PL228060B1 - Rybozymy typu „hammerhead”, kompozycja, srodek terapeutyczny je obejmujace, ich zastosowania oraz sposób selektywnej hydrolizy ex -vivo miR21 i prekursorów miR21 - Google Patents
Rybozymy typu „hammerhead”, kompozycja, srodek terapeutyczny je obejmujace, ich zastosowania oraz sposób selektywnej hydrolizy ex -vivo miR21 i prekursorów miR21Info
- Publication number
- PL228060B1 PL228060B1 PL403341A PL40334113A PL228060B1 PL 228060 B1 PL228060 B1 PL 228060B1 PL 403341 A PL403341 A PL 403341A PL 40334113 A PL40334113 A PL 40334113A PL 228060 B1 PL228060 B1 PL 228060B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mir21
- ribozyme
- ribozymes
- hydrolysis
- precursors
- Prior art date
Links
- 108091062762 miR-21 stem-loop Proteins 0.000 title claims description 220
- 108091041631 miR-21-1 stem-loop Proteins 0.000 title claims description 220
- 108091044442 miR-21-2 stem-loop Proteins 0.000 title claims description 220
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 title claims description 213
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 title claims description 213
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 title claims description 213
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 title claims description 71
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 title claims description 71
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims description 45
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 20
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 10
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 title description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 40
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 28
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 26
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 23
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 22
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 18
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 12
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 11
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 9
- 108090001102 Hammerhead ribozyme Proteins 0.000 claims description 6
- BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N Temozolomide Chemical compound O=C1N(C)N=NC2=C(C(N)=O)N=CN21 BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960004964 temozolomide Drugs 0.000 claims description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 5
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 229940084910 gliadel Drugs 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000007983 brain glioma Diseases 0.000 claims description 2
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 37
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 33
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 25
- 102200082402 rs751610198 Human genes 0.000 description 25
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 18
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 17
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 13
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 9
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 9
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 9
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 201000010915 Glioblastoma multiforme Diseases 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 8
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 7
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 5
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 5
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 5
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 5
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 5
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 101000805613 Homo sapiens Vacuole membrane protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 229920002562 Polyethylene Glycol 3350 Polymers 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 102100038001 Vacuole membrane protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 3
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 3
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 2
- 101000611943 Homo sapiens Programmed cell death protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 108091008065 MIR21 Proteins 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 102100040992 Programmed cell death protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000011443 conventional therapy Methods 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 235000010299 hexamethylene tetramine Nutrition 0.000 description 2
- 239000004312 hexamethylene tetramine Substances 0.000 description 2
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710097877 Brain tumor protein Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108010073496 Cerebrospinal Fluid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Natural products O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 101000642512 Homo sapiens Transcription factor SOX-5 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229920000604 Polyethylene Glycol 200 Polymers 0.000 description 1
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108010046983 Ribonuclease T1 Proteins 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102100034187 S-methyl-5'-thioadenosine phosphorylase Human genes 0.000 description 1
- 101710136206 S-methyl-5'-thioadenosine phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 239000012163 TRI reagent Substances 0.000 description 1
- 102100036692 Transcription factor SOX-5 Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002435 cytoreductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000002592 echocardiography Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000029824 high grade glioma Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 201000011614 malignant glioma Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- JLFNLZLINWHATN-UHFFFAOYSA-N pentaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCO JLFNLZLINWHATN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003439 radiotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000025915 regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 102220241276 rs78592515 Human genes 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/121—Hammerhead
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku są rybozymy typu ‘hammerhead’ specyficznie i wydajnie hydrolizujące miR21 RNA i/lub jego prekursory (pri-miR21 oraz pre-miR21), kompozycja i środek terapeutyczny je obejmujące, ich zastosowania do obniżania komórkowej puli miR21, w terapii guzów mózgu oraz sposób selektywnej hydrolizy ex-vivo miR21 i/lub prekursorów miR21.
Glejaki są najczęstszymi nowotworami centralnego układu nerwowego. Glejak wielopostaciowy (GBM, ang. glioblastoma multiforme) stanowi ponad 50% wszystkich glejaków oraz jest najbardziej złośliwym (IV stopnia złośliwości biologicznej wg WHO) typem pierwotnych guzów mózgu. GBM c echuje naciekający charakter wzrostu, obfite unaczynienie, gwałtowna proliferacja oraz szybki i agresywny przebieg kliniczny. Ponadto, ze względu na jego lokalizację oraz znaczną oporność na konwencjonalne terapie rokowania są bardzo złe.
Niezmiennie od wielu lat standardem w leczeniu glejaków pozostaje leczenie operacyjne jedynie wspomagane radio- i chemioterapią. Maksymalna cytoredukcja (> 98% guza) przedłuża życie, nawet do 9-12 miesięcy. Poprawia również odpowiedź pacjenta na radio- i chemioterapię. Często ze względu na umiejscowienie guza oraz jego naciekowy charakter interwencja chirurgiczna nie jest możliwa. Radioterapia (RT) stosowana jest standardowo jako pierwsze leczenie uzupełniające po zabiegu chirurgicznym. Standardem w chemioterapii jest temozolomid (TMZ) oraz gliadel (Westphal M et al., Neurooncol 5, 79-88 (2003); Stupp R et al., N Engl J Med. 352, 987-996 (2005)). W przypadku nawrotów choroby, w grupie pacjentów leczonych TMZ oraz RT obserwuje się szybszy i agresywny wzrost nowotworu, który dodatkowo wykazuje znaczną oporność na leczenie.
Ostatnie lata przyniosły znaczący postęp w poznaniu molekularnych podstaw GBM. Zidentyfikowano wiele celów terapeutycznych oraz potencjalnych terapeutyków. Większość z nowych podejść terapeutycznych wykorzystuje inhibitory małocząsteczkowe, przeciwciała monoklonalne oraz szczepionki peptydowe stosowane w celu regulacji szlaków komórkowych kluczowych dla rozwoju nowotworu, angiogenezy, a także zniesienia lekooporności komórek nowotworowych. Pomimo, że podejścia te rokowały bardzo dobrze, większość została odrzucona na etapie badań klinicznych. Glejaki od wielu lat niezmiennie pozostają jednymi z najtrudniejszych w leczeniu, najgorzej rokujących nowotworów, ze średnim czasem przeżycia wynoszącym mniej niż rok.
Wobec braku skutecznych metod leczenia glejaków, ich oporności na konwencjonalne metody leczenia, wyzwaniem są badania nad coraz to nowymi celami terapii oraz nowymi podejściami do leczenia GBM.
MikroRNA (miRNA) są to krótkie (~22 nt) RNA niekodujące białek. Odgrywają kluczową rolę w wielu procesach komórkowych, takich jak: wzrost, różnicowanie, podziały, apoptoza, sygnalizacja komórkowa oraz ekspresja genów. Szacuje się, że regulują ekspresją ponad 30% wszystkich genów kodujących białka, w tym wielu onkogenów oraz białek supresorowych (Bartel DP, Cell 116, 281-297 (2004); Esquela-Kerscher A et al., Nat Rev Cancer 6, 259-269 (2006)).
Szacuje się, że zmiany w profilu ekspresji miRNA leżą u podłoża ponad 390 chorób (http://cmbi.bjmu.edu.cn/hmdd). Największą grupę spośród nich stanowią choroby nowotworowe. miRNA leżą u podłoża licznych chorób neurologicznych i psychiatrycznych, w tym guzów mózgu. Dla wielu spośród nich określono swoiste profile ekspresji miRNA, co znacząco zwiększyło możliwości ich diagnozy i prognozowania. Wskazują też nowe, potencjalne cele terapeutyczne. Profil miRNA w nowotworach glejowych jest znacząco różny od profilu w zdrowych komórkach nerwowych. Ponadto, podobnie jak w zdrowym mózgu podczas jego rozwoju, tak w guzie w różnych stadiach jego zaawa nsowania profil miRNA ulega dynamicznym zmianom. Wytypowano miRNA, których poziom jest znacząco zmieniony w komórkach glejaka wielopostaciowego w stosunku do komórek zdrowych. Badania twórców wynalazku wskazują, że jednym z miRNA o najbardziej podwyższonym poziomie ekspresji w komórkach nowotworów glejowych jest miR21 RNA. Korelacja poziomu miR21 i ekspresji jego potencjalnych targetów (mRNA rozpoznawanych przez miRNA) pozwalają wnioskować, że jest on be zpośrednio zaangażowany w rozwój nowotworów glejowych, może stanowić dobry marker diagnostyczny oraz potencjalny cel terapii tego typu guzów (Nikaki A et al., Expert Opin Investig Drugs 21, 1475-1488 (2012)). miR21 jest pierwszym poznanym miRNA ssaków (Lagos-Quintana M et al., Science 294, 853-858 (2001)). Sekwencja kodująca miR21 zlokalizowana jest w ramieniu długim chromosomu 17 (17q23.2, 55273409-55273480), w obrębie genu kodującego białko TMEM49 (ang. transmembrane protein 49). Gen MIR21 znajduje się w intronie mRNA tego białka, posiada własny promotor, a jego transkrypcja obywa się niezależnie od transkrypcji TMEM49. Produktem genu MIR21
PL 228 060 B1 jest transkrypt pri-miR-21 o długości 3433 nt, który ulega dojrzewaniu najpierw do pre-miR-21 (72 nt), a następnie dojrzałego miR-21 (22 nt).
Zawartość miR-21 w materiale klinicznym z guzów glejowych mózgu oraz linii komórkowych wywodzących się z GBM jest znacząco wyższa od poziomu tego miRNA w komórkach zdrowych pochodzenia mózgowego (Conti A et al., J Neurooncol 93, 325-332 (2009); Chan JA et al., Cancer Res 65, 6029-6033 (2005); Ciafre SA et al., Biochem Biophys Res Commun 334, 1351-1358 (2005)). Dodatkowo jego poziom koreluje ze stopniem złośliwości guza. Poziom miRNA w tkance, płynie mózgowo rdzeniowym oraz surowicy krwi jest znacząco wyższy u pacjentów ze zdiagnozowanym glejakiem złośliwym, w porównaniu ze zdrową grupą kontrolną. Dodatkowo jest on znacząco wyższy u pacjentów z nowotworem stopnia III, w porównaniu z pacjentami z nowotworem stopnia II. Poziom miR21 ulega obniżeniu u pacjentów poddanych chemio- oraz radioterapii. Możliwa jest precyzyjna diagnoza nowotworów glejowych, określenie stadium zaawansowania choroby, prognozowanie przeżycia pacjentów, dobór odpowiedniego leczenia oraz monitorowanie przebiegu leczenia na podstawie profilu miR21 w tkance pooperacyjnej, a także w płynie mózgowo rdzeniowym oraz surowicy krwi.
Analiza funkcjonalna miR21 dowodzi, że odgrywa on kluczową rolę w procesie kancerogenezy, a ograniczenie czy hamowanie jego właściwości może zatrzymać postęp choroby oraz uwrażliwić komórki oporne na chemio- oraz radioterapię na konwencjonalną terapię. Dotychczas wytypowano ponad 170 potencjalnych targetów dla miR21, powiązanych z 9 szlakami sygnalizacji komórkowej zaangażowanych w procesy nowotworzenia. Część z zaproponowanych targetów zweryfikowano doświadczalnie. Pokazano przykładowo, że miR21 obniża poziom ekspresji białek zaangażowanych w regulację apoptozy (PDCD4, MTAP, SOX5) oraz białek odpowiedzialnych za oporność na chemioterapię (LRRIP1). Z drugiej strony, dla wielu białek, których zaburzony poziom wiąże się z zachwianiem procesu apoptozy, proliferacji, i innych, i ostatecznie zainicjowaniem oraz rozwojem nowotworu, obniżenie endogennej puli miR21 skutkuje wzrostem ich ekspresji. Ponadto, pokazano, że obniżenie poziomu miR21 skutkuje wzmożoną apoptozą komórek glioblastomy, obniża oporność na doxorubcin oraz tempo proliferacji komórek. Dowiedziono, że obniżenie poziomu miR21 w liniach komórkowych skutkuje zahamowaniem proliferacji komórek, wzmożoną apoptozą, zmniejszeniem inwazyjności komórek (Zhou X et ah, Lab Invest 90, 144-155 (2010); Li Y et ah, Brain res 1286, 13-18 (2009); Corsten MF et ak, Cancer Res 67,8994-9000 (2007)) oraz ich uwrażliwieniem na cytostatyki (Costa PM et al., Human mol Genet, pub ahead of print (2012); Zhu S et All, Cell Res 18, 350-359 (2008)), a w mysim układzie modelowym spowalnia wzrost guza oraz zmniejsza liczbę przerzutów (Gaur AB, Neuro Oncol 13, 580-590 (2011)). Potwierdza to, że miR21 może być dobrym celem terapii guzów mózgu (Li Y et ak, Brain Res 1286, 13-18 (2009)).
Dotychczas analizowano możliwość zastosowania molekularnych narzędzi anty- miR21 (m.in. inhibitorów małocząsteczkowych) (Gumireddy K et al., Angew Chem Int Ed Engl 47, 7482-7484 (2008)). Wadami zaproponowanych narzędzi jako terapeutyków są jednak: słabo poznany mechanizm działania, niska specyficzność związków, możliwość hamowania także innych pre-miRNA oraz niski indeks terapeutyczny. Badania te nie dotyczyły bezpośrednio nowotworów glejowych.
W kontekście nowotworów glejowych próbowano zastosować antysensowne oligonukleotydy (AS-ON, ang. AntiSense-OligoNucleotide) skierowane na mi-R21 (Kurreck J, Eur J Biochem 270, 1628-1644 (2003). AS-ON użyte w kontekście miR21 oraz glioblastomy wykorzystano do badań podstawowych, weryfikacji oraz identyfikacji potencjalnych sekwencji docelowych dla miRNA oraz poznania efektów komórkowych będących skutkiem inhibicji miR21. Jednakże AS-ON obarczone są wieloma wadami takimi jak krótki okres półtrwania w osoczu, degradacja przez endo- i egzonukleazy (Campbell JM et al., J Biochem Biophys Methods 20, 259-267 (1990)), niska specyficzność AS-ON (tzw. off-target effect) mniejsza stabilność kompleksów AS-ON:RNA, utrudniony transport AS-ON przez błony komórkowe i barierę krew-mózg, konieczność stosowania nośnika, indukowanie odpowiedzi immunologicznej przez syntetyczne AS-ON zawierające niemetylowane dinukleotydy CpG, oraz fakt, że degradacja heterodupleksu AS-ON:miRNA jest zależna od endogennej maszynerii białkowej, głównie RNazy H.
Wynalazek dotyczy rybozymów typu ‘hammerhead’ skierowanych na miR21 oraz prekursory miR21. Są to najmniejsze naturalne katalityczne RNA (Ferre-D’Amara AR et al. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 2, a003574 (2010)). Swoją aktywność zawdzięczają rdzeniu katalitycznemu, specyficzność - komplementarności ramion rybozymu do jego substratu. Rybozym w kompleksie z substratem tworzy trzy odcinki helikalne (I, II i III) nazywane ramionami, które otaczają wysoce za4
PL 228 060 B1 chowawczą sekwencję rdzenia katalitycznego. Helisa I i III tworzone są przez hybrydyzację rybozymu z komplementarnymi rejonami substratu, helisa II tworzy rdzeń katalityczny.
Rybozymy katalizują sekwencyjnie-specyficzną hydrolizę RNA zawierających trójnukleotyd typu 5’-NUH-3’, gdzie N oznacza dowolny nukleotyd, U urydynę natomiast H adenozynę, cytozynę lub urydynę niezwiązaną wiązaniami wodorowymi. Wydajność hydrolizy wiązań zależy głównie od sekwencji docelowego RNA (Sun LQ et al., Pharmacol Rev 52, 325-347 (2000)). Innymi czynnikami determinującymi ich aktywność, a równocześnie także specyficzność jest długość oraz skład ramion rybozymu otaczających miejsce hydrolizy. Ramiona zapewniają silne związanie rybozymu z substratem i równocześnie umożliwiają jego łatwe uwolnienie od produktów hydrolizy, dzięki czemu rybozym staje się dostępny dla kolejnych cząsteczek substratu. Wydłużenie ramion rybozymu może się wiązać ze spadkiem wydajności hydrolizy, z kolei ich skrócenie ze spadkiem specyficzności rybozymu (Hertel KJ et al., Biochemistry 33, 3374-3385 (1994); Kurreck J et al., J Biol Chem 277, 7099-7107 (2002)). Optymalna długość ramion hybrydyzujących to 6-10 reszt nukleotydowych (Scalon KJ, Curr Pharma Biotech 5, 415-420 (2004)). Twórcy niniejszego wynalazku wykazali w badaniach własnych, że wydajność hydrolizy katalizowanej przez rybozymy w znacznym stopniu zależy również od struktury RNA będącego substratem.
Z publikacji Suryawanshi H et al., Mol BioSyst 6, 1807-1809 (2010) znany jest rybozym typu ‘hammerhead’ oraz jego zmodyfikowany, oporny na nukleazy wariant komplementarny do pre-miR21 oraz miR21. Wykazano jego aktywność hydrolityczną w warunkach in vitro w stosunku do pre-miR21, ale nie do miR21. Obserwowano efekty zastosowania rybozymów w hodowli komórkowej: obniżenie puli endogennego miR21, zwiększenie ekspresji białka PDCD4 (białko targetowe miR21) oraz obniżenie przeżywalności komórek. Opisane w wymienionej pracy, zaprojektowane rybozymy to:
- forma dzika, o sekwencji:
5'-UCAGUCUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAUAAGCUAC-3'
- forma zmodyfikowana chemicznie: sekwencja nukleotydowa jak w przypadku formy dzikiej, wprowadzone modyfikacje chemiczne determinujące odporność na nukleazy.
Nie udowodniono jednak, że znane rybozymy hydrolizują dojrzały miR21, a jedynie pre-miR21. Na podstawie komplementarności sekwencji ramion rybozymu do miR21 oraz aktywności rybozymu względem pre-miR21 rybozymów opisanych w publikacji Suryawanshi H et al., Mol BioSyst 6, 1807-1809 (2010) można jedynie postulować, że rybozym ten jest aktywny również względem miR21. Również testy komórkowe nie dowodzą aktywności zaproponowanych rybozymów względem miR21. Obserwowane efekty komórkowe mogą być jedynie wynikiem hydrolizy pre-miR21.
W reakcjach in vitro wykazano aktywność rybozymów jedynie w 25 mM MgCl2 (stężenie niefizjologiczne). Nie wykazano czy zaprojektowane rybozymy wykazują również aktywność w fizjologic znym stężeniu Mg2+ (tj. ok. 1 mM). Ponad to, dostarczenie tak zaprojektowanego rybozymu do komórki wymaga nośnika, co może utrudniać potencjalne zastosowanie go w terapii.
Do tej pory nie przedstawiono rybozymów wykazujących wyższą aktywność względem premiR21 oraz miR21. Aktywność rybozymów można modulować poprzez wprowadzenie zmian w sekwencji rybozymu lub długości ramion rozpoznających substrat. Zmiany te mogą zwiększać, jak ró wnież obniżać, a nawet znosić aktywność rybozymów. Przykładowo, wprowadzenie jedynie 3 substyt ucji nukleotydowych w obrębie 22 nukleotydowego rdzenia katalitycznego powoduje całkowitą inaktywację rybozymu. W większości przypadków nie można w prosty sposób przewidzieć jaka zmiana sekwencji spowoduje spadek lub wzrost aktywności rybozymu. Każda nowa sekwencja wymaga eksperymentalnej oceny aktywności i wydajności (Gabryelska MM et al., Biochem J, 2013, epub ahead of print).
W świetle opisanego stanu techniki, niniejszy wynalazek ma na celu przezwyciężenie wskazanych niedogodności i dostarczenie nowych ulepszonych rybozymów typu ‘hammerhead’ specyficznie i wydajnie hydrolizujących miR21 i/lub jego prekursory których właściwości zapewnią możliwość ich zastosowania do obniżania komórkowej puli miR21, w terapii guzów mózgu. Celem niniejszego wyn alazku jest również dostarczenie nowych zastosowań ulepszonych rybozymów wydajnie hydrolizujących miR21 i/lub prekursory miR21 i ich wykorzystania w terapii do leczenia chorób objawiających się zwiększeniem komórkowej zawartości miRNA dla miR21 i/lub prekursorów miR21. Celem wynalazku jest również dostarczenie kompozycji i środków terapeutycznych dla leczenia chorób objawiających się zwiększeniem komórkowej zawartości miRNA dla miR21 i/lub prekursorów miR21.
Opisane są nowe rybozymy typu ‘hammerhead’, które wydajnie hydrolizują miR21 i/lub prekursory miR21, w warunkach in vitro w fizjologicznym stężeniu Mg2+, a także in vivo, w komórkach glejoPL 228 060 B1 wych. Ponad to, rybozymy będące przedmiotem wynalazku, w przeciwieństwie do rozwiązań znanych ze stanu techniki, składają się jedynie z naturalnych nukleotydów, nie posiadają modyfikacji chemicznych, co pozwala wykluczyć możliwość wystąpienia odpowiedzi komórkowej na zmodyfikowane nukleotydy.
Opisane są wiec rybozymy typu ‘hammerhead’ skierowane na sekwencję miR21 i/lub prekursory miR21, które mają zdolność do specyficznej hydrolizy miR21 i/lub prekursorów miR21, których rdzeń katalityczny ma sekwencję SEKW ID NR 1, oraz które zawierają po obu stronach ramiona, k orzystnie sześcionukleotydowe, o sekwencjach komplementarnych do rejonu w obrębie miR21 i/lub prekursorów miR21.
Wynalazek dotyczy rybozymu typu ‘hammerhead’ skierowanego na sekwencję miR21 i/lub prekursory miR21, który ma zdolność do specyficznej hydrolizy miR21 i/lub prekursorów miR21, który ma rdzeń katalityczny o sekwencji SEKW ID NR 1 i zawiera po obu stronach rdzenia katalitycznego ramiona o sekwencjach komplementarnych do rejonu w obrębie miR21 i/lub prekursorów miR21, przy czym rybozym ma sekwencję przedstawioną na SEKW ID NR 2, 3 albo 4.
Wynalazek ponadto dotyczy kompozycji, która zawiera co najmniej jeden rybozym według wynalazku lub ich mieszaninę. Taka kompozycja zawierająca rybozymy według wynalazku korzystnie zawiera nośnik zwiększający trwałość kwasów nukleinowych albo ułatwiający transport rybozymów przez błony komórkowe. Kompozycja korzystnie zawiera nośnik, którym jest Lipofektamina, przykładowo Lipofektamina 2000.
Wynalazek również dotyczy środka terapeutycznego, który jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden rybozym według wynalazku lub ich mieszaninę. Środek terapeutyczny korzystnie ponadto zawiera inny składnik hamujący rozwój komórek nowotworowych do jednoczesnego lub kolejnego zastosowania w terapii antynowotworowej. Korzystnym składnikiem hamującym rozwój komórek nowotworowych jest temozolomid lub gliadel, a nowotworem jest guz mózgu, korzystniej glejak mózgu.
Rybozymy, kompozycja jak i środek terapeutyczny według wynalazku mogą być stosowane w terapii różnych nowotworów np. guzów mózgu, szczególnie glejaków wielopostaciowych.
Wynalazek dotyczy również zastosowania rybozymów według wynalazku albo ich mieszaniny, kompozycji według wynalazku, środka terapeutycznego według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia nowotworów objawiających się zwiększeniem komórkowej zawartości miRNA dla miR21 i/lub prekursorów miR21. W korzystnym zastosowaniu chorobą objawiającą się zwiększeniem komórkowej puli miRNA dla miR21 i prekursorów miR21 jest guz mózgu, korzystniej glejak wielopostaciowy. Takie zastosowanie umożliwia selektywne niszczenie komórek nowotworowych. Lek taki może być stosowany w celu obniżania komórkowej zawartości miR21, w terapii guzów mózgu szczególnie glejaków wielopostaciowych oraz innych chorób objawiających się zwiększoną pulą miR21 i/lub prekursorów miR21.
Wynalazek dotyczy również sposobu selektywnej hydrolizy ex vivo miR21 i/lub prekursorów miR21, który obejmuje etap tworzenia kompleksu miR21 RNA i/lub prekursora miR21 z rybozymem według wynalazku lub ich mieszaniną.
Środek terapeutyczny według wynalazku można stosować w kombinowanej terapii antynowotworowej. W tym przypadku środek terapeutyczny według wynalazku zawiera dodatkowy znany składnik wspomagający hamowanie rozwoju nowotworów do jednoczesnego lub kolejnego zastosowania w terapii antynowotworowej.
Dodatkowym składnikiem wspomagającym hamowanie rozwoju nowotworów może być znany środek chemioterapeutyczny taki jak temozolomid czy gliadel lub środek radioterapeutyczny. W takiej terapii zwiększy się jej skuteczność, a ze względu na ukierunkowane działanie na komórki ze zwiększoną ilością miR21 zmniejszy się również ilość skutków ubocznych. Środek według wynalazku można stosować w kombinowanej terapii antynowotworowej. Środek podaje się na ogół w postaci odpowiednich form farmaceutycznych, gdzie substancja czynna jest połączona z terapeutycznie dopus zczalnym nośnikiem. Wybór nośnika będzie zależał od drogi podania środka i konieczności zabezpieczenia go przed inaktywacją lub degradacją przed wprowadzeniem lub w trakcie wprowadzania do komórek, tkanek lub organizmu.
Przykładowo substancję czynną w postaci kwasów nukleinowych można wprowadzać w układach liposomowych, korzystnie takich, które rozpoznają odpowiedni typ komórek lub tkanek.
Dawkę ustala się uwzględniając drogę podania, stan wymagający leczenia lub profilaktyki, a także inne specyficzne okoliczności.
PL 228 060 B1
Strukturę drugorzędową rybozymu typu ‘hammerhead’ według wynalazku przedstawia Fig. 1. Rybozym typu ‘hammerhead’ według wynalazku składa się z rdzenia katalitycznego o sekwencji SEKW ID NR 1 oraz ramion komplementarnych do rejonu w obrębie miR21 i/lub prekursora miR21. Korzystnie ramiona mają długość sześciu nukleotydów. Komplementarność ramion rybozymów do substratu jest warunkiem koniecznym do zaistnienia hydrolizy. Gwarantuje to wysoką aktywność, specyficzność i precyzję zaprojektowanych narzędzi w warunkach in vitro, w fizjologicznym stężeniu Mg2+ oraz w warunkach komórkowych. Długość ramion rybozymu jest kompromisem między aktywnością rybozymów i ich specyficznością.
W korzystnym rybozymie sześcionukleotydowe ramiona flankujące rybozymu są komplementarne do rejonu w obrębie sekwencji dojrzałego miR21 oraz prekursorów miR21. Korzystnym rybozymem jest miR21rz1 o sekwencji SEKW ID NR 2, zawierający rdzeń katalityczny o sekwencji SEKW ID NR 1. Rybozym ten hydrolizuje wiązanie przy końcu 3’ C w obrębie sekwencji AUC.
Innym korzystnym rybozymem jest miR21rz2 o sekwencji SEKW ID NR 3 zawierający rdzeń k atalityczny o sekwencji SEKW ID NR 1, który hydrolizuje wiązania przy końcu 3’ C, w obrębie sekwencji AUC.
Korzystnym rybozymem jest też miR21rz3 o SEKW ID NR 4, zawierający rdzeń katalityczny o sekwencji SEKW ID NR 1, który hydrolizuje wiązania przy końcu 3’ C, w obrębie sekwencji GUC.
Korzystnie rybozymy według wynalazku wykazują aktywność obniżającą endogenną pulę miR21 i/lub prekursorów miR21 w komórkach glejowych (Fig. 7).
Wydajność hydrolizy pre-miR21 katalizowanej przez rybozymy według wynalazku zależy od stężenia Mg2+ i zachodzi już w fizjologicznym stężeniu 1 mM, korzystnie do 5 mM, korzystniej do 10 mM, najkorzystniej w 25 mM stężeniu Mg2+ (Fig. 2A i 2B). Rybozymy będące stanem techniki, opisane w Suryawanshi H et al., Mol BioSyst 6, 1807-1809 (2010) w testach in vitro wykazują aktywność jedynie w 25 mM MgCl2 (stężenie niefizjologiczne). Nie wykazano czy rybozymy te wykazują również aktywność w fizjologicznym stężeniu Mg2+(około 1 mM).
Wydajność hydrolizy pre-miR21 katalizowanej przez rybozymy według wynalazku, jest zależna również od stężenia rybozymów, rosnąc wraz ze stosunkiem rybozym:substrat. Hydroliza pre-miR21 zachodzi korzystnie już przy 3-krotnym nadmiarze rybozymu w stosunku do substratu, korzystniej przy 6-krotnym nadmiarze rybozymu do substratu, korzystniej przy 25-krotnym nadmiarze rybozymu do substratu, najkorzystniej przy 50-krotnym nadmiarze rybozymu do substratu (Fig. 2C, 2D, 4 i 5).
Hydroliza pre-miR21 katalizowana przez rybozymy według wynalazku wymaga jonów Mg2+, nie zachodzi w obecności jonów jednowartościowych (Na+, NH4+, Li+). Jest także hamowana przez politlenki etylenu, polimery z grupy polieterów, o niskiej masie cząsteczkowej (200 oraz 400). Nie zaobserwowano hamowania hydrolizy w obecności innych czynników imitujących stłoczenie wewnątrzk omórkowe (ang. molecular crowding): PEG3350 oraz 5% MPD (Fig. 2F). Na wydajność hydrolizy premiR21 katalizowanej przez rybozymy według wynalazku nie wpływają znacząco warunki denaturacji/renaturacji oraz moment zainicjowania reakcji w obecności Mg2+ (Fig. 2E).
Wydajność hydrolizy miR21 katalizowanej przez rybozymy według wynalazku, korzystnie rybozym o sekwencji SEKW ID NR 2, zależy od stężenia Mg2+ i zachodzi przy 10-krotnym nadmiarze rybozymu do substratu w stężeniu do 5 mM, korzystnie do 10 mM, najkorzystniej w 25 mM stężeniu Mg2+. (Fig. 3A i 3B).
Wydajność hydrolizy miR21 katalizowanej przez rybozym według wynalazku, zależy od stężenia rybozymu, rosnąc wraz ze stosunkiem rybozy:substrat. Hydroliza miR21 zachodzi korzystnie już przy 1,5-krotnym nadmiarze rybozymu do substratu, korzystniej przy 3-krotnym nadmiarze rybozymu w stosunku do substratu, korzystniej przy 6-krotnym nadmiarze rybozymu do substratu, korzystniej przy 25-krotnym nadmiarze rybozymu do substratu, najkorzystniej przy 50-krotnym nadmiarze rybozymu do substratu (Fig. 3A i 3B).
Rybozymy według wynalazku charakteryzują się wysoką aktywnością w stosunku do miR21. Wydajność hydrolizy miR21 katalizowanej przez rybozym według wynalazku, zależy od czasu trwania reakcji i zachodzi wydajnie już w czasie do pół godziny, korzystnie do 1 godziny, korzystniej do 2 g odzin, korzystniej do 3 godzin, najkorzystniej do 5 godzin (Fig. 3A i 3B).
Na wydajność hydrolizy miR21 katalizowanej przez rybozym według wynalazku nie wpływ ają znacząco warunki denaturacji/renaturacji oraz moment zainicjowania reakcji w obecności Mg 2+ (Fig. 3C).
PL 228 060 B1
W stanie techniki nie opisano aktywności rybozymów względem dojrzałego miR21. Postulowano jedynie, na podstawie komplementarności ramion rybozymów do miR21, że mogą one wykazywać taką aktywność (Suryawanshi H et al., Mol BioSyst 6, 1807-1809 (2010).
Twórcy wynalazku wykazali, że rybozymy są również aktywne w komórkach linii HeLa oraz linii T98G wyprowadzonej z glioblastomy. Wydajność hydrolizy pre-miRNA, w systemie reporterowym opartym na białku EGFP, katalizowanej przez rybozymy, według wynalazku, zależy od rodzaju i stężenia rybozymów, rosnąc wraz ze stężeniem rybozymów. Hydroliza pre-miR21 zachodzi korzystnie już przy 31.25 nM, korzystniej przy 62.5 nM korzystniej przy 125 nM, najkorzystniej przy 250 nM stężeniu rybozymów w pożywce hodowlanej. Wydajność hydrolizy pre-miR21, w systemie reporterowym, katalizowanej przez rybozymy według wynalazku jest zbliżona dla wszystkich zaprojektowanych rybozymów. Zachodzi korzystnie z użyciem rybozymu miR21rz1 oraz miR21rz3, najkorzystniej z użyciem rybozymu miR21rz2 (Fig. 4 i 5).
Rybozymy anty-miR21, w przeciwieństwie do rybozymu kontrolnego (TARrz), efektywnie obniżają również endogenną zawartość miR21 oraz prekursorów miR21 w komórkach linii T98G wyprowadzonej z glejaka. Poziom wyciszenia pre-miR21 z użyciem wszystkich zastosowanych rybozymów anty-miR21 względem kontroli jest zbliżony i wynosi prawie 60%. Wyciszenie miR21 względem kontroli zachodzi korzystnie po zastosowaniu 250 nM miR21rz2, na poziomie 21.2%, korzystniej po zastosowaniu 250 nM miR21rz2, na poziomie 31.1%, najkorzystniej po zastosowaniu 250 nM miR21rz1, na poziomie 65.3%. Postuluje się, że obserwowany poziom wyciszenia miR21, po zastosowaniu miR21rz1 jest sumarycznym efektem hydrolizy miR21 oraz prekursorów miR21. Wskazuje to na przewagę narzędzi anty-miRNA według wynalazku, które jednocześnie hydrolizują dojrzały miRNA (miR21) oraz jego prekursor (Fig. 7).
Rybozymy będące stanem techniki, opisane w Suryawanshi H et al., Mol BioSyst 6, 1807-1809 (2010), w stężeniu 1 pM powodują spadek poziomu miR21 w linii MCF-7 (linia wyprowadzona z ludzkich komórek raka piersi, charakteryzuje się wysoką ekspresją miR21) na poziomie 40% oraz 60% po użyciu odpowiednio rybozymu dzikiego oraz rybozymu zmodyfikowanego. Nie wykazano w stanie techniki wpływu rybozymów na endogenną pulę miR21.
Rybozymy mogą być nietrwałe i ulegać szybkiej hydrolizie w warunkach fizjologicznych. Twórcy wykazali, że trwałość rybozymów według wynalazku, w surowicy krwi oraz w komórkach linii wyprowadzonej z glioblastomy, jest znacząco zwiększona w obecności nośnika zwiększającego trwałość kwasów nukleinowych, korzystnie Lipofektaminy 2000 (Fig. 8A i 8B).
Dodatkowo twórcy wynalazku wykazali, że hydroliza rybozymów w surowicy krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym oraz preparacie białkowym z guza mózgu zachodzi najwydajniej w obrębie ramion rybozymu. Rdzeń katalityczny rybozymu tworzy strukturę drugorzędową typu spinka do włosów, która jest odporna na hydrolizę. Utworzenie kompleksu rybozym:substrat może chronić również ramiona rybozymu przed nukleazami.
Cytowane w opisie publikacje oraz podane w nich odniesienia są również niniejszym włączone jako referencje.
Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na których:
Figura 1 przedstawia strukturę Il-rzędową rybozymu typu ‘hammerhead’ według wynalazku oraz miejsca hydrolizy pre-miR21 oraz miR21 z użyciem rybozymów skierowanych na premiR21/miR21.
(A). Miejsca w obrębie pre-miR21 oraz miR21 znajdujące się w rdzeniu katalitycznym rybozymów zaznaczono liniami, miejsca hydrolizy strzałkami (B). N oznacza dowolny nukleotyd, R - purynę, U - urydynę, A - adeninę, C - cytozynę, G - guaninę.
Figura 2 przedstawia wyniki hydrolizy pre-miR21 z użyciem rybozymów miR21rz1, miR21rz2, miR21rz3 (patrz Przykład 2).
A i B. Reakcje prowadzone przy stałym stężeniu rybozymu (miR21rz1/miR21rz2/miR21rz3) (250 nM) (25-krotny nadmiar rybozymu względem substratu) oraz różnych stężeniach Mg2+ (0, 1, 5, 10, 25, 50 mM).
C i D. Reakcje prowadzone w stałym stężeniu jonów Mg2+ (10 mM), różnych stężeniach rybozymów (miR21rz1/miR21rz2/miR21rz3) (0, 15.625, 31.25, 62.5, 125, 250 nM) (odpowiednio 1.5625-, 3.125-, 6.25-, 12.5-, 25-krotny nadmiar rybozymu względem substratu).
PL 228 060 B1
E. Reakcje prowadzone w różnych warunkach denaturacji/renaturacji oraz inicjacji.
F. Reakcje prowadzone w obecności jonów jednowartościowych lub czynników imitujących stłoczenie wewnątrzkomórkowe.
C - kontrola reakcji; L - OH ladder (50 mM NaOH, 10 mM EDTA, 95°, 2 min); T1 - hydroliza z użyciem RNAzy T1 (20 nM CB.COONa pH 4.5, 7M mocznik, 1 mM EDTA, 0,025 μ/pl RNAse T1, 55°C, 20 min), V1 - hydroliza z użyciem RNazy V1 (50 mM TrisHCl pH 7.5, 200 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 0.0002 μ/μΙ RNAza VI, 25°C, 15 min), S1 - hydroliza z użyciem nukleazy S1 (150 mM CH3COONa pH 8.0, 1M NaCl, 15 mM ZnSO4, 0.0095 μ/μ nuclease S1,37°C, 30 min), S72 - substrat o długości 72nt (pre-miR21), P56, P16 - produkty hydrolizy, odpowiednio o długości 56 i 16 nt, G45, G44, G35, G32, G28, G25, G22, G18 - produkty hydrolizy pre-miR21 z użyciem nukleazy T1, podana nazwa wskazuje długość produktu hydrolizy.
Figura 3 przedstawia wyniki hydrolizy miR21 z użyciem rybozymu miR21rz1 (patrz Przykład 2).
A i B. Reakcje prowadzone w stałym stężeniu miR21 w obecności [ P]miR21 RNA, w różnych stężeniach rybozymu lub MgCl2.
1-6. Reakcje prowadzono w stałym stężeniu rybozymu (100 nM) (10-krotny nadmiar rybozymu względem substratu). Próby suplementowano różnymi stężeniami Mg2+ (0, 1, 5, 10, 25, 50 mM), po czym dalej inkubowano w 37°C przez 1 godzinę.
7-12. Reakcje prowadzono w stałym stężeniu rybozymu (100 nM) (10-krotny nadmiar względem substratu) i Mg2+ (10 mM), przez 0.5, 1,2, 3, 5 godzin.
13-18. Reakcje prowadzono w różnych stężeniach rybozymu (0, 15.625, 31.25, 62.5, 125, 250 nM) (odpowiednio 1.5625-, 3.125-, 6.25-, 12.5-, 25-krotny nadmiar rybozymu względem substratu). Próby suplementowano 10 mM Mg2+, po czym dalej inkubowano w 37°C przez 1 godzinę.
C. Reakcje prowadzone w różnych warunkach denaturacji/renaturacji oraz inicjacji.
C - kontrola reakcji; L - OH ladder (50 mM NaOH, 10 mM EDTA, 95°, 2 min); T - hydroliza z użyciem RNAzy T1 (20 nM CB.COONa pH 4.5, 7M mocznik, 1 mM EDTA, 0.025 μ/pl RNAse T1, 55°C, 20 min), S22 - substrat o długości 22nt (miR21), P9 - produkt hydrolizy o długości 9nt, G21, G18, G15, G11, G3 - produkty hydrolizy miR21 z użyciem nukleazy T1 , podana nazwa wskazuje długość produktu hydrolizy.
Figura 4 przedstawia wpływ rybozymów anty-miR21 na stopień hydrolizy pre-miR21 w systemie reporterowym opartym na białku EGFP, w linii komórkowej HeLa (patrz Przykład 3).
A. Obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego Leica komórek linii HeLa po 24 godzinach od tran sfekcji plazmidem pEGFP-N3 zawierającym sekwencję kodującą pre-miR21 oraz różnymi stężeniami katalitycznych kwasów nukleinowych.
B. Diagram obrazujący zależność poziomu białka EGFP od stężenia poszczególnych katalitycznych kwasów nukleinowych.
C. Analiza Western blot wskazująca zależność ekspresji białka EGFP od stężenia i rodzaju zastosowanego katalitycznego kwasu nukleinowego.
C - kontrola (komórki traktowane jedynie Lipofektaminą 2000, CR - rybozym kontrolny (TARrz).
Figura 5 przedstawia wpływ rybozymów anty-miR21 na stopień hydrolizy pre-miR21 w systemie reporterowym opartym na białku EGFP, w linii komórkowej T98G wyprowadzonej z glioblastomy (patrz Przykład 3).
A. Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego Leica komórek linii T98G po 24 godzinach od transfekcji plazmidem pEGFP-N3 zawierającym sekwencję kodującą pre-miR21 oraz różnymi stężeniami katalitycznych kwasów nukleinowych.
B. Diagram obrazujący zależność poziomu białka EGFP od stężenia poszczególnych katalitycznych kwasów nukleinowych.
C. Analiza Western blot wskazująca zależność ekspresji białka EGFP od stężenia i rodzaju zastosowanego katalitycznego kwasu nukleinowego.
C - kontrola (komórki traktowane jedynie Lipofektaminą 2000, CR - rybozym kontrolny (TARrz).
Figura 6 przedstawia porównanie wydajności transfekcji komórek linii HeLa oraz T98G z użyciem znakowanego fluorescencynie dsRNA (patrz Przykład 3).
Figura 7 przedstawia wpływ rybozymów anty-miR21 na endogenną pulę miR21 oraz prekursorów miR21 w linii komórkowej T98G (patrz Przykład 4).
Figura 8 przedstawia wyniki analizy stabilności rybozymu miR21rz3 w surowicy ludzkiej (A) oraz w linii komórkowej T98G (B) (patrz Przykład 5).
PL 228 060 B1
Poniższe przykłady zostały umieszczone jedynie w celu zilustrowania wynalazku, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach.
P R Z Y K Ł A D Y
P R Z Y K Ł A D 1
Wytworzenie rybozymów miR21rz1, miR21rz2, miR21rz3
Zaprojektowano rybozymy typu ‘hammerhead’ miR21rz1, miR21rz2, miR21rz3 skierowane na sekwencję miR21 i/lub prekursorów miR21. 34 nt sekwencja rybozymów obejmuje 22 nt rdzeń katalityczny o sekwencji SEKW ID NR1 oraz zlokalizowane po obu stronach ramiona, korzystnie sześcionukleotydowe, o sekwencjach komplementarnych do rejonu w obrębie miR21 i/lub prekursorów miR21. Rybozym miR21rzl ma sekwencję SEKW ID NR 2, miR21rz2 sekwencję SEKW ID NR 3, miR21rz3 sekwencję SEKW ID NR 4. Sekwencję rdzenia katalitycznego rybozymów wybrano w oparciu o badania własne Zgłaszającego (Fedoruk-Wyszomirska A et al., J Biochem 145, 451-459 (2009)). Długość ramion rybozymu jest kompromisem między aktywnością rybozymów a ich spec yficznością (Kurreck J et al., J Biol Chem 277, 7099-7107 (2000)). Rybozymy miR21rz1 i miR21rz2 zaprojektowano tak aby hydrolizowały wiązania na końcu 3’ C w obrębie sekwencji AUC, miR21rz3 w obrębie sekwencji GUC. Obecność tych sekwencji w obrębie substratu oraz komplementarność ramion rybozymów do substratu są warunkami koniecznymi do zaistnienia hydrolizy. Gwarantuje to wysoką aktywność, specyficzność i precyzję zaprojektowanych narzędzi w warunkach in vitro, w fizjologicznym stężeniu Mg2+ oraz w warunkach komórkowych.
Strukturę II-rzędową rybozymu typu ‘hammerhead’ oraz miejsca hydrolizy pre-miR21 oraz miR21 z udziałem zaprojektowanych rybozymów przedstawiono na Fig. 1.
Rybozymy zostały z syntetyzowane zgodnie ze standardową procedurą syntezy oligonukleotydów RNA przez firmę I BA.
P R Z Y K Ł A D 2
Aktywność rybozymów skierowanych na miR21 w warunkach in vitro
Określono wydajność hydrolizy miR21 i/lub pre-miR21 z użyciem rybozymów według wynalazku w różnych stężeniach jonów Mg2+ (0, 1, 5, 10, 25, 50 mM), przy różnych stosunkach substratu do rybozymu oraz w różnym czasie (Fig. 2 i 3). pre-miR21 oraz miR21 inkubowano w nadmiarze (stężenia: 0, 15.625, 31.25, 62.5, 125, 250 nM = odpowiednio 1.5625-, 3.125-, 6.25-, 12.5-, 25-krotny nadmiar rybozymu względem substratu) poszczególnych rybozymów miR21rz1/miR21rz2/miR21rz3, w 10 pl, 50 mM Tris/HCl, pH 7.5. Reakcje prowadzono w obecności znakowanego na końcu 5’ substratu, odpowiednio [ P]pre-miR21 i [ P]miR21. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w 85°C przez 3 min. w celu denaturacji RNA, następnie wolno schładzano do 37°C (~0.5°C/min). Po osiągnięciu 37°C mieszaninę reakcyjną suplementowano MgCl2 w celu zainicjowania reakcji i dalej inkubowano w tej samej temperaturze, 0-16 godzin. Reakcje zatrzymywano przez dodanie mieszaniny zwierającej 7M mocznik, 20 mM EDTA oraz barwniki (0,1% błękit bromofenolowy oraz 0.1% cyjanol ksylonowy). Próby analizowano w 20% żelu poliakrylamidowym z dodatkiem 7M mocznika. Wydajność reakcji określano na podstawie stosunku ilościowego substratu do produktu.
W warunkach in vitro rybozymy miR21rz1, miR21rz2, miR21rz3 hydrolizują pre-miR21 z różną wydajnością. Najaktywniejszym z zaprojektowanych rybozymów jest miR21rz3. W 25-krotnym nadmiarze w stosunku do substratu, w 25 mM Mg2+ po 15 godzinach reakcji hydrolizuje on pre-miR21 na poziomie 12.5% - prawie 5.5-krotnie wyższym niż miR21rz1. W żadnych z zastosowanych warunków in vitro, rybozym miR21rz2 nie wykazuje aktywności hydrolitycznej względem pre-miR21 natomiast wykazuje taką aktywność w warunkach in vivo. Wydajność reakcji katalizowanej przez ww. rybozymy zależy od stężenia Mg2+ i zachodzi najwydajniej w 25 mM stężeniu tego jonu, przy czym wydajna hydroliza zachodzi już w 1 mM Mg2+. Rybozymy będące stanem techniki, opisane w Suryawanshi H et al., Mol BioSyst 6, 1807-1809 (2010) w testach in vitro wykazują aktywność jedynie w 25 mM MgCl2 (stężenie niefizjologiczne). Nie wykazano czy rybozymy te wykazują również aktywność w fizjologic znym stężeniu Mg2+(1 mM).
Wydajność hydrolizy pre-miR21 jest zależna również od stężenia rybozymów. Wzrasta wraz ze wzrostem stosunku rybozym:substrat i osiąga w 10 mM Mg2+, przy 3-krotnym nadmiarze rybozymu 2% i 3% wydajność hydrolizy pre-miR21, przy 50-krotnym nadmiarze rybozymu 9% i 20%, odpowiednio dla rybozymu miR21rz1 oraz miR21rz3 (Fig. 2).
W celu oceny przebiegu reakcji w obecności jonów jednowartościowych lub czynników imitujących stłoczenie wewnątrzkomórkowe (ang. molecular crowding) (Fig. 2F), reakcje prowadzono w sta10
PL 228 060 B1 łym stężeniu pre-miR21 (10 nM), w obecności 30 000 cpm [ P]pre-miR21 RNA, stałym stężeniu rybozymu miR21rz3 (250 nM), w 50 mM TrisHCI, pH 7.5 (1-13), 10 mM MgCfe (2-8, 13), 10 mM NaCI (10), 10 mM NH4Cl (11), 10 mM LiCl (12), 16% PEG200 (3), 16% PEG400 (4), 16% PEG 3350 (5), PEG4000 (6), 40 mM spermina (7), 40 mM spermidyna (8), 5% MPD, 20 mM kakodylanie sodu, pH 5.5, 10 mM LiCl, 20 mM MgCl2, 10 mM heksaamina kobaltu (14), 5% MPD, 20 mM kakodylan sodu, pH 5.5, 20 mM LiCl, 10 mM MgCl2, 10 mM heksaamina kobaltu (15), 5% MPD, 20 mM kakodylanie sodu, pH 5.5, 30 mM LiCl, 10 mM heksaamina kobaltu (16). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w 85°C przez 3 min, następnie powoli schładzano (~0.5°C na 1 min) do 37°C i inkubowano przez 15 godzin. Reakcje bez jonów Mg2+ traktowano jako reakcje kontrolne.
Produkty reakcji analizowano w 20% żelu poliakrylamidowym z 7M mocznikiem.
Wykazano, że hydroliza nie zachodzi w obecności jonów jednowartościowych (Na+, NH4+, Li+), co więcej jest hamowana przez politlenki etylenu, polimery z grupy polieterów, o niskiej masie cząsteczkowej (200 oraz 400). Nie zaobserwowano hamowania hydrolizy w obecności innych czynników imitujących stłoczenie wewnątrzkomórkowe: 16% PEG3350 oraz 5% MPD (Fig. 2F).
W celu oceny czy na wydajność hydrolizy wpływają zmiany warunków denaturacji/renaturacji lub moment zainicjowania reakcji przez dodanie Mg2+. Wydajność hydrolizy nie zależy od warunków denaturacji/renaturacji próby oraz momentu zainicjowania reakcji przez dodanie Mg2+ prowadzono reakcje w stałym stężeniu rybozymu miR21rz1 (250 nM), pre-miR21 (10 nM) w obecności 30 000 cpm [32P]pre-miR21, stałym stężeniu Mg2+ (10 mM), 50 mM TrisHCl, pH 7.5, w 37°C przez 15 godzin. 1 - pre-miR21 i rybozym denaturowano (85°C, 3 min) oddzielnie, połączono po schłodzeniu do 37°C, następnie suplementowano MgCl2; 2 - pre-miR21 i rybozym denaturowano (85°C, 3 min) łącznie, schłodzono do 37°C, następnie suplementowano MgCl2; 3 - pre-miR21 i rybozym denaturowano (85°C, 3 min) oddzielnie w obecności Mg2+, po schłodzeniu do 37°C próby połączono i inkubowano dalej w 37°C; 4 - pre-miR21 oraz rybozym denaturowano (85°C, 3 min) łącznie w obecności MgCl2, następnie schłodzono do 37°C; 5 i 6 - próby niedenaturowane, suplementowane (5) bądź niesuplementowane (6) MgCl2; 7 - pre-miR21 oraz rybozym denaturowane (85°C, 3 min) łącznie, niesuplementowane MgCl2; 8 - pre-miR21 (bez dodatku rybozym) denaturowany (85°C, 3 min), po schłodzeniu do 37°C suplementowany MgCl2. Produkty reakcji analizowano w 20% żelu poliakrylamidowym z 7M mocznikiem.
Wykazano, że we wszystkich przetestowanych warunkach hydroliza zachodzi na zbliżonym poziomie (Fig. 2E).
Rybozym miR21rz1 zaprojektowano tak aby oprócz prekursorów miR21 rozpoznawał i hydrolizował dojrzały miR21. W celu analizy hydrolizy miR21 prowadzono reakcje w stałym stężeniu miR21 w obecności [ P]miR21 RNA, w różnych stężeniach rybozymu, lub MgCl2, w 50 mM TrisHCl, pH 7.5, w objętości 10 pl. Próby inkubowano w 85°C przez 3 min, następnie powoli schładzano (~0.5°C/min), po osiągnięciu 37°C suplementowano Mg2+. Produkty reakcji analizowano w 20% żelu poliakrylamidowym z 7M mocznikiem (Fig. 3A i B).
W warunkach in vitro miR21rz1 wykazuje znacznie wyższą aktywność w stosunku do miR21 niż do jego prekursora (pre-miR21). W 10-krotnym nadmiarze rybozymu w stosunku do substratu oraz 10 mM Mg2+ już po 30 min. prawie 60% miR21 ulega hydrolizie, tymczasem w przypadku pre-miR21 taki poziom hydrolizy nie jest osiągalny nawet po 15 godzinnej inkubacji z miR21rz1 . Wydłużenie czasu inkubacji daje ~80% i ponad 90% zhydrolizowanego substratu odpowiednio po 1 i 2 godzinach. Ponadto hydroliza miR21 z użyciem miR21rz1 zachodzi w niższych stężeniach Mg2+ niż ma to miejsce w przypadku pre-miR21. W 10-krotnym nadmiarze rybozymu do substratu, po 1 godzinie w 5 mM Mg2+ 70% miR21 ulega hydrolizie, w 10 mM Mg2+ - ponad 90%. Co więcej już 1.5-krotnym nadmiarze miR21rz1 w stosunku do miR21, w 10 mM Mg2+, po 1 godzinie wydajność hydrolizy sięga 80%, w 3-krotnym nadmiarze prawie 90%. Dalsze zwiększanie nadmiaru rybozymu jedynie nieznacznie zwiększa wydajność hydrolizy substratu.
W stanie techniki nie opisano aktywności rybozymów względem dojrzałego miRNA. Postulowano jedynie, na podstawie komplementarności ramion rybozymów do miR21, że mogą one wykazywać taką aktywność (Suryawanshi H et al., Mol BioSyst 6, 1807-1809 (2010).
W celu oceny wpływu zmiennych warunków denaturacji/renaturacji lub inicjacji (Fig. 3C), prowadzono reakcje w stałym stężeniu rybozymu miR21rz1 (100 nM), miR21 (10 nM) w obecności 30 000 cpm [32P]miR21, stałym stężeniu Mg2+ (10 mM), 50 mM TrisHCl, pH 7.5, w 37°C przez 5 godzin. 1 - miR21 i rybozym denaturowano (85°C, 3 min) oddzielnie, połączono po schłodzeniu do 37°C, następnie suplementowano MgCl2; 2 - pre-miR21 i rybozym denaturowano (85°C, 3 min) łącznie,
PL 228 060 B1 schłodzono do 37°C, następnie suplementowano MgCl2; 3 - miR21 i rybozym denaturowano (85°C, 3 min) oddzielnie w obecności Mg2+, po schłodzeniu do 37°C próby połączono i inkubowano dalej w 37°C; 4 - miR21 oraz rybozym denaturowano (85°C, 3 min) łącznie w obecności MgCl2, następnie schłodzono do 37°C; 5 i 6 - próby niedenaturowane, suplementowane (5) bądź niesuplementowane (6) MgCl2; 7 - pre-miR21 oraz rybozym denaturowane (85°C, 3 min) łącznie, niesuplementowane MgCl2; 8 - miR21 (bez dodatku rybozym) denaturowany (85°C, 3 min), po schłodzeniu do 37°C suplementowano MgC.
Produkty reakcji analizowano w 20% żelu poliakrylamidowym z 7M mocznikiem.
Hydroliza miR21 z użyciem miR21rz1, podobnie jak w przypadku pre-miR21, nie zależy od warunków denaturacji/renaturacji mieszaniny reakcyjnej oraz momentu jej suplementacji z użyciem Mg2+ (Fig. 3C).
P R Z Y K Ł A D 3
Aktywność rybozymów anty-miR21 w warunkach in vivo w linii komórkowej HeLa oraz linii T98G wyprowadzonej z glioblastomy w systemie reporterowym opartym na białku EGFP
Do określenia wydajności hydrolizy pre-miR21 z użyciem zaprojektowanych rybozymów, w liniach komórkowych, wykorzystano system reporterowy oparty na białku zielonej fluorescencji (GFP). Do wektora pEGFP-N3 (BD Biosciences Clontech), pod promotorem cytomegalowirusa (CMV), w ramce odczytu dla białka EGFP wklonowano sekwencję kodującą pre-miR21. Linie komórkowe transfekowano równocześnie plazmidem pEGFP-N3 zawierającym sekwencję kodującą pre-miR21 oraz poszczególnymi rybozymami, w obecności Lipofektaminy 2000 (Invitrogen) zgodnie z instrukcją producenta. Stopień hydrolizy transkryptu zawierającego sekwencję pre-miR21 oraz mRNA białka EGFP oceniano po 24 godzinach od momentu transfekcji na podstawie pomiaru fluorescencji oraz poziomu białka EGFP. Hydroliza mRNA w obrębie sekwencji pre-miR21 uniemożliwia syntezę białka EGFP. W efekcie obserwujemy obniżony poziom tego białka oraz spadek fluorescencji w komórkach traktowanych rybozymem w stosunku do kontroli bez rybozymu.
Hodowlę linii komórkowej HeLa lub T98G prowadzono na szalkach 24 dołkowych, w pożywce odpowiednio RPMI-1640 (Sigma) lub EMEM (ATCC) suplementowanej 10% FBS (Gibko), 1% witaminami i 1% antybiotykami (Sigma), w 37°C, w 5% CO2. Po osiągnięciu 70% konfluencji linię transfekowano plazmidem pEGFP-N3 zawierającym sekwencję pre-miR21 (0.8 g μg/dołek) oraz katalitycznymi kwasami nukleinowymi, w ilościach dających ich 31.25, 62.5, 125, 250 nM stężenia w pożywce. Kwasy nukleinowe wprowadzane były do komórek z wykorzystaniem odczynnika Lipofectamine 2000 (Inv itrogen), zgodnie z protokołem producenta. Przed transfekcją komórki przemywano buforem PBS oraz dostarczono świeżej niesuplementowanej pożywki. Wydajność hydrolizy transkryptów zawierających sekwencję pre-miR21 oraz mRNA białka EGFP z użyciem katalitycznych kwasów nukleinowych oceniono 24 godziny od transfekcji na podstawie obserwacji linii komórkowej z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego Leica (Fig. 4A), pomiaru fluorescencji białka EGFP z użyciem Multi-mode Microplate Reader BioTek Synergy2 (Fig. 4B) oraz poziomu białka EGFP na podstawie analizy Western blot (Fig. 4C). Przy analizie Western blot 30 μg białka rozdzielano na 18% SDS-PAGE w obecności markera wielkości, a następnie przenoszono na membranę PVDF (1 h, 350 mM, 100V). Po zablokowaniu niespecyficznych miejsc wiązania przeciwciał 10% roztworem odtłuszczonego mleka i przepłukaniu membrany buforem PBS oraz PBS z 0.1% Tween 20 inkubowano ją przez 2 godziny najpierw w obecności przeciwciała I-rzędowego dla GFP lub GAPDH, rozcieńczonych w buforze PBS z 0,1% Tween 20 oraz 3% BSA w stosunku 1:500, a następnie w obecności przeciwciała Il-rzędowego skoniugowanego z biotyną, w stosunku 1:1000. Kolejne etapy obejmowały inkubację ze streptawidyną skoniugowaną z alkaliczną fosfatazą (10 μl streptawidyny/ 5 ml buforu PBS, 15 min) oraz immunodetekcję z użyciem roztworu Sigma Fast BCIP/NBT (Sigma). Każdy etap poprzedzało 3-krotne przepłukanie membrany, kolejno w buforze PBS, PBS + 0,1% Tween 20 oraz PBS.
Komórki transfekowane jedynie plazmidem, a także traktowane równocześnie plazmidem i rybozymem nie wykazującym komplementamości do pre-miR21 traktowano jako kontrole.
Wszystkie zastosowane rybozymy (miR21rz1 , miR21rz2, miR21rz3) wykazują zbliżoną aktywność w liniach komórkowych (Tab. 3, Fig. 4 i 5), przy czym w linii T98G jest ona nieznacznie wyższa, w porównaniu z linią HeLa.
PL 228 060 Β1
Tab. 3. Wartości IC50 dla rybozymów miR21rz1, miR21rz2, miR21rz3 w liniach T98G oraz Hela.
Wartości otrzymano na podstawie pomiaru fluorescencji komórek po 24 h od transfekcji plazmidem pEGFP-N3 zawierającym sekwencję kodującą pre-miR21. Kalkulację IC50 oraz obliczenia statystyczne wykonano w programie GraphPrism.
| miR2lrzJ | miR2lrz2 | m:R2i i zł | |
| IC50 (T98G) | 115.5 nM | 91.2 nM | 99,2 nM |
| IC5o (HeLa) | 60.2 nM | 53.0 nM | 69.2 nM |
W celu sprawdzenia czy różnice te nie wynikają z różnic w podatności tych linii na transfekcję, hodowlę linii komórkowej HeLa oraz T98G prowadzono na szalkach 24 dołkowych, odpowiednio w pożywce RPMI-1640 (Sigma) suplementowanej 10% FBS (Gibko), 1% witaminami i 1% antybiotykami (Sigma) oraz pożywce EMEM (ATCC) suplementowanej 10% FBS (Gibko), 1% witaminami i 1% antybiotykami (ATCC), w 37°C, w 5% CO2. Po osiągnięciu 70% konfluencji komórki transferowano z użyciem 300 nM (w 200 μΙ pożywki) znakowanego fluorescencyjnie dsRNA (Validated Stealth RNA i Duplex2, lnvitrogen). Kwasy nukleinowe wprowadzane były do komórek z wykorzystaniem odczynnika Lipofectamine 2000 (lnvitrogen), zgodnie z protokołem producenta. Przed transfekcją komórki przemywano buforem PBS oraz dostarczono świeżej niesuplementowanej pożywki. Wydajność transfekcji oceniono po 24 godzinach na podstawie obserwacji linii komórkowej z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego Leica (A) oraz pomiaru fluorescencji z użyciem Multi-mode Microplate Reader BioTek Synergy2 (B). Oceniono wydajność transfekcji komórek w obecności oraz bez Lipofektaminy 2000. Wydajność transfekcji obu linii z użyciem znakowanego fluorescencyjnie dsRNA jest zbliżona (~45%), z niewielką (2%) przewagą na korzyść T98G (Fig. 6). W obu liniach najwyższą aktywność wykazuje miR21rz2, IC50 = 91.2 nM oraz 53 nM, odpowiednio dla linii T98G i HeLa. W zastosowanych warunkach maksymalny stopień wyciszenia ekspresji EGFP jest zbliżony dla wszystkich rybozymów, wynosi 76% oraz 69%, odpowiednio w linii HeLa i T98G. Postuluje się, że różnice w aktywności rybozy mów w różnych liniach mogą wynikać z różnego poziomu endogennej puli miR21 oraz pre-miR21 w tych liniach. Linię T98G cechuje znacznie wyższy poziom endogennego pre-miR21 oraz miR21 niż linię HeLa. Niewątpliwie część z dostarczonych do komórek rybozymów zaangażowana jest w hydrolizę endogennych pre-miR21 oraz miR21. Przy wysokim endogennym poziomie miR21 oraz pre-miR21 spadek fluorescencji oraz poziomu białka EGFP nie odzwierciedla w pełni stopnia hydrolizy premiR21 w komórkach, a jedynie stopień hydrolizy transkryptów zawierających sekwencję pre-miR21 skoniugowaną z mRNA białka EGFP.
PRZYKŁAD 4
Aktywność rybozymów anty-miR21 w warunkach in vivo w linii komórkowej HeLa oraz linii T98G wyprowadzonej z glioblastomy - wpływ rybozymów na endogenną pulę miR21 oraz prekursorów miR21
Określono wpływ rybozymów na poziom endogennej puli miR21 oraz prekursorów miR21 w komórkach T98G. Pomiar ilościowy miR21, prekursorów miR21 oraz R18S RNA jako referencji wykonano z użyciem techniki Real-time PCR. Komórki linii T98G traktowano rybozymami anty-miR21 (250nM), rybozymem kontrolnym (250nM) lub jedynie Lipofektaminą 2000 (kontrola).
Hodowlę linii komórkowej T98G prowadzono na szalkach 24 dołkowych w pożywce EMEM (ATCC) suplementowanej 10% FBS (Gibko), 1% witaminami i 1% antybiotykami (ATCC), w 37°C, w 5% CO2. Po osiągnięciu 70% konfluencji komórki transfekowano z użyciem 250 nM (w 200 μΙ pożywki) rybozymów. Kwasy nukleinowe wprowadzane były do komórek z wykorzystaniem odczynnika Lipofectamine 2000 (lnvitrogen), zgodnie z protokołem producenta. Przed transfekcją komórki przemywano buforem PBS oraz dostarczono świeżej niesuplementowanej pożywki EMEM.
Po 24 godzinach od transfekcji izolowano RNA z użyciem TRI Reagent® (Molecular Research Center). Próby traktowano DNA-free™ Kit (Applied Biosystems) w celu usunięcia DNA oraz jonów
PL 228 060 B1 dwuwartościowych. Stężenie oraz czystość otrzymanego RNA oceniono przy pomocy NanoDrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Scientific), jakość w 10% żelu poliakrylamidowym z 7M mocznikiem. Przeprowadzono poliadenylacji miRNA oraz odwrotną transkrypcję z wykorzystaniem miRNA 1st-Strand cDNA Synthesis Kit (Stratagene). Otrzymany materiał użyto w reakcji Real-Time PCR. Rekcje przeprowadzono w obecności oligonukleotydu komplementarnego do ogona poliadenylowego (Universal Reverse Primer) oraz startera unikalnego dla miR21 (miRNA-21 Forward Primer, Agilent Technologies) oraz DyNAmo* HS SYBR* Green qPCR Kit (ThermoScientific), zgodnie z protokołem: denaturacja (95°C, 10 min.), następnie 40 cykli (95°C, 30 sek.; 55°C, 30 sek.; 72°C, 30 sek.) oraz cykl kończący (95°C, 60 sek.; 55°C, 30 sek., 95°C, 30 sek). Na podstawie otrzymanych wyników określono relatywny poziom pre-miR21 oraz miR21 w komórkach traktowanych rybozymami miR21rz1, miR21rz2, miR21rz3 oraz rybozymen kontrolnym TARrz, w odniesieniu do poziomu tych RNA w komórkach traktowanych jedynie Lipofektaminą 2000. Próby znormalizowano względem poziomu 18S rRNA.
Wyniki dowodzą, że rybozymy anty-miR21, w przeciwieństwie do rybozymu kontrolnego, efektywnie obniżają endogenną pulę miR21 oraz prekursorów miR21 w komórkach. Poziom wyciszenia prekursorów miR21 z użyciem wszystkich zastosowanych rybozymów anty-miR21 względem kontroli jest porównywalny i wynosi 56%, 56.5% oraz 59.5% odpowiednio dla miR21rz1, miR21rz2 oraz miR21rz3. Najwyższy poziom wyciszenia miR21 względem kontroli osiągnięto po zastosowaniu miR21rz1, wynosi on 65.3%. Dla miR21rz2 i miR21rz3 jest on znacząco niższy i przyjmuje wartość odpowiednio 21.2% i 31.1%. Postuluje się, że obserwowany poziom wyciszenia miR21, po zastosowaniu miR21rz1 jest sumarycznym efektem hydrolizy miR21 oraz prekursorów miR21. Wskazuje to na przewagę narzędzi anty-miRNA, które jednocześnie hydrolizują dojrzały miRNA oraz jego prekursory (Fig. 7).
Rybozymy będące stanem techniki, opisane w Suryawanshi H et al., Mol BioSyst 6, 1807-1809 (2010) w testach komórkowych, w stężeniu 1 μΜ powodują spadek poziomu miRNA na poziomie 40% oraz 60% po użyciu odpowiednio rybozymu dzikiego oraz rybozymu zmodyfikowanego.
P R Z Y K Ł A D 5
Stabilność rybozymów ‘hammerhead’ skierowanych na miR21 oraz prekursory miR21 w surowicy ludzkiej oraz hodowli komórkowej T98G.
Zaprojektowanie narzędzia katalityczne skierowane na miR21 oraz prekursory miR21 z założenia mają mieć zastosowanie w terapii GBM. Zasadne było zatem określenie ich trwałości w środowisku oddającym warunki panujące w organizmie. W warunkach in vitro wykorzystano do tego celu surowicę ludzką, ekstrakt z guza oraz płyn mózgowo-rdzeniowy, w warunkach in vivo linię komórkową wyprowadzoną z glioblastomy, T98G (Fig. 8A i B).
W celu analizy trwałości w surowicy krwi 100 nM miR21rz3 w obecności 30000 cpm [ P]miR21rz3 inkubowano w surowicy krwi przez 1 lub 10 min., w 37°C. Reakcję prowadzono w 10 μl opcjonalnie: bez dodatku Lipofektaminy 2000 bądź z dodatkiem 1 μl Lipofektaminy 2000 (Invitrogen) (przed dodaniem surowicy kwasy nukleinowe zmieszano z Lipofektaminą 2000). Reakcje zatrzym ywano przez dodanie mieszaniny zwierającej 7M mocznik, 20 mM EDTA oraz barwniki (0.1% błękit bromofenolowy oraz 0,1% cyjanol ksylonowy). Próby analizowano w 20% żelu poliakrylamidowym z dodatkiem 7M mocznika.
W celu oceny trwałości w hodowli komórkowej glioblastomy hodowlę linii komórkowej T98G prowadzono na szalkach 24 dołkowych, w pożywce EMEM (ATCC) suplementowanej 10% FBS (Gibko), 1% witaminami i 1% antybiotykami (ATCC), w 37°C, w 5% CO2. Po osiągnięciu 70% konfluencji komórki transfekowano z użyciem 250 nM miR21rz3 w obecności 60000 cpm [ P]miR21rz3 (w 200 μl pożywki). Kwasy nukleinowe wprowadzane były do komórek z wykorzystaniem odczynnika Lipofectamine 2000 (Invitrogen), zgodnie z protokołem producenta. Przed transfekcją komórki przemywano buforem PBS oraz dostarczono świeżej niesuplementowanej pożywki. Po 1, 5 lub 16 godzinach od transfekcji komórki przemyto buforem PBS, a następnie izolowano z nich RNA z użyciem TRI.
Reagent® (Molecular Research Center). Do prób dodano mieszaninę zwierającą 7M mocznik, 20 mM EDTA oraz barwniki (0,1% błękit bromofenolowy oraz 0.1% cyjanol ksylonowy), a następnie analizowano w 20% żelu poliakrylamidowym z dodatkiem 7M mocznika.
Rybozym miR21rz3 jest nietrwały w surowicy krwi. Po 1 min. inkubacji surowicą ulega niemal 100% hydrolizie. Dodatek Lipofektaminy 2000 znacząco zwiększa trwałość miR21rz3. W obecności tego nośnika nie obserwujemy degradacji rybozymu w surowicy nawet po 10 min. inkubacji. W warunkach komórkowych (linia T98G) nie zaobserwowano znaczącego ubytku rybozymu. Niewątpliwie,
PL 228 060 B1 również w tym przypadku trwałość zastosowanych kwasów nukleinowych w znacznej mierze zależy od obecności Lipofektaminy 2000 (Fig. 8).
Opis wykazu sekwencji
SEKW ID NR 1 - sekwencja rdzenia katalitycznego rybozymów według wynalazku 5’-CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA-3’
SEKW ID NR 2 - Rybozym miR21rz1 5’-CAGUCUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAUAAGC-3 ’
SEKW ID NR 3 - Rybozym miR21rz2 5’-CCAUGACUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAUUCAA-3 ’
SEKW ID NR 4 - Rybozym miR21rz3 5’-CCCAUCCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACUGGU-3’
WYKAZ SEKWENCJI <110> Instytut Chemii Bioorganicznej PAN <120> Rybozymy typu 'hammerhead' <130> PK/1904/AGR <160>4 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> artificial <220>
<223> CORE of miR21hammerhead <400> 1 cugaugaggc cgaaaggccg aa 22 <210> 2 <211> 34 <212> RNA <213> artificial <220>
<223> miR21rz1 <400> 2 cagucucuga ugaggccgaa aggccgaaau aagc 34 <210> 3 <211> 34 <212> RNA <213> artificial <220>
<223> miR21rz2 <400> 3 ccaugacuga ugaggccgaa aggccgaaau ucaa 34 <210> 4 <211> 34 <212> RNA <213> artificial <220>
<223> miR21rz3 <400> 4
Cccauccuga ugaggccgaa aggccgaaac ugru 34
Claims (9)
1. Rybozym typu ‘hammerhead’ skierowany na sekwencję miR21 i/lub prekursory miR21, który ma zdolność do specyficznej hydrolizy miR21 i/lub prekursorów miR21, znamienny tym, że ma rdzeń katalityczny o sekwencji SEKW ID NR 1 i zawiera po obu stronach rdzenia k atalitycznego ramiona o sekwencjach komplementarnych do rejonu w obrębie miR21 i/lub prekursorów miR21, przy czym rybozym ma sekwencję przedstawioną na SEKW ID NR 2, 3 albo 4.
2. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera co najmniej jeden rybozym określony w zastrz. 1 albo ich mieszaninę.
3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera nośnik ułatwiający transport rybozymów przez błony komórkowe.
4. Środek terapeutyczny, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden rybozym jak określony w zastrz. 1 albo ich mieszaninę.
5. Środek terapeutyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że ponadto zawiera inny składnik hamujący rozwój komórek nowotworowych do jednoczesnego lub kolejnego zastosowania w terapii antynowotworowej.
6. Środek terapeutyczny według zastrz. 4-5, znamienny tym, że innym składnikiem hamującym rozwój komórek nowotworowych jest temozolomid lub gliadel, a nowotworem jest guz mózgu, korzystniej glejak mózgu.
7. Rybozymy jak określone w zastrz. 1 albo ich mieszaniny, kompozycja określona w zastrz. 2-3 środek terapeutyczny określony w zastrz. 4-6 do zastosowania do wytwarzania leku do leczenia nowotworów objawiających się zwiększeniem komórkowej puli miRNA dla miR21 i/lub prekursorów miR21.
8. Rybozymy, kompozycja, środek terapeutyczny do zastosowania według zastrz. 7, znamienne tym, że nowotworem jest guz mózgu, korzystnie glejak wielopostaciowy.
9. Sposób selektywnej hydrolizy ex vivo miR21 i/lub prekursorów miR21, znamienny tym, że obejmuje tworzenie kompleksu substratu do hydrolizy jakim jest miR21 i/lub pre-miR21 z rybozymem jak określonym w zastrz. 1 lub ich mieszaniną.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL403341A PL228060B1 (pl) | 2013-03-27 | 2013-03-27 | Rybozymy typu „hammerhead”, kompozycja, srodek terapeutyczny je obejmujace, ich zastosowania oraz sposób selektywnej hydrolizy ex -vivo miR21 i prekursorów miR21 |
| EP14719866.7A EP2978847B1 (en) | 2013-03-27 | 2014-03-26 | Hammerhead ribozymes targeting mir-21 |
| PCT/IB2014/060188 WO2014155320A1 (en) | 2013-03-27 | 2014-03-26 | Hammerhead ribozymes targeting mir-21 |
| PL14719866T PL2978847T3 (pl) | 2013-03-27 | 2014-03-26 | Rybozymy typu hammerhead skierowane przeciw mir-21 |
| US14/780,001 US20160046938A1 (en) | 2013-03-27 | 2014-03-26 | Hammerhead ribozymes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL403341A PL228060B1 (pl) | 2013-03-27 | 2013-03-27 | Rybozymy typu „hammerhead”, kompozycja, srodek terapeutyczny je obejmujace, ich zastosowania oraz sposób selektywnej hydrolizy ex -vivo miR21 i prekursorów miR21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL403341A1 PL403341A1 (pl) | 2014-09-29 |
| PL228060B1 true PL228060B1 (pl) | 2018-02-28 |
Family
ID=50588767
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL403341A PL228060B1 (pl) | 2013-03-27 | 2013-03-27 | Rybozymy typu „hammerhead”, kompozycja, srodek terapeutyczny je obejmujace, ich zastosowania oraz sposób selektywnej hydrolizy ex -vivo miR21 i prekursorów miR21 |
| PL14719866T PL2978847T3 (pl) | 2013-03-27 | 2014-03-26 | Rybozymy typu hammerhead skierowane przeciw mir-21 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL14719866T PL2978847T3 (pl) | 2013-03-27 | 2014-03-26 | Rybozymy typu hammerhead skierowane przeciw mir-21 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20160046938A1 (pl) |
| EP (1) | EP2978847B1 (pl) |
| PL (2) | PL228060B1 (pl) |
| WO (1) | WO2014155320A1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10301626B2 (en) | 2015-03-02 | 2019-05-28 | The Regents Of The University Of California | Catalytic strands of minimal hammerhead ribozymes and methods of using the same |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7034009B2 (en) * | 1995-10-26 | 2006-04-25 | Sirna Therapeutics, Inc. | Enzymatic nucleic acid-mediated treatment of ocular diseases or conditions related to levels of vascular endothelial growth factor receptor (VEGF-R) |
-
2013
- 2013-03-27 PL PL403341A patent/PL228060B1/pl unknown
-
2014
- 2014-03-26 US US14/780,001 patent/US20160046938A1/en not_active Abandoned
- 2014-03-26 EP EP14719866.7A patent/EP2978847B1/en not_active Not-in-force
- 2014-03-26 WO PCT/IB2014/060188 patent/WO2014155320A1/en not_active Ceased
- 2014-03-26 PL PL14719866T patent/PL2978847T3/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20160046938A1 (en) | 2016-02-18 |
| EP2978847A1 (en) | 2016-02-03 |
| WO2014155320A1 (en) | 2014-10-02 |
| PL2978847T3 (pl) | 2017-08-31 |
| PL403341A1 (pl) | 2014-09-29 |
| EP2978847B1 (en) | 2017-02-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5898843B2 (ja) | 血管新生、血管形成、若しくは血管修復を促進するか、又は腫瘍血管新生を阻害する方法 | |
| JP2018507866A (ja) | マイクロｒｎａを有効成分として含む癌治療用医薬組成物 | |
| JP2014503553A (ja) | 新血管新生と関連する疾患及び状態を治療するためのｍｉＲＮＡ | |
| CN108779464B (zh) | 使用靶向angpt2和pdgfb的rna复合物治疗血管生成相关性疾病 | |
| Belter et al. | Inhibition of miR-21 in glioma cells using catalytic nucleic acids | |
| EP2275545A1 (en) | Use of microRNA-24 and/or its targets for the treatment and prevention of ischemia and induction of angiogenesis | |
| CN103025872A (zh) | 小沟结合剂(MGB)-寡核苷酸miRNA拮抗剂 | |
| US20120087992A1 (en) | miRNAS AS THERAPEUTIC TARGETS IN CANCER | |
| CN102970994A (zh) | 与糖尿病中的mirna相关的组合物和方法 | |
| US20220133767A1 (en) | Targeting micrornas to overcome drug tolerance and resistance | |
| WO2020146415A1 (en) | Methods of treating cancer | |
| US11186838B2 (en) | LNCRNA MEG3 for therapy and diagnosis of cardiac remodelling | |
| PL228060B1 (pl) | Rybozymy typu „hammerhead”, kompozycja, srodek terapeutyczny je obejmujace, ich zastosowania oraz sposób selektywnej hydrolizy ex -vivo miR21 i prekursorów miR21 | |
| WO2021231678A1 (en) | Reducing prominin2-mediated resistance to ferroptotic cell death | |
| WO2005113770A1 (en) | Anti-rhoa and -rhoc sirnas and therapeutic compositions comprising them. | |
| AU2009303355B2 (en) | FAS/FASL or other death receptor targeted methods and compositions for killing tumor cells | |
| US20240102019A1 (en) | Composition comprising emp3 inhibitor for inhibiting growth of cancer stemcell and use thereof | |
| KR101861738B1 (ko) | 마이크로 rna를 포함하는 이중나선 올리고 rna 구조체 | |
| KR101993894B1 (ko) | 마이크로 rna를 포함하는 이중나선 올리고 rna 구조체 | |
| JP2020537636A (ja) | 敗血症関連障害の処置のための組成物及び方法 | |
| WO2025256564A9 (en) | iRNA COMPOSITION AND METHOD OF USING SAME | |
| WO2024154163A1 (en) | Product comprising an aptamer conjugated to the edited mirna mir-589-3p and medical uses thereof | |
| EP3626820A1 (en) | Anticancer compositions containing mirna mimics and uses thereof | |
| PL248228B1 (pl) | Cząsteczka siRNA wobec sekwencji transkryptu ludzkiej tenascyny- C (TNC), nanocząstka lipidowa LNP i kompozycja farmaceutyczna ją zawierające oraz ich zastosowanie w terapii i/lub zapobieganiu rozwojowi nowotworu glejaka | |
| Kucharzewska | Molecular Aspects of Endothelial Cell Function and Hypoxia-dependent Tumor Angiogenesis |