PL228497B1 - Aktywne biologicznie białko CmLTP 9,5 oraz jego zastosowanie - Google Patents
Aktywne biologicznie białko CmLTP 9,5 oraz jego zastosowanieInfo
- Publication number
- PL228497B1 PL228497B1 PL408278A PL40827814A PL228497B1 PL 228497 B1 PL228497 B1 PL 228497B1 PL 408278 A PL408278 A PL 408278A PL 40827814 A PL40827814 A PL 40827814A PL 228497 B1 PL228497 B1 PL 228497B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- protein
- cmltp
- seq
- amino acid
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 83
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 83
- 241001233914 Chelidonium majus Species 0.000 claims description 21
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 9
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 claims description 6
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 claims description 4
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 10
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 3
- MFAMTAVAFBPXDC-LPEHRKFASA-N Arg-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O MFAMTAVAFBPXDC-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- BRCVLJZIIFBSPF-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N BRCVLJZIIFBSPF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- NLRJGXZWTKXRHP-DCAQKATOSA-N Asn-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NLRJGXZWTKXRHP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- NOXSEHJOXCWRHK-DCAQKATOSA-N Pro-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 NOXSEHJOXCWRHK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100021588 Sterol carrier protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 229940002385 chelidonium majus extract Drugs 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 108010058363 sterol carrier proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- RCQRKPUXJAGEEC-ZLUOBGJFSA-N Ala-Cys-Cys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O RCQRKPUXJAGEEC-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- DYJJJCHDHLEFDW-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N DYJJJCHDHLEFDW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SUMJNGAMIQSNGX-TUAOUCFPSA-N Arg-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O SUMJNGAMIQSNGX-TUAOUCFPSA-N 0.000 description 1
- YNDLOUMBVDVALC-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N YNDLOUMBVDVALC-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- GQGAFTPXAPKSCF-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O GQGAFTPXAPKSCF-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- JCVOHUKUYSYBAD-DCAQKATOSA-N Lys-Pro-Cys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O JCVOHUKUYSYBAD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RIPJMCFGQHGHNP-RHYQMDGZSA-N Lys-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O RIPJMCFGQHGHNP-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100205189 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-5 gene Proteins 0.000 description 1
- WECYCNFPGZLOOU-FXQIFTODSA-N Pro-Asn-Cys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O WECYCNFPGZLOOU-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- CLNJSLSHKJECME-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 CLNJSLSHKJECME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MCWHYUWXVNRXFV-RWMBFGLXSA-N Pro-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 MCWHYUWXVNRXFV-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- MXDOAJQRJBMGMO-FJXKBIBVSA-N Thr-Pro-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O MXDOAJQRJBMGMO-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- AEOFMCAKYIQQFY-YDHLFZDLSA-N Tyr-Val-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AEOFMCAKYIQQFY-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- PVPAOIGJYHVWBT-KKHAAJSZSA-N Val-Asn-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O PVPAOIGJYHVWBT-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003113 alkalizing effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 230000001775 anti-pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 108010054813 diprotin B Proteins 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000002070 germicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
(12)OPIS PATENTOWY (i9)PL (n)228497 (13) B1 (51) IntCI.
(21) Numer zgłoszenia: 408278 C07K 14/415 (2006.01)
A01N 65/00 (2009.01) A01P 1/00 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 21.05.2014 (54) Aktywne biologicznie białko CmLTP 9,5 oraz jego zastosowanie (73) Uprawniony z patentu:
UNIWERSYTET IM. ADAMA MICKIEWICZA W POZNANIU, Poznań, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono:
23.11.2015 BUP 24/15 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2018 WUP 04/18 (72) Twórca(y) wynalazku:
ANNA GOŹDZICKA-JÓZEFIAK, Robakowo, PL ROBERT NAWROT, Oborniki, PL DOROTA KUŹMA, Swarzędz, PL (74) Pełnomocnik:
rzecz, pat. Wojciech Lisiecki rσ>
'St co
CM
CM
Q_
PL 228 497 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest aktywne biologicznie białko Chelidonium majus CmLTP 9,5 typu nsLTP (non-specific lipid transfer protein) izolowane z rośliny Chelidonium majus i jego zastosowanie przeciwbakteryjne.
Z patentu PL 178 803 znany jest ekstrakt ze świeżego soku mlecznego Glistnika jaskółcze ziele (Chelidonium majus) - roślinny o działaniu antypatogennym i mitogennym w stosunku do limfocytów ludzkich.
W patencie PL 181 449 ujawniono glikoproteinę otrzymaną ze świeżego soku mlecznego korzenia Chelidonium majus uzyskanego w fazach intensywnego kwitnienia i/lub owocowania rośliny, która zbudowana jest z monomeru białka o masie 20 kD w formie tetramerycznej i/lub oktamerycznej i ma rdzeń oligosacharowy zawierający sacharozę, glukozę, galaktozę i ksylozę.
W patencie PL 197 869 ujawniono zastosowanie lektyny otrzymywanej z Chelidonium majus do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych, indukującego apoptozę w komórkach nowotworowych.
Znane białka ujawnione w polskich patentach charakteryzują się stosunkowo niską efektywnością bakteriobójczą ekstraktu oraz lektyny z Chelidonium majus.
Celem wynalazku jest rozwiązanie, którego efektywność byłaby większa niż wcześniej znanych rozwiązań.
W trakcie prowadzenia prac badawczych nieoczekiwanie okazało się, że jedno z białek wyizolowanych z Chelidonium majus wykazuje znaczenie silniejsze właściwości bakteriobójcze od dotychczas znanych izolatów białkowych z tej rośliny i samego ekstraktu.
Przedmiotem wynalazku jest białko CmLTP 9,5 izolowane z Chelidonium majus zawierające sekwencję aminokwasów, która w co najmniej 80% jest zgodna z sekwencją SEK NR ID. 1, korzystnie zwierające sekwencję aminokwasów w 90% zgodną z sekwencją SEK NR ID. 1.
W szczególności przedmiotem wynalazku jest białko CmLTP 9,5 zawierające sekwencję am inokwasów w co najmniej 95% zgodną z sekwencją SEK NR ID. 2, korzystnie zwierające sekwencję aminokwasów w 98% zgodną z sekwencją SEK NR ID. 2.
Charakterystyczną cechę białka CmLTP 9,5 jest jego zasadowość oraz masa cząsteczkowa ok. 9,5 kDa. Białko zachowuje swą stabilność przez okres co najmniej jednego roku podczas przechowywania w temp 4°C w roztworze wodnym zawierającym od 5 do 10% glicerolu.
Białko według wynalazku jest izolowane z Chelidonium majus z wykorzystaniem znanych metod izolacji białka, przy czym w końcowej fazie izolacji stosuje się etap specyficzny dla tego białka i celu w jakim jest izolowane.
W pierwszym etapie stosuje się znane metody izolacji białek polegające na rozdrobnieniu mechanicznym rośliny z Chelidonium majus. Następnie fragmenty rośliny zawiesza się w buforze do izolacji białek i wytrząsa, po czym odwirowuje, a następnie z supematantu wytrąca się białko np. siarczanem amonu. Osad białek odwirowuje się.
W celu izolacji białka CmLTP 9,5 otrzymany osad mieszaniny białek rozpuszcza się w buforze do izolacji białek, korzystnie w roztworze wodnym chlorowodorku 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propandiolu (Tris-Cl) o stężeniu od 0,05-0,2 M, zawierającego od 5-15% glicerolu. Do otrzymanego roztworu mieszaniny białek dodaje się środek alkalizujący do czasu uzyskania pH 7,9-8,5, korzystnie 8,4, odpowiadającego punktowi izoelektrycznemu białka CmLTP 9,5. Proces wytrącania białka prowadzi się w temperaturze nie wyższej niż 30°C przy użyciu 0,5-1,5 M, korzystnie 1 M, roztworu wodorotlenku metalu alkalicznego, korzystnie NaOH lub KOH. Osad wytrąconego białka CmLTP 9,5 rozpuszcza się w buforze do izolacji białek, korzystnie w roztworze wodnym chlorowodorku 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propandiolu (Tris-Cl) o stężeniu od 0,05-0,2 M, zawierającego od 5-15% glicerolu.
Tak przygotowane białko może być stosowane zarówno do badań jak i do zastosowań praktycznych.
W przykładzie 1 szczegółowo przedstawiono jeden ze sposobów izolacji białka CmLTP 9,5. W szczególności istotny jest czwarty etap izolacji specyficzny dla izolacji białka CmLTP 9,5.
W drugim aspekcie przedmiotem wynalazku jest białko CmLTP 9,5 do zastosowania jako środek bakteriobójczy i bakteriostatyczny, w szczególności względem szczepów bakterii Gram dodatnich (Bacillus sp.) i Gram ujemnych (Enterobacteriaceae, np. E. coli TG1). Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka CmLTP 9,5 zawierającego sekwencję aminokwasów, która w co najmniej 80% jest
PL 228 497 B1 zgodna z sekwencją SEK NR ID. 1, korzystnie zwierającego sekwencję aminokwasów w 95% zgodną z sekwencją SEK NR ID. 2.
Zastosowanie białka CmLTP 9,5 jako środka bakteriostatycznego polega na jego stosowaniu jako dodatek do pasz w ilości od 1 do 5 g, korzystnie 2 g białka na 1 tonę paszy w przypadku stosowania jako dodatek bakteriostatyczny do pasz.
Zastosowanie białka CmLTP 9,5 jako środka bakteriobójczego polega na jego stosowaniu jako dodatek do pasz w ilości od 10 do 40 g, korzystnie 20 g białka na 1 tonę paszy w przypadku stosowania jako dodatek bakteriobójczy do pasz.
W kolejnym aspekcie przedmiotem wynalazku jest zastosowanie jako środka dezynfekcyjnego białka CmLTP 9,5, w stężeniu od 5 do 20 pg/litr, korzystnie 10 pg/litr wody, przy czym białko CmLTP 9,5 zawiera sekwencję aminokwasów w co najmniej 80% zgodną z sekwencją SEK NR ID.1, korzystnie zwiera sekwencję aminokwasów w 95% zgodną z sekwencją SEK NR ID. 2, przy czym białko CmLTP 9,5 stosuje się w ilości 0,01 pg na 1 ml kultury bakteryjnej. Ilość białka przy jakiej zaobserwowano zahamowanie wzrostu bakterii wynosiła 0,01-0,02 pg.
Właściwości przeciwbakteryjne białka CmLTP 9,5 , pozyskanego sposobem wg wynalazku, względem szczepów bakterii Gram dodatnich (Bacillus sp.) i Gram ujemnych (Enterobacteriaceae, np. E. coliTG1) potwierdzono w wyniku następującego eksperymentu.
Do badania użyto szczepy pochodzące z kolekcji ATCC nr 11774; 11229; 8739.
Bakterie hodowano przez noc w pożywce płynnej Luria Broth (LB) (Sigma-Aldrich, nr kat. L2542) (0,5% (w/o) ekstrakt drożdżowy; 1% (w/o) trypton, 1% (w/o) NaCl). W tym celu pożywkę zaszczepiono pojedynczą kolonią odpowiedniego szczepu bakterii i hodowano przez noc w temperaturze 37°C. Następnie pasażowano na sterylną płytkę Petriego zawierającą stałą pożywkę LB (Sigma-Aldrich, nr kat, L2897) (LB+1,5% (w/o) agaroza) i prowadzono ich wzrost przez 3 godziny w temp. 37°C przy wilgotności 60%. Po tym czasie na powstałą „murawkę” bakterii nakładano sterylne krążki bibułowe o średnicy 0,8 mm nasączone roztworem białka CmLTP 9,5. Sterylizację krążków bibułowych prowadzono w autoklawie w standardowych warunkach (120°C, 30 min), po czym nakrapiano roztwór białka o stężeniu 2 pg/ml w ilościach odpowiednio: krążek nr 1: 5 pl (0,01 pg), krążek nr 2: 10 pl (0,02 pg), krążek nr 3: 20 pl (0,04 pg) i prowadzono dalej - hodowlę bakterii przez 12 godzin w temperaturze 37°C wilgotności 60%. Aktywność przeciwbakteryjną badanego białka określano na podstawie analizy wielkości strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół bibułowego krążka. Wyniki hodowli bakterii na pożywce płynnej LB w obecności różnych ilości białka CmLTP 9,5 przedstawiono na figurze 1.
Na podstawie uzyskanych danych ustalono najniższe stężenie białka CmLTP 9,5 konieczne do całkowitej lizy komórek bakteryjnych, które wynosiło 0,01-0,02 pg.
Jako próbę kontrolną stosowano frakcję ekstraktu z Chelidonium majus pozbawioną białka CmLTP 9,5.
Kolejnym etapem było określenie stopnia bakteriobójczej aktywności białka CmLTP 9,5 w zależności od ilości białka w hodowli płynnej.
W tym celu pożywkę LB zaszczepiono pojedynczą kolonią odpowiedniego szczepu bakterii i hodowano przez noc w temperaturze 37°C. Następnie tak przygotowaną kulturą bakterii 100 zaszczepiono ml świeżej pożywki i dodawano białko CmLTP 9,5 w ilościach: 0,02 pg (hodowla 1), 0,04 pg (hodowla 2) oraz 0,06 pg (hodowla 3). Jako hodowlę kontrolną stosowano czystą kulturę bez dodatków (kontrola 1) oraz kulturę zaszczepioną frakcją ekstraktu z Chelidonium majus pozbawionego białka CmLTP 9,5 (kontrola 2). Hodowlę bakterii prowadzono przez 6 h, następnie mierzono OD600. Po dwóch godzinach hodowli zaobserwowano spadek wzrostu bakterii o 54% w hodowli zawierającej badane białko w stężeniu 0,02 pg (hodowla 1), natomiast o 76% w hodowli, gdzie ilość białka w pożywce wynosiła 0,06 pg (hodowla 3). Podobny wynik uzyskano po 6 godzinach hodowli (Rys. 1).
Wyniki hodowli bakterii na pożywce płynnej LB przy stałej ilości białka CmLTP 9,5 przedstawiono na figurze 2.
Przeprowadzone badania potwierdziły właściwości bakteriobójcze białka CmLTP 9,5 już w przypadku jego stosowania w stężeniu 0,01 pg/ml, co odpowiada stężeniu 10 pg/litr środka dezynfekcyjnego. Uzyskane wyniki potwierdzają , że w celu uzyskania efektu bakteriobójczego wystarczające jest zastosowanie 10 g białka na 1 tonę paszy.
W kolejnym eksperymencie analizowano wzrost bakterii w pożywce płynnej w celu oszacowania aktywności bakteriostatycznej.
W tym celu pożywkę LB zaszczepiono pojedynczą kolonią odpowiedniego szczepu bakterii i hodowano przez noc w temperaturze 37°C. Następnie tak przygotowaną kulturą bakterii zaszczepiono
PL 228 497 B1 ml świeżej pożywki i dodano białko CmLTP 9,5 w ilości 0,004 pg, czyli w ilości 10x niższej niż bakteriobójcza. Jako hodowlę kontrolną stosowano kulturę zaszczepioną ekstraktem z soku mlecznego Chelidonium majus pozbawionego białka CmLTP 9,5.
Hodowlę bakterii w obu przypadkach prowadzono przez 12 h, przy czym OD600 kultury mierzono odpowiednio po 1,2 i 3 godzinach. Sprawdzano różnicę pomiędzy wartościami OD600 (wartość absorbancji kultury bakteryjnej - wzrasta proporcjonalnie do przyrostu ilości komórek bakteryjnych) w hodowli z dodatkiem białka CmLTP 9,5 w porównaniu do hodowli kontrolnej (Rys. 2).
Po 1 h hodowli zaobserwowano słaby wzrost bakterii w obu przypadkach. Natomiast po 3 godzinach wzrostu hodowli bakterii na pożywce płynnej LB przy stałej ilości białka CmLTP 9,5 (0,004 pg) zaobserwowano zahamowanie wzrostu bakterii ok. 40% w porównaniu z hodowlą kontrolną (Rys. 2).
Wynik eksperymentu dowodzi, że podanie białka CmLTP 9,5 w ilości 0,004 pg wywołało stopniowe hamowanie wzrostu bakterii (przez 3 h) w hodowli w porównaniu z kontrolą aż o 40%.
Wynik eksperymentu pokazuje, iż oprócz aktywności bakteriobójczej, białka CmLTP 9,5 stosowane stężeniu 0,001 pg/ml wykazuje również aktywność bakteriostatyczną. Bakterie rosną w obecności tego białka, ale wzrost jest zahamowany w ok. 40%.
Dla bakterii efektem typowym jest, iż adaptują się one do niekorzystnych warunków środowiska. W przypadku białka CmLTP 9,5 jego niskie stężenie, rzędu 0,001 pg/ml, wywołuje efekt adaptacyjny bakterii w hodowli. Ten efekt trzeba uwzględnić przy długotrwałym stosowaniu białka CmLTP 9,5 jako potencjalnego środka bakteriobójczego. W przypadku stosowania białka CmLTP 9,5 jako dodatku bakteriobójczego do pasz stosuje się je w dawkach nie mniejszych niż 5 g/tonę, korzystnie w ilości 20 g/tonę. W przypadku stosowania białka CmLTP 9,5 jako środka dezynfekcyjnego stosuje się je w stężeniu nie mniejszym 5 pg/litr, korzystnie 10 pg/litr, gdyż w niższych dawkach białko ma aktywność jedynie bakteriostatyczną.
P r z y k ł a d 1
1. Etap - świeże korzenie i pędy Chelidonium majus poddano miażdżeniu i wyciskaniu w celu uzyskania płynnego pomarańczowo-żółtego soku mlecznego (lateksu).
2. Etap - z uzyskanego lateksu przeprowadzono ekstrakcję białek z zastosowaniem wodnego roztworu chlorowodorku 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propandiolu (Tris-Cl) o stężeniu od 0,1 M, zawierającego 10% glicerolu, przy pH od 8,0. Ekstrakcję prowadzono w temperaturze nie wyższej niż 37°C przez 0,5 godziny. Po czym odwirowano, resztki komórkowe stanowiące osad odrzucano, a supernatant stosowano do dalszych etapów izolacji CmLTP 9,5.
3. Etap 3 - otrzymany w drugim etapie supernatant oczyszczano z cząstek stałych poprzez dodanie wysyconego 4 M roztworu siarczanu amonu do stężenia końcowego (siarczanu amonu) 0,2 M, w supematancie. Próbę po wymieszaniu pozostawiono na 60 minut w temp. pokojowej 23°C, po czym odwirowano, w celu oddzielenia fragmentów komórek roślinnych od roztworu zawierającego białka. Po odwirowaniu osad odrzucono a supernatant (zawierający białka) zebrano do dalszej izolacji CmLTP 9,5.
4. Etap 4 - uzyskany w trzecim etapie supernatant doprowadzono przy użyciu 1 M roztworu wodorotlenku sodu do pH 8,4, odpowiadającego punktowi izoelektrycznemu białka CmLTP 9,5. Osad białka odwirowano i rozpuszczono w buforze stanowiącym roztwór chlorowodorku 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propandiolu (Tris-Cl) o stężeniu od 0,1 M zawierającego 10% glicerolu.
PL 228 497 Β1
Lista sekwencji
Sekwencja: SEK NR ID. 1
Chelidonium majus
| Met 1 | Lys | Val | Thr | Tyr 5 | Ile | Ala | Val | Leu | Leu 10 | Thr | Ala | Met | Val | Leu 15 |
| Leu | Leu | Ser | Glu | Ala | Gin | Val | Ser | Asn | Ala | Ala | Ser | Cys | Ser | Ala |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Ile | Glu | Leu | Ala | Pro | Cys | Leu | Gly | Ala | Ile | Met | Ser | Ser | Ser | Pro |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Pro | Ser | Gly | Ala | Cys | Cys | Ser | Lys | Leu | Ser | Glu | Gin | Lys | Pro | Cys |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Leu | Cys | Gin | Tyr | Met | Arg | Asp | Pro | Asn | Leu | Arg | Gin | Tyr | Val | Asn |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Thr | Pro | Gly | Ala | Arg | Ser | Val | Ser | Asn | Ala | Cys | Arg | Val | Pro | Leu |
85 90
Pro Asn Cys
Sekwencja: SEK NR ID.2
Chelidonium majus
| Ser 1 | Ala | Ile | Glu | Leu 5 | Ala | Pro | Cys | Leu | Gly 10 | Ala | Ile | Met | Ser | Ser 15 |
| Ser | Pro | Pro | Ser | Gly 20 | Ala | Cys | Cys | Ser | Lys 25 | Leu | Ser | Glu | Gin | Lys 30 |
| Pro | Cys | Leu | Cys | Gin 35 | Tyr | Met | Arg | Asp | Pro 40 | Asn | Leu | Arg | Gin | Tyr 45 |
| Val | Asn | Thr | Pro | Gly | Ala | Arg | Ser | Val | Ser | Asn | Ala | Cys | Arg | Val |
55 60
Pro Leu Pro Asn Cys
PL 228 497 B1
Claims (18)
- Zastrzeżenia patentowe1. Izolowane białko CmLTP 9,5 z Chelidonium majus zawierające sekwencję aminokwasów, która w co najmniej 80% jest zgodna z sekwencją oznaczoną jako SEK NR ID. 1.
- 2. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera sekwencję aminokwasów, która w co najmniej 90% jest zgodna z sekwencją oznaczoną jako SEK NR ID. 1.
- 3. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera sekwencję aminokwasów, która w co najmniej 95% jest zgodna z sekwencją oznaczoną jako SEK NR ID. 2.
- 4. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera sekwencję aminokwasów, która w co najmniej 98% jest zgodna z sekwencją oznaczoną jako SEK NR ID.2.
- 5. Białko CmLTP 9,5 izolowane z Chelidonium majus zawierające sekwencję aminokwasów, która w co najmniej 80% jest zgodna z sekwencją oznaczoną jako SEK NR ID. 1 do zastosowania jako środek bakteriobójczy i bakteriostatyczny.
- 6. Białko CmLTP 9,5 izolowane z Chelidonium majus do zastosowania wg zastrz. 5, znamienne tym, że zawiera sekwencję aminokwasów, która w co najmniej 95% jest zgodna z sekwencją oznaczoną jako SEK NR ID. 2.
- 7. Białko CmLTP 9,5 izolowane z Chelidonium majus zawierające sekwencję aminokwasów, która w co najmniej 80% jest zgodna z sekwencją oznaczoną jako SEK NR ID. 1 do zastosowania jako bakteriobójczy i/lub bakteriostatyczny dodatek do pasz, przy czym stosuje się je w ilości od 1 do 40 g, białka na 1 tonę paszy.
- 8. Białko do zastosowania według zastrz. 7, znamienne tym, że jako dodatek bakteriobójczy stosuje się je w ilości od 10 do 40 g na tonę paszy.
- 9. Białko do zastosowania według zastrz. 8, znamienne tym, że jako dodatek bakteriobójczy stosuje się je w ilości 20 g na tonę paszy.
- 10. Białko do zastosowania według zastrz. 7, znamienne tym, że jako dodatek bakteriostatyczny stosuje się je w ilości od 1 do 5 g na tonę paszy.
- 11. Białko do zastosowania według zastrz. 10, znamienne tym, że jako dodatek bakteriostatyczny stosuje się je w ilości 2 g na tonę paszy.
- 12. Białko CmLTP 9,5 izolowane z Chelidonium majus do zastosowania wg zastrz. 6, znamienne tym, że zawiera sekwencję aminokwasów, która w co najmniej 95% jest zgodna z sekwencją oznaczoną jako SEK NR ID. 2.
- 13. Białko do zastosowania według zastrz. 12, znamienne tym, że jako dodatek bakteriobójczy stosuje się je w ilości od 10 do 40 g na tonę paszy.
- 14. Białko do zastosowania według zastrz. 13, znamienne tym, że jako dodatek bakteriobójczy stosuje się je w ilości 20 g na tonę paszy.
- 15. Białko do zastosowania według zastrz. 12, znamienne tym, że jako dodatek bakteriostatyczny stosuje się je w ilości od 1 do 5 g na tonę paszy.
- 16. Białko do zastosowania według zastrz. 15, znamienne tym, że jako dodatek bakteriostatyczny stosuje się je w ilości 2 g na tonę paszy.
- 17. Zastosowanie białka CmLTP 9,5 izolowanego z Chelidonium majus zawierającego sekwencję aminokwasów, która w co najmniej 80% jest zgodna z sekwencją oznaczoną jako SEK NR ID. 1. jako środka dezynfekcyjnego, przy czym stosuje się je w stężeniu od 5 do 20 pg/litr wody, korzystnie 10 pg/litr.
- 18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że białko zawiera sekwencję aminokwasów, która w co najmniej 95% jest zgodna z sekwencją oznaczoną jako SEK NR ID. 2.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL408278A PL228497B1 (pl) | 2014-05-21 | 2014-05-21 | Aktywne biologicznie białko CmLTP 9,5 oraz jego zastosowanie |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL408278A PL228497B1 (pl) | 2014-05-21 | 2014-05-21 | Aktywne biologicznie białko CmLTP 9,5 oraz jego zastosowanie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL408278A1 PL408278A1 (pl) | 2015-11-23 |
| PL228497B1 true PL228497B1 (pl) | 2018-04-30 |
Family
ID=54543852
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL408278A PL228497B1 (pl) | 2014-05-21 | 2014-05-21 | Aktywne biologicznie białko CmLTP 9,5 oraz jego zastosowanie |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL228497B1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109837283B (zh) * | 2017-11-28 | 2022-10-04 | 华中农业大学 | 柑橘天然抑菌蛋白CsLTP1制备及其应用 |
-
2014
- 2014-05-21 PL PL408278A patent/PL228497B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL408278A1 (pl) | 2015-11-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2007318640B2 (en) | Microorganism capable of controlling plant diseases and plant disease-controlling agent using the microorganism | |
| CN105670958B (zh) | 一株低温生防菌株及其应用 | |
| KR20150050578A (ko) | 식물의 비생물적 스트레스 저항성을 증가시키는 방법 | |
| CN105175518B (zh) | 凝结芽孢杆菌fm603产生的细菌素及其制备方法 | |
| CN111205359B (zh) | 一种拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin及其应用 | |
| WO2011136377A1 (ja) | 氷結晶化抑制タンパク質 | |
| US11839219B2 (en) | BVP10 protein for controlling tetranychid mites and use thereof | |
| CN105296386A (zh) | 一株高产拮抗烟草青枯病活性物质的内生解淀粉芽孢杆菌 | |
| PL228497B1 (pl) | Aktywne biologicznie białko CmLTP 9,5 oraz jego zastosowanie | |
| CN101985606B (zh) | 一种水稻根围伯克氏菌及其在防治水稻纹枯病中的应用 | |
| CN106222121B (zh) | 一种巨大芽孢杆菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用 | |
| Unni et al. | Indigenous knowledge of silkworm cultivation and its utilization in North Eastern region of India | |
| CN106615071B (zh) | 紫檀芪在防治葡萄灰霉病和荔枝霜疫霉病中的应用 | |
| US10584151B2 (en) | Recombinant peptide vaccines against ticks, and nucleotide sequences coding for the recombinant peptides | |
| KR102018118B1 (ko) | 민물 김(Prasioloa japonica) 단세포 실내 배양방법 | |
| SI24489A (sl) | Kompozicija in metoda za zaščito rastlin | |
| CN112159832B (zh) | 一种植物源多肽及用于制备草莓保鲜剂和抑菌剂的用途 | |
| Ajayasree et al. | Bacterial root bark necrosis and wilt of pomegranate, hereto a new disease | |
| CN102559672B (zh) | 一种重组海参溶菌酶n端多肽、其制备方法和应用 | |
| AU774439C (en) | Treatment of wilt diseases | |
| CN103865825B (zh) | 防治芝麻枯萎病的生防菌、分离方法、菌剂及其应用 | |
| Kumari et al. | Antifungal activity of Turbinaria conoides and evaluation for the effective concentration against the infection of Beauveria bassiana in silkworm larvae | |
| JP2023535831A (ja) | 生体刺激および生体防御ペプチドならびにその農業における使用 | |
| MX2018004528A (es) | Obtencion de fortificante mejorado de agua de levadura de cerveza. | |
| CN109628460A (zh) | 一种超深渊来源抗菌肽hydramacin及其制备方法 |