PL 227 373 B1 2 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest nowy przewodzacy polimer, zawierajacy monomer funkcyjny bis(2,2'-bitienylo)-(4-aminofenylo)metan oraz monomer sieciujacy, 2,2'-bis(2,2'-bitiofeno-5-ylo)-3,3'- -bitionaften, molekularnie wdrukowany za pomoca 2,4,6-trinitrofenolu, i sposób wytwarzania tego po- limeru jak równiez jego zastosowanie jako warstwa rozpoznajaca fluorescencyjnego czujnika che- micznego do selektywnego wykrywania i/lub oznaczania nitroaromatycznych zwiazków wybuchowych, w tym 2,4,6-trinitrofenolu. 2,4,6-Trinitrofenol (ang. 2,4,6-trinitrophenol, TNP), znany równiez jako kwas pikrynowy, jest wy- buchowym zwiazkiem nitroaromatycznym. Zwiazek ten wykorzystywany jest do produkcji zapalek, baterii elektrycznych i kolorowego szkla, a takze do trawienia miedzi i barwienia materialów tekstyl- nych. TNP jest wysoce toksyczny. Jego spozycie prowadzi do zatrucia [Wyman, J. F., Serve, M. P., Hobson, D. W., Lee, L. H., Uddin, D. E., J. Toxicol. Environ. Health, 37 (1992) 13]. Objawy zatrucia TNP to, m.in. bóle glowy i brzucha, nudnosci, wymioty a takze zóltawy odcien skóry. Wysoka dawka TNP moze spowodowac uszkodzenie erytrocytów, niezyt zoladka i jelit, zapalanie nerek, zóltaczka lub krwiomocz. Jezeli TNP dostanie sie do oka, to moze spowodowac jego podraznienie lub wywolac stan chorobowy rogówki oka. Dawka smiertelna dla królika to 120 mg/kg TNP [Patnaik, P., A comprehen- sive Guide to the Hazardous Properties of Chemical Substances, John Wiley & Sons, New Jersey, 2007]. Dlatego wykrywanie i selektywne oznaczanie 2,4,6-trinitrofenolu jest tak wazne. Do oznaczania TNP w ilosciach sladowych stosuje sie kilka metod. Wykorzystuje sie w nich ta- kie techniki analityczne jak woltamperometria, wysokosprawna chromatografia cieczowa, grawimetria i techniki spektroskopowe [Singh, S., J. Hazard. Mater., 144 (2007) 15]. Wsród tych ostatnich, techniki optyczne, a w szczególnosci fluorescencyjne, znajduja coraz szersze zastosowanie [Salinas, Y. Marti- naez-Manez, R., Marcos M. D., Sancenon, F., Costero, A. M., Parra, M., Gil, S., Chem. Soc. Rev., 41 (2012) 1261; Kim, H. N. Guo, Z., Zhu, W., Yoon, J., Tian, H., Chem. Soc. Rev., 40 (2011) 79]. Popu- larnosc tych technik zwiazana jest z mozliwoscia szerokiego wyboru zwiazków z ugrupowaniami o charakterze fluorofora lub chromofora. Techniki te charakteryzuja sie wysoka wykrywalnoscia i czu- loscia, a takze latwoscia wykonywania pomiarów spektrofotometrycznych. Wiekszosc dotychczas opublikowanych prac na ten temat glównie skupia sie na wykorzystaniu jako fluorofory mediatorów, takich jak np. polimer przewodzacy, poli[2-metoksy-5-(2-etyloheksyloksy)-1,4-fenylenowinylen] [Chu, F., Tsiminis, G., Spooner, N. A. Monro, T., Sens. Actuators. B, 199 (2014) 22], fluorescencyjnych na- nokompozytów sferycznych [Ma, Y., Li, H., Peng, S., Wang, L., Anal. Chem. 84 (2012) 8415], badz porowatych sieci polimerów [Zhang, W., Qiu, L. -G., Yuan, Y. -P, Xie, A. -J., Shen, Y. -H., Zhu, J. -F., J. Hazard. Mater., 221–222 (2012) 147]. Jednakze w przewazajacej mierze metody te obejmuja ozna- czanie TNP w fazie gazowej. Wykrywaniu i oznaczaniu TNP w roztworach moga sprostac czujniki chemiczne z dedykowa- nymi warstwami polimerów wdrukowanych molekularnie (ang. molecularly imprinted polimers, MIPs) jako elementami rozpoznajacymi zdolnymi do selektywnego i odwracalnego przylaczenia TNP. Opra- cowano juz MIP wdrukowany za pomoca TNP [ Huynh, T.-P., Sosnowska, M. I., Sobczak, J. W., KC, C. B., Nestrov, V. N., D'Souza, F., Kutner, W., Anal. Chem. 85 (2013) 8361], ale do oznaczania TNP nie wykorzystano jeszcze detekcji spektrofluorymetrycznej. W niniejszym zgloszeniu przedstawiamy przygotowanie takiego MIPu i jego zastosowanie w postaci warstwy rozpoznajacej czujnika spektro- fluorymetrycznego do selektywnego oznaczania TNP. Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie warstwy MIP i sposobu jej wytwarzania tak, aby mogla byc wykorzystana jako warstwa selektywnie rozpoznajaca TNP. Celem tym jest takze sposób jej osadzania na przetworniku sygnalu chemicznego za pomoca elektropolimeryzacji w warunkach potencjodynamicznych. Niniejszy wynalazek obejmuje rozpoznajacy przewodzacy polimer bisbitiofenowy, korzystnie w postaci warstwy polimeru molekularnie wdrukowanego, charakteryzujacy sie tym, ze stanowi go polimer zawierajacy bis(2,2'-bitienylo)-(4-aminofenylo)metan jako monomer funkcyjny, oraz 2,2'- -bis(2,2'-bitiofeno-5-ylo)-3,3'-bitionaften jako monomer sieciujacy, oraz luki molekularne wdrukowane za pomoca czasteczek 2,4,6-trinitrofenolu (TNP). Korzystnie, zastosowany monomer sieciujacy spel- nia równoczesnie role fluorofora. Ponadto obecny wynalazek obejmuje sposób wytwarzania rozpoznajacego przewodzacego po- limeru bisbitiofenowego, okreslonego powyzej, metoda wdrukowania molekularnego 2,4,6-trinitro- fenolu (TNP) za pomoca elektropolimeryzacji, korzystnie w warunkach potencjodynamicznych, charak- PL 227 373 B1 3 teryzujacy sie tym, ze prowadzi sie elektropolimeryzacje monomeru funkcyjnego stanowiacego bis(2,2'-bitienylo)-(4-aminofenylo)metan, w obecnosci monomeru sieciujacego stanowiacego 2,2'- -bis(2,2'-bitiofeno-5-ylo)-3,3'-bitionaften oraz w obecnosci 2,4,6-trinitrofenolu (TNP) jako szablonu, który to szablon jest wdrukowywany molekularnie w trakcie tej elektropolimeryzacji z wytworzeniem rozpoznajacego przewodzacego polimeru bisbitiofenowego z wdrukowanym molekularnie szablonem 2,4,6-trinitrofenolu (TNP), z którego wyekstrahowywuje sie szablon z uzyciem metanolu po osadzeniu tak otrzymanego polimeru w postaci warstwy na przetworniku sygnalu chemicznego/elektrodzie pracu- jacej i otrzymuje sie rozpoznajacy przewodzacy polimer bisbitiofenowy z lukami molekularnymi po wdrukowanym szablonie; przy czym monomer sieciujacy wystepuje w podwójnej roli, tj. z jednej strony sieciuje MIP-TNP a z drugiej jest fluoroforem, przy czym do elektropolimeryzacji stosuje sie roztwór mieszaniny rozpuszczalników, korzystnie acetonitrylu i toluenu, w stosunku objetosciowym, korzystnie, 95 : 5, zawierajacy 2,4,6-trinitrofenol (TNP), bis(2,2'-bitienylo)-(4-aminofenylo)metan i 2,2'-bis(2,2'-bitiofeno-5-ylo)-3,3'-bitionaften, korzyst- nie w stosunku molowym, 1:1:2, oraz elektrolit podstawowy, korzystnie chloran(VII) tetrabutyloamo- niowy, (TBA)CIO4, korzystnie 0,1 M, oraz przykladany potencjal jest liniowo zmieniany w sposób cykliczny w zakresie od 0 do 1,5 V, wzgledem Ag/AgCI, ze stala szybkoscia w zakresie od 5 mV/s do 5 V/s. Korzystnie, w sposobie wedlug wynalazku, przykladany potencjal jest liniowo zmieniany w spo- sób cykliczny w zakresie od 0,5 do 1,30 V wzgledem Ag/AgCI, ze stala szybkoscia 20 mV/s. Korzystnie, w sposobie wedlug wynalazku, do osadzania stosuje sie przetwornik sygnalu che- micznego/elektrode pracujaca wybrana sposród grupy stalych elektrod przewodzacych i pólprzewo- dzacych, korzystnie w postaci plytki szklanej z napylonym zlotem i plytki szklanej z warstwa tlenku cynowo-indowego. Wynalazek równiez obejmuje zastosowanie rozpoznajacego polimeru bisbitiofenowego, ko- rzystnie w postaci warstwy polimeru, molekularnie wdrukowanego za pomoca 2,4,6-trinitrofenol (TNP), okreslonego powyzej, jako elementu rozpoznajacego czujnika chemicznego do wykrywania i/lub se- lektywnego oznaczania 2,4,6-trinitrofenolu w próbkach biologicznych, jak i w czujnikach do wykrywa- nia i/lub oznaczania substancji wybuchowych, na uzyteczny sygnal analityczny za pomoca pomiarów spektrofluorymetrycznych. Wynalazek jest blizej przedstawiony w korzystnych przykladach wykonania z odniesieniem do zalaczonych rysunków, na których: Fig. 1 przedstawia zmiany pradu w zaleznosci od potencjalu podczas osadzania warstwy MIP, za pomoca elektropolimeryzacji w warunkach potencjodynamicznych, na (a) plytce szklanej pokrytej warstwa zlota i (b) plytce szklanej pokrytej warstwa ITO, przy czym polimeryzacja byla prowadzona dla roztworu 0,3 mM 2,4,6-trinitrofenolu, 0,3 mM bis(2,2'-bitienyl)-(4-aminofenyl)metanu oraz 0,6 mM 2,2'-bis(2,2'-bitiofeno-5-ylo)-3,3'- -bitionaftenu i 0,1 M (TBA)CIO4 mieszaniny dwóch rozpuszczalników organicznych, acetonitrylu i toluenu, w stosunku objetosciowym jak, odpowiednio, 95 : 5, a potencjal byl liniowo zmieniany w zakresie od 0,50 do 1,30 V vs Ag/AgCI z szybkoscia 20 mV/s, Fig. 2 przedstawia krzywe róznicowej woltamperometrii pulsowej dla roztworu 1 mM ferroce- nu w 0,1 M (TBA)CIO4, w acetonitrylu, na platynowej elektrodzie dyskowej o srednicy 1 mm pokrytej warstwa MIPu molekularnie wdrukowanego za pomoca TNP (krzywa 1) przed i (krzywa 2) po ekstrakcji szablonu TNP oraz (krzywa 3) po zanurzeniu elektro- dy z warstwa MIP-TNP z wyekstrahowanym szablonem do roztworu 50 nM TNP na 20 min, Fig. 3 przedstawia zdjecia mikroskopii sil atomowych, AFM, warstwy MIP-TNP osadzonej na plytce szklanej pokrytej (a) zlotem i (b) ITO o polu powierzchni (0,5 x 0,5) ?m 2 , Fig. 4 przedstawia widma PM-IRRAS dla plytki szklanej pokrytej warstwa zlota z (a) warstwa TNP odparowana z kropli roztworu acetonitrylu i (b) osadzona warstwa MIP-TNP za pomoca elektropolimeryzacji w warunkach potencjodynamicznych, na których za po- moca strzalek ciaglych zaznaczono drgania rozciagajace wiazania -NC a strzalkami przerywanymi drgania rozciagajace wiazania -NO2, obliczone metoda ab-initio (B3LYP/6-31G) dla swobodnej czasteczki, Fig. 5 przedstawia widma elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej zmiany rezystencji warstwy MIP-TNP osadzonego na platynowej elektrodzie dyskowej o srednicy 1 mm, PL 227 373 B1 4 w acetonitrylowym roztworze 1 mM ferrocenu w 0,1 M (TBA)CIO4, (krzywa 1) przed i (krzywa 2) po ekstrakcji szablonu TNP oraz (krzywa 3) po zanurzeniu elektrody z warstwa MIP-TNP z wyekstrahowanym szablonem na 20 min do roztworu 50 nM TNP, Fig. 6 przedstawia widma fluorescencji dla warstwy MIP-TNP osadzonej na plytce szklanej pokrytej warstwa zlota, przy dlugosci fali wzbudzajacej 350 nm, dla kolejno nanoszo- nych, a nastepnie odparowywanych, kropel acetonitrylowego roztworu analitu TNP w zakresie stezen od 2,5 do 50,6 ng ml -1 , Fig. 7 przedstawia krzywa kalibracji zmiany wzglednej fluorescencji wzgledem stezenia TNP w roztworze acetonitrylu, dla warstwy MIP-TNP osadzonej na plytce szklanej pokrytej warstwa zlota za pomoca elektropolimeryzacji potencjodynamicznej, dla kolejno nano- szonych, a nastepnie odparowanych, kropel acetonitrylowego roztworu analitu TNP w zakresie stezen od 2,5 do 50,6 ng ml -1 , Fig. 8 przedstawia stacjonarne widma fluorescencji, dla warstwy MIP-TNP z wyekstrahowa- nym szablonem TNP, osadzonej na plytce szklanej pokrytej warstwa ITO, dla róznych stezen titranta TNP, w zakresie od 0,46 do 22,45 mM, przy dlugosci fali wzbudzajacej 350 nm, Fig. 9 przedstawia krzywe kalibracji zmiany fluorescencji wzglednej dla warstwy MIP-TNP z wyekstrahowanym szablonem TNP, osadzonej na plytce szklanej pokrytej warstwa ITO wzgledem stezenia (krzywa 2) TNP, (krzywa 3) TNT, (krzywa 4) DNT oraz (krzy- wa 2) TNP dla warstwy polimeru niewdrukowanego molekularnie (ang. non-imprinted polimer, NIP). Korzystne przyklady wykonania wynalazku P r z y k l a d 1 Osadzanie warstwy polimeru wdrukowanego molekularnie za pomoca 2,4,6-trinitrofenolu na róznych elektrodach Przed osadzeniem warstwy MIP, zarówno plytki szklane pokryte warstwa zlota jak i plytki szkla- ne pokryte warstwa przewodzaca tlenku cynowo-indowego oczyszczono przez oplukanie toluenem, a nastepnie zanurzenie na 20 min w acetonie a nastepnie w wodzie, po czym na 10 min w izopro- panolu. Warstwy MIPów osadzono na ww. plytkach za pomoca elektropolimeryzacji potencjodynamicz- nej w kilku cyklach zmian potencjalu, z szybkoscia 20 mV/s, w zakresie od 0,50 do 1,30 V vs Ag/AgCI. Polimeryzacje przeprowadzono w ukladzie elektrochemicznym, w którym przeciwelektroda byla plytka szklana pokryta warstwa zlota umieszczona naprzeciw i równolegle do elektrody pracujacej. Na Fig. 1 przedstawiono zmiany pradu, towarzyszace zmianom potencjalu, prowadzace do osadzenia warstwy MIPów na plytkach szklanych pokrytych (a) zlotem i (b) ITO. Do elektropolimeryzacji zastosowano roztwór 0,3 mM 2,4,6-trinitrofenolu, 0,3 mM bis(2,2'- -bitienylo)-(4-aminofenylo)metanu oraz 0,6 mM 2,2'-bis(2,2'-bitiofeno-5-ylo)-3,3'-bitionaftenu w mie- szaninie dwóch rozpuszczalników organicznych, acetonitylu i toluenu, zmieszanych w stosunku obje- tosciowym jak, odpowiednio, 95 :5. Jako elektrolit podstawowy zastosowano chloran(VII) tetrabutylo- amoniowy, (TBA)CIO4, korzystnie o stezeniu 0,1 M. Po osadzaniu na plytkach, warstwe MIP-TNP oplukano acetonitrylem w celu usuniecia z niej resztek roztworu elektrolitu podstawowego. Podczas elektropolimeryzacji, zarówno na plytce szklanej pokrytej warstwa zlota jak i pokrytej warstwa ITO, zaobserwowano pik anodowy opowiadajacy elektroutlenieniu ugrupowania bis(2,2'- -tienylo)metanu. Dla plytki szklanej pokrytej warstwa zlota, pik pojawil sie w pierwszym cyklu przy potencjale -1,0 V vs Ag/AgCI. Nastepnie, w kolejnych dwóch cyklach, pik ten obnizal sie i przesuwal w kierunku bardziej dodatnich potencjalów. Bylo to spowodowane obnizeniem przewodnosci warstwy MIPu wraz ze wzrostem jej grubosci. Osadzana warstwa stanowi bariere, o rosnacej opornosci, utrud- niajaca dalsze elektroutlenianie ugrupowania bis(2,2'-tienylo)metanu w zadanym zakresie potencja- lów. Podczas osadzania warstwy MIP-TNP na plytce szklanej pokrytej warstwa ITO pik anodowy po- jawil sie przy potencjale -0,95 V vs Ag/AgCI i wzrósl w kolejnych dwóch cyklach. Oznacza to, ze poli- mer jest przewodzacy, a wzrost pradu moze byc zwiazany ze wzrostem powierzchni polimeru spowo- dowanym wzrostem szorstkosci warstwy osadzonego MIPTNP wraz ze wzrostem jej grubosci. Dla porównania przygotowano równiez warstwy niewdrukowanych polimerów (ang. non- imprinted polimers, NIPs). Osadzono je wedlug procedury opisanej powyzej jednakze z roztworu, który nie zawieral szablonu TNP. PL 227 373 B1 5 P r z y k l a d 2 Ekstrakcja szablonu 2,4,6-trinitrofenolu z osadzonej warstwy MIP-TNP W celu sprawdzenia czy szablon TNP jest calkowicie usuwany z warstwy MIPu za pomoca eks- trakcji, warstwe MIPu osadzono na dyskowej elektrodzie platynowej za pomoca elektropolimeryzacji w warunkach potencjodynamicznych stosujac kilka cykli zmiany potencjalu z szybkoscia 50 mV/s w zakresie od 0,50 do 1,25 V vs Ag/AgCI, z roztworu 0,3 mM 2,4,6-trinitrofenolu, 0,3 mM bis(2,2'- -bitienyl)-(4-aminofenyl)metanu, 0,6 mM 2,2'-bis(2,2'-bitiofeno-5-ylo)-3,3'-bitionaftenu i 0,1 M (TBA)CIO4 dwóch rozpuszczalników organicznych, acetonitylu i toluenu, zmieszanych w stosunku objetosciowym jak, odpowiednio, 95:5. Nastepnie szablon TNP wyekstrahowano z warstwy MIP-TNP metanolem. Ekstrakcje prowadzono przez 4 godz. przy ciaglym mieszaniu na mieszadle magnetycznym. Postep ekstrakcji kontrolowano za pomoca róznicowej woltamperometrii pulsowej (ang. differential pulse vol- tammetry, DPV), w zakresie potencjalów od 0 do 0,60 V vs Ag/AgCI, dla acetonitrylowego roztworu 0,1 mM ferrocenu i 0,1 M (TBA)CIO4 (fig. 2). Zaobserwowano pik przy potencjale 0,30 V, który malal wraz z postepem ekstrakcji. To obnizenie wysokosci piku zwiazane jest z obnizeniem przewodnosci warstw MIP spowodowane usuwaniem TNP z wdrukowanych luk molekularnych MIP-TNP. P r z y k l a d 3 Morfologia warstwy MIP W celu okreslenia morfologii i porównania osadzonych warstw MIPów na plytce szklanej z war- stwa zlota i na plytce szklanej z warstwa ITO wykonano zdjecia obszaru (0,5 x 0,5) ?m 2 mikroskopii sil atomowych (ang. atomie froce microscope, AFM) za pomoca mikroskopu MultiMode® 8 firmy Bruker sterowanego kontrolerem Nanoscope V w trybie Tapping Mode. Na podstawie tych zdjec oszacowano grubosc i szorstkosc tych warstw. Warstwa MIP-TNP osadzonej na plytce szklanej z warstwa zlota byla homogeniczna o niewielkiej szorstkosci (2,7±0,4 nm) (Fig. 3a), natomiast warstwa MIP-TNP osa- dzona na plytce szklanej pokrytej ITO byla niehomogeniczna o rozpoznawalnych ziarnach srednicy 10 nm (Fig. 3b). Warstwa ta byla stosunkowo szorstka (14,4 ± 0,9 nm). P r z y k l a d 4 Pomiary spektroskopii odbiciowo-absorpcyjnej z modulacja polaryzacji w podczerwieni dla warstwy MIP-TNP Wykonano pomiary spektroskopii odbiciowo-absorpcyjnej z modulacja polaryzacji w podczer- wieni (ang. polarization-modulation infrared reflection-absorption spectroscopy, PM-IRRAS), aby po- twierdzic osadzenie kompleksu TNP z monomerem funkcyjnym (Fig. 4). Do pomiarów zastosowano plytke szklana pokryta warstwa zlota z osadzona warstwa MIP-TNP jako próbke badana i taka plytke z osadzona przez odparowanie z kropli roztworu acetonitrylu warstwa TNP jako próbke porównawcza. Do rejestracji widm PM-IRRAS zastosowano spektrofotometr Vertex 8v z transformacja Fouriera, z modulem PMA50 i detektorem MCT(Hg-Cd-Te) kontrolowanym oprogramowaniem OPUS 6.5 firmy Bruker. Widma byly zbierane z powierzchni 0,3 cm 2 . Dla próbki porównawczej TNP analizowano pasma zarejestrowane przy 875, 1157, 1248, 1365 i 1428 cm -1 . Porównanie widm doswiadczalnych i wygenerowanych teoretycznie (ponizej) wykazuja, ze ww. pasma odpowiadaja drganiom rozciagajacym wiazan w grupie –NO2 (Fig. 4a). Dla próbki ba- danej MIP-TNP zaobserwowano podobne pasma przy 876, 1158, 1178, 1202, 1227, 1377 i 1431 cm -1 (Fig. 4b). Wskazuje to na obecnosc grupy –NO2 w próbce badanej i potwierdza wdrukowanie TNP w warstwe MIP-TNP. Widma IR zostaly równiez wygenerowane teoretycznie za pomoca teorii funkcjonalu gestosci (ang. density functional theory, DFT) z zastosowaniem metody B3LYP/6-31G w przyblizeniu harmo- nicznym za pomoca oprogramowania Gaussian 09 [Frisch, M.J., et al, Gaussian, Inc., Wallingford, CT, 2009]. W celu przypisania odpowiednich drgan wiazan do rejestrowanych pasm zastosowano proce- dure dwuetapowa. W jej pierwszym etapie zastosowano analize rozkladu energii wibracyjnej (ang. vibrational energy distribution analysis, VEDA). Obliczone za pomoca VEDA [Jamróz, M.H., Spectro- chim. Acta Part A, 114 (2013) 220] drgania w widmie IR zostaly opisane we wspólrzednych wewnetrz- nych. W drugim etapie porównano zmierzone widma IR z widmami teoretycznymi. Do porównania tego zastosowano oprogramowanie SPESCA [Spectroscopy and Molecular Modeling Group, Institute of Nuclear Chemistry and Technology, Warsaw, pp. accessed: 2014, http://smmg.pl/software/sowtware-spesca.htmn. Oprogramowanie to wykorzystuje metode regresji liniowej wazonej do przypisania czestotliwo- sci teoretycznie wygenerowanych drgan wiazan do eksperymentalnie wyznaczonych polozen pasm. PL 227 373 B1 6 P r z y k l a d 5 Pomiary rezystencji warstwy MIP-TNP za pomoca elektrochemicznej spektroskopii impe- dancyjnej Wykonano pomiary opornosci elektrycznej warstwy podwójnej za pomoca elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (ang. electrochemical impedance spectroscopy, EIS). Na dyskowej elek- trodzie platynowej o srednicy 1 mm osadzono warstwe MIP-TNP wedlug procedury opisanej w Przy- kladzie 2. Pomiary EIS przeprowadzono dla acetonitrylowego roztworu 0,1 mM ferrocenu i 0,1 M (TBA)CIO4. Do pomiarów zastosowano potencjostat SP-300 firmy BioLogic SAS (Claix, Francja) kom- puterowo sterowany za pomoca oprogramowania EC-LAB ® tego samego producenta. Pomiar prze- prowadzono przy potencjale otwartego obwodu dla czestotliwosci zmienianych w zakresie od 200 kHz do 100 mHz, co 10 mHz, przy amplitudzie 0,1 mV. Otrzymano trzy widma EIS (Fig. 5). Widma te przedstawiaja zmiane rezystencji (krzywa 1 na Fig. 5) przed i (krzywa 2 na Fig. 5) po ekstrakcji TNP wedlug procedury przedstawionej w Przykladzie 2, a takze (krzywa 3 na Fig. 5) po zanurzeniu elektro- dy z osadzona warstwa MIP-TNP z wyekstrahowanym szablonem TNP do 50 nM TNP na 20 min przy ciaglym mieszaniu za pomoca mieszadla magnetycznego. P r z y k l a d 6 Oznaczenie 2,4,6-trinitrofenolu za pomoca spektrofluorymetrii w warunkach stacjonarnych W celu oznaczenia TNP za pomoca spektroskopii fluorescencji, zastosowano plytki szklane po- kryte warstwa zlota i plytki szklane pokryte warstwa ITO z osadzonymi warstwami MIP-TNP. Warstwy te osadzono wedlug procedury przedstawionej w Przykladzie 1. Z warstw tych wyekstrahowano sza- blon TNP wedlug procedury z Przykladu 2. Do pomiarów fluorescencji zastosowano spektrofluorymetr Fluorolog-3 model FL3-22 firmy Horiba Jobin Yvon. Zarówno plytki szklane pokryte ITO jak i plytki szklane pokryte zlotem z osadzonymi warstwami MIP-TNP, z wyekstrahowanym szablonem, moco- wano w uchwycie do próbek stalych model J1933 pod katem 30° wzgledem promieniowania zródla wzbudzajacego. Pomiary byly prowadzone przy dlugosci fali wzbudzajacej 350 nm. Dzialanie chemosensora fluorescencyjnego polega na zmianie fluorescencji warstwy MIP-TNP z wyekstrahowanym szablonem po selektywnym zwiazaniu analitu TNP w lukach molekularnych polimeru. Dla plytki szklanej pokrytej zlotem przed pierwszym nakropleniem roztworu analitu zaobserwo- wano dwa piki fluorescencji, jeden przy 420 a drugi przy 600 nm (Fig. 6). Piki te stopniowo zanikaly wraz ze wzrostem stezenia nakraplanego, a nastepnie odparowywanego, acetonitrylowego roztworu analitu TNP. Pik przy 420 nm malal szybciej niz pik przy 600 nm. Natomiast w przypadku plytki pokry- tej ITO oba piki rosly wraz ze wzrostem stezenia nakraplanego roztworu analitu TNP. Wzrost ten byl najprawdopodobniej zwiazany z pecznieniem warstwy na skutek wnikania do niej czasteczek analitu i towarzyszacych im czasteczek rozpuszczalnika (Fig. 8). Aby skonstruowac krzywe kalibracyjne, wykreslono zaleznosc wzglednej fluorescencji od steze- nia analitu. Fluorescencja wzgledna, ?I, to stosunek intensywnosci fluorescencji warstwy MIP-TNP wyrazony Równaniem 1. ??? = ?? ?? 0 (1) W równaniu tym I to intensywnosc fluorescencji przed nakropleniem analitu natomiast I 0 to fluo- rescencja po nakropleniu kolejnego roztworu analitu TNP o danym stezeniu. Liniowy zakres stezeniowy rozciagal sie od 2,5 do 50,6 ng/ml, przy dlugosci fali 600 nm dla plytki szklanej pokrytej zlotem. Zaleznosc wzglednej fluoresencji od stezenia TNP opisano za pomoca równania regresji liniowej w postaci ?I = 1.014 ± (0.017) + 0.004 (± 0.001) cTNP/(ng L -1 ), natomiast dla plytki szklanej pokrytej ITO zaleznosc ta opisano równaniem postaci ?I = 0.973 ± (0.030) + 0.060 (± 0.003)cTNP / (ng L -1 ). Z równan tych wyznaczono czulosc, wspólczynnik korelacji, a takze dolna granice oznaczalnosci (ang. limit of detection, LOD) (Tabela 1). T a b e l a 1 Czulosc, wspólczynnik korelacji krzywej kalibracyjnej i dolna granica oznaczalnosci chemosensorów z warstwami MIP-TNP osadzonych na róznych podlozach Plytka szklana pokryta Czulosc ± odchyl. stand. ng -1 L Wspólczynnik korelacji LOD ng L -1 Au ITO (4±1) x 10 -3 (60±3) x 10 -3 0.85 0.98 2 0.2 PL 227 373 B1 7 Do pomiarów selektywnosci wybrano plytke szklana pokryta ITO z osadzona warstwa MIP, po- niewaz wykazywala wyzsza czulosc i wykrywalnosc niz plytka szklana pokryta zlotem. Wykonano pomiary fluorescencji dla plytki szklanej z ITO pokrytej warstwa NIPu w celu po- twierdzenia wdrukowania warstwy MIP-TNP. Warstwe NIPu osadzono na plytce z ITO wedlug proce- dury przedstawionej w Przykladzie 1. Pomiar fluorescencji warstwy NIPu wykazal, ze wiazanie TNP przez NIP bylo znacznie slabsze niz wiazanie TNP przez warstwe MIP-TNP z wyekstrahowanym sza- blonem TNP. Dlatego w przypadku warstwy NIPu, wraz ze wzrostem stezenia TNP w roztworze wzgledna fluorescencja wzrosla tylko nieznacznie. Wspólczynnik wdrukowania, tj. stosunek nachyle- nia krzywych kalibracyjnych dla warstwy MIPu i NIPu, wynosil 6,9. P r z y k l a d 7 Wyznaczenie selektywnosci chemosensora MIP-TNP za pomoca spektrofluorymetrii w wa- runkach stacjonarnych W celu wyznaczenia selektywnosci chemosensora przeprowadzono szereg pomiarów zmiany intensywnosci fluorescencji warstwy MIP-TNP z wyekstrahowanym szablonem osadzonej na plytce szklanej z ITO. Wyniki tych pomiarów przedstawiono w postaci krzywych kalibracyjnych na Fig. 9. W pomiarach tych oprócz analitu TNP nakraplane byly roztwory acetonitrylowe, o róznych stezeniach, substancji przeszkadzajacych w oznaczeniu TNP. Struktury tych substancji byly podobne do struktury analitu, tj. 2,4,6-trinitrotoluen, znany jako trotyl (ang. 2,4,6-trinitrotoluene, TNT) i 2,4-dinitrotoluenu (ang. 2,4-dinitrotoluene, DNT). Z nachylenia krzywych kalibracyjnych wyznaczono czulosci chemo- sensora z warstwa MIP-TNP wzgledem tych substancji. Selektywnosc chemosensora, której miara jest stosunek jego czulosci wzgledem TNP do czulosci wzgledem substancji przeszkadzajacej, jest dosc wysoka. Dla TNT wynosi ona 5,0 a dla DNT wynosi 1,5 (Tabela 2). T a b e l a 2 Czulosc chemosensora z warstwa MIP-TNP wzgladem substancji o podobnej budowie, przeszkadzajacych w oznaczeniu analitu Chemosensor / Analit Czulosc ± odchyl, stand., ng -1 L MIP-TNP/TNP MIP-TNP/TNT MIP-TNP / DNT (60±3) x 10 -3 (12±1) x 10 -3 (43±5) x 10 -3 Osadzanie warstwy MIPu wdrukowanego TNP za pomoca elektropolimeryzacji w warunkach potencjodynamicznych umozliwia wytworzenie warstwy o grubosci, homogenicznosci i szorstkosci odpowiedniej do oznaczenia 2,4,6-trinitrofenolu. Zastosowany monomer sieciujacy, 2,2'-bis(2,2'-bitiofeno-5-ylo)-3,3'-bitionaften, pelni podwójna role w niniejszym wynalazku. Z jednej strony zapewnia trwala trójwymiarowa strukture osadzanego MIP-TNP a z drugiej jest fluoroforem, który umozliwia oznaczanie TNP za pomoca spektrofluorymetrii w zakresie swiatla widzialnego. Zastosowanie chemosensora w pomiarach spektrofluorymetrycznych umozliwia szybkie i po- wtarzalne oznaczenie TNP. Chemosensor ten mozna latwo dostosowac do wykrywania i oznaczania podobnych wybuchowych zwiazków nitroaromatycznych. Osiagniete niskie granice oznaczalnosci dla chemosensorów, zarówno chemosensora z plytka szklana pokryta zlotem jak i plytka szklana pokryta ITO umozliwiaja wykrywanie i oznaczanie slado- wych ilosci 2,4,6-trinitrofenolu. PL