PL227923B1 - Płyn celomatyczny dżdżownicy Dendrobaena veneta do zastosowania w leczeniu raka płuc - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowe, medyczne zastosowanie płynu celomatycznego wyizolowanego z dżdżownicy Dendrobaena veneta w leczeniu raka płuc.

Znana jest z publikacji jak np., Yanqin i wsp., „European Journal of Soil Biology” t.43, 2007; Dinesh i wsp. „Bioscience Biotechnology Research Asia”, t.10, 2013; Kauschke i Mohrig, Journal Comparative Physiology, B t. 157, 1987 czy też Yamaji i wsp. Journal of Biological Chemistry, t.273, 1998, przeciwnowotworowa aktywność białek z płynu celomatycznego wyizolowanego z dżdżownic Eisenia fetida i Eudrilus eugeniae na komórki raka szyjki macicy, raka mózgu, raka okrężnicy oraz złośliwą postać białaczki.

Z kolei z publikacji Kobayashi i wsp., Comparative Biochemistry and Physiology część C, 1.128, wiadomo, że prowadzono badania na rybach, kijankach i myszach, jedynie w kierunku cytotoksyczności płynu celomatycznego z dżdżownic należących do gatunku Eisenia fetida po podgrzaniu w 60°C przez 20 minut.

Z prac autorstwa S. Matejko pt. „ Dżdżownice jako źródło aktywnie biologicznych cząstek - badania przeciwnowotworowych właściwości płynu celomatycznego” oraz „Przeciwnowotworowe właściwości białek dżdżownic”, zamieszczonych w archiwum prac dyplomowych Uniwersytetu Jagiellońskiego dostępnych na stronach internetowych https://www.apd.uj.edu.pl/index.php?page=cert&cert_cid= 55706 z dnia 2015-01-08, znany jest również wpływ płynu celomatycznego dwóch innych gatunków dżdżownic Eisenia Andrei i Aporrectodea caliginosa, na żywotność i aktywność proapoptotyczną komórek nowotworowych wątroby, raka szyki macicy oraz czerniaka złośliwego skóry i błony naczyniowej gałki ocznej.

W wymienionych publikacjach wskazano jednocześnie na toksyczne działanie białek z płynu celomatycznego badanych gatunków dżdżownic na przykładzie fibroblastów kurcząt i leukocytów świnki morskiej oraz na lizę fibroblastów i erytrocytów kręgowców.

W znanym stanie techniki nie zostały ujawnione wyniki badań płynu celomatycznego uzyskanego z gatunku dżdżownic Dendrobaena veneta, będącego źródłem aktywnie biologicznych cząstek o działaniu przeciw nowotworom.

Dotychczasowe publikacje takie jak np., M. Fiołka i wsp., „Journal of Invertebrate Pathology” t.105, 2010, czy opisy patentowe PL 212077, PL 218745 oraz P. 405944 ujawniają aktywność przeciwdrobnoustrojową i przeciwnowotworową metabolitów szczepów bakterii z rodzaju Raoulteila ornithinolytica i Bacillus pumilus wyizolowanych z jelita dżdżownicy Dendrobaena veneta.

Przedstawione wyżej publikacje, potwierdzają ogromny immunologiczny potencjał dżdżownic, stąd podjęto dalsze badania w kierunku wyizolowania samego płynu celomatycznego Dendrobaena veneta w warunkach obiecujących zachowanie największej liczby jego składników białkowych i zbadania wpływu tego płynu na szczególnie agresywne i trudne w leczeniu komórki nowotworowe.

Nieoczekiwanie, w badaniach z wykorzystaniem różnych linii komórek nowotworowych, okazało się, że płyn celomatyczny w określonej postaci uzyskany z dżdżownicy Dendrobaena veneta, wykazuje bardzo efektywne działanie w znacznym stopniu uszkadzające komórki raka płuc, przy jednoczesnym braku cytotoksyczności w stosunku do fibroblastów - prawidłowych komórek skóry mysiej oraz komórek krwi człowieka zarówno erytrocytów, jak i leukocytów.

Istotą wynalazku jest płyn celomatyczny z dżdżownicy Dendrobaena veneta do zastosowania w leczeniu raka płuc, po oddzieleniu celomocytów i koagulacji toksycznych białek w temperaturze 70-80°C.

Wynalazek został przedstawiony w poniższych przykładach wykonania.

P r z y k ł a d 1. Pozyskiwanie płynu celomatycznego z dżdżownic Dendrobaena veneta do dalszych badań.

Hodowlę dżdżownic Denrobaena veneta prowadzono w ziemi ogrodowej o wilgotności ok. 80% i temperaturze 20-22°C, karmiąc je rozdrobnioną gotowaną marchewką. Do badań wybrano kilkadziesiąt dojrzałych osobników i po opłukaniu w wodzie destylowanej i osuszeniu, polewano niewielką ilością jałowego płynu fizjologicznego. Następnie w okolicę ciała każdej dżdżownicy przykładano na 30 sekund prąd z 2 ogniw baterii o mocy 4.5 V. W tym czasie dżdżownice wyrzucały przez otwory układu wydalniczego płyn z jamy ciała wraz komórkami krwi - celomocytami. Zebrane wydaliny odwirowywano w ciągu kilkunastu minut przy obrotach 3000 na minutę, przez co oddzielono skutecznie osadzone na dnie probówki celomocyty. Supernatant przesączono przez sączek Millipore o średnicy porów 0,22 gm dla otrzymania sterylnego płynu, po czym metodą Bradford, spektrofotometrycznie

PL 227 923 B1 określono stężenie białka - 0,7 mg/ml dla utrzymania porównywalnych warunków w kolejnych eksperymentach.

Po 1 ml otrzymanego wyżej płynu celomatycznego przeniesiono do 6 probówek Eppendorfa, po czym wszystkie probówki inkubowano przez 10 minut w termobloku, kolejno w następujących temperaturach: 40, 50, 60, 70, 80, 90 i 100°C, wychładzając próbki do temp. pokojowej po każdorazowym ogrzewaniu.

Następnie z próbki płynu celomatycznego po określonej temperaturze inkubacji, pobierano 500 μΙ i dodawano do 1 ml hodowli prawidłowych fibroblastów mysich pochodzenia tłuszczowego ECACC 85011425, uzyskując stężenie białka w płynie 250 μg/ml.

W zależności od temperatury inkubacji, następował różny stopień koagulacji białek toksycznych, wpływający na uszkodzenie fibroblastów - tabela 1.

Jak wykazują wyniki tego eksperymentu, całkowita koagulacja białek toksycznych - 0% martwych komórek - następuje po inkubacji tego płynu w temp. 70-100°C.

Dodatkowo, naczynia z hodowlą kontrolną, a także z hodowlami zawierającymi fibroblasty z dodatkiem płynu według wynalazku, tj. po ogrzaniu w 70°C, 90°C i bez ogrzewania, poddano obserwacji pod mikroskopem optycznym z odwróconym polem.

Otrzymane obrazy uwidaczniają: fig. 1 - fibroblasty kontrolne, fig. 2 - fibroblasty po działaniu płynu ogrzanego w 70°C, fig. 3 - fibroblasty po działaniu płynu ogrzanego w 90°C i fig. 4 - fibroblasty z płynem bez ogrzewania.

Dalej wykazano wpływ płynu celomatycznego dżdżownicy Denrobaena veneta na lizę erytrocytów krwi ludzkiej - tabela 2.

2,5 ml krwi obwodowej ludzkiej zmieszano z antykoagulantem EDTA i rozdzielono do trzech probówek. Do pierwszej (I) z nich, jako próbki kontrolnej, dodano 250 μl 0,9% NaCl, a do pozostałych dwóch dodano również po 250 μl płynu celomatycznego dżdżownicy. Próbka II stanowiła tzw. płyn surowy nie poddawany inkubacji, zaś próbkę III inkubowano w ciągu 10 min. w temp. 80°C.

Po dokładnym wymieszaniu, próbki poddano analizie w aparacie hematologicznym po 5, 60 i 300 minutach.

Wyniki zawarte w tabeli 2 wskazują, iż płyn celomatyczny inkubowany w badanych czasach nie wpływa na zmiany parametrów hematologicznych, w przeciwieństwie do płynu surowego, powodującego prawie natychmiastową lizę erytrocytów, leukocytów i trombocytów.

Dodatkowo wykonano analizę mikroskopową rozmazów próbek krwi I, II i III barwionych metodą May-GOmwalda-Giemsy.

Wszystkie obrazy mikroskopowe krwi z płynem celomatycznym ogrzewanym (próbka III) nie wykazują różnic morfologicznych w porównaniu z kontrolną (próbka I), co dowodzi braku toksycznego działania tego płynu po obróbce termicznej na komórki krwi człowieka.

Przedstawione na rysunku obrazy mikroskopowe ilustrują niżej wymienione komórki krwi:

- neutrofil wraz z erytrocytami - fig. 5 - kontrola (próbka I ) oraz fig. 6 - próbka III z dodatkiem płynu inkubowanego w 80°C.

- limfocyt z erytrocytami - fig. 7 - kontrola (próbka I ) oraz fig. 8 - próbka III z dodatkiem płynu inkubowanego w 80°C.

- neutrofil i limfocyt bez erytrocytów po działaniu nieogrzewanego płynu (próbka II) - fig. 9.

P r z y k ł a d 2. Określenie cytotoksyczności płynu celomatycznego względem komórek raka płuc.

Badania prowadzono na linii komórek nabłonkowych raka płuc A549. Hodowle wszystkich komórek prowadzono w standardowych warunkach - 37°C, 5% CO2, 90% wilgotność powietrza, na pożywce RPMI z dodatkiem 8% płodowej surowicy bydlęcej. Gęstość wyjściowa zawiesiny wynosiła 104 komórek w mililitrze podłoża.

Założono 5 hodowli zawierających komórki nabłonkowe raka płuc wraz z płynem celomatycznym o różnej temperaturze inkubacji - 70, 80, 90 i 100°C, a także z płynem nieogrzewanym.

Do 1 ml każdej hodowli dodawano 0,5 ml płynu celomatycznego, uzyskując stężenie białka 250 μg/ml w każdej z nich.

Po inkubacji w czasie 24, 48 i 72 godziny, do hodowanych komórek dodawano trypsynę, celem całkowitego oderwania komórek od naczynia hodowlanego, a następnie błękit trypanu dla zabarwienia komórek martwych. Następnie liczono ilość martwych i żywych komórek nowotworowych w komorze Borkera. Badanie powtarzano trzykrotnie. Procent komórek martwych w stosunku do kontroli stanowiącej 100% komórek nowotworowych, przedstawiono jako współczynnik cytotoksyczności w tabeli 3.

PL 227 923 B1

Dodatkowo, naczynia z hodowlą kontrolną zawierającą same komórki rakowe oraz hodowle komórek nowotworowych z płynami według wynalazku inkubowanymi w temp. 75 i 90°C, a także z płynem surowym, poddano obserwacji pod mikroskopem optycznym z odwróconym polem.

Obrazy mikroskopowe oznaczone na rysunku jako fig. 10 do 13, przedstawiają kolejno: fig. 10 - kontrola - komórki raka płuc, fig. 11 - komórki raka płuc po działaniu płynu celomatycznego inkubowanego w temp. 75°C, fig. 12 - komórki raka płuc po działaniu płynu celomatycznego inkubowanego w temp. 90°C, fig. 13 - komórki raka płuc po działaniu płynu celomatycznego surowego, bez ogrzewania.

Jak wykazano w powyższych przykładach, płyn celomatyczny z dżdżownicy Dendrobaena veneta, po oddzieleniu celomocytów i inkubacji w temp. 70-80°C, wykazuje bardzo efektywne działanie uszkadzające komórki raka płuc, przy jednoczesnym braku cytotoksyczności w stosunku do fibroblastów i komórek krwi ludzkiej.

Wprawdzie płyn celomatyczny surowy, bez inkubacji, wykazuje dużą aktywność przeciwnowotworową, ale jest jednocześnie toksyczny względem fibroblastów i komórek krwi.

Z kolei płyn inkubowany w temperaturach 90 i 100°C, nie wykazuje cytotoksyczności w stosunku do fibroblastów i komórek krwi ludzkiej, ale jednocześnie nie wykazuje działania cytotoksycznego w stosunku do komórek raka płuc.

Claims (1)

1. Płyn celomatyczny dżdżownicy Dendrobaena veneta do zastosowania w leczeniu raka płuc, po oddzieleniu celomocytów i koagulacji toksycznych białek w temperaturze 70-80°C.