PL228868B1 - Zmodyfikowana cząsteczka czynnika wzrostu fibroblastów-1, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca zmodyfikowaną cząsteczkę czynnika wzrostu fibroblastów-1, zastosowanie cząsteczki i kompozycje farmaceutyczne obejmujące cząsteczkę - Google Patents

Description

(21) Numer zgłoszenia: 413558 C07K 14/50 (2006.01)

A61K 38/18 (2006.01)

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 13.08.2015

Zmodyfikowana cząsteczka czynnika wzrostu fibroblastów-1, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca zmodyfikowaną cząsteczkę czynnika wzrostu fibroblastów-1, zastosowanie cząsteczki i kompozycje farmaceutyczne obejmujące cząsteczkę

	(73) Uprawniony z patentu: TABACZEWSKI PIOTR, Puallup, US TABACZEWSKI MIROSŁAW, Szamotuły, PL
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
27.02.2017 BUP 05/17	(72) Twórca(y) wynalazku: PIOTR TABACZEWSKI, Puallup, US MIROSŁAW TABACZEWSKI, Szamotuły, PL
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.05.2018 WUP 05/18	(74) Pełnomocnik:
	rzecz, pat. Zbigniew Kamiński

oo co oo

CM

CM

Ω.

PL 228 868 B1

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Wynalazek należy do dziedziny medycyny molekularnej a w szczególności do dziedziny tworzenia modyfikowanych cząsteczek o wyższej stabilności, o lepszych właściwościach pobudzających podziały mitotyczne i nowych chemicznych i technologicznych właściwościach, które mogą być zastosowane w medycynie.

Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowana cząsteczka czynnika wzrostu fibroblastów-1, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca zmodyfikowaną cząsteczkę czynnika wzrostu fibroblastów-1, zastosowanie tej cząsteczki i kompozycje farmaceutyczne obejmujące tę cząsteczkę.

Tło wynalazku

Ludzki czynnik fibroblastów 1 (FGF-1) to cytokina o silnych zdolnościach do pobudzania wzrostu różnorodnych linii komórkowych, w tym fibroblastów, komórek śródbłonka naczyń i komórek epidermy. (8) Wymienione linie komórkowe odpowiedzialne są za tworzenie znaczącej masy tkanek tworzących skórę i w związku z tym FGF-1 stanowi znakomity potencjał do zastosowania w medycynie, w przypadkach konieczności regeneracji skóry. (1) Do tej funkcji FGF-1 wymaga połączenia ze znajdującymi się na powierzchni komórek receptorami kinaz tyrozynowych o wysokim powinowactwie (high affinity cellsurface tyrosine kinase receptors - FGFRs), które po dimeryzacji przekazują dalej sygnał wewnątrzkomórkowy. Dodatkowo, FGF-1 wiąże się z macierzą zewnątrzkomórkową (EM) in vivo tworząc wysoce skomplikowaną jednostkę sygnałową FGF-1/FGFR/EM. Macierz zewnątrzkomórkową tworzy rusztowanie, na którym FGF-1 tworzy homodimery i uzyskuje właściwą orientację przestrzenną. W związku z tym tworzenie kompleksów z EM i wiązanie z jej receptorami jest konieczne dla aktywności biologicznej. Po związaniu się z macierzą zewnątrzkomórkową, FGF-1 uzyskuje znacznie wyższą stabilność termiczną i oporność na enzymy, w szczególności metaloproteazy. (2) Po stymulacji swojej kanonicznej linii komórkowej, fibroblasty wydzielają dużą ilość składników tworzących EM, które z kolei aktywują FGF-1, co skutkuje szybkim wzrostem i dojrzewaniem fibroblastów. Dodatkowo aktywowane są inne niezbędne linie komórkowe, takie jak komórki śródbłonka naczyń i komórki nabłonkowe. W wyniku działania tych czynników, uzyskuje się szybką regenerację skóry. W przypadku patologicznych ran proces gojenia jest hamowany przez obecność bakterii rosnących w postaci biofilmu, wysoką aktywność proteolityczną powodującą degradację macierzy związanej z cytokinami, słabe tworzenie naczyń i nabłonka. W takim niekorzystnym środowisku fizjologicznym, proces regeneracji jest przerwany i ciągłe zapalenie/zakażenie hamuje właściwy proces gojenia. Szczególnie narażona na ryzyko rozwoju źle gojących się chronicznych ran jest populacja osób starszych, z cukrzycą i innymi zaburzeniami odporności. Częste występowanie patologicznych ran i obciążenie kosztami systemu opieki zdrowotnej jest znaczące, co więcej oczekiwany jest wzrost kosztów w związku ze starzeniem się populacji. Trudno gojące się rany prowadzą również do niskiej samooceny, socjalnej izolacji i obniżonej jakości życia. Oprócz chronicznych ran, kolejny obszar, w którym szeroko oczekiwane jest przyspieszenie procesu gojenia to uszkodzenia rogówki w wyniku np. urazów powodowanych przez soczewki kontaktowe czy ropiejących zakażeń. Jest to spowodowane tym, że stany te są związane z ogromnym bólem i cierpieniem. Podsumowując, istnieje zapotrzebowanie na czynnik wzrostu o niewygórowanej cenie, którego zastosowanie pozwoliłoby na polepszenie obecnie dostępnych procedur terapeutycznych wśród tych dużych, ekonomicznie wrażliwych i cierpiących populacji.

FGF-1 ze swoimi najbardziej zróżnicowanymi spośród czynników FGF funkcjami i wysokim poziomem produkcji podczas ekspresji w bakteriach stanowi obiecujący i najlepszy wybór spośród cytokin do zastosowania na ogólnodostępnym rynku (1 mililitr hodowli bakteryjnej o wysokiej gęstości może wyprodukować 0,1 miligrama białka, podczas gdy biologiczna aktywność uzyskiwana jest przy 10 mikrogramach/mililitr). Główne przeszkody to obecność N-formylowanej metioniny i niska stabilność, co przekłada się na krótki czas w jakim możliwe jest wykorzystanie związku. Korzystne byłoby zastosowanie bardziej skutecznych form i potencjału do chemicznych modyfikacji w celu zwiększenia różnorodności tej cytokiny prowadzących do udoskonalonych właściwości farmakochemicznych.

Strukturalnie FGF-1 należy do rodziny białek charakteryzujących się obecnością struktury przestrzennej beta-koniczynki. (4, 5) Struktura ta jest utworzona przez sześć domen o wyglądzie dwuniciowych szpilek. Trzy z domen tworzą strukturę beczki a pozostałe trzy tworzą trójkątny układ zamykający beczkę. Ułożenie struktury drugorzędowej nadaje cząsteczkom pseudo trójstronną symetrię. FGF-1,

PL 228 868 B1 jeżeli nie jest ustabilizowany przez EM, ma wewnętrznie niską stabilność i relatywnie krótki czas półtrwania z temperaturą topnienia nieco wyższą niż przeciętna temperatura ciała. (9) Ze względu na niską termostabilność, FGF-1 łatwo ulega szybkiemu proteolitycznemu rozkładowi i agregacji.

Podczas analizy korelacji anizotropicznych czynników termicznych z użyciem wysokorozdzielczego promieniowania rentgenowskiego (promienie X) przy rozdzielczości 1.10 angstrema (A), stwierdzono, że wchodzące we wzajemną interakcję C- i N-końcowe fragmenty FGF-1 o strukturze beta-kartki wyznaczają granice domeny wiążącej wewnątrz cząsteczki. (5). Analiza przy użyciu spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) wykazała, że oddziaływanie pomiędzy pierwszą a ostatnią przeciw-równoległą beta-kartką w pozycji 133 jest najmniej jasno zdefiniowane (przy użyciu schematu numerowania 140 aminokwasów) i pozycje 134-145 są w znacznej mierze niezorganizowane. (6) Wykazano również w analizie wymiany wodoru na deuter z wygaszanym przepływem przy wykorzystaniu wielowymiarowej spektroskopii NMR, że tworzenie struktury białka jest inicjowane przez tworzenie wiązania wodorowego łączącego N- i C-końce. (6) Te dane są zgodne z twierdzeniem, że pierwsza i ostatnia beta-kartka cząsteczki stanowi słabe, lecz jednocześnie kluczowe struktury, które są niezbędne w procesie zwijania i rozfałdowania białka. (7) Innym źródłem strukturalnej słabości jest szereg wgłębień w wewnętrznym rdzeniu cząsteczki i obecność trzech reszt cysteiny, które są wrażliwe na atak oksydacyjny. Wielu badaczy testowało hipotezy, że zwiększona stabilność białka spowodowana wprowadzeniem kilku mutacji do FGF-1, aby skorygować strukturalne słabości będzie miała wpływ na wyższą aktywność. Analiza tych mutantów prowadziła do interesującej obserwacji, że początkowa stabilność skutkowa znaczącym wzrostem aktywności, lecz po osiągnięciu maksimum wydajności proces był odwracany i najbardziej termostabilne warianty stawały się nieaktywne biologicznie. Ten mechanizm może być wyjaśniony faktem, że wzrost termostabilności jest związany z usztywnieniem cząsteczki i związaną z tym niezdolnością do wykonywania strukturalnych dopasować niezbędnych do wiązania receptora i EM. Ten sam mechanizm został opisany dla innych cząsteczek, trudno jest jednak uogólnić zasady występowania takiego zjawiska. (10, 11).

Użyto kilku skutecznych podejść w celu stworzenia mutantów FGF-1 o zwiększonej stabilności i aktywności. W jednym z podejść, tam gdzie możliwe, użyto technik opartych o homologię, na podstawie odpowiedniego porównania (dopasowania) zidentyfikowano w FGF-1 homologiczne pozycje konserwowanych aminokwasów, które miały największy wpływ na stabilność białka. Na podstawie tych kryteriów opisanych dla zidentyfikowanych pozycji reszt aminokwasowych, wprowadzono mutacje zmieniające określoną resztę aminokwasową. Spośród przebadanych kandydatów, mutant FGF-1 o reszcie histydyny zastąpionej resztą tryptofanu w pozycji reszty aminokwasowej 21 (His21Trp) wykazywał najwyższą stabilność. (13) W innym podejściu, wprowadzono mutacje na N- i C-końcu beta-kartki w miejscach odpowiedzialnych za strukturalne osłabienie; zamiana lizyny na walinę w pozycji 12 (Lys12Val) i proliny na walinę w pozycji 134 (Pro134Val).

Trzecie podejście polegało na zmutowaniu schowanych reaktywnych reszt tiolowych np. przez zastąpienie reszty cysteiny resztą waliny w pozycji 117 (Cys117Val) w celu eliminacji destabilizujących reakcji utleniania w tym miejscu. We wszystkich przypadkach uzyskano bardziej stabilne i bardziej biologicznie aktywne warianty cząsteczek. Gdy połączono terminalną stabilizację z eliminacją reszt tiolowych, uzyskano jeszcze bardziej aktywne cząsteczki takie jak np. FGF-1 (Lys12Val/Cys117Val/Pro134Val). (14)

Aby zastymulować fibroblasty i inne komórki docelowe, FGF-1 musi dimeryzować i przyjąć zaktywowaną konformację. Proces dimeryzacji i aktywacji wymaga wiązania z siarczanem heparanu (HS). Siarczan heparanu to glikozamina szeroko rozpowszechniona w EM komórek ssaczych, włączając w to skórę, i jest niezbędna w przekazywaniu sygnału przez EM. Heparyna jest bardziej usiarkowanym analogiem heparanu i może być używana w jego miejsce. Dokładna trójwymiarowa struktura trzeciorzędowego kompleksu sygnałowego (FGF-1 :heparyna/heparan)FGFR nie jest w pełni znana, ponieważ skrystalizowano dwa alternatywne kompleksy. Obydwa jednak zawierają pod-struktury 1:1:1 zawierający dimer FGF-1. (12) Tak więc, konsensusowy trzeciorzędowy kompleks jest tworzony z dwu związanych cząsteczek FGF-1 i stabilizowany przez dwie cząsteczki siarczanu heparanu lub heparyny, z minimum sześcioma cząsteczkami jednostek cukrowych i dwoma receptorami FGFR. Można z dużą dozą prawdopodobieństwa zakładać, że utworzony wcześniej dimer FGF-1 będzie się wiązał się z FGFR i EC w sposób kooperacyjny, co w efekcie przyczyni się do powstania kompleksów o lepszych właściwościach przekazywania sygnału ze względu na wydajniejszą reakcję.

Pod względem biochemicznym FGF-1 to mała, kompaktowa cząsteczka, nieposiadająca łańcucha bocznego, mogąca służyć jako donor w miejscowo specyficznej reakcji tworzenia pochodnych. Brak

PL 228 868 B1 łańcucha bocznego zdecydowanie ogranicza możliwości wyprodukowania cząsteczek FGF-1 nowej generacji o dodatkowych ulepszonych lub specyficznie nakierowanych właściwościach (np. preparaty o spowolnionym uwalnianiu).

Powodem, dla którego FGF-1 może ulegać ekspresji w systemach prokariotycznych (bakterie) w tak wysoce efektywny sposób w aktywnej formie, jest fakt, że polipeptydy FGF-1 nie wymagają modyfikacji post-translacyjnych do swojego funkcjonowania. Mankamentem bakteryjnych systemów ekspresyjnych jest fakt, że wyprodukowana cząsteczka zawiera N-formylowaną metioninę. Formylowane peptydy produkowane przez bakterie są silnymi atraktantami dla neutrofili i mogą przyczyniać się do powstawania procesu pro-zapalnego. (3) W preparacie oczyszczonego FGF-1 może znaleźć się chemiczny i biologiczny materiał obcego pochodzenia obecny podczas wzrostu bakterii jako składniki śladowe i wyzwolić niekorzystną reakcję uczuleniową. W związku z tym, ulepszenie procesu oczyszczania w celu otrzymania czystej cytokiny, standaryzacja procesu o obniżenie jego kosztów byłyby ze wszech miar pożądane.

Mając w pamięci powyższe uwagi, wynalazek opisuje polipeptydy o znacząco korzystnej charakterystyce.

Podsumowanie wynalazku

Wynalazek dotyczy trzeciej generacji cząsteczek FGF-1 składających się z dwóch części: zmodyfikowanej cytokiny FGF-1 i giętkiego linkera na N końcu cząsteczki. (Fig. 1). We wszystkich konstruktach użyto skróconej, w pełni aktywnej, cząsteczki FGF-1 z podstawnikami lub bez podstawników. Wszystkie konstrukty zawierają identyczny N-końcowy linker.

Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowana cząsteczka czynnika wzrostu fibroblastów-1 (FGF-1) obejmująca dwie części: zmodyfikowaną cytokinę FGF-1 i giętki linker N-końcu tej cząsteczki, zawierająca sekwencję wybraną spośród SEQ ID NO 1 do 3.

Korzystnie cząsteczka obejmuje 140 reszt aminokwasowych formy FGF-1 przedstawionych w SEQ ID NO: 1 jako L-FGF-WT, i linker, korzystniej cząsteczka zawiera resztę histydynową zmutowaną do konsensusowej reszty tyrozyny w pozycji 21, jak przedstawiono w SEQ ID NO: 2 jako L-FGF-H21Y, i linker.

Korzystnie cząsteczka zawiera mutację H21Y, dwie mutacje stabilizujące końcowe beta-kartki podstawienie reszty lizyny przez resztę waliny, podstawienie reszty proliny przez resztę waliny w pozycjach kolejno 12 i 134, podstawienie reszty cysteiny przez resztę waliny w pozycji 11, jak przedstawiono w SEQ ID NO:3 jako L-FGF- K12V/H21 Y/C 117V/P134/V, i linker.

Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca zmodyfikowaną cząsteczkę FGF-1 o sekwencji wybranej spośród SEQ ID NO: 1-3.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zmodyfikowana cząsteczka według wynalazku do zastosowania do stymulacji komórek responsywnych, w szczególności, fibroblastów, komórek śródbłonka i keratynocytów, korzystnie do leczenia ran, a zwłaszcza do zastosowania do indukowania reakcji gojenia podczas procedur endoskopowych, po biopsji oraz w trakcie operacji chirurgicznej.

Korzystnie zmodyfikowana cząsteczka według wynalazku jest do zastosowania w powiązaniu z heparyną.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, która składa się z farmaceutycznie akceptowalnego nośnika i modyfikowanej cząsteczki czynnika wzrostu fibroblastów-1 (FGF-1) lub cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego tę cząsteczkę według wynalazku.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna ma formę plastra lub opatrunku stosowanego na ranę.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna ma formę kropli zakrapianych do oka i ucha w celu leczenia owrzodzeń.

Pierwsza cząsteczka zbudowana z niezmodyfikowanej, skróconej cząsteczki FGF-1 i linkera została nazwana: L-FGF-WT Druga cząsteczka zawiera mutację zmieniającą histydynę w tyrozynę w pozycji 21 i linker została nazwana: L-FGF-H21Y Trzecia cząsteczka oprócz mutacji H21Y, zawiera dodatkowe mutacje stabilizujące beta- kartkę zmieniające lizynę na walinę i prolinę na walinę, w pozycjach 12 i 134, oraz zawiera walinę w miejsce cysteiny w pozycji 117, co usuwa niestabilność cząsteczki warunkowaną obecnością grupy tiolowej. Cząsteczka zawiera linker i została nazwana L- FGFK12V/H21Y/C117V/P134/V.

Wynalazek został przedstawiony na rysunku, na którym

Figura 1 przedstawia porównanie sekwencji aminokwasowych cytokin L-FGF trzeciej generacji. 6His to sześć reszt histydynowych, które mogą być usunięte w wyniku trawienia trombiną (THR, rozpoznawane miejsce cięcia zaznaczone jest na zielono), w wyniku trawienia powstają warianty L-FGF

PL 228 868 B1 z krótszym linkerem i cysteiną (cys) mogącą być w kontakcie z rozpuszczalnikiem i mogącą tworzyć wiązanie S-S w warunkach utleniających, co pozwala na formowanie dimerów. Jest to również miejsce tworzenia pochodnych, gdy warunki redukujące są utrzymywane. EK: gdy użyta jest enterokinaza (rozpoznawane miejsce zaznaczono na różowo), uwalniane są cząsteczki L-FGF bez linkera. Podstawienia w natywnej cząsteczce (na górze) prowadzące do zwiększonej aktywności/stabilności zaznac zono na czerwono.

Figura 2 pokazuje przewidywaną strukturę trójwymiarową trzeciej generacji FGF-1. Na lewo pokazane są białka z linkerem skróconym w wyniku działania protrombiny. Na prawo bez linkera, po odcięciu enterokinazą. Proszę zwrócić uwagę, że wewnętrzna struktura FGF-1 jest identyczna. Pozycja linkera jest wysoce zmienna i nie tworzy żadnej struktury drugorzędowej lub nie ulega interakcji z FGF-1. Rejon linkera jest przewidziany z bardzo niskim prawdopodobieństwem, co jest zgodne ze znaczną przestrzenną ruchomością tego rejonu. Niebieskie szczebelki reprezentują wodorowe wiązania wewnątrzcząsteczkowe i wiązana pomiędzy resztami. Wizualizacja przestrzenna (3D) została wykonana przy użyciu publicznie dostępnego narzędzia phyre 2server na stronie www.sbq.bio.ic.ac.uk. Struktura drugorzędowa została przewidziana przy użyciu oprogramowania Chimera 1.10.1 dostępnego w UCSF.

Figura 3. A. pokazuje barwiony błękitem Coomassie Brillant obraz rozdziału produktów oczyszczania FGF na złożu zawierającym nikiel (Ni-NTA) w elektroforezie w denaturującym żelu akrylamidowym (SDS-PAGE). Ścieżka 3: L-FGF-WT, Ścieżka 6 [powinno być 5 wg obrazu na żelu] L-FGF-H21Y, Ścieżka 9 L-FGF-K12V/H21Y/C117V/P134V, Ścieżki 1, 4, 7: Surowicza albumina wołowa (BSA), Ścieżki 2, 6, 8 standard masy molekularnej z zaznaczonymi wartościami. B. Analiza Western Blot z użyciem przeciwciał anty-His. Ścieżka 2 [powinno być 1 wg obrazu na żelu]: L-FGF-WT, Ścieżka 4: L-FGF-H21Y, Ścieżka 6: L-FGF-K12V/H21Y/C117V/P134V. Ścieżki 1,3, 5 standard masy cząsteczkowej ze wskazanymi wartościami masy.

Dla lepszego zobrazowania wynalazku, kluczowe właściwości pokazane zostały na Figurze 1. Giętki linker dodany jest do N-końca skróconej formy FGF-1. Ten linker zawiera łańcuch 6 histydyn (6 His), który może być użyty do wydajnego oczyszczania przy użyciu chromatografii Ni-NTA. Zawiera również resztę cysteinową, która po utlenieniu może tworzyć wiązania dwusiarczkowe efektywnie tworząc homodimery, które następnie mogą ulegać interakcji z heparyną/heparanem i być aktywowane. Linker ma dostateczną długość i giętkość (Figury 1 i 2), co pozwala indywidualnym składnikom FGF-1 na dostateczną swobodę przestrzenną pozwalającą na odnalezienie miejsc wiązania z glikozaminoglikanami i przyjęcie odpowiedniej aktywnej formy. Opierając się na konsensusowej, trójwymiarowej strukturze trzeciorzędowego kompleksu FGF:heparyna/heparan:FGFR obecność linkera nie powinna zmieniać przestrzennego ułożenia pozwalającego na wiązanie do receptora FGFR lub EC. (Figura 2) W warunkach środowiska redukującego, nie powstają formy dimeryczne a monomery mogą swobodnie wiązać się z glikozaminoglikanami. Kompleksy heparyna:L-FGF-1 mogą być modyfikowane lub unieruchamiane przez dostępną grupę sulfhydrylową linkerowej cysteiny i tworzyć cząsteczki następnej generacji. Alternatywnie, po wystawieniu na działanie środowiska utleniającego w tkance, cząsteczki zaczną tworzyć dimery wzmacniając zdolności aktywujące tak ustabilizowanych kompleksów. Linker zawiera również dwa unikalne miejsca rozpoznawane przez proteazy: trombinę i enterokinazę, nieobecne w niezmodyfikowanej cząsteczce FGF-1. Gdy zastosowano trombinę, łańcuch 6 His i formylowany pierwszy aminokwas na N-końcu jest usuwany i powstaje aktywna forma L-FGF-1 ze skróconym linkerem. Ten przykład trzeciej generacji FGF-1 opisuje cytokinę, która może być użyta w preparatach medycznych. Jeżeli zachodzi taka potrzeba, można całkowicie usunąć linker z FGF-1 przy pomocy enterokinazy. Tak więc, pierwszy enzym może zostać użyty do usunięcia immunogennej N-formylowanej grupy i łańcucha 6His niezbędnego wyłącznie do oczyszczania. Drugi enzym może być użyty do uwolnienia aktywnych monomerów cytokiny od ich nośnika w przypadkach, gdy łańcuch boczny cysteiny zawartej w linkerze był użyty do immobilizacji cząsteczki.

W niniejszym zgłoszeniu opisano trzy wersje cytokiny FGF-1. Pierwsza to skrócona, biologicznie aktywna forma o długości 140 aminokwasów, bez żadnych zmian sekwencji, i która została nazwana formą dziką (WT). Pozostałe dwie formy są zmodyfikowane w sposób następujący. W FGF-H21Y w cząsteczce cytokiny obecne jest zapewniające dużą stabilność podstawienie znajdującej się na powierzchni białka reszty histydyny przez resztę tyrozynę w pozycji 21, która jest obecna w FGF-12. Ten wariant FGF-1 został już wcześniej opisany. (13) Wnioskowano, że zwiększona stabilność spowodowana jest tworzeniem dodatkowego wiązania wodorowego o długości 1,97A pomiędzy atomem tlenu pochodzącym z reszty lizyny 113 w głównym łańcuchu. Ta mutacja nie wpłynęła na wiązanie z komórkami NIH 3T3 lub stymulację fosforylacji kinazy MAP w tych fibroblastach.

PL 228 868 B1

Trzy dodatkowe mutacje w FGF-K12V/H21Y/C117V/P134/V: w pozycji 12 reszta lizyny zastąpiona resztą waliny, w pozycji 117 reszta cysteiny zastąpiona resztą waliny i w pozycji 134 reszta proliny zastąpiona resztą waliny, również zostały opisane wcześniej. (14) FGF-K12V/C117V/P134/V ma wyższą stabilność termiczną i aktywność, co przekłada się na lepszą cząsteczkę biologiczną. Argumentowano, że efekt ten jest spowodowany zwiększoną stabilizacją oddziaływań pomiędzy terminalnymi beta kartkami i usunięciem jednej stabilizującej reszty cysteiny. (14)

FGF-K12V/H21Y/C117V/P134/V stanowi nową wersję FGF-1. Cząsteczka ta powinna wiązać się do macierzy zewnątrzkomórkowej podobnie jak cząsteczki typu dzikiego i równocześnie być bardziej stabilna i aktywna w niskich stężeniach. Niektóre mutacje opisane wcześniej, których niezależne właściwości dają efekt w postaci wyższej stabilności termicznej i biologicznej aktywności. Wysoka liczba stabilizujących zmian może być skompensowana przez potencjalnie destabilizujący terminalny linker, o strukturze zmienionej w taki sposób, aby nadać mu doskonałe właściwości farmakologiczne.

Cząsteczki o lepszych właściwościach stabilności termicznej takie jak L-FGF-H21Y i L-FGFK12V/H21Y/C117V/P134/V mają dłuższy okres półtrwania i co za tym idzie dłuższy czas działania. Ta właściwość pozwala na ich rzadsze stosowanie (na przykład raz, zamiast dwa razy dziennie) i w niższym stężeniu. Możliwość przechowywania preparatu cytokiny w temperaturze pokojowej jest wysoce pożądana, zwłaszcza wśród populacji o niskim poziomie socjoekonomicznym. Możliwość rzadszych aplikacji wśród pacjentów niestosujących się do zaleceń i wśród osób niepełnosprawnych jest również bard zo korzystna. Korzystne jest również zastosowanie cząsteczek FGF w połączeniu z glikozaminoglikanami (heparyna lub heparan) ze względu na ich wyższą aktywność biologiczną i stabilność takich preparatów. Bardziej od heparanu preferowana jest heparyna, ze względu na to, że jest ogólnie dostępna na rynku a jej cena, przy potrzebnych ilościach, nie jest wygórowana. Dodatkowo, ma właściwości przeciwzapalne. (15)

Według jednego z przykładów wykonania wynalazku, oczyszczone i poddane trawieniu trypsyną cytokiny trzeciej generacji L-FGF-WT, L-FGF-H21Y i L-FGF-K12V/H21Y/C117V/P134/V są stosowane do stymulacji komórek odpowiadających w szczególności fibroblastów, komórek śródbłonka i keratynocytów.

Jest ogólnie przyjęte, że komórkami docelowymi może być zbiór komórek, włączając w to komórki odpowiadające na sygnał i obojętne komórki tworzące sieć powiązanych komórek określanych jako tkanki i organy. Taki zespół komórek może być hodowany in vitro, wyizolowany z organizmu, lub może znajdować się bezpośrednio w organizmie.

Funkcją fibroblastów jest zapewnienie strukturalnego wsparcia dla organów. Ta funkcja osiągana jest przez produkcję prekursorów wszystkich składników macierzy pozakomórkowej u ludzi. Macierz pozakomórkowa również stanowi rusztowanie, na którym unieruchamiane są niezbędne składniki (chemokiny, czynniki wzrostu, enzymy itd.), które zapewniają krytyczne regulatorowe środowisko dla składników komórkowych zdrowych tkanek i organów. Komórki śródbłonka stanowią podstawę naczyń krwionośnych i limfatycznych, które są niezbędne do przepływu składników odżywczych. Keratynocyty tworzą zewnętrzną powłokę organów zewnętrznych, co zapewnia ochronę mechaniczną i oddzielenie od środowiska zewnętrznego. Uszkodzenie tej zewnętrznej warstwy odsłania warstwy wewnętrzne tkanek i czyni je wrażliwymi na czynniki mikrobiologiczne i mechaniczne. Przerwanie warstwy zewnętrznej jest kluczowym etapem patologicznego tworzenia ran. Rozwój tych trzech rodzajów tkanek, które są zdolne do odpowiedzi na stymulację FGF-1 w formie szybkiego wzrostu, jest niezbędny do efektywnego procesu gojenia.

Ze względu na fakt, iż fibroblasty są odpowiedzialne za wzrost wszystkich składników tworzących tkankę łączną, pełnią ważną rolę w procesach regeneracji tkanek. Naturalnie, wzmocnione przez FGF-1 właściwości zwiększenia podziałów mitotycznych są traktowane jako skuteczna aktywność, szczególnie w gojeniu ran. Przedstawiony według wynalazku sposób oparty jest na dostarczeniu do uszkodzonej tkanki czynnika wzrostu o wysokiej aktywności w postaci czystego roztworu, preparatu o spowolnionym uwalnianiu składnika czynnego lub jako dodatku i suplementacji do innych dostępnych środków farmaceutycznych. Preferowaną formą aplikacji są szczególne kombinacje ze środkami przeciwzapalnymi i antybiotycznymi. Preferowane środki przeciwzapalne to sterydy, a zwłaszcza hydrokortyzon. Preferowany środek antybiotyczny to antybiotyki takie jak np. kombinacja mupirocyny i gentamycyny.

Osoba biegła w dziedzinie zrozumie, że polipeptydy mogą być również zastosowane wraz z tradycyjnymi trwałymi materiałami takimi jak plastry czy opatrunki na rany. Osoba biegła w dziedzinie zrozumie, że polipeptydy mogą być zastosowane w urządzeniach medycznych, na przykład w procedurach

PL 228 868 B1 endoskopowych, po biopsjach, w celu indukcji reakcji gojenia. W takich przypadkach zastosowanie heparanu jest bardziej korzystne od użycia heparyny. Specjalista w dziedzinie doceni fakt, iż preparaty polipeptydów mogą być podane w formie kropli doocznych i dousznych w celu leczenia owrzodzeń.

Kolejny korzystny przykład zastosowania opisanych polipeptydów to preparaty zawierające fazę stałą, gdzie polipeptydy stabilizowane glikozaminoglikanami mogą być unieruchamiane przy użyciu grup sulfhydrylowych linkera i uwalniane przez trawienie enterokinazami.

Podsumowując, specjalista w dziedzinie będzie w stanie rozpoznać dowolny typ urządzenia i formułę leku, która w kontakcie z tkanką łączną może zostać użyta jako sposób dostarczenia w celu aktywacji i indukcji wzrostu komórek wrażliwych na działanie FGF-1.

P r z y k ł a d

Materiały i Metody

Klonowanie

Geny kodujące L-FGF-1 i jego obydwie zmutowane wersje z linkerem zostały zsyntetyzowane de novo z użyciem nakładających się oligomerów z firmy Genscript przy użyciu standardowych technik. Syntetyczne geny zostały najpierw wstawione do wektora pUC57, a ich sekwencje zostały zweryfikowane przez sekwencjonowanie. Następnie zweryfikowany DNA został przeniesiony do bakteryjnego wektora ekspresyjnego pCOLDII (Takara).

Nadprodukcja i oczyszczanie białek

Rekombinowana dzika cząsteczka L-FGF-WT i zmutowane białka ulegały ekspresji w komórkach gospodarza E. coli po indukcji 10 mM izopropylo-3-D-tio-galaktozydem. Rozpuszczalną frakcję L-FGF wyizolowano poprzez mechaniczne zniszczenie komórek. W skrócie, po wyhodowaniu w płynnej hodowli komórki zbierano przez wirowanie przy 10 000 x g przez 10 minut. Osad zawieszano w 20 mM Tris-HCI, pH 7,5 przez delikatne poruszanie probówką na lodzie do końcowego stężenia 10x (100 mililitrów hodowli do 10 mililitrów zawieszonych w buforze bakterii). Zawiesinę następnie rozbijano ultradźwiękami na lodzie przy użyciu mikrokońcówki i następujących ustawień: poziom mocy 5, przy 50% obciążeniu przez 20 cykli, probówka była cały czas trzymana na lodzie podczas sonikacji. Cały lizat wirowano następnie przy 14000 x g przez 10 minut, aby rozdzielić frakcję rozpuszczalną i nierozpuszczalną. Rozpuszczalne cytokiny L-FGF obecne w supernatancie wiązano ze złożem Ni-NTA (kwas nitrylooctowy) na kolumnie (Qiagen, Valencia CA) przy udziale reakcji powinowactwa pomiędzy łańcuchem 6His a NTA. Niezwiązany materiał był wymywany przez płukanie 10 objętościami kolumny buforu o składzie 25 mM imidazol, 50 mM Na2PO4, 100 mM NaCI, 10 mM (NH4)2SO4, 0,1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 5 mM L-metionia, pH 7,0. L-metioninę dodano do buforu aby obniżyć utlenianie reaktywnych tioli i innych potencjalnych reakcji rozkładu w wyniku utleniania. Cytokiny L-FGF wymywano roztworem imidazolu o końcowym stężeniu 250 mM, a następnie dodatkowo oczyszczano na złożu HiLoad Superdex 75 do chromatografii wykluczenia SEM (GE Life Sciences, Pittsburgh PA), zrównoważonym buforem 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 8,0. Do przechowywania, do oczyszczonych preparatów białka dodawano glicerol do końcowego stężenia 10%. Glicerol był sterylizowany przez sączenie przez filtr o wielkości porów 0,22 mikrona, odpowietrzany przez nasycenie N2, i preparat błyskawicznie zamrażano w suchym lodzie a następnie przechowywane w temperaturze -80°C. Czystość finalnego preparatu białka była oceniana poprzez barwienie żeli błękitem Coomassie Brilliant (BIO-RAD Laboratories, Inc., Hercules CA) po elektroforezie denaturującej z SDS w żelu akrylamidowym (SDS PAGE), (wyniki pokazane na Fig. 3)

Kolometryczne oznaczenie stężenia białka metodą Bradforda, z albuminą jako białkiem referencyjnym, użyto do oznaczenia stężenia preparatów L-FGF. W celu uwidocznienia czystości i oszacowania poziomu ekspresji białek, białka L-FGF były przygotowane w nieobecności heparyny.

Wyniki

Trzy wersje cytokiny FGF-1 z linkerem zostały sklonowane i uzyskano ich ekspresje w E. coli. Wszystkie oczyszczono do wysokiej czystości przy użyciu dwustopniowego procesu oczyszczania na złożu Ni-NTA i kolumnie do chromatografii wykluczenia. (Fig. 3). Obecność linkera 6His potwierdzano specyficzną reakcją z przeciwciałami (Fig. 3B). W obydwu oznaczeniach pokazano, że pojedynczy etap oczyszczania pozwalał na uzyskanie wysoce homogennego produktu. Poziom produkcji oczyszczonego białka był bardzo wysoki, na poziomie >10 mg ma 100 ml kondycjonowanego podłoża.

Obecnie, oczyszczone L-FGF testowano pod kątem ich termicznej stabilności, czasu półtrwania in vitro i in vivo, aktywności wzmacniania podziałów mitotycznych, wrażliwości na trawienie trombiną i enterokinazą, derywatyzację sulfhydrylowego łańcucha bocznego linkera i reakcję dimeryzacji.

PL 228 868 Β1

Lista sekwencji SEQ ID No: 1 l-fgf-wt

MHHHHHHSSG LVPRGSGHCK ETAAAKFERQ HMDSDDDDK FNLPPGNYKK

PKLLYC3NGGHFLRILPDGT VDGTRDRSDQ HIQLQLSAES VGEVYIKSTE TGQYLAMDTD GLLYGSQTPNEECLFLERLE ENHYNTYISK KHAEKNWFVG LKKNGSCKRG PRTHYGQKAI LFLPLPVSSD

SEG ID No: 2

L-FGF-H21Y

MHHHHHHSSG LYPRGSGHCK ETAAAKFERQ HMDSDDDDK FNLPPGNYKK

PKLLYCSNGGYFLRILPDGT VDGTRDRSDQ HIQLQLSAES VGEVYIKSTE TGQYLAMDTD GLLYGSQTPN EECLFLERLE ENHYNTYISK KHAEKNWFVG LKKNGSCKRG PRTHYGQKAI LFLPLPVSSD

SEQ ID No.: 3

L-FGF-K12V/H21Y/C117V/P134/V

MHHHHHHSSG LVPRGSGHCK ETAAAKFERQ HMDSDDDDK FNLPPGNYKK

PVLLYCSNGGYFLRrLPDGT VDGTRDRSDQ HIQLQLSAES VGEVYIKSTE TGQYLAMDTD GLLYGSQTPNEECLFLERLE ENHYNTYISK KHAEKNWFVG LKKNGSVKRG PRTHYGQKAI LFLVLPVSSD

Literatura

1. Demidova-Rice TN, Hamblin MR, Herman IM. Acute and impaired wound healing: pathophysiology and current methods for drug delivery, part 1: normal and chronic wounds: biology, causes, and approaches to care. Adv Skin Wound Care. 2012;25:304-314. doi: 10.1097/01. ASW.0000416006.55218.d0.

2. Ogura K, Nagata K, Hatanaka H, et al. Solution structure of human acidic fibroblast growth factor and interaction with heparin-derived hexasaccharide. J.Biomol.NMR. 1999; 13(1):11 — 24. doi: 10.1023/A: 1008330622467.

3. VanCompernolle SE, Clark KL, Rummel KA, Todd SC. Expression and function of formyl peptide receptors on human fibroblast cells. J Immunol. 2003; 171(4):2050-2056. doi: 10.4049/jimmunol.171.4.2050.

4. McLachlan AD. Three-fold structural pattern in the soybean trypsin inhibitor (Kunitz). J Mol Biol. 1979;133(4):557-563. doi:10.1016/0022-2836(79)90408-X.

5. Bernett MJ, Somasundaram T, Blaber M. An atomie resolution structure for human fibroblast growth factor 1. Proteins. 2004;57(3):626-634. doi:10.1002/prot.20239.

6. Lozano RM, Pineda-Lucena A, Gonzalez C, et al. 1H NMR structural characterization of a nonmitogenic, vasodilatory, ischemia-protector and neuromodulatory acidic fibroblast growth factor. Biochemistry. 2000;39(17):4982-4993. doi : 10.1021/bi992544n.

7. Samuel D, Kumar TKS, Balamurugan K, Lin WY, Chin DH, Yu C. Structural Events during the Refolding of an All???-Sheet Protein. J Biol Chem. 2001 ;276(6):4134-4141. doi: 10.1074/jbc.M005921200.

8. Raju R, Palapetta SM, Sandhya VK, et al. A Network Map of FGF-1/FGFR Signaling System. JSignal Transduct. 2014;2014:962962. doi: 10.1155/2014/962962.

PL 228 868 B1

9. Culajay JF, Blaber SI, Khurana A, Blaber M. Thermodynamic characterization of mutants of human fibroblast growth factor 1 with an increased physiological half-life. Biochemistry. 2000;39(24):7153-7158.

10. Shoichet BK, Baase WA, Kuroki R, Matthews BW. A relationship between protein stability and protein function. Proc Natl Acad Sci. 1995;92(2):452-456. doi: 10.1073/pnas.92.2.452.

11. Zhang XJ, Baase WA, Matthews BW. Multiple alanine replacements within alpha-helix 126134 of T4 lysozyme have independent, additive effects on both structure and stability. Protein Sci. 1992; 1(6)761-776. doi: 10.1002/pro.5560010608.

12. Brown A, Robinson CJ, Gallagher JT, Blundell TL. Cooperative heparinmediated oligomerization of fibroblast growth factor-1 (FGF1) precedes recruitment of FGFR2 to ternary complexes. Biophys J. 2013; 104(8): 1720-1730. doi: 10.1016/j.bpj.2013.02.051.

13. Zakrzewska M, Krowarsch D, Wiedlocha A, Otlewski J. Design of fully active FGF-1 variants with increased stability. Protein Eng Des Sel. 2004;17(8):603-611. doi:10.1093/protein/gzh076.

14. Xia X, Babcock JP, Blaber SI, Harper KM, Blaber M. Pharmacokinetic Properties of 2ndGeneration Fibroblast Growth Factor-1 Mutants for Therapeutic Application. PLoS One. 2012;7(11). doi:10.1371/journal.pone.0048210.1.

15. Casu B, Haggi A, Torri G. Heparin-derived heparan sulphate mimics that modulate inflammation and cancer. Matrix Biol. 2010; 29(6):442-452. doi: 10.1016/j.matbio.2010.04.003.

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zmodyfikowana cząsteczka czynnika wzrostu fibroblastów-1 (FGF-1) obejmująca dwie części: zmodyfikowaną cytokinę FGF-1 i giętki linker na N-końcu tej cząsteczki, zawierająca sekwencję wybraną spośród SEQ ID NO 1 do 3.
2. 2. Cząsteczka według zastrz. 1, obejmująca 140 reszt aminokwasowych formy FGF-1 przedstawionych w SEQ ID NO: 1 jako L-FGF-WT, i linker.
3. 3. Cząsteczka według zastrz. 1 albo 2 zawierająca resztę histydynową zmutowaną do konsensusowej reszty tyrozyny w pozycji 21, jak przedstawiono w SEQ ID NO: 2 jako L-FGF-H21Y, i linker.
4. 4. Cząsteczka według dowolnego z zastrz. 1-3 zawierająca mutację H21Y, dwie mutacje stabilizujące końcowe beta-kartki - podstawienie reszty lizyny przez resztę waliny, podstawienie reszty proliny przez resztę waliny w pozycjach kolejno 12 i 134, podstawienie reszty cysteiny przez resztę waliny w pozycji 11, jak przedstawiono w SEQ ID NO: 3 jako L-FGFK12V/H21Y/C117V/P134/V, i linker.
5. 5. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca zmodyfikowaną cząsteczkę FGF-1 o sekwencji wybranej spośród SEQ ID NO: 1-3.
6. 6. Zmodyfikowana cząsteczka zdefiniowana w zastrz. 1-4 do zastosowania do stymulacji komórek responsywnych, w szczególności, fibroblastów, komórek śródbłonka i keratynocytów.
7. 7. Zmodyfikowana cząsteczka zdefiniowana w zastrz. 1 -4 do zastosowania do leczenia ran.
8. 8. Zmodyfikowana cząsteczka według zastrz. 6 albo 7, znamienna tym, że jest do zastosowania do indukowania reakcji gojenia podczas procedur endoskopowych, po biopsji oraz w trakcie operacji chirurgicznej.
9. 9. Zmodyfikowana cząsteczka według zastrz. 8, znamienna tym, że jest do zastosowania w powiązaniu z heparyną.
10. 10. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że składa się z farmaceutycznie akceptowalnego nośnika i modyfikowanej cząsteczki czynnika wzrostu fibroblastów-1 (FGF-1) określonej w zastrz. 1 -4 lub cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego tę cząsteczkę określonej w zastrz. 5.
11. 11. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że jest w formie plastra lub opatrunku stosowanego na ranę.
12. 12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10 albo 11, znamienna tym, że jest w formie kropli zakrapianych do oka i ucha w celu leczenia owrzodzeń.