JPH0240399A - 線維芽細胞増殖因子ムテインの複合体あるいは組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ
ｇｒｏｗｔｈ　　ｒａｃｔｏｒ、以下ＦＧＦと略称する
。）ムティンの安定化方法および安定なＦＧＦムティン
含有曳合体あるいは組成物およびこれらの製造法に関す
る。

従来の技肛 ＦＧＦは、当初ｌ３ＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３細胞などの線Ｒａ
ｔ芽細胞に対して強い増殖促進作用を示す因子として分
離された［ゴスボダ口ヴイッツ、ネイチャー　（ＮａＬ
ｕｒｅ）＋　２４９巻、１２３頁（１９７４年月。

現在では、ＦＧＦが、中胚葉山来のほとんどすべての細
胞に対して増殖促進作用を有することが知られている。

ＦＧＦは、その等電点に基づいて、塩基性ＦＧＦ（以下
、ｂＦＧＦと略称する。）お上び酸性ＦＧＦ（以下、ａ
ＰＧＦと略称する。）の２つに大別される。これらのＦ
ＧＦは、血管内皮細胞に対して強い増殖促進作用やプラ
スミノゲンアクヂベーター誘導作用を存するため、血管
新生促進剤、創傷治療薬、抗血栓薬、抗動脈硬化剤など
の予防治療薬としての用途が期待されている。

従来から、ＦＧＦは動物白米の臓器、たとえばウシ脳下
垂体、から単一にまで精製されていたが、その供給量に
は限度があり、また異種動物由来であるために抗原性が
懸念されるなどの問題点を有していた。最近、組換えＤ
ＮＡ技術を用いて、クローン化されたヒトＦＧＦ遺伝子
を微生物や動物細胞で発現させることにより、ＦＧＦを
大量に生産する方法が開発された（フエブス・レターズ
（Ｆ　Ｅ　Ｉ３　Ｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第２１３巻、
＋８９−１９４頁（１９８７年）：ヨーロッパ特許出願
公開第２３７．９６６号公報参照）。

さらに、ＦＧＦのアミノ酸配列を修飾することによって
、浸れた活性を存しあるいは安定性が向上したムティン
を生産する方法が開発された［日本特許出願第６３−５
０２４９号明細書、ヨーロッパ特許出願第８８１０３０
４７．２号明細書、バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・リサーチ・コミューＺケーションズ（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）第
１５１巻第７０！〜７０８頁（１９８８年）］。

発明が解決しようとずろ課題 ところが、ＦＧＦムティンは安定性が向上されてはいる
ものの、水溶液中で急速に失活することがあり、凍結乾
燥操作によっても容易にその生物活性が低下することが
ある。さらに、点滴静注など長時間かけてＦＧＦムティ
ンを投与する場合には、その間の力価低下が避けられな
いこともある。

ＦＧＦの失活がヘパリンなどのある種のグリコサミノグ
リカンの添加によって防止できることが報告されている
［ジャーナル・才ブ・セルラー・フィノオロジ−（Ｊ、
　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ＰｈｙｓｉｏｌｏｇＹ）　１２８
巻、４７５頁（１９８６年）］。

課題を解決するための手段 上記の事情に鑑み、本発明者らは鋭意研究を重ねたとこ
ろ、意外にらＦＧＦムティンの水溶液にグリコサミノグ
リカンを添加することにより、ＦＧＦムティンの安定性
が顕著に増大することを見い出し、これに仄づいてさら
に研究した結果、本発明を完成した。

本発明は、（１）、Ｆ’ＧＦムティンとグリコサミノグ
リカンとの複合体あるいはこれらを配合した組成物；（
２）、ＰＧＦムティンとグリコサミノグリカンとを水性
媒体中で接触させることによるＦ　Ｇ　Ｆムティンとグ
リコサミノグリカンとの複合体あるいはこれらを配合し
た組成物の製造法；および（３）、ＦＧＦムティンとグ
リコサミノグリカンとを水性媒体中で接触させることに
よるＦＧＦムティンの安定化方法である。

上記ＦＧＦとしては、塩基性のもの（以下、ｂＦＧＦと
略称することらある。）でもよく、酸性のもの（以下、
ａＦＧＦと略称することらある。）でもよい。

上記ＦＧＦは、哺乳動物由来のものが挙げられる。該哺
乳動物としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ。

ヒツジ、ウマなどが挙げられる。

該ＦＧＦとしては、脳や下垂体などの既にその存在が明
らかにされている各種臓器から抽出されるものが挙げら
れる。

本発明のムティンとしては、上記のＦＧＦのムティンが
挙げられる。

本発明で用いられるＦＧＦムティンとしては、たとえば
日本特許出願第６３−５０２４９号明細古、ヨーロッパ
特許出願第８８１０３０４７．２号明細書、バイオケミ
カル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ
ケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　　　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍ
ｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）第１５１巻第７０１〜７０８
頁（１９８８年）に記載のムティンが挙げられる。

たとえば、本発明におけるＦＧＦムティンとしては、本
来、元のペプチドあるいは蛋白質のアミノ酸配列が変異
したものであり、したがって該変異としては、アミノ酸
の付加、構成アミノ酸の欠損、他のアミノ酸への置換が
挙げられる。

該アミノ酸の付加としては、少なくともｌのアミノ酸が
付加しているものが挙げられる。

該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１側のＦＧ
Ｆ構成アミノ酸か欠損しているものが挙げられろ。

故地のアミノ酸への置換としては、少なくとも１個のＦ
ＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの
が挙げられる。

ＦＧＦに少なくとも１個のアミノ酸が付加しているムテ
ィンにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、ペプ
チドを発現する際に用いられろ開始コドンに基因するメ
チオニンや、シグナルペプチドは含まれないしのである
。

付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１個
であるが、ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。

さらに好ましくは、ＦＧＦと…同性（ホモロノー）が認
められており、同様の活性を示すタンパクのアミノ酸配
列の一部あるいはすべてが挙げられる。

ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が欠損し
ているムティンにおける欠損している構成アミノ酸の改
としては、ＦＧＦの有する特徴を失わない限り何個でも
よい。

該欠損している構成アミノ酸の例としては、ヒトｂＦＧ
Ｆのアミノ末端側１０残基：Ｖｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ　
−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｓｐ　−
Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｓ　ｅｒ。

ヒトｂＦＧＦのアミノ末端側１４残基：ＭｅＬ−Ｐｒｏ
−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ΔｓｐＧ　ｌｙ　
−Ｇ　ｌｙ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　！ａ　−
Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｒｏ。

ヒトｂＦＧＦのアミノ末端側４１残基。

ヒトｂＦＧＦのカルボキシル末端側６１残基：などが挙
げられろ。

ＦＧＦの少なくとも１個のＦ　Ｇ　Ｆ　＋Ｍ構成アミノ
酸別のアミノ酸で置換されているムティンにおける置換
される前の少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸の数と
しては、ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。

置換される而の構成アミノ酸の例としては、システィン
。システィン以外のものが挙げられる。

システィンが特に好ましい。置換される前の構成アミノ
酸としてシスティン以外のらのとしては、アスパラギン
酸、アルギニン、グリシン、バリンなどが挙げられる。

置換される前の構成アミノ酸がシスティンである場合に
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリシン、バリン、アラニン、ロインン、イソロ
イシン、チロノン。フェニルアラニン、ヒスチジン、ト
リプトファン、セリンスレオニン、メチオニンなどが挙
げられろ。特に、セリンスレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がシスティン以外のもので
ある場合には、置換された別のアミノ酸としては、たと
えば、アミノ酸の親水性、疎水性あるいは電荷の点で、
置換される前のアミノ酸とは異なる性質を６つものを選
ぶ。具体的には置換される萌のアミノ酸がアスパラギン
酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてアスパ
ラギン。

スレオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギニンな
どが挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニンが好
ましい。

置換される曲のアミノ酸がアルギニンの場合には置換さ
れたあとのアミノ酸としてグルタミン。

スレオニン、ロインン、フェニルアラニン、アスパラギ
ン酸が挙げられるが、特にグルタミンが好ましい。

置換される１ｒｊの構成アミノ酸がグリシンである場合
には、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン
、ロインン、フェニルアラニン、セリン。

グルタミン酸、アルギニンなどが挙げられ、特にスレオ
ニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニンアラニ
ン、ロイシン１．システィン、グルタミン、アルギニン
、アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニンが好
ましい。

置換されるＭの構成アミノ酸がバリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、゛セリン、ロイシ
ン、プロリン、グリシン、リジン、アスパラギン酸など
が挙げられ、特にセリンが好ましい。

置換される前の元の構成アミノ酸としては、アスパラギ
ン酸、アルギニン、グリシン、セリン、バリンが好まし
い。

置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン、グ
ルタミン、アルギニン、スレオニン、メチオニン、セリ
ン、ロイシンが好ましい。

置換されたムティンの最ら好ましいものとしては、構成
アミノ酸であるシスティンがセリンに置換されたものが
最も好ましい。

上記の置換においては、２以上の置換を同時に行なって
もよい。特に、２または３個の構成アミノ酸が置換され
るのが好ましい。

該ムティンは、上記した付加、欠損、置換の２つまたは
３つが組み合わさったものでもよい。

該ムティンを製造するためには、特定部位指向性液シＩ
ａ誘発技術（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｍｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓ）が採用される。該技術は周知であり、
アール・エフ・レイサー（１，ａＬｈｅｒ、　Ｒ，Ｆ、
　）及びジェイ・ピー・レコック（Ｉ、ｅｃｏｑ、　Ｊ
、　Ｐ、　）、ジエネティック・エンジニアリング（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミ
ツクブレス社（１９８３年）第３１−５０頁、に示され
ている。オリゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエ
ム・スミス（Ｓｍｉｔｈ、　　Ｍ、　）及びニス・ギラ
ム（Ｇｉｌｌａｍ、　Ｓ、）、ノエネティック・エンジ
ニアリング・原理と方法、プレナムプレス社（１９８１
年）３巻　ｌ−３２頁に示されている。

該ムティンをコードする構造遺伝子を製造するためには
、たとえば、 （ａ）ＦＯＰの構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖ＤＮ
Ａを突然変異株オリゴヌクレオチドプライマーと雑種形
成させる（この１本鎖で代替えすべきシスティン用コド
ン、又は場合によりこのコドンと対合をつくるアンチセ
ンス・トリプレットを包含する領域に対して上記プライ
マーは相捕的なものである。但し、当該コドンの他のア
ミノ酸暗号化用コドン、又は場合によりアンチセンス・
トリプレットとの不一致はこの限りでない。）、（ｂ）
ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、突然
変異性へテロ二量体（ｈｃｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）を形
成さＵ゛る、及び （ｃ）この突然変異性へテロ二量体を複製する。

次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮ
Ａを単離し、プラスミドへ組み込む。

このようにして得られたプラスミドで適当な宿主を形質
転換し、得られた形質転換体を培地に培養することによ
り、ムティンを製造することができろ。

グリコサミノグリカンは、ムコ多糖類とも呼ばれる多糖
の一つであり、二糖類がくりかえし反復して結合した分
岐のない多糖鎖から構成される。

二つの糖残基のうち一つが常にアミノ糖（Ｎ−アセチル
−Ｄ−グリコサミンまたはＮ−アセチルＤ−ガラクトサ
ミン）であることが特徴である。

グリコサミノグリカンは通常糖残基の多くに硫酸基また
はカルボキシル基もくしはその両方を有している。

本発明で用いられるグリコサミノグリカンとしては、上
記の特徴を備えたグリコサミノグリカンならばいずれで
も良いが、くりかえし三糖類の一方がＤ−グルクロン酸
、■７−イズロン酸、もしくはＤ−ガラクトースからな
り、もう一方がＮ−アセチル−Ｄ−グリコサミンもしく
はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンからなるものが望
ましい。これらの糖のほかに微１のＤ−ガラクトース、
Ｄキンロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース、Ｄガラ
クトサミンなどを含有しても良い。また、三糖単位あた
り約０．１〜３．０個の硫酸基を有しているものが望ま
しく、分子量は、約１，０００〜＋００．０００．好ま
しくは約２，０００〜５０゜０００の範囲に含まれる。

該グリコサミノグリカンの具体例としては、たとえばヘ
パリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸などの各種臓器
から抽出、精製されるものが挙げられる。さらに、過酸
化水素等を用いて低分子化した低分子ヘパリン、低分子
ヘパラン硫酸などが挙げられる。

本発明で用いられるグリコサミノグリカンは、遊離のも
のでも良く、また塩の形のものでも良い。

該塩としては、たとえば、ナトリウム塩、カリウム塩、
アンモニウム塩、トリメデルアンモニウム塩などが挙げ
られる。

また、ＦＧＦムティンに水媒体中で接触させる際に、グ
リコサミノグリカンの遊離のものを加え、次に適当量の
アルカリまたは酸を加えて所望のｐＨにしてもよい。ア
ルカリを加えることにより、グリコサミノグリカンは、
水媒体中で塩の形となっていて６よく、遊離のらのと塩
の形のものとが混在していてもよい。

本発明のＦＧＦムティンをグリコサミノグリカンに水媒
体中で接触させる際に、さらに二または三塩基性カルボ
ン酸の存在下に行なうと、ＦＧＦムティンがより安定化
されるので有利である。

該二塩基性カルボン酸としては、たとえば酒石酸、マレ
イン酸、リンゴ酸、フマル酸などが挙げられる。

該三塩基性カルボン酸としては、たとえばクエン酸、イ
ソクエン酸などが挙げられる。

上記カルボン酸は遊離のものでら良くまた塩の形のもの
でもよい。該塩としてはたとえばナトリウム塩、カリウ
ム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。

また、水媒体にカルボン酸の遊離のものを加え、次いで
適当量のアルカリまたは酸を加えて所望の１）　Ｈにし
てらよい。アルカリを加えることにより、水媒体中で、
カルボン酸は、塩の形となっていてもよく、遊離のもの
と塩の形のものが混在していてもよい。

ＦＧＦムティンをグリコサミノグリカンに水媒体中で接
触さ仕る際に、グリコサミノグリカンの使用量は、ＦＧ
Ｆムティン１モルに対し、グリコサミノグリカンが約０
．１−１００モル、さらに好ましくは約０．５〜４モル
の範囲で加えることが好ましい。

水媒体中におけるグリコサミノグリカンの濃度は、約０
．０００５〜５１／Ｖ％が好ましく、さらに、約０．０
１〜ＩＷ／Ｖ％が好ましい。

水媒体中におけるＦＧＦムティンの濃度は、約０．００
０５〜５１／Ｖ％が好ましく、サラニ約０゜０ｌ−ＩＩ
／Ｖ％が好ましい。

該カルボン酸の使用量としては、水媒体中の濃度が約１
ｍＭ〜ＩＭが好ましく、さらに約１０ｍＭ〜５００ｍＭ
が好ましい。

水媒体中で接触させるには、ＦＧＦムティン。

グリコサミノグリカン、さらにカルボン酸を水媒体中で
単に混合するだけで目的を達し得る。

該水媒体としては、注射用蒸留水を用いるのが好ましい
。

混合する際の条件としては、ＦＧＦムティン。

グリコサミノグリカン、さらにカルボン酸のそれぞれを
水溶液として混合しても良く、また固体のまま添加して
水媒体中で溶液と成しても良い。混合の際の温度は約０
〜４０℃、　ｐＨは約３〜ＩＯの範囲にあることが好ま
しく、さらに約５〜９の範囲にあることが好ましい。混
合に要する時間は通常約１〜３０分である。

上記方法により、安定化されたＦＧＦムティンの組成物
が得られる。

該安定化されたＦＧＦムティン組成物中では、ＰＧＦム
ティンとグリコサミノグリカンとは一定の割合で結合し
複合体を形成して存在していると考えられる。したがっ
て、所望により安定化されたＦＧＦムティン複合体を単
離することらできる。

単離、採取法としては、たとえば、セファデックスやＴ
ＳＫゲルなどを用いるゲルろ適法や、ＤＦＡＥ−または
ＣＭ−）ヨバールなどを用いるイオン交換クロマトグラ
フィー、等電点分画法などが挙げられる。従って、目的
に応じてＦＧＦムティン複合体を単離、採取しても良い
し、単離、採取せずにそのまま組成物として用いても良
い。

該複合体は、ＦＧＦムティンとグリコサミノグリカンと
が約ｌ・０．５〜約１：５で複合体を形成したものであ
る。なお、該複合体はたとえば１ＭＮａＣＩ２などの高
濃度の塩類の存在下で解離するので、単離操作中は高い
イオン強度を有する溶媒の使用を避ける必要がある。

このようにして、安定化されたＦＧＦムティンの複合体
あるいは組成物が得られる。すなわち、後述の実施例に
より示されるように、本発明の複合体あ□るいは組成物
は、熱、ｐｉ−１，プロテアーゼに対して安定である。

特に、本発明の複合体あるいは組成物は、中性条件下に
おいてはもとより、酸性およびアルカリ性条件下におい
てら安定である。

該安定化されたＦＧＦムティン複合体もしくは安定化さ
れたＦＯＰムティン組成物は、そのまま、または他の薬
理学的に許容されうる担体、賦形剤。

希釈剤とともに医薬組成物（例、注射剤１錠剤、カプセ
ル剤、液剤、軟膏）として、温血動物（例、ヒト。

マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、犬、ネコ）に対
して非経口的または経口的に安全に投与することができ
ろ。

該製剤としては、たとえば、注射剤、注射投与に用いる
ための溶液、凍結品もしくは凍結乾燥品などの形態にす
るのが好ましい。

医薬組成物としての製剤化にあたっては、公知の製剤学
的製造法に準じ、所望により製剤学的に許容され得ろ添
加剤、希釈剤、賦形剤などを用いる。

たとえば、注射用水溶液剤とする場合は、水性溶剤（例
、蒸留水）、水溶性溶剤（例、生理的食塩水。

リンゲル液）、油性溶剤（例、ゴマ油、オリーブ油）等
の溶剤、または所望により溶解補助剤（例、サリヂル酸
ナトリウム、酢酸ナトリウム）、緩衝剤（例、クエン酸
ナトリウム、グリセリン）２等張化剤（例、ブドウ糖、
転化糖）、安定剤（例、ヒト血清アルブミン、ポリエチ
レングリコール）、保存剤（例、ベンジルアルコール、
フェノール）、無痛化剤（例、塩化ベンザルコニウム、
塩酸ブロカイン）等の添加剤を用いて、常套手段により
製造される。

また、たとえば固型状注射用製剤とするには、希釈剤（
例、蒸留水、生理的食塩水、ブドウ糖）、賦形剤（例、
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）アルギン酸ナト
リウム）、保存剤（例、ベンジルアルコール、塩化ベン
ザルコニウム、フェノール）、無痛化剤（ブドウ糖、グ
ルコン酸カルシウム、塩酸プロ力イン）等を混合し、常
套手段により、固型状注射用製剤に製造することができ
る。

さらに、製剤化にあたっては、ブドウ糖などの単糖類や
、アミノ酸、各種塩類、ヒト血清アルブミンなどを添加
しても良く、その他に等張化剤、ｐｌ［調節剤、無痛化
剤、防腐剤などを加えて安定で仔効なＦＧＦムティン製
剤をＦＩ製することができる。

上記の方法により得られるＦＧＦムティン複合体もしく
は組成物は線維芽細胞の増殖を促進させる作用等を有し
、安定性が高く、毒性は低いので、火傷、創傷、術後組
織などの治癒促進剤、あるいは血管新生作用による血栓
症や動脈便化症などの治療薬として用いることができる
。また、細胞培養を促進させるための試薬として用いる
ことができる。

本発明の方法により得られたＦＧＦムティン複合体らし
くは組成物を上記した医薬として用いる場合には、たと
えば上記した温血動物に、投与ルート、症状などを考慮
して、ＰＧＰムティンの量として１日量約１ｎｇないし
１００μｇ／　ｋｇの中から適当量を選んで投与される
。

また、本発明方法により得られたＦＧＦムティン曳合体
らしくは組成物を細胞培養を促進させるための試薬とし
て用いる場合、ＦＧＦムティンの量として培地ＩＱあた
り約０．０１−１０μｇ１　さらに好ましくは約０．１
−１０μｇとなるように培地に加えることが好ましい。

このようにして、ＦＧＦムティンにグリコサミノグリカ
ンを水媒体中で接触させることにより、ＦＧＦムティン
を安定化することができ、また安定化されたＦＧＦムテ
ィン複合体を得ることができるので、ＦＧＦムティンを
安定な作用を持続させたまま、で製剤化できる。

後述の参吋例１において用いられたプラスミドｐＴＢｅ
６９を保持する形質転換体エンエリキア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｊｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｋ　１２　　ＭＭ　２
９４　／ｐＴＢ６６９（ＩＦＯ１４５３２，ＦＥＲＭＢ
Ｐ−１２８１）は、ヨーロッパ特許出願公開第２３７．
９６６号公報の実施例３に記載の方法で製造されたもの
である。

後述の実施例において用いられたりコンビナンドヒト塩
基性１？ＧＦムテインＣ９２３（以下、ｒｈｂＦＧＦム
ティンＣ２３と略称することもある。）は、ロ本特許出
願第６３〜５０２４９号明細書ヨーロッパ特許出願第８
８１０３０４７．２号明細吉、バイオケミカル・アンド
・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ
第１５１巻第７０１〜７０８頁（１９８８年）に記載の
方法で製造される。すなわち、該ｒｈｂＰ　Ｇ　Ｆムテ
ィンｃｓ２３は、形質転換体エノエリヒア・コリＭ　Ｍ
　２９４／１）Ｔｒ３７６２（ＩＦＯ１４６１３，ＦＥ
ＲＭ［３Ｐ−１６４５）を用いて、後述の参考例１〜３
（上述の文献等に記載の方法と同様の方法である。、）
に記載の方法で製造、精製されたものである。

上述の形質転換体Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＫＩ２　ＭＭ２９４
／１）ＴＢ６６９（後述の参考例１において用いられた
プラスミドｐＴＢ６６９を保持する。）、およびＥ、　
ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＴＢ　７６２（後述の参η例
３参照）は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）および通商
産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲｌ）に寄
託されている。それらの受託番号および受託口を次の表
Ｉに示す。なお、ＦＲＩへの寄託については、当初国内
寄託がなされＦＥＲＭＰ番号で示される受託番号が付さ
れ、該寄託はブダペスト条約に基づく寄託に切換えられ
て、ＦＥｒｔＭ　　ＢＰ層番号示される受託番号が付さ
れ、同研究所（ＦＲＩ）に保管されている。

（以下余白） なお、以下の参考例におけるヒトｂＦＧＦのアミノ酸配
列のアミノ酸の番号は、第１図に示されたヒトｂＦＧＦ
のアミノ酸配列のＮ末端のＭｅｔを第１番目として数え
るものとする。

参考例１　（ムティンをコードする塩基配列を有する組
換えＤＮＡの製造） （１）、ヒトｂＦＧＦ遺伝子のＭＩ３ベクターのクロー
ニング： ヨーロッパ特許出願公開第２３７，９６６号公報明細書
の実施例３で得られたプラスミドｐＴ８６６９を制限酵
素ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨｌで消化さぜた。ファージベ
クターＭＩ３ｍｐ８（クレイ・メツノング（Ｊ、　Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ）、メソッズ・イン・エンジ−モロジー、１
０１．２０〜７８（１９８３））復製型（ＲＦ）ＤＮＡ
を制限酵素Ｅｃｏｎｌ及びＢａｍｆ（Ｉで消化させ、予
めＥｃｏＲ［及びＢａｍ１−１１で消化させてあったｐ
ＴＢ６６９由来のヒトｂＦＧＦ　　ＤＮＡ断片と混合し
た。次に混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結させ、連結
ＤＮＡを大腸菌−ＪＭ１０５菌株の被感染能力のある菌
体中へ形質転換させ、Ｘｇａｌを指示秤とするプレート
上に播き〔クレイ・メッシング等、ニュークレイツク・
アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　
　Ｒｅｓ、　）　（１９８１）９）Ｊ３０９−３２１頁
〕、組換えファージを含有するプラーク（白いプラーク
）を袷い上げ、組み換え部分の塩基配列をジテオキンヌ
クレオチド合成鎖停止法［Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　　ら
、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）　９　、３０９（＋９８
１）］によって決定して、ヒトｂＦＧＦＤＮへが正確に
挿入されていることを確認した。

このＭ１３−ＰＯツクーンから１本鎖ファージＤＮＡを
精製し、合成オリゴヌクレオチドを使用する特定部位指
向性変異誘発の鋳型として用いた。

（２）サイト特異的突然変異誘発 ０　、１　ｍＭアデノシン三燐酸（ＡＴＰ）、５０ｍＭ
ヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリス−ＩＩ　
Ｃ＋）ｐｔｒ　８　、　Ｏｌｌ　０　ｍＭ　　ＭｇＣＩ
２．５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びＴ４キナ
ーゼ９単位の存在下に、５０μρ中で合成オリゴヌクレ
オチド ５’＞ＣＧＴ　　ＴＣＴ　　ＴＧＣＴＧＴ　　ＡＧＡＧ
ＣＣＧＣＴ　　＜３’ ＣＣｙｓ２（ｉをＳｅｒに変更するためのプライマー（
制限酵素Ｒｓａｌの認識配列が消失する。）〕４０ピコ
モルをＴ４キナーゼにより３７℃で１時間処理した。５
０ｍＭ　　ＮａＣ１，Ｉ　、ＯｍＭ）リス−１１ＣＩ。

ｐｌ−１８，０、Ｉ　ＯｍＭ　　ＭｇＣＩｔ及びｌ０ｍ
Ｍ　　β−メルカプトエタノールを含有する混合物５０
μＱ中で、このキナーゼ処理されたプライマー（１２ピ
コモル）を６７℃で５分、及び４２℃で２５分加熱する
ことによって１本鎖（ｓｓ）Ｍ　ｌ　３−　Ｐ　０ＤＮ
Ａ５μｇに雑＋ｉ形成させた。アニーリングした混合物
を次に水上で冷却し、０　、５　ｍＭ各デオキノヌクレ
オチド三燐酸（ｄＮＴＰ）、８０ｍＭトリス１−Ｉ　Ｃ
１％ｐＨ７，４，８ｍＭ　　ＭｇＣＩｔ、１００ｍＭＮ
ａＣｌＳＤＮＡポリメラーゼｌ　　Ｋ　ｌｅｎｏｗ断片
９単位、０　、５　ｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ４ＤＮＡリカ
ーゼ２単位を含仔する反応混合物５０μＱに添加し、３
７℃で３時間及び２５℃で２時間反応し、０゜２ｍＭ　
　ＥＤＴＡ２μＱを加え反応を停止した。被感染能力の
あるＪＭ１０５細胞の形質転換に使用し、閑を一夜成育
させ、培養基上澄液から５ｓＤＮΔを単離した。この５
ｓＤＮＡをブライマー伸長の第二サイクルに鋳型として
使用し、ゲル精製されたＲ　Ｆ　ｙＭＤ　Ｎ　Ａを被感
染能力のあるＪＭ１０５細胞中へ形質転換さ仕、寒天プ
レート上に播き、−夜培養するとファージプラークが得
られた。

（３）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドブライマーは、システィン７０を暗号づ
けるものからセリンを暗号づけるもので ５′　〉ＡΔＣＧＡＴ　　ＴＡＧ　　　ＣＧＣＴＣＡ　
　ＣＴＣＣ＜３’ とする。（制限酵素ＨａｅＩＩの認識配列か生成される
）（４）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドブライマーは、システィン８８を暗号づ
けるらのからセリンを暗号づけろもので ５’　　＞ＧＴＡ　　ΔＣＡ　　ＧＡＣＴＴＡ　　　Ｇ
ＡＡ　　ＧＣＴ　　ＡＧＴ　　＜３’ とする。（制限酵素Ａｌｕｌの認識配列が生成される） （５）特定部位指向性変異誘発； 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドブライマーは、システィン９３を暗号づ
けるものからセリンを暗号づけるもので ５’＞ＴＣＧ　　ＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＡＡ　　　Ｇ
ＡＣＴＣＡ　　ＴＣＣ＜３’ とする。（制限酵素Ｉ目ｎｒｌの認識配列が生成される
） （６）突然変異誘発原化されたプラークのふるい分けと
同定； 突然変異させたＭ２Ｓ−ＰＯプラークの入ったプレート
類（上記（＋）項）並びに突然変異しないＭ２Ｓ−ＰＯ
ファージプラークの入った２枚のプレートを４℃に冷却
し、各プレートからのプラークを２枚のニトロセルロー
ス円形フィルター上へ、第一フィルターの場合には乾燥
フィルターを寒天プレート上へ５分重ね、第二フィルタ
ーの場合は１５分重ねて移した。次に０，２Ｎ　　Ｎａ
ＯＨ。

１．５Ｍ　　ＮａＣｌ及び０．２％トリトンＸ−１００
に５分浸した厚手のろ紙上へフィルター類を置き、次に
０　、５　Ｍ　トリス−ｔｌ　ＣＩ、ｐｔｌ　７　、５
、及び１．５Ｍ　ＮａＣ１に浸したろ紙上へ更に５分重
ねて中和した。フィルター類を同様なやり方で２ＸＳＳ
Ｃ（標準クエン酸塩）に浸したフィルター上で２回洗い
、乾燥し、真空乾燥炉内で８０℃で２時間乾燥させた。

重複フィルター類をフィルター当たり１０ｄのＤＮＡ雑
種形成緩衝液（５Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ）、ｐＨ７，０，４ｘ
デンハード液（ポリビニルピロリドン。

フィコール及び牛血清アルブミン、１×＝各０．０２％
）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）。

５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０及び１００
μｇ　／　ｒｎｆｌの、変性サケ精子ＤＮＡにより、５
５℃で４時間、事前雑種形成させた。オリゴヌクレオヂ
ドブライマーをｌ　Ｏ５ｃｐｍ／　ｒｎｌｌ、に４２℃
で２４時間雑種形成させた。０．１％ＳＤＳと減少量の
ＳＳＣを含有する洗浄用緩衝液中でそれぞれ３０分、５
０℃でフィルター類を洗った。フィルター類を、初めに
’２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃを含んだ緩衝液で洗い、突然変異
化されないＭ２Ｓ−ＰＯプラークを含有する対照フィル
ターはガイガー計数管を用いて放射能の存在について検
査した。５ｓｃａ度を段階的に低下させ、未突然変異Ｍ
＋３−ＰＯプラータをらつ対照フィルター上に検出可能
な放射能が残らなくなるまでフィルター類を洗った。Ｓ
ＳＣの使用最低濃度は０，１　ｘＳＳＣであった。フィ
ルターを空気乾燥し、−７０℃で２〜３日露光してオー
トラジオグラフをとった。突然変異したＭ２Ｓ−ＰＯの
プラーク１００００個と突然変異されない対照プラーク
１００個をキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプロー
ブによってふるい分けた。対照プラークではプローブと
雑種形成したものか全く存在せず、一方突然変異された
Ｍ２Ｓ−ＰＯプラーク３〜ｌＯ個がプローブと雑種を形
成した。

突然変異ＭＩ３−ＰＯプラークの１個を取り上げ、ＪＭ
Ｉ０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮＡをつく
り、菌体ペレットから２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡをつくった
。適当な才１１ゴヌクレオヂドプライマーと５ｓＤＮＡ
を使用して塩基配列を解析した。

その結果、Ｔ　Ｇ　Ｃ（Ｃｙｓ２６　）コドンがＴＣＴ
（Ｓａｒ）コドンへ変換されたこと、ＴＧＴ（Ｃｙｓ７
０）コドンがＡｃｃ（Ｓｅｔ）コドンへ変換されたこと
、ＴＧＴ（Ｃｙｓ８８）コドンが、Ｔ　ＣＴ　（Ｓ　ｅ
ｒ）コドンへ変換されたこと、ＴＧ’ｒ（Ｃｙｓ９３）
：］　トンがＴＣＴ（Ｓｅｔ）コドンへ変換されたこと
がそれぞれ確認された。

変異したＭ＋３−ＰＯファーノのうち、コドンＣｙｓ−
２６がＳｅｒになったものをＭＩ３−Ｐｉ。

コドンＣｙｓ−７０がＳｅｔになったものをＭ２Ｓ−Ｐ
２．コドンＣｙｓ−８８がＳｅｔになったものをＭ２Ｓ
−Ｐ３．コドンＣｙｓ−９３がＳｅｔになったものをＭ
２Ｓ−Ｐ４とした。

参考例２　（突然変異誘発原化されたプラークのふるい
分けと同定） 参考例１で得られた突然変異させたＭｌ３−Ｐ２ファー
ジプラークの入ったプレート類並びに参考例！で得られ
た突然変異しないＭｌ３−Ｐ２ファージプラークの入っ
た２枚のプレートを４℃に冷却し、各プレートからのプ
ラークを２枚のニトロセルロース円形フィルター上へ、
第一フィルターの場合には乾燥フィルターを寒天プレー
ト上へ５分重ね、第二フィルターの場合は１５分重ねて
移した。次に０．２Ｎ　　Ｎａ０Ｉｌ　　ｌ　、５Ｍ　
　ＮａＣ１及び０．２％トリトンＸ−１００に５分浸し
た厚手のろ紙上へフィルター類を置き、次に０．５Ｍト
リス−Ｉ　Ｃ１，１）Ｉ−１７、５、及び１．５Ｍ　　
ＮａＣ１に浸したろ紙上へ更に５分重ねて中和した。フ
ィルター類を同様なやり方で２ＸＳＳＣ（＋ｆｆｉ準ク
エツクエン酸塩したフィルター上で２回洗い、乾燥し、
真空乾燥炉内で８０℃で２時間乾燥させた。

重複フィルター類をフィルター当たりＩＯｄのＤＮＡ雑
種形成緩衝液（５ｘＳＳＣ）、ｐＨ７，０，４ｘデンハ
ード液（ポリビニルピロリドン、フィコール及び牛血清
アルブミン、ｌ×＝各０．０２％）。

０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｍＭ
燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０及び　１００μｇ／
７Ｉ７の、変性サケ精子ＤＮＡにより、５５℃で４時間
、平面雑種形成させた。オリゴヌクレオチドブライマー
をｌ　０５ｃｐｍ／１ｎｌに４２℃で２４時間雑種形成
させた。０．１％ＳＤＳと減少量のＳＳＣを含存する洗
浄用緩衝液中でそれぞれ３０分、５０℃でフィルター類
を洗った。フィルター類を、初めに２ＸＳＳＣを含んだ
緩衝液で洗い、突然変異化されないＭｌ３−Ｐ２プラー
クを含有する対照フィルターはガイガー計数管を用いて
放射能の存在について検査した。ＳＳＣ濃度を段階的に
低下さけ、未突然変異Ｍ　Ｉ　３−　Ｐ　２プラークを
６つ対照フィルター上に検出可能な放射能が残らなくな
るまでフィルター類を洗った。ＳＳＣの使用最低濃度は
０．１ＸＳＳＣであった。フィルターを空気乾燥し、−
７０℃で２〜３日露光してオートラジオグラフをとった
。突然変異したＭｌ３−Ｐ２のプラークｔｏｏｏｏ個と
突然変異されない対照プラーク１００個をキナーゼ処理
したオリゴヌクレオチドプローブによってふるい分けた
。対照プラークではプローブと雑種形成したものが全く
存在せず、一方突然変異されたＭｌ３−Ｐ２プラーク３
〜ｌＯ個がプローブと雑種を形成した。

突然変異ＭＩ３−ｒ’２プラークの１個を取り上げ、Ｊ
　Ｍ　ｔ　Ｏ５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮ
Ａをつくり、菌体ベレットから２本ｆｆ１（ｄｓ）ＤＮ
Ａをつくった。適当なオリゴヌクレオチドプライマーと
ｓ　Ｓ　Ｄ　Ｎ　Ａを使用して塩基配列を解析した。

その結果、ＴＧＣ（Ｃｙｓ２６）コドンがＴＣＴ（Ｓｅ
ｒ）コドンへ変換されたこと、’ｒｃ’ｒ（ｃｙｓ８８
）コドンがＴＣＴ（Ｓｅｔ）コドンへ変換されたこと、
ＴＧＴ（Ｃｙｓ９３）コドンがＴＣＴ（Ｓｅｔ）コドン
へ変換されたことがそれぞれ確認された。

変異したＭｌ３−Ｐ２ファージのうち、コドンＣｙｓ−
２６および−７０がＳｅｔになったものをＭｌ　３−Ｐ
　１２．コドンＣｙＳ−７０および−８８がＳｅｔにな
ったものをＭｌ３−Ｐ２３．コドンＣｙｓ−７０および
−９３がＳｅｔになったものをＭｌ３−　Ｉ）　２４と
した。

参考例３　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺伝
子の大腸菌における発現） 前記参考例２で得られたＭｌ３−Ｐ２３のレプリカティ
ブフオーム（ＲＦ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびｐｓＬ
＋で切断し、ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする領域
を含む約０．５Ｋｂ　　ＤＮＡ断片を得た。

一方、ｔｒｐプロモーターを何するプラスミドｐｔｒｐ
７８１　（Ｋｕｒｏｋａｗａ、　Ｔ　、　らニュークレ
イツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｃｉｃ　　Ａｃ
１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）１１、　３０７７−３０８５（
１９８３））ＤＮＡをＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉで切断
して、ｔｒｐプロモーター、テトラサイタリン耐性遺伝
子およびプラスミド複製開始部位を含む約３．２Ｋｂ　
　ＤＮＡ断片を分離した。ヒトｂＦ’ＧＦのムティンを
コードする遺伝子領域を含む前記０．５Ｋｂ　　Ｅｃｏ
ＲＩ　−ＰｓｔＩ　　ＤＮＡ断片と、この３．２Ｋｂ　
　ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により結合さ仕
ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴＢ７６２
を構築した。

このプラスミドｐＴｒ３７６２を用いて大腸菌ＭＭ２９
４を形質転換させることによりムティンＣ２３をコード
する遺伝子を含存するプラスミド１）ｉ’１３７６２を
含む閑Ｋ　Ｅ　５ｃｈａｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ　１Ｍ
Ｍ２９４／Ｉ）ＴＥ１０１（ＩＦＯ１４６１３゜ＦＥｆ
ｌＭ　　ＵＰ−１６４５）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 萌記形質転換体を、それぞれ１％グルコース。

０．４％カザミノ酸、８μｇ／ｄテトラサイクリンを含
むＭ９培地で培養し、Ｋ　１ｅｆｔ値が約２００の時点
で、３βインドリ−ルアクリル酸を２５μｇ／旙になる
ように添加し、さらに４時間培養した。

培養後、菌体を集め、１／２０量の２０ｍＭＴｒｉｓ・
ＭＣＩ、　ｐｔｒ　　７．６．　　ｌ　０％シュークロ
ース溶液に懸澗した。この懸濁液にフェニルメヂルスル
ホニルフルオライドでＰ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　）をＩｍＭＥＤ
ＴＡをＩ　ＯｍＭ、ＮａＣｌを０．１Ｍ、スペルミジン
塩酸塩を１０ｍＭ、リゾチームを１００μｇ／ｄ（いず
れら最終濃度）となるように添加し、０℃。

４５分放置後、３０秒間超音波処理を加えた。

この溶液を１８００　Ｏｒｐｍ（サーバル遠心機、５Ｓ
３４０−ター）３０分間遠心して上清を得、菌体抽出液
とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 マウスＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３細胞を５％仔牛血清を含むＤ
ＭＥＭ培地に浮遊し、タンク９６六マイクロタイタープ
レート（平底）に１穴あたり０，２ｄ（２ＸｌＯ’個）
ずつ播種して、培養し、翌日。

０．５％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地に交換した。

３０間培養したのち０５％ｌ３ＳＡを含むＤＭＥ培地で
５倍ずつ段階的に希釈した菌体抽出液を１穴あたり１０
μｇずつ添加して、培養し、２０時間後に’Ｉ−１−Ｔ
ｄｒ（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、　０　、５　ｍＣｉ／ｒｎＩ
。

ＲＣＣＡ　ｍｅｒｓｈａｍ）を各式に２ｔｔＱずつ加え
た。６時間後に細胞を０．２％トリプシン−〇、０２％
ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）処理ではがし、
タイターチックセルハーベスタ−を用いて、グラスフィ
ルター上に細胞を捕集し細胞に取り込まれた’Ｉ（−Ｔ
ｄｒｆｉをシンチレーションカウンターにて測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＴＢ　７６
２の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの７０位および８８位の
Ｃｙｓがそれぞれ５ｅｒｆ、：置換されたｒｈｂ　ＦＧ
ＦムティンＣ９２３が得られた。

（４）上記（３）で得られた抽出液２５Ｐｎ１．（培養
液５００ｄより調製）を２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
ｐ［−１７，４，０，２Ｍ　ＮａＣ１溶液で平衡化した
ＤＥＡＥセルロース（ＤＥ５２．ワットマン社、英国）
カラム（径２ｘｌＯｃｍ）に通し、抽出液中の核酸成分
を除去した。カラムからの素通り液および２０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，４，０，２Ｍ　ＮａＣ１溶液
でのカラム洗液を合わせて集めた（Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ素通
り画分６０ｄ）。

この両分をヘパリンカラムＳ　ｈｏｄｅｘ　Ａ　Ｆ　−
ｐａｋＨＲ−８９４（８ｍｍ［ＤＸ５ｃｍ、昭和電工製
）を装備した高速液体クロマトグラフィー装置（ギルソ
ン社、フランス）にかけた。カラムを、２０１１１ＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐＩ（７，４溶液１次いで２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ　　ｐｌ［７，４，０，５Ｍ　Ｎａ
Ｃｌ溶液で洗った後、２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　
　ｐＨ７，４、バッファー中、０．５Ｍから２ＭのＮａ
Ｃ１の直線勾配溶出（ｌｉｎｅａｒ　　ｇｒａｄｉｃｎ
ｔ　　ｅｌｕｔｉｏｎ、　　６（Ｌ＋４．流速１．０ｄ
／ｍ１ｎ）を行った。

溶出時間１５〜２５分の間に溶出されたピーク画分がｒ
ｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ９２３を含むことが分かった
ので、この両分を採取した。宝酒造株式会社製の牛脳由
来Ｆ’ＣＦ（純度９５％以上）のＰＧＦ活性を基章とす
る比活性は、ｌ　、　ｌ　ｍｇ　−ｐｒｏｔｅｉｎＦ　
Ｇ　Ｆ　／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであった。

参考例４　（内皮細胞を用いるヒトｂＦＧＦの活性測定
法） 後述の実施例におけるＦＧＦ活性の測定は、次に示す方
法によって行なった。

＋θ％仔牛血清を含むＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地で２倍ずつ段
階的に希釈した試料をヌンク社製９６穴マイクロタイタ
ープレート（平底）に１穴あたり５０μり添加したのち
、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ
）から購入した牛脂児心臓内皮細胞（ＣＲＬ　　１３９
５）を１穴あたり５０μｌ２（２ＸＩＯ’個）ずつ播種
し、３日間培養した。その後、ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍ
　Ｐ　Ｂ　Ｓ　、シグマ社）を各式に２０μρずつ加え
た。４，５時間後１０％５ＤＳＯ，０ＩＮ１−１（Ｊ！
を１００μＱ加え一晩培養器内で放置したのち、タイタ
ーチックマルチスキャンを用いて５９０μｍにおける吸
光度を測定した［多田ら、ジャーナル・才ブ・イムノロ
ジカル・メソッズ（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｒ　　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ）：９３巻、
１５７頁（１９８６年）］。

実施例！ ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｔｌ　７　、４　）に、参考
例３で得られたｒｈｂＦＧＦムティンＣ９２３を２００
μｇ／７ｎ１になるように加えたしのに、ヘパリンナト
リウム（分子量６，０００〜２５．０００）もしくは低
分子量ヘパリンナトリウム（分子ｆｉ１３．９００〜６
４００）を添加して３７℃で４８時間インキュベートし
た。ヘパリンナトリウムの終濃度を２００μｇ／滅（モ
ル比Ｉ：１）および２ｍｇ／ｄ（モル比１：１０）に、
低分子量ヘパリンナトリウムの終濃度６７μｇ／ｄ（モ
ル比Ｉ：１）に設定した。対照群として無添加群を置い
た。４８時間後の残存活性を表２に示す。対照群では、
ＦＧＦ活性はほとんど失われたにもかかわらず、ヘパリ
ンナトリウムおよび低分子量ヘパリンナトリウム添加群
ではＦＧＦ活性が安定に保持されていた。

ヘパリンナトリウム　　　　　　１：１０　　　１００
低分子ｍヘパリンナトリウム　　ｌ：ｌ　　　　　１０
０実施例２ ウシ胎児血清を１０％含有するダルベツコＭＥＭ培地に
、参考例３で得られたｒｈｂＦＧＦムティンＣＳ２３を
１０μｇ／Ｔｎ１になるように加えたものに、ヘパリン
ナトリウム（分子！１６，０００〜２５．０００）、ヘ
パラン硫酸ナトリウム（分子９１０．０００〜＋　５．
０００）またはデルマタン硫Ｆｉ！ｌトＩＪウム（分子
ｍ１１，０００〜２５，０００）のグリコサミノグリカ
ン類を終濃度５００μｇ／ｄまたは２５μｇ／淑になる
ように添加して３７℃で４８時間インキュベートした。

対照群として無添加群を置いた。１８時１ｍ後の残存活
性を表３に示す。対照群では、ＦＧＦ活性はほとんど失
われたにらかかわらず、グリコサミノグリカン類添加群
ではＦＧＦ活性か安定に保持されていた。

ヘパリンナトリウム（平均分子量１２．０００）を終濃
度７３μｇ／−（モル比ｌ：１）になるように添加して
５６℃で４時間インキュベートした。対照としてヘパリ
ンナトリウム無添加群を置いた。

３０分および４時間後の残存活性を表４に示す。

表４に示された結果から明らかなように、対照群ではＦ
ＧＦ活性は低下したにもかかわらず、ヘパリンナトリウ
ム添加群では、高温下において乙ＦＧＦ活性の低下が防
がれている。

ヘパリンナトリウム ヘパリンナトリウム ヘパラン硫酸ナトリウム ヘパラン硫酸ナトリウム デルマタン硫酸ナトリウム ２５　　　　　　　　＋００ 実施例３ ５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐｌ（７□４）溶液に
、参考例３で得られたｒｈｂｒ；’　Ｇ　ＦムティンＣ
９２３を１００μｇ／ｄになるように加えた乙のに、ヘ
パリンナトリウム ヘパリンナトリウム 無　　添　　加 無　　添　　加 ４時間　　　　　８ １６時間　　　　７ ３０分　　　　　５ ４時間 実施例４ ２ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に参考例３で得ら
れたｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ５２３を１００μｇ／
滅になるように加えたものに、ヘパリンナトリウム（平
均分子量１２．０００）を終濃度７３μｇ／滅（モル比
ｌ：１）になるように添加して３７℃でｐｔ１３．ｏ、
５．０，７．４および９．７の条件下に２時間インキュ
ベートした。表５に２時間後の残存ＦＧＦ活性を示す。

表５に示した結果から明らかなように、いずれのｐ　Ｈ
においてら対照群ではＦＧＦ活性は著しく代下したにも
かかわらず、ヘパリンナトリウム添１」【１群ではＦＧ
Ｆ活性が高く保持されていた。

表　　５ ヘパリンナトリウム ヘパリンナトリウム ヘパリンナトリウム ヘパリンナトリウム 無　　添　　加 無　　添　　加 無　　添　　加 ３．０　　　　　　７ ５．０　　　　　　　＋０ ７．４　　　　　　９ ３．０　　　　　　３ ５．０　　　　　　　４ ７．４　　　　　　６ 実施例５ 参考例３で得られたｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ８２３
を１００μｇ／１４に、平均分子量１２，０００のヘパ
リンナトリウムを７３μｇ１０ｆ（モル比１：１）にな
るように８ｍＭのＯＣＱに添加した後、ペプシンを４μ
ｇ／ｄになるように加えた（最終ｐｔ＋２．１）。ヘパ
リンナトリウム無添加群を対照とした。反応液を３７℃
で３０分間インキュベートし、残存ＦＧＦ活性を測定し
た（表６）。対照群ではＦＧＦ活性はほとんど失われた
にもかかわらず、ヘパリンナトリウム添加群ではＦＧＦ
活性が安定に保持されていたことから、ペプシン消化に
対してｒｈｂＦＧＦムティンＣＳ２３か安定化されたこ
とか分かる。

表　　６ 添　加　物　　　　　残存ＦＧＦ活性（％）八、バリン
ナトリウム　　　　　　　　１００無　　添　　加　　
　　　　　　　　　　　　　０実施例６ 参考例３で得られたｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ８２３
（９８０μｇ／滅）ｌ容と平均分子量４，９００の低分
子量ヘパリンナトリウム（３ｍｇ／ｄ）Ｉ容とを混合し
た。混合液の７５０μＱをＴ　Ｓ　Ｋ−ゲル３０００Ｓ
Ｗ（東ソー社製）カラム（０，７５Ｘ６０ａｍ）に添着
し、０　、　Ｉ　Ｍ　Ｎ　ａｔ　Ｓ　Ｏａを含むＯ，１
Ｍリン酸緩衝液（ｐｌＴＧ、Ｑ）を用いて溶出した。溶
出速度はｌ　、　ＯＪ、　／　ｍｉｎ、検出波長は２３
０　ｎｍ、混合液は単一のピーク（ピークｌ）を与えた
（第２図）。

ピークｌを分取して分析した結果、ｒｈｂＦＧＦムティ
ンＣ！；２３と低分子ｍヘパリンナトリウムとをモル比
ｌ・２の割合で含有する両省の複合体であった。ｒｈｂ
ＦＧＦムティンＣ９２３および低分子量ヘパリンナトリ
ウムを単独で添着した場合の溶出１を第２［ｆ！Ｊｒい
（ユ８ゎイれ◆およ夾、示、え。

複合体はｒｈｂＦＧＦムティン２３および低分子エヘパ
リンナトリウムよりも高分子量側に溶出された。その分
子量は第２図より約７０．０００と算出された。

実施例７ 参考例３で得られたｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ５２３
，０，５＋ｎｇ；ヘパリン硫酸ナトリウム　０．３７ｍ
ｇ、クエン酸ナトリウム１５ｍｇを含む溶液（１）Ｉ−
１７４）を調製して、安定な注射液を得た。

発明の効果 ＦＯＰムティンにグリコサミノグリカンを水性媒体中で
接触させることにより、ＦＧＦムティンを安定化さ仕る
ことができるのて、ＦＧＦムティンを安定な作用を持続
させたまま製剤化することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトｂＦＧＦをコードする塩基配列と、それ
から推測されるアミノ酸配列とを示す。 第２図は、実施例６で得られた、ｒｈｂＦＧＦムティン
Ｃ９２３と低分子ヘパリンとの組成物のゲルろ過パター
ンを示す。 代理人　　弁理士　　岩　１）　　弘

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ムテインとグリ
   コサミノグリカンとの複合体あるいはこれらを配合した
   組成物。
2. （２）、ＦＧＦムテインが、少なくとも１個のヒト塩基
   性ＦＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されている
   ムテインである請求項１記載の複合体あるいは組成物。
3. （３）、グリコサミノグリカンがヘパリン、ヘパラン硫
   酸またはデルマタン硫酸である請求項１記載の複合体あ
   るいは組成物。
4. （４）、さらに二または三塩基性カルボン酸を配合した
   請求項１記載の組成物。
5. （５）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ムテインとグリ
   コサミノグリカンとを水性媒体中で接触させることを特
   徴とするＦＧＦムテインとグリコサミノグリカンとの複
   合体あるいはこれらを配合した組成物の製造法。
6. （６）、ＦＧＦムテインが、少なくとも１個のヒト塩基
   性ＦＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されている
   ムテインである請求項５記載の製造法。
7. （７）、グリコサミノグリカンがヘパリン、ヘパラン硫
   酸またはデルマタン硫酸である請求項５記載の製造法。
8. （８）、さらに二または三塩基性カルボン酸を配合した
   請求項５記載の製造法。
9. （９）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ムテインとグリ
   コサミノグリカンとを水性媒体中で接触させることを特
   徴とするＦＧＦムテインの安定化方法。
10. （１０）、ＦＧＦムテインが、少なくとも１個のヒト塩
    基性ＦＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されてい
    るムテインである請求項９記載の安定化方法。
11. （１１）、グリコサミノグリカンがヘパリン、ヘパラン
    硫酸またはデルマタン硫酸である請求項９記載の安定化
    方法。
12. （１２）、ＦＧＦムテインにグリコサミノグリカンおよ
    び二または三塩基性カルボン酸を接触させる請求項９記
    載の安定化方法。