PL227811B1 - Zestaw diagnostyczny i sposób jednoczesnego wykrywania mutacji w obrębie genu NF1 dla grupy pacjentów z podejrzeniem choroby Recklinghausena. - Google Patents
Zestaw diagnostyczny i sposób jednoczesnego wykrywania mutacji w obrębie genu NF1 dla grupy pacjentów z podejrzeniem choroby Recklinghausena. Download PDFInfo
- Publication number
- PL227811B1 PL227811B1 PL408727A PL40872714A PL227811B1 PL 227811 B1 PL227811 B1 PL 227811B1 PL 408727 A PL408727 A PL 408727A PL 40872714 A PL40872714 A PL 40872714A PL 227811 B1 PL227811 B1 PL 227811B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- group
- jvf7
- amplicons
- primers
- mutations
- Prior art date
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 30
- 101150083321 Nf1 gene Proteins 0.000 title claims description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 10
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 27
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 6
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims description 4
- 102000007530 Neurofibromin 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010085793 Neurofibromin 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 claims description 2
- 101100404599 Caenorhabditis elegans nfi-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims 1
- 208000003019 Neurofibromatosis 1 Diseases 0.000 description 70
- 208000024834 Neurofibromatosis type 1 Diseases 0.000 description 70
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 3
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 102200002729 rs199474745 Human genes 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014970 Ephelides Diseases 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 208000003351 Melanosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010073338 Optic glioma Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 208000008511 optic nerve glioma Diseases 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 102220000147 rs137854552 Human genes 0.000 description 1
- 102220103032 rs199474742 Human genes 0.000 description 1
- 102220092573 rs876657714 Human genes 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny i sposób jednoczesnego wykrywania mutacji w obrębie genu NF1 dla grupy pacjentów z podejrzeniem choroby Recklinghausena.
Choroba Recklinghausena to choroba wywoływana przez mutacje w obrębie genu NF1, kodującego białko neurofibrominy, zlokalizowanego na chromosomie 17q11.2. Jest to gen o jednym z najwyższych współczynników występowania mutacji spontanicznych, co sprawia, że ich wykrycie jest szczególnie trudne.
Obraz kliniczny zmian wywoływanych przez mutacje w obrębie genu NF1 jest bardzo zróżnicowany, począwszy od zmian skórnych w postaci plam koloru kawy z mlekiem (cafe-au-lait), czy piegów w okolicach pach i pachwin po glejaka nerwu wzrokowego, patrz: Molecular genetics of neurofibromatosis type 1 (NF1); M.Shen i in. J Med. Genet 1996; 33:2-17. Ponieważ postawienie prawidłowego rozpoznania wyłącznie na podstawie objawów klinicznych choroby nie jest możliwe, stąd w diagnostyce neurofibromatozy typu I stosuje się różnego rodzaju metody analizy mutacji genu NF1.
W amerykańskim zgłoszeniu patentowym US20030134272 A1 ujawniono sposób analizy mutacji, w którym poprzez stymulację fytohemaglutyniną izolowanych z krwi obwodowej pacjenta limfocytów uzyskuje się B-limfoblastiodalną transformowaną EBV linię komórkową. Po izolacji RNA z tej linii komórkowej dokonuje się syntezy i amplifikacji cDNA poprzez reakcję RT-PCR i analizy cDNA za pomocą sekwencjonowania. Za pomocą sposobu ujawnionego w tym zgłoszeniu nie można dokonać masowej analizy wszystkich mutacji.
W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO03074740 A1 ujawniono sposób analizy mutacji, przy czym uniwersalna w założeniu twórców rozwiązania metoda pozwala na wykrywanie pojedynczych, znanych już mutacji, a zatem nie jest odpowiednia do wykrywania nowopowstających mutacji, które jeszcze nie są znane.
Patent amerykański US6238861 B1 ujawnia ogólny proces identyfikacji sekwencji genu NF1. W diagnozowaniu choroby wykorzystuje się standardowe sekwencjonowanie, przy czym ujawnienie nie zapewnia gotowego zestawu diagnostycznego a jedynie przedstawia ogólny zestaw technik, opartych na reakcji PCR i klasycznym sekwencjonowaniu.
Z kolei w amerykańskim zgłoszeniu patentowym US56005799 A ujawniono metodę wykrywania mutacji somatycznych w genie NF1, związanych z nieprawidłową regulacją białka ras u pacjentów z chorobą nowotworową. Metoda ta ujawnia analizę jedynie mutacji somatycznych i jest dedykowana określonej grupie pacjentów.
Znane w stanie techniki sposoby wykrywania mutacji w obrębie genu NF1 wymagają szeregu czynności przygotowawczych i muszą być prowadzone osobno dla każdego z pacjentów, co sprawia, że analiza mutacji genu NF1 jest wysoce czasochłonna i kosztowna.
Poza tym, mutacje w obrębie genu NF1 są wykrywane z podobną częstością w różnych eksonach, dlatego też pełna analiza mutacji w obrębie tego genu musi obejmować wszystkie 58 fragmentów kodujących.
Celem wynalazku jest dostarczenie zestawu diagnostycznego do wykrywania mutacji w obrębie genu NF1, który obejmuje pełną analizę mutacji w obrębie sekwencji kodujących oraz intronowych, odpowiedzialnych za splicing, dla tego genu a przy tym umożliwia szybkie i jednoczesne przeprowadzenie analizy dla wielu próbek pacjentów, przez co znacząco obniża się koszty analizy i zwiększa dostępność wykorzystania tej metody diagnostycznej jako rutynowego postępowania w diagnostyce choroby Recklinghausena.
Nieoczekiwanie został on zrealizowany zgodnie z niniejszym wynalazkiem.
Przedmiotem wynalazku jest zestaw primerów do wykrywania mutacji w obrębie genu NF1 u pacjentów z podejrzeniem choroby Recklinghausena, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące pule primerów:
PL 227 811 Β1
Grupa 1, obejmuje primery dla 20 amplikonów
AF/11F: ACTCCACAGACCCTCTCCTTG
AW11R: CTGGGATAAAGGGGATGGAG
NF1 2 1 F: AAGCTGTTAACGTGTTTTTTTTTTC
| 7VF7_2_1_R: | AAGAAAAGAAAGCAAATTCCCC |
| ArF7_3_l_F: | TCTGGGAGGTAAAATGGAAGA |
| NF1_3JJL· | TTGTCTGTCACCAGGTCAGC |
| NF1_4J_F: | TTTTGTTCTGTGTGTGTGTTTGA |
| NFl_4_l_R: | GGGGCAAAAGAACTTGTCTC |
| NF15JF: | AGATGATGTCTTGCTATGTTGC |
| 7VF7_5_1_R: | AAATGCTCATTTTCTCTACTGC |
| AT7_6_1_F: | TCCAAGGCATATTTGCTGTTT |
| AF/_6_1_R: | ACCCAGTTCCAAAATGCCTA |
| NF1 8 1 F: | TGTTGCCCTTGGGTTTTTAC |
A7-78JR: AAATCTTTGTTCATTGCCTGGT
AF/91F: TTGCTATAATATTAGCTACATCTGGAA 7VF7_9_1_R: AGAGTCAGAACTTTAATGTTAGCAATTATC NFll61 _F: ACACTTTGATAACTGTTTCTCT ATT/ ló l R: AACACTTTAGTAATCTCTCACC 7VF7_18_1_F: GTCTTCCACCCTTGACTCTC
A7?7_18_1_R: GCTACTTGAATTTCCCCTGT
AF7_19_1_F: GCTCTTCCTACTCCTTTTGG
7VF7_19_1_R: TTTCTGTTGCTAAGGGCATA
A/'7_27_l_l·: CAAAACCTAGAGAACTGGCATGT
PL 227 811 Β1
AF/27 1R:CATCTTTCTTCTGGCTCTGAAA AF7_29_1_F: AGACTCCATGCAGACTCTCTTC JVF/_29_1_R: TTAATGATCAAGGGGAGAAGG AF7_37_1_F: TGAATCCAGACTTTGAAGAATTGTT ,VF/_37 1 JC CTAGGGAGGCCAGGATATAGTCTAGT NF1_3 81 _F: GTGGGAACTCTTCCTTAAATGG 2VF7_38_1_R: ACCTACCGTAAACTCGGGTCAG AF7_42_2_F: TTAGCACGCTACATGCTGATG AF7_42_2_R:GCACTGAGTATTCCGCTTATGG NF1_A3_ 1 _F: G AGGTTTGATTTAGGG A AC ATGA 7VF7_43_1_R: CCAATAACACAGTCCATGCAA 7VF/_46_1_F: CCAAGATCACCATAGCATGAGA jVF7_46_1_R:TGAAAGAAAGTAACATTCAACACTGA AF7_51_1_R: GGCATCAAAAACTTTGCTACAC ^/_51_1_F: CCTAGGGATACACCAAGAGTTTG jVF7_55_1_F: TGAAGAAATGCCCCAGAAAG 2VF7_55_1_R:TGTCAACCAGTTACATTGGACA — Grupa 2, obejmuje primery dla 20 amplikonów
NF1J_\J·. AGGTTGCGCAGTTAGCAGTT NFl_7_iJL· TTGCTCCAAGGAAAGGAAGA AF7_10_l_F: TTCTTCTGGCAGCTGGATTT AF7101R: TGAAGCCAAAAAGAACAGCA AF/_12_1_F: ATGGTGTGTGTTTGCATGGT AF7_12_1_R: AGAGGAAATGAAGGACCCATT NFl_l3_2_F: TCCTGAGTCTTATGTCTGATACCATG AF7_13_2_R: TTGGCGTTTCAGCTAAACCC NFl_l 5_1_F: TCCAGTGTTATGTTTACCAAAAATG
PL 227 811 Β1
7VF/_15_1_R: CATTCATCGAAAGCATTGGT AF7_2O_1.F: ACTTGGCTGTAGCTGATTGA 2VF7_2O_1_R: ACTTTACTGAGCGACTCTTGAA NF121_2_F: TGGATAAAGCATAATTTGTCAAGT NF1_2l_2_R: TCTCTTATTTTTCACCTTTCTCTATGA AF7 23J F: TTTAGAATGCCTTCTCTTTTGTCT 7VF7_23_1_R: TGCTCTCTTTTCATGTCCTCCT ,VF/_25_1_F: TTTGGGTTGTGCTAATAATTTGTTT AF7_25_1_R: TTCCTATCCTAGTCCTGTCATGG YF/_28_1_F: TTTGCCTTAATTTAGCAAGTGG AF7_28_1_R: CCTACAGAAATGCACGAATAGG AF7_3 5_1 _F: GGATTGAAGTAGACATGGTCCTG 7VF7_35J_R: GTTGGATTCCCCAAACATGG 7VF/_36_1_F: CCCTTTAGAATGCCTGTTGC AF7_36_1_R: CCCTGCTATATGCTCCCAAG ATF7_39_2_F: TTAAAAATCGAGGGCCAGTTAC iVF/_39_2_R: AAGTGGTCCACAGGTCTCTAAAG AF7_4O_1_F: TTTTTCCCCGAATTCTTTATG JVF/_40_l_R: TCCCTAGTGTCTAGCGCAGT AF7_41_1_F: GCCTCAGGTAAAATAGAATTTTCAT AF7_41_1_R: GTCAATTATTTTGCACATCCTTCCA AF7_44_1_F: CACTTGCATGGACTGTGTTATTGGT AF7 44 1_R: AGCTCTTGGTTGCAGGGATGGAT jVF7_49_1_F: GGAAGAAGACCTCAGCAGATGC AF7_49_1_R: CAACCGCCAAAAAACCTATAGG rVF7_54_l_F: GGAGGCCCTTAAATATTAAAAACA AF7_54_1_R: TCTCATTTTGCCCTCTTTGC
PL 227 811 Β1
AF7_57_2_F: TTCTTGATGCCTTGATTGACAC NF1_57_2_R: TCAACCTTGGAATATCATGTGG VF7_58_1_F: TGCACAGACAAAATCGCCTA jVF7_58_1_R: CAAACCGGATGGGTTCATTA — Grupa 3, obejmuje primery dla 10 amplikonów
JVF/_11_1_F: TTGAAGTTCGTTICAAGACC JVF7_11_1_R: ACGCAAAGAAAAGAAAGAAAA 7VF7_14_1_F: GCCACTACCTCCCAAAGTCC NFiJ 4_1_R: GATAC AAAGC AAGTAAACCCCTTC AF7_17_l_F: CTCTTGGTTGTCAGTGCTTC jVF/_17_1_R: CAGAAAACAAACAGAGCACAT .\'F7_22_1_F: GTGTATGGGTACGAGTGTCTGC jVF7_22_I_R: AACGTACACAACTTCTGGCTACC 7VF/_24_1_F: CGTCATGTCACTTAGGTTATCTGG jVF7_24_1_R: TTTCAAACACAAAAGTTTGACATC AF7_26_1_F: TCGCGAGAGAGGAGAGAAAC 7VF7_26_1_R: TGTGGACAAACAGATGCAAA AF7_33_1F: TTTGGGAAGGTTAGAAACACTAC jVF/_33_1_R: CAAGCTATGTCTTGACCTAGAGC AF7_34_1_F: GTGTGAACAAGCCCTCCATA AF7 34J R: CCCAAAGAGCAAATCTGTGA 7VF7_5O_1 _F: TGCACATTTAACAGGTACTATGCTC AF7_5 0_ 1 R: TC ACTTACTCTTCCTAGGC C ATC AF7 52 1 F; TGGGAACAAAACCCTTTGAG
AF7 52 1 R: TTTTGAGAAATGGCAAACG — Grupa 4, obejmuje primery dla 9 amplikonów
PL 227 811 Β1
NF7_13_1_F: aacgattttcattgttttgttaagc AF7_13_ 1 _R: CTTATAGCTTCTTGTCTCCAGGTCTG 7VF7_3O_1_F: CGTTGCACTTGGCTTAATGT NF1J0_1_R: CCACACACCATCAGCAGCTA 7W7_31_1_F; TTTTTGTTGATTCCATTTGTGTT AF7311R: TGAAAGCTATTTTGTGCCAGA 7VF7_3 8_2_F: ACAAAAGTCCTAGGGCAATCAG jV7'7_38_2_R: TAACCAACACTGCATACCTTCC NF1 39 1 F: TTGGAACTATAAGGAAAAATACGTTT 7VF7_39_1_R: AGGGTTTTCTTTGAATTCTCTTAGA 7VF7_42_1_F: GTGCTAAAACTTTGAGTCCCATGT jV7r7_42_l_R: ATAATCTATATTGATCAGGTGAAGTA 7VF7_45_1_F: ATGCATATTGTTGAAAATACAGCTA jVF7_45_l_R: TTTCATTGACCTCAAATTTAAACG jVF7_56_1_F: TGGTTGACAACTTTTTATGCTGA JVF7_56_1_R: ATACACACACCCCAACACCA A7'7_57_1_F: ATATTTTTGGCTTCAGATGGG NF1 5 7 1 R: TTGGTGTCTTATATTGTTGCTC AA — Grupa 5, obejmuje primery dla 3 amplikonów
AF7_21_1 R: ATTGGATACAGAGCAGGAC 7VF7_21_1_F: CATGTGAGTGGAGGAGGA AF7 32J_F; TGCAAAGTTTGACCTTTGAACT 7VF7_32_1 _R: CAAAAGCACATAACTGAAAACCA 7VF7_47_1_F: CCCCAAAAGAGAAAACATGG 7VF7_47_1 _R: GCTGGTAAGGAAATATACTC ACAATAA — Grupa 6, obejmuje primery dla 2 amplikonów
PL 227 811 Β1
NF1481 _F: TGTTCTGTGGTTTTCTGC AGTC
JVF7_48_1_R: ATTACAGACGTGAGCCACCA .VF7_53_1_F: CTAAAGAAAGCTGTTGAATTTTAGAAG ,Y77_53 1 _R: GGCTGAATTGTTATCTGTTTGG
Korzystnie stężenia poszczególnych primerów w danej grupie mieszczą się w zakresie od 1 do 10 μΜ, zaś objętość puli uzupełniana jest wodą do wartości objętości końcowej 200 μΙ. Szczególnie korzystnie stężenie puli primerów w grupie 1 wynosi od 1 do 8 μΜ, w grupie 2 wynosi od 1 do 6 μΜ, w grupie 3 wynosi od 1 do 10 μΜ, w grupie 4 wynosi od 1,5 do 8 μΜ, w grupie 5 wynosi 1 μΜ, w grupie 6 wynosi od 1 do 1,5 μΜ.
Długości fragmentów poszczególnych amplikonów przedstawiono w tabeli 1.
| Amplikon | długość [pary zasad] |
| NF1 1 1 | 457 |
| NF1 2 1 | 228 |
| NF1 3 1 | 364 |
| NF1 4 1 | 414 |
| NF1 5 1 | 469 |
| NF1 6 1 | 511 |
| NF1 7 1 | 535 |
| NF1_8_1 | 473 |
| NF19 1 | 355 |
| NF1 10 1 | 435 |
| NF111 1 | 272 |
| NF1 12 1 | 383 |
| NF1 13 1 | 275 |
| NF1 13 2 | 248 |
| NF1 14 1 | 485 |
| NF1 15 1 | 569 |
| NF1 16 1 | 348 |
| NF1 17 1 | 261 |
| NF1 18..1 | 387 |
| NF1191 | 191 |
| NF1 20 1 | 247 |
| NF1 21 1 | 341 |
| NF1 21 2 | 551 |
| NF1221 | 455 |
| NF1 23 1 | 300 |
| NF1 24 1 | 334 |
PL 227 811 Β1
| NF1 25 1 | 366 |
| NF1 261 | 430 |
| NF1 27 1 | 422 |
| NF1 28 1 | 428 |
| NF1 29 1 | 423 |
| NF1 30 1 | 334 |
| NF1 31 1 | 326 |
| NF1 32 1 | 370 |
| NF1 33 1 | 410 |
| NF1 34 1 | 534 |
| NF1 35 1 | 441 |
| NF1 361 | 379 |
| NF1 37 1 | 644 |
| NF1 38 1 | 470 |
| NF1 38 2 | 428 |
| NF1 39 1 | 321 |
| NF1 39 2 | 419 |
| NF1 40 1 | 372 |
| NF1 41 1 | 446 |
| NF1 42 1 | 415 |
| NF142 2 | 431 |
| NF1 43 1 | 493 |
| NF1 44 1 | 364 |
| NF1 45 1 | 328 |
| NF1 46 1 | 307 |
| NF1 47 1 | 416 |
| NF1 48 1 | 436 |
| NF1...49 1 | 303 |
| NF1 50 1 | 381 |
| NF1 51 1 | 453 |
| NF1 52 1 | 439 |
| NF1 53 1 | 362 |
| NF1 54 1 | 319 |
| NF1 55 1 | 460 |
| NF1 56 1 | 427 |
| NF1 57 1 | 339 |
| NF1 57 2 | 416 |
| NF1 58 1 | 402 |
Dobór zestawów primerów w każdej z grup w sposób, obejmujących zarówno eksony jak i części intronowe odpowiedzialne za splicing, a także dopasowanie odpowiedniej długości fragmentów amplikonów stanowią o przewadze rozwiązania według wynalazku nad rozwiązaniami znanymi ze stanu techniki, gdyż pozwalają na dokonanie pełnej oceny mutacji, które zostały już wcześniej zidentyfikowane, jak również nowych, dotychczas niezidentyfikowanych mutacji. W rozwiązaniu według wynalazku istotny jest także dobór stężeń końcowych primerów w puli. W wyniku prac badawczych twórcy wynalazku ustalili, że korzystne stężenia primerów w zestawie według wynalazku dla danej grupy mieszczą się w zakresie od 1 do 10 μΜ.
Zestaw według wynalazku został tak zaprojektowany, by przy jego pomocy można było dokonać pełnej diagnostyki mutacji obszaru kodującego genu NF1, optymalny pod względem dokładności wykrywania mutacji i czasochłonności analizy.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania mutacji w obrębie genu NF1 u pacjentów z podejrzeniem choroby Recklinghausena, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:
PL 227 811 Β1
- izolację DNA z próbki krwi żylnej lub śliny pacjenta
- przygotowanie mieszaniny reakcyjnej dla każdego zestawu primerów z grup 1-6, przy czym — Grupa 1, obejmuje primery dla 20 amplikonów ;Y77J1J': ACTCCACAGACCCTCTCCTTG NF1J_1 _R: CTGGGATAAAGGGGATGGAG jW7_2_1_F: AAGCTGTTAACGTGTTTTTTTTTTC JVF7_2_1_R: AAGAAAAGAAAGCAAATTCCCC A'F/3 1 F: TCTGGGAGGTAAAATGGAAGA AA7_3JR: TTGTCTGTCACCAGGTCAGC jVF7_4_1_F: TTTTGTTCTGTGTGTGTGTTTGA VF7_4_1_R: GGGGCAAAAGAACTTGTCTC XF1_5_ 1 _F: AGATGATGTCTTGCTATGTTGC JVF/_5_1_R: AAATGCTCATTTTCTCTACTGC
PL 227 811 Β1
7VF7_6_1_F: TCCAAGGCATATTTGCTGTTT
NFl_6_l_R: ACCCAGTTCCAAAATGCCTA
7VF7_8_1_F: TGTTGCCCTTGGGTTTTTAC
7W*7_8_1_R: AAATCTTTGTTCATTGCCTGGT
7VF/_9_1_F: TTGCTATAATATTAGCTACATCTGGAA AF7 9 1R: AGAGTCAGAACTTTAATGTTAGCAATTATC 7VF7_1 6_1_F: ACACTTTGATAACTGTTTCTCT NF1 16 1 _R: AACACTTTAGTAATCTCTCACC AF7J81F: GTCTTCCACCCTTGACTCTC
AF/ISJR: GCTACTTGAATTTCCCCTGT
AF7_19_1_F: GCTCTTCCTACTCCTTTTGG
AF7191R: TTTCTGTTGCTAAGGGCATA
NF1_21_\_F: CAAAACCTAGAGAACTGGCATGT AF7_27_1 _R: CATCTTTCTTCTGGCTCTGAAA jVF7_29_1_F: AGACTCCATGCAGACTCTCTTC AF7_29_1_R: TTAATGATCAAGGGGAGAAGG AF7 37 1 F: TGAATCCAGACTTTGAAGAATTGTT
7VF7_37_1_R: CTAGGGAGGCCAGGATATAGTCTAGT AF7_38_1_F: GTGGGAACTCTTCCTTAAATGG AF7 38 1 R:ACCTACCGTAAACTCGGGTCAG
AF7 42 2 F: TTAGCACGCTACATGCTGATG
7VF7_42_2_R: GCACTGAGTATTCCGCTTATGG
7VF7_43_1_F: GAGGTTTGATTTAGGGAACATGA AF7 43 1R: CCAATAACACAGTCCATGCAA NF1_46_1_F: CCAAGATCACCATAGCATGAGA AF7_46_1_R: TGAAAGAAAGTAACATTCAACACTGA NF1_51_1_R: GGCATCAAAAACTTTGCTACAC
PL 227 811 Β1
NF/_51_1 _F: CCTAGGGATACACC AAGAGTTTG 2VF7_55J_F: TGAAGAAATGCCCCAGAAAG 2VF7_55_1_R:TGTCAACCAGTTACATTGGACA — Grupa 2, obejmuje primery dla 20 amplikonów
AF7_7_1_F: AGGTTGCGCAGTTAGCAGTT ArF/_7_l_R: TTGCTCCAAGGAAAGGAAGA 7VF7_1 O„1_F: TTCTTCTGGCAGCTGGATTT A7-7_10_l_R: TGAAGCCAAAAAGAACAGCA AF7_I2_1_F: ATGGTGTGTGTTTGCATGGT AF7 12 1R: AGAGGAAATGAAGGACCCATT AF7_1 3_2_F: TCCTGAGTCTTATGTCTGATACCATG 7VF7_13_2_R: TTGGCGTTTCAGCTAAACCC ,\F7J 5_1_F: TCCAGTGTTATGTTTACCAAAAATG
AF7151R: CATTCATCGAAAGCATTGGT jV7?7_2O_1_F: ACTTGGCTGTAGCTGATTGA AF7 20 1 R: ACTTTACTGAGCGACTCTTGAA NF1_21_2_F: TGGATAAAGCATAATTTGTCAAGT NF1_21 _2_R: TCTCTTATTTTTC ACCTTTCTCTATGA jVF7_23_l_F: TTTAGAATGCCTTCTCTTTTGTCT 7VF7_23_1_R: TGCTCTCTTTTCATGTCCTCCT AF7_25_1_F: TTTGGGTTGTGCTAATAATTTGTTT A7?7_25_1_R:TTCCTATCCTAGTCCTGTCATGG Λ^7 28J F: TTTGCCTTAATTTAGCAAGTGG 7VF7_28_1_R: CCTACAGAAATGCACGAATAGG A7?7_35_1_F: GGATTGAAGTAGACATGGTCCTG WF7_35 J_R: GTTGGATTCCCCAAACATGG 7VF7_36_1_F: CCCTTTAGAATGCCTGTTGC
PL 227 811 Β1 jVF7_36_l_R: CCCTGCTATATGCTCCCAAG AF7_39_2_F: TTAAAAATCGAGGGCCAGTTAC AF7_39_2_R:AAGTGGTCCAGAGGTGTGTAAAG AF7_40_l_F: TTTTTCCCCGAATTCTTTATG 7VF7_4O_1_R: TCCCTAGTGTCTAGCGCAGT NF141 _1 _F: GCCTCAGGTAAAATAGAATTTTCAT NFł_41_1_R: GTCAATTATTTTGC ACATCCTTCCA 7VF7_44_1_F: CACTTGCATGGACTGTGTTATTGGT NF1 44 1R:AGCTCTTGGTTGCAGGGATGGAT AF7_49_1_F: GGAAGAAGACCTCAGCAGATGC AF7_49_1_R: CAACCGCCAAAAAACCTATAGG 7VF7_54_1_F: GGAGGCCCTTAAATATTAAAAACA AF7 54 1 R: TCTCATTTTGCCCTCTTTGC NF1_57_2_F: TTCTTGATGCCTTGATTGACAC 7VF7_57_2_R: TCAACCTTGGAATATCATGTGG AF7_58_1_F: TGCACAGACAAAATCGCCTA AF7_58_1_R: CAAACCGGATGGGTTCATTA — Grupa 3, obejmuje primery dla 10 amplikonów
NF1J 1_1_F: TTGAAGTTCGTTTCAAGACC A'F7_11_1_R: ACGCAAAGAAAAGAAAGAAAA AF7_14_1_F: GCCACTACCTCCCAAAGTCC Λ7'7 14 1R: GATACAAAGCAAGTAAACCCCTTC AF7_17_1_F: CTCTTGGTTGTCAGTGCTTC AF7_17_1_R: CAGAAAACAAACAGAGCACAT AF7_22_1_F: GTGTATGGGTACGAGTGTCTGC JVF7_22_1_R: AACGTACACAACTTCTGGCTACC AF7_24_1_F: CGTCATGTCACTTAGGTTATCTGG
PL 227 811 Β1
AF7 24 1 R: TTTCAAACACAAAAGTTTGACATC AF7_26_1_F: TCGCGAGAGAGGAGAGAAAC jVF7_26_1_R: TGTGGACAAACAGATGCAAA 7VF7_33_1_F; TTTGGGAAGGTTAGAAACACTAC AF7_33_1_R: CAAGCTATGTCTTGACCTAGAGC AF7 34 1 F: GTGTGAACAAGCCCTCCATA .YF/34JR: CCCAAAGAGCAAATCTGTGA AF7 50 1 F: TGCACATTTAACAGGTACTATGCTC 7VF7 _50_l_R: TCACTTACTCTTCCTAGGCCATC 7VF7_52_1_F: TGGGAACAAAACCCTTTGAG A7'/_52_1_R: TTTTGAGAAATGGCAAACG — Grupa 4, obejmuje primery dla 9 amplikonów
AF7_13_1 _F: AACGATTTTCATTGTTTTGTTAAGC 7VF7_13_1_R: CTTATAGCTTCTTGTCTCCAGGTCTG 2VF7_3O_1_F: CGTTGCACTTGGCTTAATGT AF7_30_l_R: CCACACACCATCAGCAGCTA AF7_311 _F: TTTTTGTTGATTCCATTTGTGTT 7VF7_31_1_R: TGAAAGCTATTTTGTGCCAGA AF7_38_2_F: ACAAAAGTCCTAGGGCAATCAG jVF7_38_2_R: TAACCAACACTGCATACCTTCC AF7 39 1 F: TTGGAACTATAAGGAAAAATACGTTT
AF7 39 1 R; AGGGTTTTCTTTGAATTCTCTTAGA 7VF7_42_1_F: GTGCTAAAACTTTGAGTCCCATGT A'F7_42_1_R: ATAATCTATATTGATCAGGTGAAGTA yVF7_45_l_F: ATGCATATTGTTGAAAATACAGCTA 7VF7_45_1_R: TTTCATTGACCTCAAATTTAAACG AF7_56_1_F: TGGTTGACAACTTTTTATGCTGA
PL 227 811 Β1
7VF7_56_1_R: ATACACACACCCCAACACCA AF7_57_1_F: ATATTTTTGGCTTCAGATGGG 7VF7_57_1_R: TTGGTGTCTTATATTGTTGCTCAA — Grupa 5, obejmuje primery dla 3 amplikonów
7VF7_21 _l_R: ATTGGATACAGAGCAGGAC 7VF7_21_1_F: CATGTGAGTGGAGGAGGA 7VF7_32_1_F: TGCAAAGTTTGACCTTTGAACT 7VF7_32_1_R: CAAAAGCACATAACTGAAAACCA AF7 47 1 F: CCCCAAAAGAGAAAACATGG 7VF7_47_1 _R: GCTGGTAAGGAAATATACTC ACAATAA — Grupa 6, obejmuje primery dla 2 amplikonów jVF/_48_1_F: TGTTCTGTGGTTTTCTGCAGTC 7VF7_48_1_R: ATTACAGACGTGAGCCACCA ,VF7_53_1_F: CTAAAGAAAGCTGTTGAATTTTAGAAG 7VF7_53_1_R: GGCTGAATTGTTATCTGTTTGG
- przeprowadzenie reakcji multiplex PCR
- przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania genomowego
- sekwencjonowanie genomowe
- bioinformatyczna analiza danych.
Sposób wykrywania mutacji według wynalazku zapewnia dokonanie pełnej oceny mutacji występujących w regionach kodujących oraz w intronach, w częściach flankujących eksony genu NF1 i - zarówno mutacji, które zostały już wcześniej zidentyfikowane, jak również nowych, dotychczas niezidentyfikowanych, co ma szczególnie doniosłe znaczenie w diagnostyce choroby Recklinghausena. Diagnostyka mutacji genu NF1 sposobem według wynalazku pozwala na wczesne wykrycie zmian w obrębie genu NF1 i podjęcie terapii na wczesnym etapie rozwoju choroby, jeszcze przed pełnym wystąpieniem jej objawów.
Ze względu na fakt, iż diagnostyka mutacji genu NF1 sposobem według wynalazku wykorzystuje technologię multipleksowania produktów PCR w połączeniu z odczytem na wysokoprzepustowych maszynach genomowych możliwa jest jednoczesna analiza tego genu dla wielu pacjentów, przez co znacząco obniża się koszty i czas trwania tej analizy.
Jest to szczególnie ważne w przypadku chorób genetycznych, bowiem kompleksowe odczytanie sekwencji genów istotnych dla prawidłowej diagnozy jednocześnie dla wielu pacjentów znacząco zwiększa dostępność tej metody i w konsekwencji pozwala objąć badaniem nie tylko pacjentów, u których istnieje podejrzenie choroby Recklinghausena, ale również włączyć w takie badanie członków ich rodzin. Dzięki temu, że jednostkowy koszt analizy ulega obniżeniu, gdy bada się jednocześnie próbki od wielu pacjentów na raz, sposób według wynalazku może przyczynić się do szybszego wykrywania choroby Recklinghausena, a tym samym do podjęcia terapii lub zapobiegania rozwojowi skutków wywoływanych przez tę chorobę zanim wystąpią jej objawy.
Sposób wykrywania mutacji według wynalazku dla pacjenta jest bardzo komfortowy. Próbkę materiału genetycznego do badania pobiera się ze śliny lub krwi żylnej pacjenta. W przypadku pobie16
PL 227 811 Β1 rania próbki ze śliny pacjenta dodatkową zaletą sposobu jest to, że jest ona nieinwazyjna. Poza tym pobrana próbka ze śliny jest stabilna przez okres około roku od pobrania, dlatego umożliwia pobranie i przechowywanie dużych ilości wysokojakościowego materiału genetycznego, który nie ulega degradacji przez długi czas. Możliwe jest zatem samodzielne pobranie próbki przez pacjenta i jej przesłanie do laboratorium genetycznego.
Do pobrania materiału genetycznego ze śliny można wykorzystać komercyjnie dostępne zestawy, np. zestaw typu OG-510 Oragene-DNA firmy DNAGenotek.
Pobieranie materiału genetycznego z krwi żylnej pacjenta można realizować za pomocą zestawów próżniowych. Krew należy pobrać do probówki z odczynnikiem EDTA (np. probówka morfologiczna).
Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach wykonania, które nie ograniczają jego zakresu.
Przykład 1
A. Pobranie próbki materiału genetycznego i izolacja DNA
Materiał do badania pobrano z krwi żylnej pacjenta.
Izolację DNA z limfocytów obecnych w próbce krwi żylnej przeprowadzono za pomocą zestawu Blood Mini firmy A&A Biotechnology według procedury dołączonej do zestawu. Uzyskano 20 μΙ oczyszczonego DNA pacjenta.
II- REAKCJA MULTIPLEKS PCR
1. Dokonano pomiaru stężenia próbek genomowego DNA (gDNA) (metodą fluorescencyjną z użyciem odczynnika PicoGreen®).
2. Przygotowano mieszaninę reakcyjną dla każdej z pul primerów 1-6.
| Odczynnik | Stężenie początkowe | Stężenie końcowe w mieszaninie | Objętość [μΐ] |
| DNA genomowe | 20-40 ng/μΙ | 1 | |
| MasterMix | 2x | lx | 12,5 |
| DMSO | 100% 5% | 1,25 | |
| Pula primerów 1 -6 | różne | 1-10 μΜ | 1 |
| Woda Milli-Q® | do 25 |
3. Warunki reakcji PCR:
| 95°C | 30 cykli: |
| 94°C | 30 s |
| 60°C | 90 s |
| 72°C | 60 s |
| 72°C | 7 min |
| 4°C | hołd |
4. Dodatkowo, jako etap opcjonalny sprawdzono na żelu agarozowym otrzymane amplikony (1 μΙ buforu obciążającego, 3 μΙ próbki, 1,8%-2% agaroza, 0,5x TBE, marker wielkości 100-1000 bp, 70V, 45 min).
5. Zmierzono stężenia pul amplikonów (metodą fluorescencyjną z użyciem odczynnika PicoGreen®).
6. Dla każdej próbki (pacjenta) połączono pule 1-6, w ilości:
χ μΙ danej puli =10* liczba amplikonów / stężenie z PicoGreen®
PL 227 811 B1
W ten sposób w końcowej puli danej próbki (pacjenta) uzyskano 10 ng każdego amplikonu.
7. Obliczono końcowe stężenie (c) puli:
c puli= suma amplikonów * 10/ całkowita objętość puli
8. Do oczyszczania pobrano 200 ng amplikonów każdej próbki (pacjenta).
V = 200 /c puli
9. Jeśli wyliczona ilość jest większa niż faktyczna, bierze się całość puli.
10. Prowadzono oczyszczanie amplikonów z użyciem odczynnika AMPure XP Beads (1,5x objętości). Eluowano amplikony w 42,5 μl wody Milli-Q® (ultraczysta woda typu 1, uzyskiwana w urządzeniu firmy MilliporeCorp.)
B. Przygotowanie biblioteki fragmentów DNA przygotowanej do sekwencjonowania genomowego z użyciem odczynników dostarczonych przez producenta (Illumina) lub odpowiedników
Niniejszy protokół przedstawia przygotowanie biblioteki z użyciem odczynników NEBNext® DNA Library Prep Master Mix for Illumina oraz NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina.
a) WYKAŃCZANIE KOŃCÓW Mieszanina reakcyjna:
DNA 42,5 ul
NEBNext End Repair Reaction Buffer (10X) 5 μl
NEBNext End Repair Enzyme Mix_2,5 ul ul
Inkubowano przez 30 minut w temperaturze 20°C. Oczyszczano z użyciem odczynnika AMPure XP Beads (1,6x objętości). Eluowano w 21 ul wody Milli-Q®.
b) ADENYLACJA NA 3' KOŃCU
Mieszanina reakcyjna:
DNA 21 ul
NEBNext dA-Tailing Reaction Buffer (10X) 2,5 ul Klenow Fragment (3' > 5' exo-)_1,5 ul ul
Inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C.
Oczyszczano z użyciem odczynnika AMPure XP Beads (1,6x objętości). Eluowano w 17,25 ul wody Milli-Q®.
c) LIGACJA ADAPTORÓW
Mieszanina reakcyjna:
| DNA | 17 ul |
| Quick Ligation Reaction Buffer (5X) | 5 ul |
| Quick T4 DNA Ligase | 2,5 ul |
| NEBNext Adaptor | 0,5 ul |
| 25 ul |
Inkubowano przez 15 minut w temperaturze 20°C.
Dodano 1,5 ul USER™ enzyme mix, wymieszano przez pipetowanie.
Inkubowano przez 15 minut w 37°C.
Oczyszczono z użyciem odczynnika AMPure XP Beads (1,4x objętości).
Eluowano w 25 ul wody Milli-Q®.
Oczyszczono ponownie z użyciem odczynnika AMPure XP Beads (1,0x objętości). Eluowano w 20 ul wody Milli-Q®
d) AMPLIFIKACJA PCR Mieszanina reakcyjna:
DNA 20 ul
Universal PCR Primer (25 uM) 0,5 ul
Index Primer (25 uM) 0,5 ul
NebNext High-Fidelity 2X PCR MasterMix 21 ul ul
PL 227 811 Β1
Składniki reakcji pipetowano w temperaturze 4°C.
| 98°C | 30 s | |
| 8 cykli | ||
| 98°C | 10s | |
| 65°C | 30 s | |
| 72°C | 30 s | |
| 72°C | 5 min | |
| 4°C | hołd |
Zmierzono stężenia bibliotek metodą fluorescencyjną (PicoGreen®). Na fig. 1 rysunku przedstawiono wynik elektroforezy na urządzeniu Agilent 2100 Bioanalyzer poszczególnych pul amplikonów uzyskanych sposobem według wynalazku oraz przygotowanej biblioteki do sekwencjonowania.
C. Sekwencjonowanie genomowe w urządzeniu MISEQ (lllumina)
Sekwencjonowanie prowadzone jest zgodnie z protokołem producenta (lllumina) z wykorzystaniem zestawu odczynników dostarczonych przez producenta (lllumina).
D. Analiza informatyczna danych z sekwencjonowania
Dane uzyskane w wyniku sekwencjonowania poddane są najpierw kontroli jakości. Usuwane są sekwencje adaptorów używanych w procesie sekwencjonowania oraz usuwane są fragmenty odczytów, których średnia lokalna jakość <20. Dalsza analiza jest wykonywana z wykorzystaniem zarówno oprogramowania ogólnie dostępnego, jak i komercyjnego. W każdym przypadku jako wynik uzyskuje się listę wariantów o wysokiej jakości (>=30). Do oznaczenia stopnia patogenności każdego wariantu wykorzystywane są bazy danych, takie jak dbSNP, ClinVar.
E. Walidacja metody
W celu zwalidowania metody diagnostycznej przeprowadzono badania klasyczną metodą sekwencjonowania Sangera. Mutacje wykryte za pomocą sposobu według wynalazku były zgodne w wynikami metody klasycznej, co świadczy o prawidłowości i powtarzalności metody według wynalazku w wykrywaniu mutacji w obrębie genu NF1.
Wynik identyfikacji mutacji przy wykorzystaniu sekwencjonowania genomowego sposobem według wynalazku przedstawiono na Fig. 2 rysunku. Przy użyciu zestawu według wynalazku, za pomocą sposobu według wynalazku wykryto następujące mutacje przedstawione w Tab. 1.
T a b e I a 1. Wykryte mutacje
| Położenie | znana | nowa |
| ,YF7:NM 000267.3:exon39:c.C5839T:p,R1947X | + | |
| ΛΈ/:ΝΜ 000267.3 :c.6756+1 G>T | + | |
| NF1: NM 000267.3 :exon20:c.G2330C:p.W777S | -I- | |
| NF1: NM 000267.3 :exon37:c.C5242T:p.R1748X | + | |
| NFJ: NM 000267.3:exon44:c.C6709T:p.R2237X | + | |
| NFJ: NM 000267.3:exon28:c.C3826T:p.R1276X | + | |
| Λϊ·7:ΝΜ 000267:exonl8:c.2154 2155insA:p.D718fs | + | |
| Λ7·7: NM 000267:exonl0:c.l 131 1134del:p.377 378del | + |
PL 227 811 Β1
Claims (4)
1. Zestaw primerów do wykrywania mutacji w obrębie genu NF1 u pacjentów z podejrzeniem choroby Recklinghausena, znamienny tym, że obejmuje następujące pule primerów, gdzie — Grupa 1, obejmuje primery dla 20 amplikonów
NFI 1 1 F: ACTCCACAGACCCTCTCCTTG
7VF/_1_1_R:
CTGGGATAAAGGGGATGGAG
AF7_2_1_F:
AAGCTGTTAACGTGTTTTTTTTTTC
AF7_2_1_R:
AAGAAAAGAAAGCAAATTCCCC
AF7_3_1_F:
TCTGGGAGGTAAAATGGAAGA
7VF7_3_1_R:
TTGTCTGTCACCAGGTCAGC
AF741F:
TTTTGTTCTGTGTGTGTGTTTGA
A?7_41R:
GGGGCAAAAGAACTTGTCTC
AF751F:
AGATGATGTCTTGCTATGTTGC
WF7_5_1_R:
AAATGCTCATTTTCTCTACTGC
AF/_6_1_F:
TCCAAGGCATATTTGCTGTTT
jVF7_6_1 R:
ACCCAGTTCCAAAATGCCTA
AF7_8_1_F:
TGTTGCCCTTGGGTTTTTAC
A1V_8_1_R:
AAATCTTTGTTCATTGCCTGGT
AF7_9_1_F:
TTGCTATAATATTAGCTACATCTGGAA
NFI 9 1 R:
AGAGTCAGAACTTTAATGTTAGCAATTATC yVF7_l 6_1_F: ACACTTTGATAACTGTTTCTCT ΛΤ716 _1_R: AACACTTTAGTAATCTCTCACC 2VF7_18_1_F: GTCTTCCACCCTTGACTCTC NF7_181 _R: GCTACTTGAATTTCCCCTGT 7VF7 19 1 F: GCTCTTCCTACTCCTTTTGG
PL 227 811 Β1
AF71 9_1_R: TTTCTGTTGCTAAGGGCATA
AF7_27_1_F:CAAAACCTAGAGAACTGGCATGT
AF7_27_1_R:CATCTTTCTTCTGGCTCTGAAA jVF7_29_1_F: AGACTCCATGCAGACTCTCTTC
AF7_29_1_R:TTAATGATCAAGGGGAGAAGG
Λ7-7 3 7_ 1 _F: TGAATCCAGACTTTGAAGAATTGTT
AF7_37_1_R:CTAGGGAGGCCAGGATATAGTCTAGT
A7-7_38_1_F: GTGGGAACTCTTCCTTAAATGG
AF7_38_1_R:ACCTACCGTAAACTCGGGTCAG
7VF7_42_2_F:TTAGCACGCTACATGCTGATG
7VF7_42_2_R:GCACTGAGTATTCCGCTTATGG
NF1_43_ 1_F: GAGGTTTGATTTAGGGAACATGA
7VF7_43_1_R:CCAATAACACAGTCCATGCAA
YF7_46_1_F: CCAAGATCACCATAGCATGAGA jYF7_46_l_R:TGAAAGAAAGTAACATTCAACACTGA
JVF7_51_1_R:GGCATCAAAAACTTTGCTACAC
NF1_51_1_F: CCTAGGGATACACCAAGAGTTTG
7VF7_55_1_F: TGAAGAAATGCCCCAGAAAG
AF7_55_1_R:TGTCAACCAGTTACATTGGACA — Grupa 2, obejmuje primery dla 20 amplikonów
YF7_7_1_F: AGGTTGCGCAGTTAGCAGTT AF/_7_1_R: TTGCTCCAAGGAAAGGAAGA A7/_1O_1_F: TTCTTCTGGCAGCTGGATTT AF/JOJR: TGAAGCCAAAAAGAACAGCA AF712J F: ATGGTGTGTGTTTGCATGGT JVF7_12_1_R: AGAGGAAATGAAGGACCCATT AF7_13_2_F: TCCTGAGTCTTATGTCTGATACCATG
PL 227 811 Β1 /YF7 J3_2_R: TTGGCGTTTCAGCTAAACCC NF1J 5_1 _F: TCCAGTGTTATGTTTACCAAAAATG AF7 _151 _R: CATTCATCGAAAGCATTGGT JVF7_2O_1_F: ACTTGGCTGTAGCTGATTGA AF7_2O_1_R: ACTTTACTGAGCGACTCTTGAA NF1_21 _2_F: TGGATAAAGCATAATTTGTCAAGT 7VF7_21_2_R: TCTCTTATTTTTC ACCTTTCTCTATGA AF7_23_1_F: TTTAGAATGCCTTCTCTTTTGTCT NF1_23 J R: TGCTCTCTTTTCATGTCCTCCT AF7_25_1_F: TTTGGGTTGTGCTAATAATTTGTTT NF1 _25_1 R: TTCCTATCCTAGTCCTGTC ATGG 7VF7_28J_F: TTTGCCTTAATTTAGCAAGTGG 7VF7_28_1_R: CCTACAGAAATGCACGAATAGG NFl_35_l_F: GGATTGAAGTAGAC ATGGTCCTG AF7 35JR: GTTGGATTCCCCAAACATGG 7VF7_36_1_F: CCCTTTAGAATGCCTGTTGC AF7_36_1_R: CCCTGCTATATGCTCCCAAG 7VF7_39_2_F: TTAAAAATCGAGGGCCAGTTAC 7VF7_39_2_R: AAGTGGTCCAGAGGTGTGTAAAG AF/_40J_F: TTTTTCCCCGAATTCTTTATG AF7_40_l_R: TCCCTAGTGTCTAGCGCAGT ;VF/41_1_F: GCCTCAGGTAAAATAGAATTTTCAT 7VF7_41_1_R:GTCAATTATTTTGCACATCCTTCCA AF7_44_1 _F: CACTTGCATGGACTGTGTTATTGGT AF7_44_1_R: AGCTCTTGGTTGCAGGGATGGAT 7VF7_49_1_F: GGAAGAAGACCTCAGCAGATGC AF7_49_1_R: CAACCGCCAAAAAACCTATAGG
PL 227 811 Β1
AF/54 1F: GGAGGCCCTTAAATATTAAAAACA YF/_54_1_R: TCTCATTTTGCCCTCTTTGC JVF7_57_2_F: TTCTTGATGCCTTGATTGACAC AF7_57_2_R:TCAACCTTGGAATATCATGTGG 7VF7_58_1_F: TGCACAGACAAAATCGCCTA AF7_58_1_R: CAAACCGGATGGGTTCATTA — Grupa 3, obejmuje primery dla 10 amplikonów
AF7 J1_1_F: TTGAAGTTCGTTTCAAGACC AF7_11_1_R: ACGCAAAGAAAAGAAAGAAAA 2VF7_14_1_F: GCCACTACCTCCCAAAGTCC 7VF7_14_1 R: GATACAAAGCAAGTAAACCCCTTC 7VF7_17_1_F: CTCTTGGTTGTCAGTGCTTC AF7171R: CAGAAAACAAACAGAGCACAT NFl_22_l_F: GTGTATGGGTACGAGTGTCTGC AF7 22 1 R: AACGTACACAACTTCTGGCTACC AF7_24_1_F: CGTCATGTCACTTAGGTTATCTGG AF7_24_ 1_R: TTTC AAAC AC AAAAGTTTGAC ATC AF7_2ó_l_F: TCGCGAGAGAGGAGAGAAAC jVF/_26_1_R: TGTGGACAAACAGATGCAAA WF7_33_1_F: TTTGGGAAGGTTAGAAACACTAC AF7_33_1_R:CAAGCTATGTCTTGACCTAGAGC AF7_34_1_F: GTGTGAACAAGCCCTCCATA AF7_34_1_R: CCCAAAGAGCAAATCTGTGA YF7_5O_1_F: TGCACATTTAACAGGTACTATGCTC AF7_5O_1_R: TCACTTACTCTTCCTAGGCCATC NFIJ2JJ: TGGGAACAAAACCCTTTGAG NF1 _52_1_R: TTTTGAGAAATGGCAAACG
PL 227 811 Β1 — Grupa 4, obejmuje primery dla 9 amplikonów
NF1 _13_ 1 _F: AACGATTTTCATTGTTTTGTTAAGC AF713_1_R: CTTATAGCTTCTTGTCTCCAGGTCTG AF7_30_l_F: CGTTGCACTTGGCTTAATGT AF7_3O_1 _R: CC ACACACCATC AGCAGCTA NF1_31 _1 _F: TTTTTGTTGATTCCATTTGTGTT NF1J 1_ IR: TGAAAGCTATTTTGTGCC AGA AF7_38_2 F: ACAAAAGTCCTAGGGCAATCAG AF7_38_2_R:TAACCAACACTGCATACCTTCC AF7_39_1 _F: TTGGAACTATAAGGAAAAATACGTTT jVF7_39_l_R:AGGGTTTTCTTTGAATTCTCTTAGA AF7_42_1_F: GTGCTAAAACTTTGAGTCCCATGT 7VF7_42_1_R:ATAATCTATATTGATCAGGTGAAGTA jVF7_45_1_F: ATGCATATTGTTGAAAATACAGCTA jVF7_45_l_R:TTTCATTGACCTCAAATTTAAACG FF156J _F: TGGTTGAC AACTTTTTATGCTGA AF7 56 1_R:ATACACACACCCCAACACCA AF7_57_1_F: ATATTTTTGGCTTCAGATGGG 7VF7_57_1_R:TTGGTGTCTTATATTGTTGCTCAA — Grupa 5, obejmuje primery dla 3 amplikonów ?VF7_21_1_R: ATTGGATACAGAGCAGGAC AF7_21_1_F; CATGTGAGTGGAGGAGGA NFi_32_1_F: TGCAAAGTTTGACCTTTGAACT jVF7_32_1_R: CAAAAGCACATAACTGAAAACCA AF7_47_1_F: CCCCAAAAGAGAAAACATGG AF7_47_1_R: GCTGGTAAGGAAATATACTCACAATAA
PL 227 811 Β1 — Grupa 6, obejmuje primery dla 2 amplikonów
JVF/_48_1_F: TGTTCTGTGGTTTTCTGCAGTC ATF/_48_1_R: ATTACAGACGTGAGCCACCA AF/_53_1_F: CTAAAGAAAGCTGTTGAATTTTAGAAG A7?/_53_1_R: GGCTGAATTGTTATCTGTTTGG
2. Zestaw primerów według zastrz. 1, znamienny tym, że końcowe stężenie puli primerów wynosi od 1 do 10 μΜ, korzystnie w grupie 1 wynosi od 1 do 8 μΜ, korzystnie w grupie 2 wynosi od 1 do 6 μΜ, korzystnie w grupie 3 wynosi od 1 do 10 μΜ, korzystnie w grupie 4 wynosi od 1,5 do 8 μΜ, korzystnie w grupie 5 wynosi 1 μΜ, korzystnie w grupie 6 wynosi od 1 do 1,5 μΜ.
3. Sposób wykrywania mutacji w obrębie genu NF1 u pacjentów z podejrzeniem choroby Recklinghausena, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
- Izolację DNA z próbki materiału biologicznego
- Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej dla każdego zestawu primerów, jak określono w zastrz. 1
- Przeprowadzenie reakcji multiplex PCR
- Sekwencjonowanie genomowe
- Informatyczna analiza danych
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że próbkę materiału genetycznego stanowi ślina lub krew żylna pacjenta.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL408727A PL227811B1 (pl) | 2014-06-30 | 2014-06-30 | Zestaw diagnostyczny i sposób jednoczesnego wykrywania mutacji w obrębie genu NF1 dla grupy pacjentów z podejrzeniem choroby Recklinghausena. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL408727A PL227811B1 (pl) | 2014-06-30 | 2014-06-30 | Zestaw diagnostyczny i sposób jednoczesnego wykrywania mutacji w obrębie genu NF1 dla grupy pacjentów z podejrzeniem choroby Recklinghausena. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL408727A1 PL408727A1 (pl) | 2016-01-04 |
| PL227811B1 true PL227811B1 (pl) | 2018-01-31 |
Family
ID=54978733
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL408727A PL227811B1 (pl) | 2014-06-30 | 2014-06-30 | Zestaw diagnostyczny i sposób jednoczesnego wykrywania mutacji w obrębie genu NF1 dla grupy pacjentów z podejrzeniem choroby Recklinghausena. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL227811B1 (pl) |
-
2014
- 2014-06-30 PL PL408727A patent/PL227811B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL408727A1 (pl) | 2016-01-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3602142B2 (ja) | Ｓｔｒ座位の多重増幅 | |
| ES2280562T3 (es) | Procedimiento para detectar dna originario de diferentes individuos. | |
| JP6798697B2 (ja) | Ｈｌａ遺伝子のｐｃｒプライマーセット及びそれを用いたシークエンス法 | |
| DK2881739T3 (en) | Method and kit for determining the genome integrity and / or quality of a library of DNA sequences obtained by deterministic restriction site whole-genome amplification | |
| WO2008070249A2 (en) | A method of detecting genomic aberrations for prenatal diagnosis | |
| KR102559124B1 (ko) | Flt3 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도 | |
| TWI567202B (zh) | 檢測酒精代謝基因之方法及套組 | |
| KR100808312B1 (ko) | 인위적 에스엔피 서열의 동시증폭을 이용한 염색체,유전자, 혹은 특정 뉴클레오티드 서열의 카피 수 측정방법 | |
| US11753683B2 (en) | MCC as epigenetic marker for the identification of immune cells, in particular basophil granulocytes | |
| PL227811B1 (pl) | Zestaw diagnostyczny i sposób jednoczesnego wykrywania mutacji w obrębie genu NF1 dla grupy pacjentów z podejrzeniem choroby Recklinghausena. | |
| JP7447155B2 (ja) | Ｓｄｃ２遺伝子のメチル化検出方法 | |
| EP3063295B1 (en) | Method for analyzing body fluid samples | |
| KR20200064891A (ko) | 조혈모세포 이식 후 혈액암 예후 예측을 위한 정보 제공 방법 | |
| Said et al. | Association between AXIN1 gene polymorphisms (wnt signaling pathway gene) and nephropathy induced by diabetes and hypertension in the Egyptian population | |
| CN111690736A (zh) | 一种华法林用药基因检测试剂盒及使用方法 | |
| KR101855748B1 (ko) | 단일 형광에 대해서 pcr의 다중신호를 측정하는 방법 | |
| RU2837158C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования Синдрома Марфана | |
| RU2843692C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфизма rs12143842 гена NOS1AP и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации | |
| WO2018186680A1 (ko) | 게놈 dna 기반의 장 pcr 프라이머 세트를 포함하는 신경섬유종증 진단용 조성물 | |
| Leube et al. | Ulna/height ratio as clinical parameter separating EXT1 from EXT2 families? | |
| EP3559256B1 (en) | Method for determining attention deficit hyperactivity | |
| RU2777086C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования буллезного эпидермолиза | |
| Lizanecz et al. | Mistyping of angiotensinogen M235T alleles | |
| RU2772938C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования семейной гипертрофической кардиомиопатии | |
| De Siena et al. | Incidence of amplification failure in DMPK allele due to allelic dropout event in a diagnostic laboratory |