PL228497B1

PL228497B1 - Biologically active protein CmLTP 9,5 and its applications

Info

Publication number: PL228497B1
Application number: PL408278A
Authority: PL
Inventors: Anna Goździcka-Józefiak; Robert Nawrot; Dorota Kuźma
Original assignee: Univ Im Adama Mickiewicza W Poznaniu
Priority date: 2014-05-21
Filing date: 2014-05-21
Publication date: 2018-04-30
Also published as: PL408278A1

Description

(12)OPIS PATENTOWY ₍i₉₎PL ₍n)228497 (13) B1 (51) IntCI.(12) PATENT DESCRIPTION ₍ i ₉₎ PL ₍ n) 228497 (13) B1 (51) IntCI.

(21) Numer zgłoszenia: 408278 C07K 14/415 (2006.01)(21) Application number: 408278 C07K 14/415 (2006.01)

A01N 65/00 (2009.01) A01P 1/00 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 21.05.2014 (54) Aktywne biologicznie białko CmLTP 9,5 oraz jego zastosowanie (73) Uprawniony z patentu:A01N 65/00 (2009.01) A01P 1/00 (2006.01) (22) Application date: May 21, 2014 (54) CmLTP 9.5 biologically active protein and its use (73) Patent holder:

UNIWERSYTET IM. ADAMA MICKIEWICZA W POZNANIU, Poznań, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono:UNIVERSITY OF ADAM MICKIEWICZA IN POZNAŃ, Poznań, PL (43) Application was announced:

23.11.2015 BUP 24/15 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:23.11.2015 BUP 24/15 (45) The following was announced about the grant of the patent:

30.04.2018 WUP 04/18 (72) Twórca(y) wynalazku:30/04/2018 WUP 04/18 (72) Inventor (s):

ANNA GOŹDZICKA-JÓZEFIAK, Robakowo, PL ROBERT NAWROT, Oborniki, PL DOROTA KUŹMA, Swarzędz, PL (74) Pełnomocnik:ANNA GOŹDZICKA-JÓZEFIAK, Robakowo, PL ROBERT NAWROT, Oborniki, PL DOROTA KUŹMA, Swarzędz, PL (74) Representative:

rzecz, pat. Wojciech Lisiecki rσ>thing, pat. Wojciech Lisiecki rσ>

'St co'St co

CMCM

Q_Q_

PL 228 497 B1PL 228 497 B1

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest aktywne biologicznie białko Chelidonium majus CmLTP 9,5 typu nsLTP (non-specific lipid transfer protein) izolowane z rośliny Chelidonium majus i jego zastosowanie przeciwbakteryjne.The subject of the invention is the biologically active Chelidonium majus CmLTP 9.5 nsLTP (non-specific lipid transfer protein) protein isolated from the Chelidonium majus plant and its antibacterial use.

Z patentu PL 178 803 znany jest ekstrakt ze świeżego soku mlecznego Glistnika jaskółcze ziele (Chelidonium majus) - roślinny o działaniu antypatogennym i mitogennym w stosunku do limfocytów ludzkich.Patent PL 178 803 describes the extract of fresh milk juice of Celandine Celandine (Chelidonium majus) - a vegetable with antipathogenic and mitogenic effect in relation to human lymphocytes.

W patencie PL 181 449 ujawniono glikoproteinę otrzymaną ze świeżego soku mlecznego korzenia Chelidonium majus uzyskanego w fazach intensywnego kwitnienia i/lub owocowania rośliny, która zbudowana jest z monomeru białka o masie 20 kD w formie tetramerycznej i/lub oktamerycznej i ma rdzeń oligosacharowy zawierający sacharozę, glukozę, galaktozę i ksylozę.Patent PL 181 449 discloses a glycoprotein obtained from fresh milk sap of Chelidonium majus root obtained in the phases of intensive flowering and / or fruiting of the plant, which is composed of a 20 kD protein monomer in tetrameric and / or octameric form and has an oligosacchar core containing sucrose, glucose, galactose and xylose.

W patencie PL 197 869 ujawniono zastosowanie lektyny otrzymywanej z Chelidonium majus do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych, indukującego apoptozę w komórkach nowotworowych.Patent PL 197 869 discloses the use of a lectin obtained from Chelidonium majus in the preparation of a medicament for the treatment of neoplastic diseases, inducing apoptosis in neoplastic cells.

Znane białka ujawnione w polskich patentach charakteryzują się stosunkowo niską efektywnością bakteriobójczą ekstraktu oraz lektyny z Chelidonium majus.Known proteins disclosed in Polish patents are characterized by a relatively low bactericidal effectiveness of the extract and the lectin from Chelidonium majus.

Celem wynalazku jest rozwiązanie, którego efektywność byłaby większa niż wcześniej znanych rozwiązań.The object of the invention is a solution whose efficiency would be greater than that of previously known solutions.

W trakcie prowadzenia prac badawczych nieoczekiwanie okazało się, że jedno z białek wyizolowanych z Chelidonium majus wykazuje znaczenie silniejsze właściwości bakteriobójcze od dotychczas znanych izolatów białkowych z tej rośliny i samego ekstraktu.In the course of research, it was surprisingly found that one of the proteins isolated from Chelidonium majus has significantly stronger bactericidal properties than the previously known protein isolates from this plant and the extract itself.

Przedmiotem wynalazku jest białko CmLTP 9,5 izolowane z Chelidonium majus zawierające sekwencję aminokwasów, która w co najmniej 80% jest zgodna z sekwencją SEK NR ID. 1, korzystnie zwierające sekwencję aminokwasów w 90% zgodną z sekwencją SEK NR ID. 1.The invention relates to a CmLTP 9.5 protein isolated from Chelidonium majus having an amino acid sequence which is at least 80% consistent with that of SEQ ID NO. 1, preferably those having 90% amino acid sequence consistent with the sequence of SEQ ID NO. 1.

W szczególności przedmiotem wynalazku jest białko CmLTP 9,5 zawierające sekwencję am inokwasów w co najmniej 95% zgodną z sekwencją SEK NR ID. 2, korzystnie zwierające sekwencję aminokwasów w 98% zgodną z sekwencją SEK NR ID. 2.In particular, the invention relates to a CmLTP 9.5 protein having at least 95% of the amino acid sequence consistent with the sequence of SEQ ID NO. 2, preferably having 98% amino acid sequence consistent with the sequence SEQ ID NO. 2.

Charakterystyczną cechę białka CmLTP 9,5 jest jego zasadowość oraz masa cząsteczkowa ok. 9,5 kDa. Białko zachowuje swą stabilność przez okres co najmniej jednego roku podczas przechowywania w temp 4°C w roztworze wodnym zawierającym od 5 do 10% glicerolu.A characteristic feature of the CmLTP 9.5 protein is its basicity and molecular weight of approx. 9.5 kDa. Protein retains its stability for at least one year when stored at 4 ° C in an aqueous solution containing 5 to 10% glycerol.

Białko według wynalazku jest izolowane z Chelidonium majus z wykorzystaniem znanych metod izolacji białka, przy czym w końcowej fazie izolacji stosuje się etap specyficzny dla tego białka i celu w jakim jest izolowane.The protein according to the invention is isolated from Chelidonium majus using known methods of protein isolation, the final phase of isolation using a step specific to this protein and the purpose for which it is isolated.

W pierwszym etapie stosuje się znane metody izolacji białek polegające na rozdrobnieniu mechanicznym rośliny z Chelidonium majus. Następnie fragmenty rośliny zawiesza się w buforze do izolacji białek i wytrząsa, po czym odwirowuje, a następnie z supematantu wytrąca się białko np. siarczanem amonu. Osad białek odwirowuje się.In the first stage, known methods of protein isolation are used, consisting in the mechanical grinding of the Chelidonium majus plant. The plant fragments are then suspended in a protein isolation buffer and shaken, then centrifuged, and then the protein is precipitated from the supernatant, e.g. with ammonium sulphate. The protein pellet is centrifuged.

W celu izolacji białka CmLTP 9,5 otrzymany osad mieszaniny białek rozpuszcza się w buforze do izolacji białek, korzystnie w roztworze wodnym chlorowodorku 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propandiolu (Tris-Cl) o stężeniu od 0,05-0,2 M, zawierającego od 5-15% glicerolu. Do otrzymanego roztworu mieszaniny białek dodaje się środek alkalizujący do czasu uzyskania pH 7,9-8,5, korzystnie 8,4, odpowiadającego punktowi izoelektrycznemu białka CmLTP 9,5. Proces wytrącania białka prowadzi się w temperaturze nie wyższej niż 30°C przy użyciu 0,5-1,5 M, korzystnie 1 M, roztworu wodorotlenku metalu alkalicznego, korzystnie NaOH lub KOH. Osad wytrąconego białka CmLTP 9,5 rozpuszcza się w buforze do izolacji białek, korzystnie w roztworze wodnym chlorowodorku 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propandiolu (Tris-Cl) o stężeniu od 0,05-0,2 M, zawierającego od 5-15% glicerolu.In order to isolate the CmLTP 9.5 protein, the obtained pellet of the protein mixture is dissolved in a protein isolation buffer, preferably in an aqueous solution of 2-amino-2 (hydroxymethyl) -1,3-propanediol hydrochloride (Tris-Cl) with a concentration of 0.05 -0.2 M, containing from 5-15% glycerol. An alkalizing agent is added to the resulting protein mixture solution until a pH of 7.9-8.5, preferably 8.4, corresponding to the isoelectric point of the CmLTP protein 9.5 is obtained. The protein precipitation process is carried out at a temperature of not more than 30 ° C with 0.5-1.5 M, preferably 1 M, of an alkali metal hydroxide solution, preferably NaOH or KOH. The precipitate of the precipitated CmLTP 9.5 protein is dissolved in a protein isolation buffer, preferably in an aqueous solution of 2-amino-2 (hydroxymethyl) -1,3-propanediol hydrochloride (Tris-Cl) with a concentration of 0.05-0.2 M containing from 5-15% glycerol.

Tak przygotowane białko może być stosowane zarówno do badań jak i do zastosowań praktycznych.The protein prepared in this way can be used both for research and practical applications.

W przykładzie 1 szczegółowo przedstawiono jeden ze sposobów izolacji białka CmLTP 9,5. W szczególności istotny jest czwarty etap izolacji specyficzny dla izolacji białka CmLTP 9,5.Example 1 details one method of isolating the CmLTP 9.5 protein. In particular, the fourth isolation step specific for the isolation of the CmLTP 9.5 protein is important.

W drugim aspekcie przedmiotem wynalazku jest białko CmLTP 9,5 do zastosowania jako środek bakteriobójczy i bakteriostatyczny, w szczególności względem szczepów bakterii Gram dodatnich (Bacillus sp.) i Gram ujemnych (Enterobacteriaceae, np. E. coli TG1). Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka CmLTP 9,5 zawierającego sekwencję aminokwasów, która w co najmniej 80% jestIn a second aspect, the invention provides a CmLTP 9.5 protein for use as a bactericidal and bacteriostatic agent, in particular against strains of Gram positive (Bacillus sp.) And Gram negative (Enterobacteriaceae, e.g. E. coli TG1) bacteria. The invention relates to the use of a CmLTP 9.5 protein having an amino acid sequence of at least 80% is

PL 228 497 B1 zgodna z sekwencją SEK NR ID. 1, korzystnie zwierającego sekwencję aminokwasów w 95% zgodną z sekwencją SEK NR ID. 2.According to the sequence of SEQ ID NO. 1, preferably having a 95% amino acid sequence consistent with the sequence SEQ ID NO. 2.

Zastosowanie białka CmLTP 9,5 jako środka bakteriostatycznego polega na jego stosowaniu jako dodatek do pasz w ilości od 1 do 5 g, korzystnie 2 g białka na 1 tonę paszy w przypadku stosowania jako dodatek bakteriostatyczny do pasz.The use of the CmLTP 9.5 protein as a bacteriostatic agent consists in its use as a feed additive in an amount of 1 to 5 g, preferably 2 g of protein per ton of feed when used as a bacteriostatic feed additive.

Zastosowanie białka CmLTP 9,5 jako środka bakteriobójczego polega na jego stosowaniu jako dodatek do pasz w ilości od 10 do 40 g, korzystnie 20 g białka na 1 tonę paszy w przypadku stosowania jako dodatek bakteriobójczy do pasz.The use of the CmLTP 9.5 protein as a bactericide is based on its use as a feed additive in an amount of 10 to 40 g, preferably 20 g of protein per tonne of feed when used as a bactericidal feed additive.

W kolejnym aspekcie przedmiotem wynalazku jest zastosowanie jako środka dezynfekcyjnego białka CmLTP 9,5, w stężeniu od 5 do 20 pg/litr, korzystnie 10 pg/litr wody, przy czym białko CmLTP 9,5 zawiera sekwencję aminokwasów w co najmniej 80% zgodną z sekwencją SEK NR ID.1, korzystnie zwiera sekwencję aminokwasów w 95% zgodną z sekwencją SEK NR ID. 2, przy czym białko CmLTP 9,5 stosuje się w ilości 0,01 pg na 1 ml kultury bakteryjnej. Ilość białka przy jakiej zaobserwowano zahamowanie wzrostu bakterii wynosiła 0,01-0,02 pg.In a further aspect the invention relates to the use of a CmLTP 9.5 protein as a disinfectant at a concentration of 5 to 20 pg / liter, preferably 10 pg / liter of water, the CmLTP 9.5 protein having an amino acid sequence at least 80% compatible with the sequence of SEQ ID NO. 1, preferably contains 95% of the amino acid sequence consistent with the sequence of SEQ ID NO. 2, wherein the CmLTP 9.5 protein is used in the amount of 0.01 pg per 1 ml of bacterial culture. The amount of protein at which inhibition of bacterial growth was observed was 0.01-0.02 pg.

Właściwości przeciwbakteryjne białka CmLTP 9,5 , pozyskanego sposobem wg wynalazku, względem szczepów bakterii Gram dodatnich (Bacillus sp.) i Gram ujemnych (Enterobacteriaceae, np. E. coliTG1) potwierdzono w wyniku następującego eksperymentu.The antibacterial properties of the CmLTP 9.5 protein obtained according to the invention against strains of Gram positive (Bacillus sp.) And Gram negative bacteria (Enterobacteriaceae, e.g. E. coliTG1) were confirmed by the following experiment.

Do badania użyto szczepy pochodzące z kolekcji ATCC nr 11774; 11229; 8739.Strains from the ATCC Collection No. 11774 were used for the study; 11229; 8739.

Bakterie hodowano przez noc w pożywce płynnej Luria Broth (LB) (Sigma-Aldrich, nr kat. L2542) (0,5% (w/o) ekstrakt drożdżowy; 1% (w/o) trypton, 1% (w/o) NaCl). W tym celu pożywkę zaszczepiono pojedynczą kolonią odpowiedniego szczepu bakterii i hodowano przez noc w temperaturze 37°C. Następnie pasażowano na sterylną płytkę Petriego zawierającą stałą pożywkę LB (Sigma-Aldrich, nr kat, L2897) (LB+1,5% (w/o) agaroza) i prowadzono ich wzrost przez 3 godziny w temp. 37°C przy wilgotności 60%. Po tym czasie na powstałą „murawkę” bakterii nakładano sterylne krążki bibułowe o średnicy 0,8 mm nasączone roztworem białka CmLTP 9,5. Sterylizację krążków bibułowych prowadzono w autoklawie w standardowych warunkach (120°C, 30 min), po czym nakrapiano roztwór białka o stężeniu 2 pg/ml w ilościach odpowiednio: krążek nr 1: 5 pl (0,01 pg), krążek nr 2: 10 pl (0,02 pg), krążek nr 3: 20 pl (0,04 pg) i prowadzono dalej - hodowlę bakterii przez 12 godzin w temperaturze 37°C wilgotności 60%. Aktywność przeciwbakteryjną badanego białka określano na podstawie analizy wielkości strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół bibułowego krążka. Wyniki hodowli bakterii na pożywce płynnej LB w obecności różnych ilości białka CmLTP 9,5 przedstawiono na figurze 1.The bacteria were grown overnight in Luria Broth (LB) liquid medium (Sigma-Aldrich, cat.no. L2542) (0.5% (w / o) yeast extract; 1% (w / o) tryptone, 1% (w / o) ) NaCl). For this purpose, the medium was inoculated with a single colony of the appropriate bacterial strain and cultured overnight at 37 ° C. Then, they were passaged into a sterile Petri dish containing solid LB medium (Sigma-Aldrich, cat.no. L2897) (LB + 1.5% (w / o) agarose) and grown for 3 hours at 37 ° C and 60 ° C humidity. %. After this time, sterile paper discs with a diameter of 0.8 mm, soaked in a solution of CmLTP 9.5 protein, were placed on the resulting "lawn" of bacteria. The paper discs were sterilized in an autoclave under standard conditions (120 ° C, 30 min), and then a protein solution with a concentration of 2 pg / ml was spotted in the following amounts: disc No. 1: 5 pl (0.01 pg), disc No. 2: 10 µl (0.02 µg), disk No. 3: 20 µl (0.04 µg), and further cultivation of the bacteria was carried out for 12 hours at 37 ° C, 60% humidity. The antibacterial activity of the tested protein was determined on the basis of the analysis of the size of the zone of inhibition of bacterial growth around the paper disc. The results of culturing the bacteria on LB liquid medium in the presence of various amounts of CmLTP 9.5 protein are shown in Figure 1.

Na podstawie uzyskanych danych ustalono najniższe stężenie białka CmLTP 9,5 konieczne do całkowitej lizy komórek bakteryjnych, które wynosiło 0,01-0,02 pg.Based on the obtained data, the lowest concentration of CmLTP 9.5 protein necessary for the complete lysis of bacterial cells was determined, which was 0.01-0.02 pg.

Jako próbę kontrolną stosowano frakcję ekstraktu z Chelidonium majus pozbawioną białka CmLTP 9,5.A fraction of the Chelidonium majus extract devoid of the CmLTP 9.5 protein was used as a control.

Kolejnym etapem było określenie stopnia bakteriobójczej aktywności białka CmLTP 9,5 w zależności od ilości białka w hodowli płynnej.The next step was to determine the degree of bactericidal activity of the CmLTP 9.5 protein depending on the amount of protein in the liquid culture.

W tym celu pożywkę LB zaszczepiono pojedynczą kolonią odpowiedniego szczepu bakterii i hodowano przez noc w temperaturze 37°C. Następnie tak przygotowaną kulturą bakterii 100 zaszczepiono ml świeżej pożywki i dodawano białko CmLTP 9,5 w ilościach: 0,02 pg (hodowla 1), 0,04 pg (hodowla 2) oraz 0,06 pg (hodowla 3). Jako hodowlę kontrolną stosowano czystą kulturę bez dodatków (kontrola 1) oraz kulturę zaszczepioną frakcją ekstraktu z Chelidonium majus pozbawionego białka CmLTP 9,5 (kontrola 2). Hodowlę bakterii prowadzono przez 6 h, następnie mierzono OD600. Po dwóch godzinach hodowli zaobserwowano spadek wzrostu bakterii o 54% w hodowli zawierającej badane białko w stężeniu 0,02 pg (hodowla 1), natomiast o 76% w hodowli, gdzie ilość białka w pożywce wynosiła 0,06 pg (hodowla 3). Podobny wynik uzyskano po 6 godzinach hodowli (Rys. 1).For this purpose, the LB medium was inoculated with a single colony of the appropriate bacterial strain and grown overnight at 37 ° C. Then, the bacterial culture prepared in this way was inoculated with ml of fresh medium and the CmLTP 9.5 protein was added in the amounts of: 0.02 pg (culture 1), 0.04 pg (culture 2) and 0.06 pg (culture 3). As a control, a pure culture without additives was used (control 1) and a culture inoculated with a Chelidonium majus extract fraction lacking CmLTP 9.5 protein (control 2). The bacteria were grown for 6 h, then the OD600 was measured. After two hours of cultivation, a 54% decrease in bacterial growth was observed in the culture containing the tested protein at a concentration of 0.02 pg (culture 1), and by 76% in the culture where the amount of protein in the medium was 0.06 pg (culture 3). A similar result was obtained after 6 hours of cultivation (Fig. 1).

Wyniki hodowli bakterii na pożywce płynnej LB przy stałej ilości białka CmLTP 9,5 przedstawiono na figurze 2.The results of culturing the bacteria on LB liquid medium at a constant amount of CmLTP 9.5 protein are shown in Figure 2.

Przeprowadzone badania potwierdziły właściwości bakteriobójcze białka CmLTP 9,5 już w przypadku jego stosowania w stężeniu 0,01 pg/ml, co odpowiada stężeniu 10 pg/litr środka dezynfekcyjnego. Uzyskane wyniki potwierdzają , że w celu uzyskania efektu bakteriobójczego wystarczające jest zastosowanie 10 g białka na 1 tonę paszy.The conducted studies confirmed the bactericidal properties of the CmLTP 9.5 protein when it is used at a concentration of 0.01 pg / ml, which corresponds to a concentration of 10 pg / liter of disinfectant. The obtained results confirm that in order to obtain the bactericidal effect it is sufficient to use 10 g of protein per 1 ton of feed.

W kolejnym eksperymencie analizowano wzrost bakterii w pożywce płynnej w celu oszacowania aktywności bakteriostatycznej.In another experiment, the growth of bacteria in a liquid medium was analyzed to estimate the bacteriostatic activity.

W tym celu pożywkę LB zaszczepiono pojedynczą kolonią odpowiedniego szczepu bakterii i hodowano przez noc w temperaturze 37°C. Następnie tak przygotowaną kulturą bakterii zaszczepionoFor this purpose, the LB medium was inoculated with a single colony of the appropriate bacterial strain and grown overnight at 37 ° C. Then, the prepared culture of bacteria was inoculated

PL 228 497 B1 ml świeżej pożywki i dodano białko CmLTP 9,5 w ilości 0,004 pg, czyli w ilości 10x niższej niż bakteriobójcza. Jako hodowlę kontrolną stosowano kulturę zaszczepioną ekstraktem z soku mlecznego Chelidonium majus pozbawionego białka CmLTP 9,5.Ml of fresh medium and the CmLTP 9.5 protein was added in an amount of 0.004 µg, which is 10 times less than the germicidal amount. As a control, a culture inoculated with Chelidonium majus milk juice extract devoid of CmLTP 9.5 protein was used.

Hodowlę bakterii w obu przypadkach prowadzono przez 12 h, przy czym OD600 kultury mierzono odpowiednio po 1,2 i 3 godzinach. Sprawdzano różnicę pomiędzy wartościami OD600 (wartość absorbancji kultury bakteryjnej - wzrasta proporcjonalnie do przyrostu ilości komórek bakteryjnych) w hodowli z dodatkiem białka CmLTP 9,5 w porównaniu do hodowli kontrolnej (Rys. 2).The bacteria were cultivated in both cases for 12 h, with the OD 600 of the culture being measured after 1.2 and 3 hours, respectively. The difference between the OD600 values (the value of the absorbance of the bacterial culture - increases in proportion to the increase in the number of bacterial cells) in the culture supplemented with the CmLTP 9.5 protein was checked compared to the control culture (Fig. 2).

Po 1 h hodowli zaobserwowano słaby wzrost bakterii w obu przypadkach. Natomiast po 3 godzinach wzrostu hodowli bakterii na pożywce płynnej LB przy stałej ilości białka CmLTP 9,5 (0,004 pg) zaobserwowano zahamowanie wzrostu bakterii ok. 40% w porównaniu z hodowlą kontrolną (Rys. 2).After 1 h of cultivation, weak bacterial growth was observed in both cases. On the other hand, after 3 hours of growth of the bacterial culture on the LB liquid medium with a constant amount of CmLTP 9.5 protein (0.004 pg), inhibition of bacterial growth was observed by approx. 40% compared to the control culture (Fig. 2).

Wynik eksperymentu dowodzi, że podanie białka CmLTP 9,5 w ilości 0,004 pg wywołało stopniowe hamowanie wzrostu bakterii (przez 3 h) w hodowli w porównaniu z kontrolą aż o 40%.The result of the experiment proves that the administration of the CmLTP 9.5 protein in the amount of 0.004 pg caused a gradual inhibition of bacterial growth (for 3 h) in the culture as compared to the control by as much as 40%.

Wynik eksperymentu pokazuje, iż oprócz aktywności bakteriobójczej, białka CmLTP 9,5 stosowane stężeniu 0,001 pg/ml wykazuje również aktywność bakteriostatyczną. Bakterie rosną w obecności tego białka, ale wzrost jest zahamowany w ok. 40%.The result of the experiment shows that in addition to bactericidal activity, CmLTP 9.5 proteins used at the concentration of 0.001 pg / ml also show bacteriostatic activity. Bacteria grow in the presence of this protein, but growth is inhibited by about 40%.

Dla bakterii efektem typowym jest, iż adaptują się one do niekorzystnych warunków środowiska. W przypadku białka CmLTP 9,5 jego niskie stężenie, rzędu 0,001 pg/ml, wywołuje efekt adaptacyjny bakterii w hodowli. Ten efekt trzeba uwzględnić przy długotrwałym stosowaniu białka CmLTP 9,5 jako potencjalnego środka bakteriobójczego. W przypadku stosowania białka CmLTP 9,5 jako dodatku bakteriobójczego do pasz stosuje się je w dawkach nie mniejszych niż 5 g/tonę, korzystnie w ilości 20 g/tonę. W przypadku stosowania białka CmLTP 9,5 jako środka dezynfekcyjnego stosuje się je w stężeniu nie mniejszym 5 pg/litr, korzystnie 10 pg/litr, gdyż w niższych dawkach białko ma aktywność jedynie bakteriostatyczną.A typical effect for bacteria is that they adapt to unfavorable environmental conditions. In the case of the CmLTP 9.5 protein, its low concentration, of the order of 0.001 pg / ml, causes an adaptive effect of bacteria in culture. This effect has to be considered with long-term use of CmLTP 9.5 protein as a potential bactericide. When the CmLTP 9.5 protein is used as a bactericidal feed additive, it is used in doses of not less than 5 g / tonne, preferably in an amount of 20 g / tonne. In the case of using the CmLTP 9.5 protein as a disinfectant, it is used in a concentration of not less than 5 µg / liter, preferably 10 µg / liter, because in lower doses the protein has only bacteriostatic activity.

P r z y k ł a d 1P r z k ł a d 1

1. Etap - świeże korzenie i pędy Chelidonium majus poddano miażdżeniu i wyciskaniu w celu uzyskania płynnego pomarańczowo-żółtego soku mlecznego (lateksu).1. Stage - fresh roots and shoots of Chelidonium majus were crushed and pressed to obtain a liquid orange-yellow milk juice (latex).

2. Etap - z uzyskanego lateksu przeprowadzono ekstrakcję białek z zastosowaniem wodnego roztworu chlorowodorku 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propandiolu (Tris-Cl) o stężeniu od 0,1 M, zawierającego 10% glicerolu, przy pH od 8,0. Ekstrakcję prowadzono w temperaturze nie wyższej niż 37°C przez 0,5 godziny. Po czym odwirowano, resztki komórkowe stanowiące osad odrzucano, a supernatant stosowano do dalszych etapów izolacji CmLTP 9,5.2. Stage - protein extraction was performed from the latex obtained with the use of an aqueous solution of 2-amino-2 (hydroxymethyl) -1,3-propanediol hydrochloride (Tris-Cl) with a concentration of 0.1 M, containing 10% glycerol, at a pH of 8.0. Extraction was carried out at a temperature of not more than 37 ° C for 0.5 hours. Subsequently, it was centrifuged, the cell debris constituting the pellet was discarded and the supernatant used for further isolation steps of CmLTP 9.5.

3. Etap 3 - otrzymany w drugim etapie supernatant oczyszczano z cząstek stałych poprzez dodanie wysyconego 4 M roztworu siarczanu amonu do stężenia końcowego (siarczanu amonu) 0,2 M, w supematancie. Próbę po wymieszaniu pozostawiono na 60 minut w temp. pokojowej 23°C, po czym odwirowano, w celu oddzielenia fragmentów komórek roślinnych od roztworu zawierającego białka. Po odwirowaniu osad odrzucono a supernatant (zawierający białka) zebrano do dalszej izolacji CmLTP 9,5.3. Step 3 - The supernatant obtained in the second step was purified from solid particles by adding a saturated 4M ammonium sulfate solution to a final concentration of 0.2M (ammonium sulfate) in the supernatant. After mixing, the sample was left for 60 minutes at room temperature of 23 ° C, then centrifuged in order to separate the plant cell fragments from the protein-containing solution. After centrifugation, the pellet was discarded and the supernatant (containing proteins) was collected for further isolation of CmLTP 9.5.

4. Etap 4 - uzyskany w trzecim etapie supernatant doprowadzono przy użyciu 1 M roztworu wodorotlenku sodu do pH 8,4, odpowiadającego punktowi izoelektrycznemu białka CmLTP 9,5. Osad białka odwirowano i rozpuszczono w buforze stanowiącym roztwór chlorowodorku 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propandiolu (Tris-Cl) o stężeniu od 0,1 M zawierającego 10% glicerolu.4. Step 4 - The supernatant obtained in the third step was adjusted to pH 8.4 with 1 M sodium hydroxide solution, corresponding to the isoelectric point of the CmLTP protein 9.5. The protein pellet was centrifuged and dissolved in a solution of 2-amino-2 (hydroxymethyl) -1,3-propanediol hydrochloride (Tris-Cl) at a concentration from 0.1 M containing 10% glycerol.

PL 228 497 Β1PL 228 497 Β1

Lista sekwencjiSequence list

Sekwencja: SEK NR ID. 1Sequence: SEQ ID NO. 1

Chelidonium majusChelidonium majus

Met 1 Underworld 1 Lys Lys Val Val Thr Thr Tyr 5 Tyr 5 Ile How much Ala Ala Val Val Leu Leu Leu 10 Leu 10 Thr Thr Ala Ala Met Underworld Val Val Leu 15 Leu 15 Leu Leu Leu Leu Ser Cheese Glu Glu Ala Ala Gin Gin Val Val Ser Cheese Asn Asn Ala Ala Ala Ala Ser Cheese Cys Cys Ser Cheese Ala Ala 20 twenty 25 25 30 thirty Ile How much Glu Glu Leu Leu Ala Ala Pro Pro Cys Cys Leu Leu Gly Gly Ala Ala Ile How much Met Underworld Ser Cheese Ser Cheese Ser Cheese Pro Pro 35 35 40 40 45 45 Pro Pro Ser Cheese Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys Cys Ser Cheese Lys Lys Leu Leu Ser Cheese Glu Glu Gin Gin Lys Lys Pro Pro Cys Cys 50 50 55 55 60 60 Leu Leu Cys Cys Gin Gin Tyr Tyr Met Underworld Arg Arg Asp Asp Pro Pro Asn Asn Leu Leu Arg Arg Gin Gin Tyr Tyr Val Val Asn Asn 65 65 70 70 75 75 Thr Thr Pro Pro Gly Gly Ala Ala Arg Arg Ser Cheese Val Val Ser Cheese Asn Asn Ala Ala Cys Cys Arg Arg Val Val Pro Pro Leu Leu

85 9085 90

Pro Asn CysPro Asn Cys

Sekwencja: SEK NR ID.2Sequence: SEQ ID NO. 2

Chelidonium majusChelidonium majus

Ser 1 Cheese 1 Ala Ala Ile How much Glu Glu Leu 5 Leu 5 Ala Ala Pro Pro Cys Cys Leu Leu Gly 10 Gly 10 Ala Ala Ile How much Met Underworld Ser Cheese Ser 15 Cheese 15 Ser Cheese Pro Pro Pro Pro Ser Cheese Gly 20 Gly twenty Ala Ala Cys Cys Cys Cys Ser Cheese Lys 25 Lys 25 Leu Leu Ser Cheese Glu Glu Gin Gin Lys 30 Lys thirty Pro Pro Cys Cys Leu Leu Cys Cys Gin 35 Gin 35 Tyr Tyr Met Underworld Arg Arg Asp Asp Pro 40 Pro 40 Asn Asn Leu Leu Arg Arg Gin Gin Tyr 45 Tyr 45 Val Val Asn Asn Thr Thr Pro Pro Gly Gly Ala Ala Arg Arg Ser Cheese Val Val Ser Cheese Asn Asn Ala Ala Cys Cys Arg Arg Val Val

55 6055 60

Pro Leu Pro Asn CysPro Leu Pro Asn Cys

PL 228 497 B1PL 228 497 B1

Claims

Patent claims

1. An isolated CmLTP 9.5 protein from Chelidonium majus having an amino acid sequence that is at least 80% consistent with the sequence shown as SEQ ID NO. 1.

2. The protein according to claim 1 The method of claim 1, wherein the amino acid sequence is at least 90% consistent with the sequence indicated as SEQ ID NO. 1.

3. The protein according to claim 1 The method of claim 1, wherein the amino acid sequence is at least 95% consistent with the sequence indicated as SEQ ID NO. 2.

4. The protein according to claim 1 The method of claim 1, wherein the amino acid sequence is at least 98% consistent with the sequence indicated as SEQ ID NO. 2.

5. CmLTP 9.5 protein isolated from Chelidonium majus having an amino acid sequence that is at least 80% consistent with the sequence shown as SEQ ID NO. 1 for use as a bactericidal and bacteriostatic agent.

6. CmLTP 9.5 protein isolated from Chelidonium majus for use according to claim 1; 5. A method according to claim 5, characterized in that it comprises an amino acid sequence which is at least 95% consistent with the sequence indicated as SEQ ID NO. 2.

7. CmLTP 9.5 protein isolated from Chelidonium majus containing an amino acid sequence that is at least 80% consistent with the sequence shown as SEQ ID NO. 1 for use as a bactericidal and / or bacteriostatic feed additive, in an amount of 1 to 40 g of protein per ton of feed.

8. The protein for use according to claim 1 The method as claimed in claim 7, characterized in that they are used as bactericidal additive in an amount of 10 to 40 g per ton of feed.

9. The protein for use according to claim 1 The method according to claim 8, characterized in that the amount of 20 g per ton of feed is used as bactericidal additive.

10. The protein for use according to claim 1 The method according to claim 7, characterized in that they are used as bacteriostatic additive in an amount of 1 to 5 g per ton of feed.

11. The protein for use according to claim 1 The method of claim 10, characterized in that the amount of 2 g per ton of feed is used as bacteriostatic additive.

12. CmLTP 9.5 protein isolated from Chelidonium majus for use according to claim 1. The method according to claim 6, characterized in that it comprises an amino acid sequence which is at least 95% consistent with the sequence indicated as SEQ ID NO. 2.

13. The protein for use according to claim 1 The method according to claim 12, characterized in that they are used as bactericidal additive in an amount of 10 to 40 g per ton of feed.

14. The protein for use according to claim 1, The method according to claim 13, characterized in that the amount of 20 g per ton of feed is used as bactericidal additive.

15. The protein for use according to claim 1, The method as claimed in claim 12, characterized in that they are used as bacteriostatic additive in an amount of 1 to 5 g per ton of feed.

16. The protein for use according to claim 1, The method of claim 15, characterized in that the amount of 2 g per ton of feed is used as bacteriostatic additive.

17. Use of a CmLTP 9.5 protein isolated from Chelidonium majus containing an amino acid sequence which is at least 80% compatible with the sequence identified as SEQ ID NO. 1. as a disinfectant, at a concentration of 5 to 20 µg / liter of water, preferably 10 µg / liter of water.

18. Use according to claim 1 17. The method of claim 17, wherein the protein comprises an amino acid sequence at least 95% consistent with the sequence indicated as SEQ ID NO. 2.