PL229497B1 - Sposób wytwarzania trójwymiarowych rusztowań polilaktydowych - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania trójwymiarowych rusztowań polilaktydowych do hodowli ekwiwalentów skóry charakteryzuje się tym, że roztwór polilaktydu w chloroformie lub dichlorometanie o stężeniu 4 - 10% wag. umieszcza się w reaktorze szklanym i miesza się do całkowitego rozpuszczenia polimeru. Następnie do roztworu dodaje się nierozpuszczalnik polilaktydu, którym jest alkohol metylowy lub etylowy w ilości od 3 do 20% wag., i miesza się w temperaturze od 20 do 25°C do uzyskania jednorodnego roztworu, po czym dodaje się alkohol alifatyczny C3-C5, prosty lub rozgałęziony, w ilości od 3 do 12% wag. i nadal miesza się do uzyskania jednorodnego roztworu. Roztwór wylewa się na podłoże i suszy. Podczas całego procesu mieszanie realizuje się za pomocą mieszadła o objętości 40 - 50% objętości roztworu polimeru i z prędkością 550 - 700 obr/min.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania trójwymiarowych rusztowań (skafoldów) polilaktydowych do hodowli ekwiwalentów skóry.

Pochodząca z języka angielskiego nazwa skafold oznacza przestrzenne rusztowanie umożliwiające wzrost komórek. Skafoldy polimerowe są wykorzystywane do przeszczepów autogennych. W procesie przeszczepu pobiera się i namnaża tkanki regenerowanego narządu, umieszcza się je na polimerowym skafoldzie, po czym tak przygotowany skafold wprowadza się do miejsca przeznaczenia. Polimery używane jako skafoldy powinny być biokompatybilne i biodegradowalne. Wykorzystanie polimerów biodegradowalnych do wytwarzania skafoldów powala na łatwe usunięcie wyhodowanych tkanek z matrycy polimerowej poprzez jej degradację w łagodnych warunkach, bez uszkadzania żywych komórek. Z tych powodów do wytwarzania skafoldów bardzo często wykorzystuje się polilaktyd i jego kopolimery. Bardzo ważna jest także porowatość ogólna polimeru i wielkość porów. Przyjmuje się, że wielkość i układ porów powinny zapewniać właściwą migrację komórek tkanki oraz transport substancji w obrębie rusztowania. Właściwości morfologiczne skafoldów w znacznym stopniu zależą od metody ich otrzymywania.

Do wykonania skafoldów wykorzystuje się zazwyczaj poli-L-laktyd (bez dodatku centrów D), poiiDL-laktyd oraz kopolimery poli(laktyd-co-glikolid) lub poli(laktyd-co-kaprolakton).

Porowate skafoldy otrzymywane są metodą inwersji faz, występującą w dwóch wariantach - metoda sucha (inwersja faz z odparowaniem rozpuszczalnika) i metoda mokra (żelowanie nierozpuszczalnikiem).

W metodzie suchej skafold formuje się z trójskładnikowego układu o stężeniu od 10-40% wag., w skład którego wchodzi polimer membranotwórczy, jego rozpuszczalnik i nierozpuszczalnik. Układ ten otrzymywany jest w wyniku rozpuszczenia polimeru w jego rozpuszczalniku w podwyższonej temperaturze (40-65°C). Rozpuszczanie trwa około 1-6 h. Następnie w tej samej temperaturze dodawany jest nierozpuszczalnik polimeru. Po wymieszaniu roztwór jest wylewany na szklane podłoże i następuje odparowanie rozpuszczalników w temperaturze otoczenia (Mikos A. Temenoff J. Formation of highly porous biodegradable scaffolds for tissue engineering·, Electron J Biotechnol; 2000; 3-23).

W metodzie mokrej w pierwszym etapie jest tworzony roztwór polimeru w jego rozpuszczalniku w sposób taki sam, jak w metodzie suchej. Następnie dodawany jest nierozpuszczalnik analogicznie jak w metodzie suchej. Jednorodny roztwór wylewany jest na szklane podłoże, a następnie zanurzany do kąpieli żelującej składającej się z nierozpuszczalnika lub mieszaniny kilku nierozpuszczalników polimeru. Po upływie około 24 godzin skafold jest suszony na powietrzu w temperaturze pokojowej (Ma P. X., Scaffolds for tissue fabrication·, Materials Today; 2004; 30).

Znane procesy najczęściej prowadzi się w podwyższonej temperaturze, w celu poprawy rozpuszczalności stosowanych polimerów. Najbardziej powszechnie stosowanymi rozpuszczalnikami są dimetylosuIfotlenek, dimetyloforamid, dioksan lub tetrahydrofuran, zdecydowanie rzadziej korzysta się z chloroformu. Powszechnie stosowane rozpuszczalniki są trudne w regeneracji i kosztowne. Do suszenia skafoldów używa się suszarek próżniowych.

Wymienione wyżej metody prowadzą do uzyskania skafoldów silnie porowatych w całej objętości, łącznie z powierzchnią skafoldu. Rusztowania takie są wykorzystywane najczęściej do hodowli chondrocytów lub osteocytów. Otwarte pory na powierzchni skafoldu powodują problem w przypadku hodowli komórek służących jako ekwiwalenty skóry. Aby otrzymać prawidłowo zróżnicowane komórki skóry niezbędne jest dostarczenie odpowiednich czynników wzrostu tych komórek, takich jak np. aminokwasy. Aminokwasy są dobrze rozpuszczalne w wodzie, więc w trakcie namnażania komórek w środowisku wodnym są wypłukiwane z objętości skafoldu. W konsekwencji dostarczanie składników wspomagających wzrost komórek nabłonka jest nieefektywne.

Problem ten został rozwiązany dzięki otrzymaniu polilaktydowego skafoldu dwuwarstwowego, o litej warstwie zewnętrznej.

Sposób wytwarzania trójwymiarowych rusztowań polilaktydowych do hodowli ekwiwalentów skóry według wynalazku charakteryzuje się tym, że roztwór polilaktydu w chloroformie lub dichlorometanie o stężeniu 4-10% wag. umieszcza się w reaktorze szklanym i miesza się do całkowitego rozpuszczenia polimeru. Następnie do roztworu dodaje się nierozpuszczalnik polilaktydu, którym jest alkohol metylowy lub alkohol etylowy w ilości od 3 do 20% wag., i miesza się w temperaturze od 20 do 25°C do uzyskania jednorodnego roztworu, po czym dodaje się alkohol alifatyczny C3-C5, prosty lub rozgałęziony, w ilości od 3 do 12 % wag. i nadal miesza się do uzyskania jednorodnego roztworu. Roztwór

PL 229 497 Β1 wylewa się na podłoże i suszy się. Podczas całego procesu mieszanie realizuje się za pomocą mieszadła o objętości 40-50% objętości roztworu polimeru i z prędkością 550-700 obr/min.

Korzystnie proces prowadzi się w reaktorze o kształcie kulistym. Korzystnie element mieszający mieszadła ma kształt baryłkowaty.

Korzystnie suszenie prowadzi się przez 60-80 h, w przepływie laminarnego powietrza.

Korzystnie jako polilaktyd stosuje się poli-L-laktyd.

Korzystnie stosuje się poli-L-laktyd o ciężarze cząsteczkowym 53 500-86 000 g/mol, zawartości centrów D od 0,01-0,5% wag.

W wyniku procesu przeprowadzonego zgodnie z wynalazkiem uzyskuje się trójwymiarowy, dwuwarstwowy skafold, w którym warstwa zewnętrza jest warstwą litą, a warstwa wewnętrzna jest porowata. Warstwa lita nie przepuszcza wody ani związków małocząsteczkowych, natomiast warstwa porowata jest warstwą przepuszczającą. Dzięki takiej strukturze związki wspomagające wzrost komórek niezbędne w hodowli tkanki skóry, takie jak aminokwasy, cukry, kwas hialuronowy, zostają zatrzymane wewnątrz rusztowania przez litą warstwę zewnętrzną. W rezultacie zużycie substancji dodawanych do hodowli tkanki jest niższe, powstaje mniej odpadów i hodowla jest bardziej ekonomiczna.

W celu uzyskania takiego efektu niezbędny jest dodatek alkoholu C3-C5 po uzyskaniu jednorodnego układu polimer-rozpuszczalnik-nierozpuszczalnik, odpowiednia temperatura procesu, dobór rozpuszczalnika i nierozpuszczalnika polilaktydu.

Sposobem według wynalazku otrzymuje się skafold o średnicy porów większej niż 10 gm, co pozytywnie wpływa na kształt i właściwości biologiczne otrzymanych ekwiwalentów. Komórki nie ulegają zdeformowaniu oraz utrzymują właściwości zbliżone do komórek występujących w organizmach żywych.

Skafoldy otrzymane sposobem według wynalazku są przeznaczone do zastosowania w hodowli ekwiwalentów skóry. Mogą także zstąpić testy (np. leków lub kosmetyków) wykonywane na ludziach lub zwierzętach.

Sposób według wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach.

Przykład 1

W reaktorze szklanym kulistym o pojemności 50 mL rozpuszczano 0,4 g PLA (o Mn 86 000 g/mol) w 5 mL CHCh przez 24 h, w 25°C. Następnie roztwór PLA/CHCh podgrzewano w łaźni wodnej do temperatury 25°C, ciągle mieszając przy użyciu mieszadła magnetycznego (szybkość mieszania 600 min¹). Do mieszania stosuje się umieszczony w kolbie element mieszający o baryłkowatym kształcie, którego objętość stanowiła 45% objętości roztworu polimeru. Po ustabilizowaniu się warunków dodawano 1 mL metanolu i podgrzewano roztwór do 30°C ciągle mieszając. Po rozpuszczeniu częściowo wytrąconego PLA dodawano mL1 -butanolu. Po ponownym rozpuszczeniu częściowo wytrąconego PLA i dokładnym wymieszaniu się składników mieszaniny zawartość kolby wylewano na szalkę Petriego o średnicy 60 mm. Przed wylaniem szalka była odtłuszczona przy użyciu EtOH, a następnie wysuszona. W temperaturze 25°C odparowano rozpuszczalnik i nierozpuszczalnik polimeru w przepływie laminarnego powietrza przez 72 h. Otrzymano skafold dwuwarstwowy o warstwie litej i porowatej o średnicach porów wynoszących 18-25 gm. Otrzymany skafold przedstawiono na obrazie SEM (skaningowej mikroskopii elektronowej) wykonanym mikroskopem Hitachi P-1000 (Fig. 1). Próbka skafoldu przed pomiarem została napylona złotem w celu poprawienia jej przewodności.

Przykład 2

Przeprowadzono proces jak w Przykładzie 1, z tą różnicą, że nie dodano 1-butanlu. Otrzymano skafold jednowarstwowy, bez warstwy litej. Otrzymany skafold przedstawiono na obrazie SEM wykonanym mikroskopem Hitachi P-1000 (Fig. 2).

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania trójwymiarowych rusztowań polilaktydowych do hodowli ekwiwalentów skóry, w którym polilaktyd umieszcza się w rozpuszczalniku, w reaktorze szklanym i miesza się do całkowitego rozpuszczenia polimeru, następnie do roztworu dodaje się nierozpuszczalnik polilaktydu i miesza się, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik polilaktydu stosuje się chloroform lub dichlorometan, stężenie roztworu polilaktydu w rozpuszczalniku wynosi 4-10% wag., jako nierozpuszczalnik polilaktydu stosuje się alkohol metylowy lub alkohol

   PL 229 497 Β1 etylowy w ilości od 3 do 20% wag., mieszanie roztworu po dodaniu nierozpuszczalnika prowadzi się w temperaturze od 20 do 25°C do uzyskania jednorodnego roztworu, po czym dodaje się alkohol alifatyczny C3-C5, prosty lub rozgałęziony, w ilości od 3 do 12% wag. i nadal miesza się do uzyskania jednorodnego roztworu, po czym roztwór wylewa się na podłoże i suszy się.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszanie realizuje się za pomocą mieszadła o objętości 40-50% objętości roztworu polimeru i z prędkością 550-700 obr./min.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że element mieszający mieszadła ma kształt baryłkowaty.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w reaktorze o kształcie kulistym.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że suszenie prowadzi się przez 60-80 h, w przepływie laminarnego powietrza.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się poli-L-laktyd.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się poli-L-laktyd o ciężarze cząsteczkowym 53 500-86 000 g/mol, o zawartości centrów D od 0,01-0,5%wag.