PL242762B1 - Sposób wytwarzania rusztowania komórkowego o dużej elastyczności - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób wytwarzania rusztowania komórkowego o dużej elastyczności, w którym prepoli(sebacynian glicerolu) o ciężarze cząsteczkowym Mn 1—20 kg/mol i stopniu estryfikacji 60-80%, rozpuszcza się w mieszaninie rozpuszczalników polarnych i niepolarnych, w stężeniu 10-65% wag. i miesza się do całkowitego rozpuszczenia polimeru, następnie do roztworu dodaje się 20-35% wag. alkoholu C1-C3 jako ciekłego porofora i miesza się do uzyskania jednorodnego roztworu, po czym roztwór wylewa się na podłoże z mieszaniny NaCl i NaHCO3 o rozmiarach ziaren <500 μm i zamraża do temperatury -10-(-20)°C, a następnie przeprowadza wodną kąpiel płuczącą przez 2-5 h, w temperaturze 0-5°C, w stanie zamrożenia skafoldu, zaś gotowy skafold suszy się metodą liofilizacji.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania biodegradowalnego rusztowania komórkowego o dużej elastyczności, zbudowanego z poli(sebacynianiu glicerolu).

Rusztowania komórkowe, nazywane także skafoldami (ang. Scaffolds - rusztowania) są przestrzennymi strukturami zbudowanymi z sieci wzajemnie połączonych trójwymiarowych porów. Skafoldy są stosowane w inżynierii tkankowej do odtwarzania uszkodzonych lub utraconych tkanek. Wówczas, najpierw pobiera się komórki regenerowanej tkanki z organizmu pacjenta, następnie izoluje się, namnaża w zwykłej hodowli dwuwymiarowej i przenosi się na skafold. Popularnym rozwiązaniem jest stosowanie do wytwarzania skafoldów polimerów biodegradowalnych rozkładających się do nietoksycznych produktów, które są z łatwością wydalane.

Rusztowanie komórkowe, aby mogło być stosowane do regeneracji tkanki, musi spełniać określone wymogi. Musi być nietoksyczne wobec komórek organizmu oraz musi mieć także odpowiednią wielkość porów dopasowaną do rozmiaru komórek regenerowanej tkanki. Ponadto musi mieć właściwą dla danej tkanki wytrzymałość mechaniczną oraz odpowiedni czas degradacji, zbliżony do tempa regeneracji tkanki. Rusztowanie powinno także zapewniać dostęp substancji odżywczych i czynników wzrostu.

Do otrzymywania skafoldów wykorzystuje się zazwyczaj polimery, zarówno naturalne jak i syntetyczne. Wśród polimerów naturalnych popularnymi są przede wszystkim żelatyna, kolagen, czy chitozan. Związki te bardzo dobrze naśladują naturalną macierz zewnątrzkomórkową, ponadto są dobrze tolerowane przez organizm, a po rozłożeniu mogą stanowić składniki odżywcze dla komórek. Wadą tych związków jest mała wytrzymałość mechaniczna oraz wrażliwość na zmiany warunków procesu przetwarzania (wysoka temperatura, zmiany pH), co znacznie obniża ich użyteczność w przemyśle. Alternatywą wobec związków pochodzenia naturalnego są biodegradowalne polimery syntetyczne tj. polilaktyd (PLA), poli-ε-kaprolakton, poliglikolid oraz ich kopolimery. Polimery te cechuje biodegradowalność i biozgodność (w organizmach ulegają degradacji do nietoksycznych produktów - dwutlenku węgla i wody, które są łatwo wydalane) oraz dobre właściwości mechaniczne. Ponadto, odpowiednio dobierając rodzaj i długość łańcucha węglowego polimeru, można sterować właściwościami mechanicznymi oraz czasem degradacji rusztowania. Wadami tych materiałów jest duża sztywność i hydrofobowość powierzchni.

Istnieje wiele metod otrzymywania skafoldów, wśród nich na szczególną uwagę zasługują: metoda inwersji faz, elektroprzędzenie oraz druk 3D. Każda z tych metod pozwala na otrzymanie rusztowań o zupełnie innych właściwościach. Metoda inwersji faz, w porównaniu do pozostałych, charakteryzuje się łatwością oraz niewielkimi ograniczeniami co do stosowanych materiałów, ze względu na brak konieczności stosowania dużych zmian ciśnienia i temperatury.

Sposób otrzymywania skafoldów wraz z doborem odpowiedniego materiału ściśle wpływa na właściwości rusztowań, szczególnie na ich strukturę oraz wytrzymałość mechaniczną. Z tej przyczyny projektując skafold należy odpowiednio dobrać te parametry, w zależności od oczekiwanych efektów.

Dominującą metodą wytwarzania skafoldów z poli(sebacynianu glicerolu) (PGS), stosowaną niemal we wszystkich opisanych eksperymentach, jest metoda wymywania soli. Polega ona na rozpuszczeniu uprzednio zsyntezowanego pre-polimeru PGS w rozpuszczalniku organicznym (np. THF, etanol, chloroform, dioksan), a następnie wylaniu go do formy. Najczęściej do pre-polimeru wprowadza się porofor, który można dodać bezpośrednio do roztworu albo do formy. W tym drugim przypadku roztwór wylewa się na warstwę porofora. Rolę porofora pełni zazwyczaj NaCl, gdyż jest niegroźny dla organizmu. Po odparowaniu rozpuszczalnika pre-polimer poddaje się sieciowaniu w próżni, w podwyższonej temperaturze (120-150°C), przez 72-144 h. Ostatnim etapem jest wypłukanie porofora w wodzie destylowanej. Wadą opisanego procesu jest jego długotrwałość i zależność od wielu parametrów, zarówno syntezy pre-polimeru, jak i sieciowania [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Dodatkowo, w skafoldzie pozostaje duża ilość soli, co sprawia, że jest on mało elastyczny. W badaniach komórkowych pozostający NaCl może prowadzić do lizy komórek, zatem wydajna regeneracja tkankowa jest niemożliwa.

Inną metodą otrzymywania skafoldów z PGS jest elektroprzędzenie. Metoda ta pozwala uzyskać rusztowania o strukturze włóknistej, ale wymaga zastosowania specjalistycznej aparatury [7].

Kolejna metoda otrzymywania skafoldów z PGS, znana z opisu patentowego CN106581748A, pozwala na otrzymanie rusztowań o makroporach. Zgodnie z tą metodą najpierw wlewa się żelatynę do specjalnej formy, a następnie zamraża się w celu otrzymania porowatego skafoldu-matrycy. Skafoldmatrycę zanurza się w roztworze PGS pod próżnią, aby polimer dokładnie wypełnił wszystkie luki i poddaje utwardzaniu.

Obecny wynalazek ma na celu rozwiązanie wyżej zdefiniowanych problemów. W szczególności celem wynalazku było otrzymanie rusztowana komórkowego o dużej elastyczności, przeznaczonego zwłaszcza do hodowli dużych komórek, np. mięśniowych lub nerwowych.

Sposób wytwarzania rusztowania komórkowego o dużej elastyczności według wynalazku charakteryzuje się tym, że pre-poli(sebacynian glicerolu) o ciężarze cząsteczkowym Mn 1-20 kg/mol i stopniu estryfikacji 60-80%, rozpuszcza się w mieszaninie rozpuszczalników polarnych i niepolarnych, w stężeniu 10-65% wag. i miesza się do całkowitego rozpuszczenia polimeru, następnie do roztworu dodaje się 20-35% wag. alkoholu C1-C3 jako ciekłego porofora, i miesza się do uzyskania jednorodnego roztworu, po czym roztwór wylewa się na podłoże z mieszaniny NaCl i NaHCOs o rozmiarach ziaren <500 μm i zamraża do temperatury -10 - (-20)°C. Następnie przeprowadza się wodną kąpiel płuczącą przez 2-5 h, w temperaturze 0-5°C, w stanie zamrożenia skafoldu. Gotowy skafold suszy się przez liofilizację. Jako rozpuszczalnik niepolarny stosuje się chloroform lub dichlorometan lub ich mieszaninę z dioksanem, a jako rozpuszczalnik polarny stosuje się metanol, etanol lub izopropanol. Suszenie metodą liofilizacji prowadzi się w temperaturze -30 - (-50)°C i przy ciśnieniu 0,01-0,001 MPa.

Korzystnie rozpuszczalnikiem niepolarnym jest chloroform z dioksanem, a rozpuszczalnikiem polarnym jest etanol.

Korzystnie suszenie metodą liofilizacji prowadzi się w temperaturze -35°C i pod ciśnieniem 0,01 MPa.

W wyniku procesu przeprowadzonego zgodnie z wynalazkiem uzyskuje się trójwymiarowy skafold, którego struktura wewnętrzna oprócz sieci połączonych porów zawiera także duże kwadratowe pory. Dodatkowo wnętrza ścianek są silnie perforowane (dziurkowane), co odpowiada za efektywną wymianę metabolitów. Pory kwadratowe w rusztowaniu mogą być zasiedlane przez namnażające się komórki o bardzo dużym rozmiarze tj. komórki mięśniowe lub nerwowe, zaś w strukturach wewnątrz ścianek może zachodzić bardzo wydajna wymiana metabolitów. Otrzymany skafold charakteryzuje się wysoką elastycznością, porównywalna z tkanką nerwową lub mięśniową.

W sposobie według wynalazku stosuje się układ dwóch poroforów: alkoholu i NaHCOs. Alkohol jest poroforem odpowiedzialnym za wytwarzanie małych porów we wnętrzu ścianek rusztowania. Natomiast NaHCOs reaguje z wolnymi grupami kwasu sebacynowego z wytworzeniem in situ CO2, który jest odpowiedzialny za wytwarzanie dużych porów. NaCl jest używany jedynie do oddzielenia prepolimeru wylewanego do formy od jej powierzchni, a nie jest mieszany z prepolimerem, jak w stanie techniki. Nie pełni więc funkcji porofora.

Skafoldy otrzymane sposobem według wynalazku są przeznaczone do zastosowania w hodowli wybranych komórek, w których to niezbędne jest stosowanie podłoża o dużych porach, odpowiedniej nasiąkliwości oraz elastyczności, np. komórek mięśniowych lub nerwowych.

Na rysunku przedstawiono:

Fig. 1 - obraz SEM skafoldu o kwadratowych porach (powiększenie 100x);

Fig. 2 - obraz SEM skafoldu o kwadratowych porach z uwidocznieniem struktur (perforacji) wewnętrznych ścianek (powiększenie 300x);

Fig. 3 - obraz SEM klasycznego skafoldu otrzymanego z użyciem NaCl (powiększenie 300x).

Sposób według wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach.

Przykład 1

W kolbie stożkowej 50 mL rozpuszczano 0,75 g prepolimeu PGS (o M _n 10 000 g/mol, stopień estryfikacji 75%) w 5 mL CHCh i 15 mL dioksanu przez 24 h, w 25°C. Następnie do roztworu PGS/CHCl3/Dioksan dodawano 0,5 mL EtOH ciągle mieszając przy użyciu mieszadła magnetycznego oraz elementu mieszającego (szybkość mieszania 200 min^-1). Po rozpuszczeniu częściowo wytraconego materiału polimerowego zawartość kolby wylewano na szalkę Petriego o średnicy 60 mm. Na szalce znajdowała się 5 mm warstwa mikronizowanej mieszaniny NaCl i NaHCO3 o rozmiarze ziaren 300 μm. Przed wylaniem szalka była odtłuszczona przy użyciu EtOH, a następnie wysuszona. Następnie przez 24 h zamrażano skafold w -18°C. Następnie płukano go w 5°C przez 4 h, z użyciem wody dejonizowanej. Następnie skafold liofilizowano przez 24 h w -35°C, pod ciśnieniem 0,01 MPa. Otrzymany skafold zbadano przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) (Fig. 1, 2), przy czym przed badaniem próbkę skafoldu połamano w ciekłym azocie, a następnie napylono 7-10 nm warstwą złota przy użyciu napylarki K550X Sputter Coater. Skafold otrzymany zgodnie z Przykładem 1 posiada kwadratowe pory oraz perforację wewnętrznych ścianek. Otrzymany skafold posiada elastyczność wyznaczoną jako moduł Younga 0,1 MPa (porównywalny z tkanką mięśniową lub nerwową).

Przykład 2, porównawczy.

W kolbie stożkowej 50 mL rozpuszczano 0,75 g prepolimeu PGS (o M _n 10 000 g/mol, stopień estryfikacji 75%) w 15 mL dioksanu przez 24 h, w 25°C. Następnie roztwór mieszano przy użyciu mieszadła magnetycznego oraz elementu mieszającego (szybkość mieszania 200 min^-1). Po rozpuszczeniu zawartość kolby wylewano na szalkę Petriego o średnicy 60 mm. Na szalce znajdowała się 5 mm warstwa NaCl. Przed wylaniem szalka była odtłuszczona przy użyciu EtOH, a następnie wysuszona. Następnie przez 24 h zamrażano skafold w -18°C. Następnie płukano go w temp. pokojowej przez 24 h z użyciem wody dejonizowanej. Następnie suszono przez 24 h w temperaturze otoczenia. Otrzymany skafold zbadano przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) (Fig. 3), przy czym przed badaniem próbkę skafoldu nie łamano w ciekłym azocie, gdyż rozpadła się samoistnie, a następnie napylono 7-10 nm warstwą złota przy użyciu napylarki K550X Sputter Coater. Otrzymany skafold posiada elastyczność wyznaczoną jako moduł Younga 10 MPa (porównywalny z tkanką chrzęstną). Dodatkowo obserwowano pękanie skafoldu w próbie statycznego rozciągania.

Bibliografia:

1. Gao, J., Crapo, P. M. & Wang, Y. Macroporous Elastomeric Scaffolds with Extensive Micropores for Soft Tissue Engineering. Tissue Eng. 12, 917-925 (2006).

2. Jia, Y. et al. Synthesis and characterization of poly(glycerol sebacate)-based elastomeric copolyesters for tissue engineering applications. Polym. Chem. 7, 2553-2564 (2016).

3. Shi, H. et al. Poly(glycerol sebacate)-modified polylactic acid scaffolds with improved hydrophilicity, mechanical strength and bioactivity for bone tissue regeneration. RSC Adv. 5, 79703-79714 (2015).

4. Guo, X. L., Lu, X. L., Dong, D. L. & Sun, Z. J. Characterization and optimization of glycerol/sebacate ratio in poly(glycerol-sebacate) elastomer for cell culture application. J. Biomed. Mater. Res. - Part A 102, 3903-3907 (2014).

5. Li, Y., Cook, W. D., Moorhoff, C., Huang, W. C. & Chen, Q. Z. Synthesis, characterization and properties of biocompatible poly(glycerol sebacate) pre-polymer and gel. Polym. Int. 62, 534-547 (2013).

6. Sundback, C. A. et al. Biocompatibility analysis of poly(glycerol sebacate) as a nerve guide material. Biomaterials 26, 5454-5464 (2005).

7. Kurzydłowski, K. & Lewandowska, M. Nanomateriały inżynierskie. (Wydawnictwo Naukowe PWN, 2011).

Claims (3)

1. Sposób wytwarzania rusztowania komórkowego o dużej elastyczności, w którym pre-poli(sebacynian glicerolu) rozpuszcza się w rozpuszczalniku, dodaje się porofor, a następnie roztwór wylewa się do formy, znamienny tym, że pre-poli(sebacynian glicerolu) o ciężarze cząsteczkowym Mn 1-20 kg/mol i stopniu estryfikacji 60-80%, rozpuszcza się w mieszaninie rozpuszczalników polarnych i niepolarnych, w stężeniu 10-65% wag. i miesza się do całkowitego rozpuszczenia polimeru, następnie do roztworu dodaje się 20-35% wag. alkoholu C1-C3 jako ciekłego porofora i miesza się do uzyskania jednorodnego roztworu, po czym roztwór wylewa się na podłoże z mieszaniny NaCl i NaHCOs o rozmiarach ziaren <500 μm i zamraża do temperatury -10 - (-20)°C, a następnie przeprowadza wodną kąpiel płuczącą przez 2-5 h, w temperaturze 0-5°C, w stanie zamrożenia skafoldu, zaś gotowy skafold suszy się metodą liofilizacji, przy czym jako rozpuszczalnik niepolarny stosuje się chloroform lub dichlorometan lub ich mieszaninę z dioksanem, a jako rozpuszczalnik polarny stosuje się metanol, etanol lub izopropanol, oraz przy czym suszenie metodą liofilizacji prowadzi się w temperaturze -30 - (-50)°C i przy ciśnieniu 0,01-0,001 MPa.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczalnikiem niepolarnym jest chloroform z dioksanem, a rozpuszczalnikiem polarnym jest etanol.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że suszenie metodą liofilizacji prowadzi się w temperaturze -35°C i pod ciśnieniem 0,01 MPa.