PL227923B1

PL227923B1 - Dendrobaena veneta earthworm celomatic fluid for application in treatment of lung cancer

Info

Publication number: PL227923B1
Application number: PL411346A
Authority: PL
Inventors: Marta Fiołka; Jolanta Rzymowska; Przemysław Kołodziej
Original assignee: Uniwersytet Marii Curie Sklodowskiej; Uniwersytet Marii Curie Skłodowskiej; Uniwersytet Medyczny W Lublinie
Priority date: 2015-02-23
Filing date: 2015-02-23
Publication date: 2018-01-31
Also published as: PL411346A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowe, medyczne zastosowanie płynu celomatycznego wyizolowanego z dżdżownicy Dendrobaena veneta w leczeniu raka płuc.The subject of the invention is a new medical use of the celomic fluid isolated from the worm Dendrobaena veneta in the treatment of lung cancer.

Znana jest z publikacji jak np., Yanqin i wsp., „European Journal of Soil Biology” t.43, 2007; Dinesh i wsp. „Bioscience Biotechnology Research Asia”, t.10, 2013; Kauschke i Mohrig, Journal Comparative Physiology, B t. 157, 1987 czy też Yamaji i wsp. Journal of Biological Chemistry, t.273, 1998, przeciwnowotworowa aktywność białek z płynu celomatycznego wyizolowanego z dżdżownic Eisenia fetida i Eudrilus eugeniae na komórki raka szyjki macicy, raka mózgu, raka okrężnicy oraz złośliwą postać białaczki.She is known from publications such as, for example, Yanqin et al., "European Journal of Soil Biology" vol. 43, 2007; Dinesh et al. "Bioscience Biotechnology Research Asia", Vol. 10, 2013; Kauschke and Mohrig, Journal Comparative Physiology, B vol. 157, 1987 or Yamaji et al. Journal of Biological Chemistry, vol. 273, 1998, antitumor activity of proteins from celomic fluid isolated from earthworms Eisenia fetida and Eudrilus eugeniae on cervical cancer cells , brain cancer, colon cancer and malignant leukemia.

Z kolei z publikacji Kobayashi i wsp., Comparative Biochemistry and Physiology część C, 1.128, wiadomo, że prowadzono badania na rybach, kijankach i myszach, jedynie w kierunku cytotoksyczności płynu celomatycznego z dżdżownic należących do gatunku Eisenia fetida po podgrzaniu w 60°C przez 20 minut.On the other hand, from the publication of Kobayashi et al., Comparative Biochemistry and Physiology part C, 1.128, it is known that tests were carried out on fish, tadpoles and mice only for the cytotoxicity of cellomatous fluid from earthworms belonging to the species Eisenia fetida after heating at 60 ° C by Twenty minutes.

Z prac autorstwa S. Matejko pt. „ Dżdżownice jako źródło aktywnie biologicznych cząstek - badania przeciwnowotworowych właściwości płynu celomatycznego” oraz „Przeciwnowotworowe właściwości białek dżdżownic”, zamieszczonych w archiwum prac dyplomowych Uniwersytetu Jagiellońskiego dostępnych na stronach internetowych https://www.apd.uj.edu.pl/index.php?page=cert&cert_cid= 55706 z dnia 2015-01-08, znany jest również wpływ płynu celomatycznego dwóch innych gatunków dżdżownic Eisenia Andrei i Aporrectodea caliginosa, na żywotność i aktywność proapoptotyczną komórek nowotworowych wątroby, raka szyki macicy oraz czerniaka złośliwego skóry i błony naczyniowej gałki ocznej.From the works by S. Matejko entitled "Earthworms as a source of actively biological particles - research on the anti-cancer properties of the celomatic fluid" and "Anti-cancer properties of earthworm proteins", published in the archives of the Jagiellonian University diploma theses available at https://www.apd.uj.edu.pl/index.php ? page = cert & cert_cid = 55706 dated 2015-01-08, the influence of the celomic fluid of two other species of earthworms Eisenia Andrei and Aporrectodea caliginosa is also known on the viability and pro-apoptotic activity of liver cancer cells, cervical cancer, and malignant melanoma of the skin and uveal membrane of the eyeball ocular.

W wymienionych publikacjach wskazano jednocześnie na toksyczne działanie białek z płynu celomatycznego badanych gatunków dżdżownic na przykładzie fibroblastów kurcząt i leukocytów świnki morskiej oraz na lizę fibroblastów i erytrocytów kręgowców.The above-mentioned publications also indicated the toxic effect of proteins from the celomatous fluid of the studied earthworm species on the example of chicken fibroblasts and guinea pig leukocytes, and the lysis of vertebrate fibroblasts and erythrocytes.

W znanym stanie techniki nie zostały ujawnione wyniki badań płynu celomatycznego uzyskanego z gatunku dżdżownic Dendrobaena veneta, będącego źródłem aktywnie biologicznych cząstek o działaniu przeciw nowotworom.The known art does not disclose the results of research on the cellular fluid obtained from the species of Dendrobaena veneta, which is a source of active biological particles with anti-tumor activity.

Dotychczasowe publikacje takie jak np., M. Fiołka i wsp., „Journal of Invertebrate Pathology” t.105, 2010, czy opisy patentowe PL 212077, PL 218745 oraz P. 405944 ujawniają aktywność przeciwdrobnoustrojową i przeciwnowotworową metabolitów szczepów bakterii z rodzaju Raoulteila ornithinolytica i Bacillus pumilus wyizolowanych z jelita dżdżownicy Dendrobaena veneta.Previous publications such as, for example, M. Fiołka et al., "Journal of Invertebrate Pathology" vol. 105, 2010, or patents PL 212077, PL 218745 and P. 405944 disclose the antimicrobial and antitumor activity of metabolites of bacterial strains of the genus Raoulteila ornithinolytica and Bacillus pumilus isolated from the intestine of the earthworm Dendrobaena veneta.

Przedstawione wyżej publikacje, potwierdzają ogromny immunologiczny potencjał dżdżownic, stąd podjęto dalsze badania w kierunku wyizolowania samego płynu celomatycznego Dendrobaena veneta w warunkach obiecujących zachowanie największej liczby jego składników białkowych i zbadania wpływu tego płynu na szczególnie agresywne i trudne w leczeniu komórki nowotworowe.The publications presented above confirm the enormous immunological potential of earthworms, hence further research was undertaken to isolate the Dendrobaena veneta celomic fluid itself under conditions that promise to preserve the largest number of its protein components and to study the effect of this fluid on particularly aggressive and difficult to treat cancer cells.

Nieoczekiwanie, w badaniach z wykorzystaniem różnych linii komórek nowotworowych, okazało się, że płyn celomatyczny w określonej postaci uzyskany z dżdżownicy Dendrobaena veneta, wykazuje bardzo efektywne działanie w znacznym stopniu uszkadzające komórki raka płuc, przy jednoczesnym braku cytotoksyczności w stosunku do fibroblastów - prawidłowych komórek skóry mysiej oraz komórek krwi człowieka zarówno erytrocytów, jak i leukocytów.Unexpectedly, in studies with the use of various tumor cell lines, it turned out that the celomic fluid in a specific form obtained from the worm Dendrobaena veneta shows a very effective effect, significantly damaging lung cancer cells, with the simultaneous lack of cytotoxicity in relation to fibroblasts - normal skin cells mouse and human blood cells, both erythrocytes and leukocytes.

Istotą wynalazku jest płyn celomatyczny z dżdżownicy Dendrobaena veneta do zastosowania w leczeniu raka płuc, po oddzieleniu celomocytów i koagulacji toksycznych białek w temperaturze 70-80°C.The essence of the invention is the cellomatous fluid from the worm Dendrobaena veneta for use in the treatment of lung cancer after the separation of the cellomocytes and the coagulation of toxic proteins at a temperature of 70-80 ° C.

Wynalazek został przedstawiony w poniższych przykładach wykonania.The invention is illustrated in the following examples.

P r z y k ł a d 1. Pozyskiwanie płynu celomatycznego z dżdżownic Dendrobaena veneta do dalszych badań.Example 1. Obtaining celomic fluid from Dendrobaena venet earthworms for further research.

Hodowlę dżdżownic Denrobaena veneta prowadzono w ziemi ogrodowej o wilgotności ok. 80% i temperaturze 20-22°C, karmiąc je rozdrobnioną gotowaną marchewką. Do badań wybrano kilkadziesiąt dojrzałych osobników i po opłukaniu w wodzie destylowanej i osuszeniu, polewano niewielką ilością jałowego płynu fizjologicznego. Następnie w okolicę ciała każdej dżdżownicy przykładano na 30 sekund prąd z 2 ogniw baterii o mocy 4.5 V. W tym czasie dżdżownice wyrzucały przez otwory układu wydalniczego płyn z jamy ciała wraz komórkami krwi - celomocytami. Zebrane wydaliny odwirowywano w ciągu kilkunastu minut przy obrotach 3000 na minutę, przez co oddzielono skutecznie osadzone na dnie probówki celomocyty. Supernatant przesączono przez sączek Millipore o średnicy porów 0,22 gm dla otrzymania sterylnego płynu, po czym metodą Bradford, spektrofotometrycznieThe cultivation of Denrobaena veneta earthworms was carried out in garden soil with a humidity of about 80% and a temperature of 20-22 ° C, feeding them with shredded, boiled carrots. Several dozen mature specimens were selected for the study and, after rinsing them in distilled water and drying them, they were poured with a small amount of sterile physiological fluid. Then, electricity was applied to the body area of each earthworm for 30 seconds from 2 battery cells with a power of 4.5 V. During this time, the earthworms ejected fluid from the body cavity through the openings of the excretory system along with blood cells - cellomocytes. The collected excreta was centrifuged for several minutes at 3000 revolutions per minute, which effectively separated the cellomocytes deposited on the bottom of the tube. The supernatant was filtered through a Millipore filter with a pore diameter of 0.22 gm to obtain a sterile fluid followed by the Bradford method, spectrophotometrically

PL 227 923 B1 określono stężenie białka - 0,7 mg/ml dla utrzymania porównywalnych warunków w kolejnych eksperymentach.The protein concentration was determined to be 0.7 mg / ml to maintain comparable conditions in subsequent experiments.

Po 1 ml otrzymanego wyżej płynu celomatycznego przeniesiono do 6 probówek Eppendorfa, po czym wszystkie probówki inkubowano przez 10 minut w termobloku, kolejno w następujących temperaturach: 40, 50, 60, 70, 80, 90 i 100°C, wychładzając próbki do temp. pokojowej po każdorazowym ogrzewaniu.1 ml of the above-obtained celomic fluid was transferred to 6 Eppendorf tubes, then all tubes were incubated for 10 minutes in a thermoblock, successively at the following temperatures: 40, 50, 60, 70, 80, 90 and 100 ° C, cooling the samples to the temperature of room after each heating.

Następnie z próbki płynu celomatycznego po określonej temperaturze inkubacji, pobierano 500 μΙ i dodawano do 1 ml hodowli prawidłowych fibroblastów mysich pochodzenia tłuszczowego ECACC 85011425, uzyskując stężenie białka w płynie 250 μg/ml.Then, from a sample of the celomic fluid after the specified incubation temperature, 500 µΙ was withdrawn and added to 1 ml of ECACC 85011425 fat-derived normal mouse fibroblast cultures, resulting in a fluid protein concentration of 250 µg / ml.

W zależności od temperatury inkubacji, następował różny stopień koagulacji białek toksycznych, wpływający na uszkodzenie fibroblastów - tabela 1.Depending on the incubation temperature, a different degree of coagulation of toxic proteins took place, affecting the damage of fibroblasts - Table 1.

Jak wykazują wyniki tego eksperymentu, całkowita koagulacja białek toksycznych - 0% martwych komórek - następuje po inkubacji tego płynu w temp. 70-100°C.As shown by the results of this experiment, complete coagulation of toxic proteins - 0% of dead cells - occurs after the incubation of this fluid at 70-100 ° C.

Dodatkowo, naczynia z hodowlą kontrolną, a także z hodowlami zawierającymi fibroblasty z dodatkiem płynu według wynalazku, tj. po ogrzaniu w 70°C, 90°C i bez ogrzewania, poddano obserwacji pod mikroskopem optycznym z odwróconym polem.In addition, the vessels with the control culture as well as the cultures containing fibroblasts with the addition of the fluid according to the invention, i.e. after heating at 70 ° C, 90 ° C and without heating, were observed under an inverted optical microscope.

Otrzymane obrazy uwidaczniają: fig. 1 - fibroblasty kontrolne, fig. 2 - fibroblasty po działaniu płynu ogrzanego w 70°C, fig. 3 - fibroblasty po działaniu płynu ogrzanego w 90°C i fig. 4 - fibroblasty z płynem bez ogrzewania.The obtained images show: Fig. 1 - control fibroblasts, Fig. 2 - fibroblasts after the action of the fluid heated at 70 ° C, Fig. 3 - fibroblasts after the action of the fluid heated at 90 ° C, and Fig. 4 - fibroblasts with the fluid without heating.

Dalej wykazano wpływ płynu celomatycznego dżdżownicy Denrobaena veneta na lizę erytrocytów krwi ludzkiej - tabela 2.The influence of the cellomatous fluid of the Denrobaena venet on the lysis of human blood erythrocytes was further demonstrated - Table 2.

2,5 ml krwi obwodowej ludzkiej zmieszano z antykoagulantem EDTA i rozdzielono do trzech probówek. Do pierwszej (I) z nich, jako próbki kontrolnej, dodano 250 μl 0,9% NaCl, a do pozostałych dwóch dodano również po 250 μl płynu celomatycznego dżdżownicy. Próbka II stanowiła tzw. płyn surowy nie poddawany inkubacji, zaś próbkę III inkubowano w ciągu 10 min. w temp. 80°C.2.5 ml of human peripheral blood was mixed with EDTA anticoagulant and distributed into three tubes. 250 µl of 0.9% NaCl was added to the first (I) of them as a control, and 250 µl of earthworm cell fluid was also added to the other two. Sample II was the so-called the crude fluid was not incubated and sample III was incubated for 10 min. at 80 ° C.

Po dokładnym wymieszaniu, próbki poddano analizie w aparacie hematologicznym po 5, 60 i 300 minutach.After thorough mixing, the samples were analyzed on a hematology machine after 5, 60 and 300 minutes.

Wyniki zawarte w tabeli 2 wskazują, iż płyn celomatyczny inkubowany w badanych czasach nie wpływa na zmiany parametrów hematologicznych, w przeciwieństwie do płynu surowego, powodującego prawie natychmiastową lizę erytrocytów, leukocytów i trombocytów.The results presented in Table 2 show that the celomic fluid incubated in the studied times did not change the hematological parameters, unlike the crude fluid, which causes almost immediate lysis of erythrocytes, leukocytes and thrombocytes.

Dodatkowo wykonano analizę mikroskopową rozmazów próbek krwi I, II i III barwionych metodą May-GOmwalda-Giemsy.Additionally, a microscopic analysis of smears of blood samples I, II and III stained with the May-GOmwald-Giemsa method was performed.

Wszystkie obrazy mikroskopowe krwi z płynem celomatycznym ogrzewanym (próbka III) nie wykazują różnic morfologicznych w porównaniu z kontrolną (próbka I), co dowodzi braku toksycznego działania tego płynu po obróbce termicznej na komórki krwi człowieka.All microscopic images of blood with heated celomic fluid (sample III) do not show morphological differences compared to the control (sample I), which proves the lack of toxic effect of this fluid on human blood cells after thermal treatment.

Przedstawione na rysunku obrazy mikroskopowe ilustrują niżej wymienione komórki krwi:The microscopic images shown in the figure illustrate the following blood cells:

- neutrofil wraz z erytrocytami - fig. 5 - kontrola (próbka I ) oraz fig. 6 - próbka III z dodatkiem płynu inkubowanego w 80°C.- neutrophil with erythrocytes - fig. 5 - control (sample I) and fig. 6 - sample III with the addition of fluid incubated at 80 ° C.

- limfocyt z erytrocytami - fig. 7 - kontrola (próbka I ) oraz fig. 8 - próbka III z dodatkiem płynu inkubowanego w 80°C.- lymphocyte with erythrocytes - fig. 7 - control (sample I) and fig. 8 - sample III with the addition of fluid incubated at 80 ° C.

- neutrofil i limfocyt bez erytrocytów po działaniu nieogrzewanego płynu (próbka II) - fig. 9.- neutrophil and lymphocyte without erythrocytes after exposure to unheated fluid (sample II) - Fig. 9.

P r z y k ł a d 2. Określenie cytotoksyczności płynu celomatycznego względem komórek raka płuc.Example 2. Determination of cellular fluid cytotoxicity against lung cancer cells.

Badania prowadzono na linii komórek nabłonkowych raka płuc A549. Hodowle wszystkich komórek prowadzono w standardowych warunkach - 37°C, 5% CO2, 90% wilgotność powietrza, na pożywce RPMI z dodatkiem 8% płodowej surowicy bydlęcej. Gęstość wyjściowa zawiesiny wynosiła 104 komórek w mililitrze podłoża.The research was carried out on the A549 lung cancer epithelial cell line. All cells were cultured under standard conditions - 37 ° C, 5% CO2, 90% air humidity, in RPMI medium supplemented with 8% fetal bovine serum. The initial density of the suspension was 104 cells per milliliter of medium.

Założono 5 hodowli zawierających komórki nabłonkowe raka płuc wraz z płynem celomatycznym o różnej temperaturze inkubacji - 70, 80, 90 i 100°C, a także z płynem nieogrzewanym.5 cultures containing lung cancer epithelial cells were set up together with the celomic fluid with different incubation temperatures - 70, 80, 90 and 100 ° C, as well as with the unheated fluid.

Do 1 ml każdej hodowli dodawano 0,5 ml płynu celomatycznego, uzyskując stężenie białka 250 μg/ml w każdej z nich.0.5 ml of celomic fluid was added to 1 ml of each culture, obtaining a protein concentration of 250 µg / ml in each.

Po inkubacji w czasie 24, 48 i 72 godziny, do hodowanych komórek dodawano trypsynę, celem całkowitego oderwania komórek od naczynia hodowlanego, a następnie błękit trypanu dla zabarwienia komórek martwych. Następnie liczono ilość martwych i żywych komórek nowotworowych w komorze Borkera. Badanie powtarzano trzykrotnie. Procent komórek martwych w stosunku do kontroli stanowiącej 100% komórek nowotworowych, przedstawiono jako współczynnik cytotoksyczności w tabeli 3.After incubation for 24, 48 and 72 hours, trypsin was added to the cultured cells to completely detach the cells from the culture vessel, followed by trypan blue to stain dead cells. Then the number of dead and living tumor cells in the Borker chamber was counted. The test was repeated three times. The percentage of dead cells in relation to the control, which is 100% neoplastic cells, is presented as the cytotoxicity index in Table 3.

PL 227 923 B1PL 227 923 B1

Dodatkowo, naczynia z hodowlą kontrolną zawierającą same komórki rakowe oraz hodowle komórek nowotworowych z płynami według wynalazku inkubowanymi w temp. 75 i 90°C, a także z płynem surowym, poddano obserwacji pod mikroskopem optycznym z odwróconym polem.In addition, the control culture vessels containing the cancer cells only and the cultures of cancer cells with the fluids according to the invention incubated at 75 and 90 ° C, as well as with the crude fluid, were observed under an inverted optical microscope.

Obrazy mikroskopowe oznaczone na rysunku jako fig. 10 do 13, przedstawiają kolejno: fig. 10 - kontrola - komórki raka płuc, fig. 11 - komórki raka płuc po działaniu płynu celomatycznego inkubowanego w temp. 75°C, fig. 12 - komórki raka płuc po działaniu płynu celomatycznego inkubowanego w temp. 90°C, fig. 13 - komórki raka płuc po działaniu płynu celomatycznego surowego, bez ogrzewania.The microscopic images marked in the figures as Figs. 10 to 13 show in turn: Fig. 10 - control - lung cancer cells, Fig. 11 - lung cancer cells after the action of celomic fluid incubated at 75 ° C, Fig. 12 - cancer cells lung after the treatment with the CEC fluid incubated at 90 ° C, Fig. 13 - lung cancer cells after the treatment with the raw CEL, without heating.

Jak wykazano w powyższych przykładach, płyn celomatyczny z dżdżownicy Dendrobaena veneta, po oddzieleniu celomocytów i inkubacji w temp. 70-80°C, wykazuje bardzo efektywne działanie uszkadzające komórki raka płuc, przy jednoczesnym braku cytotoksyczności w stosunku do fibroblastów i komórek krwi ludzkiej.As shown in the above examples, the celomic fluid from the worm Dendrobaena veneta, after separating the cells and incubating at 70-80 ° C, shows a very effective damaging effect on lung cancer cells, while not being cytotoxic to fibroblasts and human blood cells.

Wprawdzie płyn celomatyczny surowy, bez inkubacji, wykazuje dużą aktywność przeciwnowotworową, ale jest jednocześnie toksyczny względem fibroblastów i komórek krwi.Although the crude celomic fluid, without incubation, shows high antitumor activity, it is also toxic to fibroblasts and blood cells.

Z kolei płyn inkubowany w temperaturach 90 i 100°C, nie wykazuje cytotoksyczności w stosunku do fibroblastów i komórek krwi ludzkiej, ale jednocześnie nie wykazuje działania cytotoksycznego w stosunku do komórek raka płuc.On the other hand, the fluid incubated at 90 and 100 ° C did not show cytotoxicity to human fibroblasts and cells, but at the same time it did not show cytotoxicity to lung cancer cells.

Claims

1. Dendrobaena veneta cellomatics for use in the treatment of lung cancer after the separation of cellomocytes and the coagulation of toxic proteins at 70-80 ° C.