcescens będące dobrymi producentami 2,3-BD, należą do grupy oportunistycznych patogenów. Spośród mikroorganizmów posiadających status GRAS, zdolności do wytwarzania znaczących ilości 2,3-BD wykazują szczepy Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens i Paenibacillus polymyxa.
Najwyższy poziom produkcji 2,3-BD osiągnięto w hodowlach z dokarmianiem szczepu Bacillus licheniformis DSM 8785 (zarówno wolnego, jak i pułapkowanego w żelach LentiKats) na bardzo bogatym podłożu z glukozą [czasopismo Applied Microbiology and Biotechnology (2013) 97: 6715-6723], Uzyskano 144 g/l 2,3-BD po 127 godzinach fermentacji (produktywność 1,14 g/l • godzina)
Również wysokie nagromadzenie 2,3-BD (115,7 g/l) osiągnięto w hodowli z dokarmianiem termofilnego szczepu Bacillus licheniformis na podłożu z glukozą [czasopismo Biotechnology for Biofuels, (2013), 6: 123]. Przy użyciu 260 g/l glukozy uzyskano 115,7 g/l 2,3-BD podczas 48-godzinnej fermentacji.
W czasopiśmie Bioresource Technology (2012) 124: 237-244 opisano otrzymywanie 2,3-BD w hodowlach szczepu Paenibacillus polymyxa DSM 365 na podłożu z ekstraktem drożdżowym i sacharozą. W podłożu zawierającym 212,5 g/l sacharozy w hodowlach z dokarmianiem w czasie 54 godzin tworzyło się 111 g/l 2,3-BD.
PL 227 253 B1
Sposób wytwarzania 2,3-BD w drodze hodowli unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożu zawierającym źródło węgla, w którym stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii sporządzony z mieszaniny roztworu wodnego PVA zawierającego alginian sodu i zawiesiny komórek bakterii w drodze ogrzewania roztworu PVA i alginianu sodu w autoklawie temperaturze 121°C w czasie 20 minut, ochłodzenia do temperatury 30°C, zmieszania z zawiesiną bakterii, odpowietrzenia pod próżnią wkroplenia tej mieszaniny do roztworu wodnego CaCl2 i pozostawienia w nim w czasie 24 godziny, następnie wprowadzenia utworzonych sferycznych form żelu do wodnego roztworu aldehydu glutarowego na czas 24 godziny, przeniesienia do roztworu wodnego glicyny także na czas 24 godziny i w końcu odmycia solą fizjologiczną z dodatkiem CaCl2, przechowywany w soli fizjologicznej z dodatkiem CaCl2, według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 sporządzony z mieszaniny zawiesiny komórek bakterii o stężeniu 109-1010/ml i 5-8% (w/v) wodnego roztworu PVA o masie cząsteczkowej 20000-80000 Da zawierającego 1-2% (w/v) alginianu sodu, zawierającej 0,5 ml zawiesiny komórek bakterii na 10 ml roztworu PVA z alginianem, którą po odpowietrzeniu pod próżnią wkrapla się do roztworu wodnego CaCl2 o stężeniu 1-2% (w/v) stosowanego w ilości 100-200 ml na 10,5 ml tej mieszaniny, następnie utworzone sferyczne formy żelu wprowadza się do roztworu wodnego aldehydu glutarowego o stężeniu 0,5-2,0% (w/v) i o pH 3, użytego w ilości 10-20 ml na 10,5 ml mieszaniny zawiesiny komórek bakterii i roztworu i w końcu otrzymany żel przenosi się do 0,4 M roztworu wodnego glicyny, który używa się w ilości 250 ml na 10,5 ml mieszaniny zawiesiny komórek bakterii i roztworu PVA. Hodowlę unieruchomionych komórek bakterii prowadzi się w podłożu zawierającym w 1 l pożywki: hydrolizat enzymatyczny wysłodków buraczanych w ilości zapewniającej obecność 10 g czystej glukozy lub hydrolizat wytłoków jabłkowych w ilości zapewniającej obecność 25 g czystej glukozy, 2 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g NH4CI, stosując 2-3 g unieruchomionych komórek bakterii na 25 ml podłoża, w temperaturze 37°C, okresowo w czasie 12-36 godzin. Hydrolizaty enzymatyczne wysłodków buraczanych i wytłoków jabłkowych otrzymuje się w wyniku działania na wysłodki lub wytłoki wieloenzymowym preparatem z Aspergillus niger IBT 90 zawierającym 36,2 U/ml celulazy, 73,2 U/ml ksylanazy, 123,2 U/ml pektynazy, 207,5 U/ml enzymów amylolitycznych i 74,5 U/ml inwertazy, przy czym stosuje się 1 ml preparatu wieloenzymowego na 20 g suchej masy wysłodków lub wytłoków.
Sposób wytwarzania 2,3-BD w drodze hodowli unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożu zawierającym źródło węgla, w którym stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii sporządzony z mieszaniny roztworu wodnego PVA zawierającego alginian sodu i zawiesiny komórek bakterii w drodze ogrzewania roztworu PVA i alginianu sodu w autoklawie temperaturze 121°C w czasie 20 minut, ochłodzenia do temperatury 30°C, zmieszania z zawiesiną bakterii, odpowietrzenia pod próżnią wkroplenia do oziębionego oleju roślinnego, następnie kilkakrotnego zamrażania i rozmrażania, oddzielenia utworzonych sferycznych form żelu z unieruchomionymi komórkami od oleju i przemycia detergentem i solą fizjologiczną z dodatkiem CaCl2, przechowywany w soli fizjologicznej z dodatkiem CaCl2 w temperaturze 4°C lub w formie wysuszonej, według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 sporządzony z mieszaniny zawiesiny komórek bakterii o stężeniu 109-1010/ml i 5-8 % (w/v) wodnego roztworu PVA o masie cząsteczkowej 20000-80000 Da zawierającego 1-2% (w/v) alginianu sodu, zawierającej 0,5 ml zawiesiny komórek bakterii na 10 ml roztworu PVA, którą po odpowietrzeniu pod próżnią wkrapla się do oleju schłodzonego do temperatury 0°C, następnie zamraża 3-5-krotnie do temperatury co najmniej -25°C na czas 10-24 godziny i rozmraża w temperaturze pokojowej. Hodowlę unieruchomionych komórek bakterii prowadzi się w podłożu zawierającym w 1 l pożywki: melasę buraczaną w ilości zapewniającej obecność 80 g czystej sacharozy lub hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych w ilości zapewniającej obecność 43 g czystej glukozy, 32 g ekstraktu drożdżowego, 6,2 g NH4Cl, z dokarmianiem czystą glukozą dodawaną w trakcie hodowli 3-4 razy w porcjach po 50 g/l podłoża, stosując 2-3 g unieruchomionych komórek bakterii na 25 ml podłoża, w temperaturze 37°C, okresowo w czasie 120-190 godzin. Hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych sporządza się jak opisano powyżej.
W poniższej tabeli 1 przedstawiono profil monosacharydów w hydrolizatach wytłoków jabłkowych (J) i w hydrolizatach wysłodków buraczanych wykorzystywanych w produkcji 2 ,3-BD.
PL 227 253 B1
T a b e l a 1
Cukier Hydrolizaty wytłoków jabłkowych Hydrolizaty wysłodków buraczanych
% suchej masy % w puli monosacharydów % suchej masy % w puli monosacharydów
Glukoza 20,1 28,8 18,0 30,5
Arabinoza 1,6 2,3 15,6 26,4
Kwas galakturonowy 4,8 6,9 14,6 24,7
Galaktoza 1,0 1,4 3,9 6,6
Fruktoza 39,9 57,1 3,5 5,9
Ksyloza 1,7 2,4 1,7 2,9
Mannoza 0,5 0,7 1,3 2,2
Ramnoza 0,1 0,1 0,4 0,7
Suma 69,8 100 59,0 100
Po rozpoczęciu fermentacji z użyciem nośnika z pułapkowanymi w nim komórkami bakterii następuje namnażanie bakterii w nośniku, a następnie częściowe uwalnianie komórek i namnażanie w pożywce. Po osiągnięciu odpowiedniego OD660 (6-8) w cieczy hodowlanej, preparat może być z niej usunięty i po odmyciu solą fizjologiczną (zawierającą 0,1 g/l CaCl2) wykorzystany w kolejnych hodowlach jako stabilne inokulum, bez konieczności uaktywniania szczepu na skosach i w prehodowlach i bez strat jego uzdolnień do produkcji 2,3-BD. Właściwy stan fizjologiczny komórek w żelu jest utrzymywany dzięki przenoszeniu ich do świeżych podłoży i odnawianiu się populacji. Po okresie dłuższego (kilkumiesięcznego) przechowywania preparatów w soli fizjologicznej w temperaturze 4°C, czas osiągnięcia odpowiedniego namnożenia komórek w nośniku i podłożu podczas pierwszej hodowli wynosi do 48 godzin. Nośnik z unieruchomionymi komórkami usuwa się po uzyskaniu odpowiedniego namnożenia bakterii w podłożu lub po zakończeniu hodowli i używa jako inokulum w kolejnych fermentacjach, lub przechowuje w soli fizjologicznej (zawierającej 0,1 g/l CaCl2) w temperaturze 4°C.
Sposób według wynalazku ilustrują poniższe przykłady.
P r z y k ł a d 1
0,5 ml zawiesiny komórek bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059, o stężeniu około 1010/ml zmieszano z 10 ml sterylnego 6% (w/v) wodnego roztworu PYA o masie cząsteczkowej 72 kDa i stopniu hydrolizy 97,5-99,5%, zawierającego 1,2% (w/v) alginianu sodu, przygotowanego w autoklawie w temperaturze 121°C w czasie 20 minut i następnie ochłodzonego do temperatury 30°C. Po dokładnym wymieszaniu i odpowietrzeniu mieszaninę wkroplono do 100 ml 2% (w/v) roztworu wodnego chlorku wapnia. Utworzone sferyczne formy żelu o wymiarach 3-4 mm pozostawiono w roztworze w ciągu doby. Następnie, po przemyciu solą fizjologiczną, przeniesiono je do 15 ml 1% (w/v) roztworu wodnego aldehydu glutarowego (GA) (pH 3) na okres 24 godzin.
W celu zablokowania pozostałych wolnych grup aldehydowych w GA, nośnik umieszczono w 250 ml 0,4 M roztworze glicyny na 24 godziny. Otrzymany preparat przemyto sterylną solą fizjologiczną z dodatkiem 0,1 g/l CaCl2 i przetrzymywano w tym roztworze w temperaturze 4°C do czasu jego użycia. Unieruchomiony szczep bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 wykorzystano w kolejnych hodowlach okresowych w podłożach zawierających w 1 l pożywki: hydrolizat enzymatyczny wysłodków buraczanych w ilości odpowiadającej 10 g glukozy, 2 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g NH4CI, stosując 2,6 g unieruchomionych komórek bakterii na 25 ml podłoża, w temperaturze 37°C, kolejno w czasie 48, 20, 20, 24, 24, 18, 18 i 24 godzin oraz w hodowlach okresowych w podłożach zawierających w 1 l pożywki: hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych w ilości odpowiadającej 25 g glukozy, 2 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g NH4CI, stosując 2,6 g unieruchomionych komórek bakterii na 25 ml podłoża, w temperaturze 37°C, kolejno w czasie 44, 21, 19,19,19 i 22 godzin.
Hydrolizaty enzymatyczne wysłodków buraczanych i wytłoków jabłkowych otrzymywano w wyniku działania na wysłodki lub wytłoki wieloenzymowym preparatem z Aspergillus niger IBT 90 zawierającym 36,2 U/ml celulazy, 73,2 U/ml ksylanazy, 123,2 U/ml pektynazy, 207,5 U/ml enzymów amylo6
PL 227 253 B1 litycznych i 74,5 U/ml inwertazy, przy czym stosowano 1 ml preparatu wieloenzymowego na 20 g suchej masy wysłodków lub wytłoków.
W poniższej tabeli 2 przedstawiono wyniki produkcji 2,3-BD w kolejnych hodowlach unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożach zawierających hydrolizat enzymatyczny wysłodków buraczanych (B).
T a b e l a 2
Nr hodowli I II III IV V VI VII VIII
Czas hodowli [godziny] 48 20 20 24 24 18 18 24
Stężenie 2,3-BD [g/l] 11,30 8,7 9,3 9,8 10,2 9,2 9,9 9,1
Produktywność [g 2,3-BD/l x godzina] 0,23 0,43 0,46 0,41 0,425 0,5 0,55 0,38
W poniższej tabeli 3 przedstawiono wyniki produkcji 2,3-BD w kolejnych hodowlach unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożach zawierających hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych (J).
T a b e l a 3
Nr hodowli I II III IV V VI
Czas hodowli [godziny] 44 21 19 19 19 22
Stężenie 2,3-BD [g/l] 16,80 16,90 12,36 16,20 15,10 16,30
Produktywność [g 2,3 BD/l x godzina] 0,38 0,8 0,65 0,85 0,79 0,74
P r z y k ł a d 2
0,5 ml zawiesiny komórek bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 o stężeniu około 1010/ml zmieszano z 10 ml sterylnego 12% (w/v) wodnego roztworu PVA o masie cząsteczkowej 72 kDa i stopniu hydrolizy 97,5-99,5%, zawierającego 0,025% (w/v) alginianu sodu, przygotowanego w autoklawie w temperaturze 121°C, w czasie 20 minut i następnie ochłodzonego do temperatury 30°C. Po dokładnym wymieszaniu i odpowietrzeniu mieszaninę wkroplono do naczynia zawierającego około 200 ml oleju jadalnego oziębionego do temperatury 0°C. Utworzone sferyczne formy żelu pozostawi ano w naczyniu i wraz z nim umieszczano w zamrażarce (-25°C) na okres 23 godzin. Po upływie tego czasu pojemnik wyjęto i rozmrożono żel pozostawiając go przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Cykl zamrażania/rozmrażania przeprowadzano 5-krotnie.
Otrzymane preparaty przechowywano w soli fizjologicznej (4°C) z dodatkiem 0,1 g/l CaCl2 do czasu użycia. Unieruchomiony szczep bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 użyto w kolejnych hodowlach okresowych w podłożach zawierających w 1 l pożywki: hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych w ilości odpowiadającej 25 g glukozy, 2 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g NH4CI, stosując 2,6 g unieruchomionych komórek bakterii na 25 ml podłoża, w temperaturze 37°C, w czasie 24, 19, 22 i 22 godziny.
Hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych otrzymano jak w przykładzie 1.
W poniższej tabeli 4 przedstawiono wyniki produkcji 2,3-BD w kolejnych hodowlach unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożach zawierających hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych (J).
T a b e l a 4
Nr hodowli I II III IV
Czas hodowli [godziny] 24 19 22 22
Stężenie 2,3-BD [g/l] 16,51 17,10 16,95 16,30
Produktywność [g 2,3-BD/l x godzina] 0,69 0,9 0,77 0,74
PL 227 253 B1
Unieruchomiony szczep bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 poddano także trzem hodowlom (użyto także w trzech hodowlach) z dokarmianiem glukozą (3x50 g/l podłoża) w podłożu o zoptymalizowanym składzie (bez składnika fosforanowego), zawierających w 1 l pożywki: hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych w ilości odpowiadającej 43 g glukozy (hodowla I i II w tabeli 5) lub melasę buraczaną w ilości odpowiadającej 80 g sacharozy (hodowla III w tabeli 5), 32 g ekstraktu drożdżowego, 6,2 g NH4CI, stosując 2,6 g unieruchomionych komórek bakterii na 25 ml podłoża, w temperaturze 37°C, w czasie odpowiednio 168 (hodowla I), 162 godziny (hodowla II) i 120 godzin (hodowla III), (do 48 godziny hodowle wstrząsane (130 rpm), od 48 godziny - stacjonarne; usunięcie nośnika po 48 godzinach).
W poniższej tabeli 5 przedstawiono wyniki produkcji 2,3-BD w hodowlach z dokarmianiem unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożu o optymalnym składzie, zawierającym hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych (hodowla I i II) lub melasę buraczaną (hodowla III).
T a b e l a 5
Nr hodowli I II III
Czas hodowli [godzina] 168 162 120
Stężenie glukozy*/sacharozy** i cukrów redukujących*** w podłożu wyjściowym [g/l] 43* 120*** 43* 120*** QQ** Q***
Zasilanie glukozą (50 g/l) (godzina fermentacji) 24, 42, 48 24, 48, 72 18, 24, 42
Stężenie 2,3-BD [g/l] 100,20 114,00 90,00
Produktywność [g 2,3-BD/l x godzina] 0,59 0,70 0,75
W hodowlach w podłożu o zoptymalizowanym składzie, zawierającym wyjściowo tylko hydrolizat wytłoków jabłkowych lub melasę jako źródło węgla oraz ekstrakt drożdżowy i NH4CI, w wyniku dokarmiania glukozą (3x50 g/l) szczep Bacillus licheniformis NCIMB 8059 wytwarzał od 90 do 114 g/l
2,3-BD. Nośnik z unieruchomionymi komórkami był usuwany po około 48 godzinach od rozpoczęcia fermentacji i po odmyciu solą fizjologiczną (z 0,1 g/l CaCl2) był używany w kolejnych hodowlach z zasilaniem, bez strat uzdolnień szczepu do produkcji 2,3-BD.

Claims (4)

1. Sposób wytwarzania 2,3-BD w drodze hodowli unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożu zawierającym źródło węgla, w którym stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii sporządzony z mieszaniny roztworu wodnego alkoholu poliwinylowego zawierającego alginian sodu i zawiesiny komórek bakterii, w drodze ogrzewania roztworu alkoholu poliwinylowego i alginianu sodu w autoklawie w temperaturze
121°C w czasie 20 minut, ochłodzenia do temperatury 30°C, zmieszania z zawiesiną bakterii, odpowietrzenia pod próżnią, wkroplenia tej mieszaniny do roztworu wodnego chlorku wapnia na czas 24 godziny, następnie wprowadzenia utworzonych sferycznych form żelu do wodnego roztworu aldehydu glutarowego na czas 24 godziny, przeniesienia do roztworu wodnego glicyny także na czas 24 godziny i w końcu odmycia solą fizjologiczną z dodatkiem chlorku wapnia przechowywany w soli fizjologicznej z dodatkiem chlorku wapnia, znamienny tym, że stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 sporządzony z mieszaniny zawiesiny komórek bakterii o stężeniu 109-1010/ml i 5-8% (w/v) wodnego roztworu alkoholu poliwinylowego o masie cząsteczkowej 20000-80000 Da zawierającego 1-2% (w/v) alginianu sodu, zawierającej 0,5 ml zawiesiny komórek bakterii na 10 ml roztworu alkoholu poliwinylowego z alginianem, którą, po odpowietrzeniu pod próżnią, wkrapla się do roztworu wodnego chlorku wapnia o stężeniu 1-2% (w/v) stosowanego w ilości 100-200 ml na 10,5 ml tej mieszaniny, następnie utworzone sferyczne formy żelu wprowadza się do roztworu wodnego aldehydu glutarowego o stężeniu 0,5-2,0% (w/v) i o pH 3, użytego w ilości 10-20 ml na 10,5 ml mieszaniny zawiesiny komórek bakterii i roztworu alkoholu poliwinylowego i w końcu otrzymany żel przenosi się
PL 227 253 B1 do 0,4 M roztworu wodnego glicyny, który używa się w ilości 250 ml na 10,5 ml mieszaniny zawiesiny komórek bakterii i roztworu alkoholu poliwinylowego, natomiast hodowlę unieruchomionych komórek bakterii prowadzi się w podłożu zawierającym w 1 l pożywki: hydrolizat enzymatyczny wysłodków buraczanych w ilości zapewniającej obecność 10 g czystej glukozy lub hydrolizat wytłoków jabłkowych w ilości zapewniającej obecność 25 g czystej glukozy, 2 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g chlorku amonu, stosując 2-3 g unieruchomionych komórek bakterii na 25 ml podłoża, w temperaturze 37°C, okresowo w czasie 12-36 godzin.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hydrolizaty enzymatyczne wysłodków buraczanych lub wytłoków jabłkowych otrzymuje się w wyniku działania na wysłodki lub wytłoki wieloenzymowym preparatem z Aspergillus niger IBT 90 zawierającym 36,2 U/ml celulazy, 73,2 U/ml ksylanazy, 123,2 U/ml pektynazy, 207,5 U/ml enzymów amylolitycznych i 74,5 U/ml inwertazy, przy czym stosuje się 1 ml preparatu wieloenzymowego na 20 g suchej masy wysłodków lub wytłoków.
3. Sposób wytwarzania 2,3-BD w drodze hodowli unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 w podłożu zawierającym źródło węgla, w którym stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii sporządzony z mieszaniny roztworu wodnego alkoholu poliwinylowego zawierającego alginian sodu i zawiesiny komórek bakterii, w drodze ogrzewania roztworu alkoholu poliwinylowego i alginianu sodu w autoklawie w temperaturze 121°C w czasie 20 minut, ochłodzenia do temperatury 30°C, zmieszania z zawiesiną bakterii, odpowietrzenia pod próżnią, wkroplenia do oziębionego oleju roślinnego, następnie kilkakrotnego zamrażania i rozmrażania, oddzielenia utworzonych sferycznych form żelu z unieruchomionymi komórkami od oleju i przemycia detergentem i solą fizjologiczną z dodatkiem chlorku wapnia, przechowywany w soli fizjologicznej z dodatkiem chlorku wapnia w temperaturze 4°C lub w formie wysuszonej, znamienny tym, że stosuje się preparat unieruchomionego szczepu bakterii Bacillus licheniformis NCIMB 8059 sporządzony z mieszaniny zawiesiny komórek bakterii o stężeniu 1 09-1010/ml i 5-8% (w/v) wodnego roztworu alkoholu poliwinylowego o masie cząsteczkowej 20000-80000 Da zawierającego 1-2% (w/v) alginianu sodu, zawierającej 0,5 ml zawiesiny komórek bakterii na 10 ml roztworu alkoholu poliwinylowego, którą po odpowietrzeniu pod próżnią, wkrapla się do oleju schłodzonego do temperatury 0°C, następnie zamraża 3-5-krotne do temperatury co najmniej -25°C na czas 10-24 godziny i rozmraża w temperaturze pokojowej, natomiast hodowlę unieruchomionych komórek bakterii prowadzi się w podłożu zawierającym w 1 l pożywki: melasę buraczaną w ilości zapewniającej obecność 80 g czystej sacharozy lub hydrolizat wytłoków jabłkowych w ilości zapewniającej obecność 43 g czystej glukozy, 32 g ekstraktu drożdżowego, 6,2 g chlorku amonu, z dokarmianiem czystą glukozą dodawaną w trakcie hodowli 3-4 razy w porcjach po 50 g/l podłoża, stosując 2-3 g unieruchomionych komórek bakterii na 25 ml podłoża, w temperaturze 37°C, okresowo w czasie 120-190 godzin.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że hydrolizat enzymatyczny wytłoków jabłkowych otrzymuje się w wyniku działania na wytłoki wieloenzymowym preparatem z Aspergillus niger IBT 90 zawierającym 36,2 U/ml celulazy, 73,2 U/ml ksylanazy, 123,2 U/ml pektynazy, 207,5 U/ml enzymów amylolitycznych i 74,5 U/ml inwertazy, przy czym stosuje się 1 ml preparatu wieloenzymowego na 20 g suchej masy wytłoków.
PL412465A 2015-05-25 2015-05-25 Sposób wytwarzania 2,3-butanodiolu PL227253B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL412465A PL227253B1 (pl) 2015-05-25 2015-05-25 Sposób wytwarzania 2,3-butanodiolu

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL412465A PL227253B1 (pl) 2015-05-25 2015-05-25 Sposób wytwarzania 2,3-butanodiolu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL412465A1 PL412465A1 (pl) 2016-12-05
PL227253B1 true PL227253B1 (pl) 2017-11-30

Family

ID=57405852

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL412465A PL227253B1 (pl) 2015-05-25 2015-05-25 Sposób wytwarzania 2,3-butanodiolu

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL227253B1 (pl)

Also Published As

Publication number Publication date
PL412465A1 (pl) 2016-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101411073B1 (ko) 폴리비닐 알코올 겔 내에 고정화된 효소 또는 미생물 형태의 생체촉매의 산업적 생산 방법, 이의 사용 방법, 및 이의 생산 장치
CN110734885B (zh) 一种用于发酵海杂鱼的复合微生物菌剂及酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥的制备方法
KR970009295B1 (ko) 트레할룰로스 및 이소말툴로스의 제조방법
Nimisha et al. Amylase activity of starch degrading bacteria isolated from soil
Otajevwo et al. Cultural conditions necessary for optimal cellulase yield by cellulolytic bacterial organisms as they relate to residual sugars released in broth medium
FR2644178A1 (fr) Micro-organisme de l'espece bacillus coagulans et procede utilisant ce micro-organisme pour produire de l'acide l(+)lactique optiquement pur
CN103266152B (zh) 一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法
FR2464992A1 (fr) Culture thermophile anaerobie productrice d'ethanol
Vijayabaskar et al. Amylase production by moderately halophilic Bacillus cereus in solid state fermentation
Aarti et al. Saccharification of alkali pre-treated aquatic weeds biomass using partially purified cellulase immobilized on different matrices
Suzuki et al. Production of extracellular thermostable pullulanase by an amylolytic obligately thermophilic soil bacterium, Bacillus stearothermophilus KP 1064
Raju et al. Production of amylase by using Pseudomonas aeruginosa isolated from garden soil
WO2013170440A1 (en) Bacterial culture media and methods for their preparation and use
Esawy et al. Characterization of extracellular dextranase from a novel halophilic Bacillus subtilis NRC-B233b a mutagenic honey isolate under solid state fermentation
CN108440655B (zh) 抗植物软腐病蛋白及其编码基因和构建的抗病菌株
PL227253B1 (pl) Sposób wytwarzania 2,3-butanodiolu
EP0737246B1 (fr) Souches bacteriennes du genre bacillus, phenotypiquement proches du genre lactobacillus, procede de culture et applications
Cassa-Barbosa et al. Isolation and characterization of yeasts capable of efficient utilization of hemicellulosic hydrolyzate as the carbon source
RU2091483C1 (ru) Способ получения бактериальных клеток рода clostridium, способных продуцировать споры и продукты метаболизма
CN112522121B (zh) 一种克鲁维酵母及其在生产木糖醇中的应用
CN117286063A (zh) 一种高活性饲用罗伊氏乳杆菌剂的制备方法
RU2177995C2 (ru) Штамм бактерий bacillus licheniformis - продуцент комплекса термостабильных амилолитических и протеолитических ферментов
CN103540580B (zh) 一种甘露聚糖酶及生产方法
BAJPAI et al. Immobilization of Kluyveromyces marxianus cells with inulinase in agar
Faridah et al. Characterization of extracellular protease from halophilic microbes isolated from Bledug Kuwu, Grobogan, Central Java