PL230096B1 - System nośników kwasów nukleinowych, sposób przygotowania systemu oraz ich zastosowanie - Google Patents
System nośników kwasów nukleinowych, sposób przygotowania systemu oraz ich zastosowanieInfo
- Publication number
- PL230096B1 PL230096B1 PL410078A PL41007814A PL230096B1 PL 230096 B1 PL230096 B1 PL 230096B1 PL 410078 A PL410078 A PL 410078A PL 41007814 A PL41007814 A PL 41007814A PL 230096 B1 PL230096 B1 PL 230096B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- glycero
- cholesterol
- phosphatidylcholine
- dope
- serum
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000000969 carrier Substances 0.000 title claims abstract description 15
- ISXSJGHXHUZXNF-LXZPIJOJSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate;hydrochloride Chemical compound Cl.C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 ISXSJGHXHUZXNF-LXZPIJOJSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229920001731 Polyprenol Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 229930186185 Polyprenol Natural products 0.000 claims abstract description 14
- -1 cationic polyprenol Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- BDMCAOBQLHJGBE-UHFFFAOYSA-N C60-polyprenol Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC(=CCCC(=C/CCC(=C/CCC(=C/CCC(=C/CCC(=C/CCC(=C/CCC(=C/CCC(=C/CO)C)C)C)C)C)C)C)C)C)C)C)C BDMCAOBQLHJGBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 8
- 125000001185 polyprenyl group Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 229920001550 polyprenyl Polymers 0.000 claims abstract description 5
- FVXDQWZBHIXIEJ-LNDKUQBDSA-N 1,2-di-[(9Z,12Z)-octadecadienoyl]-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC FVXDQWZBHIXIEJ-LNDKUQBDSA-N 0.000 claims abstract description 3
- GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N Dimethyl dicarbonate Chemical compound COC(=O)OC(=O)OC GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 36
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 16
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 10
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 10
- RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N Isoprene Chemical group CC(=C)C=C RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 8
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 claims description 2
- KHWUKFBQNNLWIV-KPNWGBFJSA-N (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol hydrochloride Chemical compound Cl.C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 KHWUKFBQNNLWIV-KPNWGBFJSA-N 0.000 claims 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 abstract 2
- QFMZQPDHXULLKC-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(diphenylphosphino)ethane Chemical compound C=1C=CC=CC=1P(C=1C=CC=CC=1)CCP(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 QFMZQPDHXULLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 abstract 1
- WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 0.000 abstract 1
- ZLGYVWRJIZPQMM-HHHXNRCGSA-N 2-azaniumylethyl [(2r)-2,3-di(dodecanoyloxy)propyl] phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCCCCCC ZLGYVWRJIZPQMM-HHHXNRCGSA-N 0.000 abstract 1
- KYLYEZUDQSQIRP-UHFFFAOYSA-N D,L-(alpha-Glyceryl)-2-(dimethylammonium)-aethylphosphat Natural products CN(C)CCOP(O)(=O)OCC(O)CO KYLYEZUDQSQIRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N 0.000 abstract 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 12
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 10
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 10
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 10
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 150000003096 polyprenols Chemical class 0.000 description 3
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 150000002031 dolichols Chemical class 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000002479 lipoplex Substances 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical class CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 description 1
- ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q10 Natural products COC1=C(OC)C(=O)C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001357 autoimmunogenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 description 1
- 235000017471 coenzyme Q10 Nutrition 0.000 description 1
- ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N coenzyme Q10 Chemical compound COC1=C(OC)C(=O)C(C\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 1
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 1
- NPCOQXAVBJJZBQ-UHFFFAOYSA-N reduced coenzyme Q9 Natural products COC1=C(O)C(C)=C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)C(O)=C1OC NPCOQXAVBJJZBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003956 transport vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940035936 ubiquinone Drugs 0.000 description 1
- IAHBIMWHYUOIOH-UHFFFAOYSA-N vanadium hydrochloride Chemical compound Cl.[V] IAHBIMWHYUOIOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku jest system zawierający jako nośniki kwasów nukleinowych kationowe pochodne poliprenoli, o różnej długości łańcucha poliprenylowego o wzorze 1 oraz lipidy pomocnicze wybrane z grupy obejmującej DOPE (1,2-dioleilo-sn-glicero-3- fosfatydyloetanoloamina), cholesterol, DC-cholesterol [chlorowodorek {3ß-[N-(N',N'-dimetyloaminoetan)-karbamoilo]cholesterolu}], DOPC: (1,2-dioleilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina), DMPC (1,2-dimirystylo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina), DMPE (1,2-dimirystylo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloamina), DLPC (1,2-dilaurylo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina), DPPC (1,2-dipalmitylo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina), fosfatydylocholina, fosfatydyloetanoloamina, DPPE (1,2-dipalmitylo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloamina), DLPE (2-dilaurylo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloamina), DOPS (1,2-dioleilo-sn-glicero-3-fosfatydyloseryna), POPC (1-palmitylo-2-oleilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina), PDME (fosfatydylo-N,N-dimetyloetanoloamina), DSPE (1,2-distearylo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloamina), DSPC (1,2-distearylo-SA7-glicero-3- fosfatydylocholina), POPE (1-palmitylo-2-oleilo-sn-glicero-3-fosfatydyletanoloamina), PMME (fosfatydylo-monometyloetanoloamina), a także, ewentualnie, może zawierać substancje modyfikujące powierzchnię lipopleksów. Ujawniono także sposób przygotowania i zastosowanie systemu określonego powyżej do przygotowania preparatów do wprowadzania kwasów nukleinowych do komórek eukariotycznych.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest system nośników kwasów nukleinowych w postaci kompozycji opartych na kationowych pochodnych poliprenoli, sposób przygotowania systemu nośników kwasów nukleinowych oraz ich zastosowanie.
Postęp w rozumieniu patogenezy wielu chorób i dynamiczny rozwój narzędzi do przenoszenia kwasów nukleinowych stworzył perspektywę nowych zastosowań dla technik dostarczania. DNA i RNA do komórek oraz ich wprowadzania do praktyki laboratoryjnej i klinicznej. Obecnie kwasy nukleinowe można już uważać za leki przeciw ciągle rosnącej liczbie chorób zarówno genetycznych, jak i nabytych. Do takich chorób zaliczyć można hemofilię, niedobory odporności, ból przewlekły, a także HIV, mukowiscydozę, arteriosklerozę, reumatoidalne zapalenie stawów, nowotwory i inne (Kaiser J, Gene therapy celebrates a decade of progress. Science 2011; vol 334; 7: 29-30; Flotte TR, Gene therapy: the first two decades and the current state-of-the-art. J Cell Physiol 2007; 213: 301-305). Obiecujący i stale rosnący potencjał terapii genowej w zwalczaniu chorób, które w obecnej chwili uważane są za nieuleczalne, stymuluje poszukiwania efektywnych przenośników materiału genetycznego, które mogłyby być bezpiecznie stosowane in vivo.
Najbardziej efektywne strategie dostarczania genów oparte są na stosowaniu wektorów wirusowych. Jednak ich zastosowania kliniczne napotykają na szereg istotnych ograniczeń, np. ich ograniczoną ładowność, mutagenne, onkogenne i auto-immunogenne skutki uboczne, a także wysokie koszty produkcji wielkoskalowej (Vannucci L, Lai M, Chiuppesi F, Ceccherini-Nelli L, Pistello M. Viral vectors: a look back and ahead on gene transfer technology. New Microbiologica 2013; 36: 1-22). Wektory niewirusowe stanowią obiecującą alternatywę, ponieważ są bezpieczne i stosunkowo tanie w produkcji. Wśród strategii transferu genów, w których stosuje się wektory nie-wirusowe, lipofekcja uważana jest za jedną z najbardziej obiecujących metod.
Strategia lipofekcji oparta jest na zastosowaniu lipidów kationowych, które mogą spontanicznie oddziaływać z negatywnie naładowanymi kwasami nukleinowymi tworząc lipopleksy (kompleksy lipidów z kwasami nukleinowymi). Ich niespecyficzne oddziaływanie z komórkowymi białkami i cukrami znajdującymi się na powierzchni błony komórkowej stymuluje endocytozę prowadząc do tworzenia pęcherzyków endocytarnych. Mieszaniny lipidów kationowych i pomocniczych (zwanych także ko-lipidami), np. DOPE (1,2-dioleilo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloamina), zmieniają właściwości lipopleksów ułatwiając uwalnianie kwasów nukleinowych w czasie endocytozy.
Znaczący potencjał lipidów kationowych jako nośników, dostarczających leki genetyczne, stał się przyczyną intensywnych badań mających na celu opracowanie efektywnych przenośników lipidowych. Jednakże, pomimo tego, że zsyntetyzowano liczne rodzaje lipidów kationowych i pomocniczych (Koynova R and Tenchov B, Recent Patents in Cationic Lipid Carriers for Delivery of Nucleic Acids, Recent Patents on DNA & Gene Sequences 2011; 1 5: 8-27), dotychczas nie udało się opracować idealnego wektora do lipofekcji. Może to wynikać z faktu, że wydajność lipofekcji zależy nie tylko od struktury lipidów i ko-lipidów, ale także od właściwości komórek będących obiektem lipofekcji i warunków jej prowadzenia (np. in vitro vs. in vivo). Co więcej, różnorodność szlaków i mechanizmów biorących udział w procesie lipofekcji skutkuje wysoką złożonością wzajemnych relacji pomiędzy strukturą nośników do lipofekcji, bezpieczeństwem ich działania i wydajnością. Często sprzeczne dane literaturowe dotyczące wpływu właściwości nośników i lipopleksów na wydajność transfekcji stanowią dodatk owe przeszkody w opracowaniu nowych lipidów i ko-lipidów do dostarczania genów do komórek.
Poliizoprenoidy są lipidowymi składnikami komórkowych układów enzymatycznych, biorących udział w glikozylacji białek u prokariontów (poliprenole) i eukariontów (dolichole), równocześnie jako elementy strukturotwórcze modulują właściwości błon lipidowych. Związki te biosynt etycznie są blisko powiązane z innymi ważnymi elementami metabolizmu komórki (np. ubichinonem, cholesterolem, witaminami A, D, E, K). Kationowe formy poliprenoli i dolicholi najprawdopodobniej nie występują w żywych komórkach, ale mogą być syntetyzowane z występujących w naturze alkoholi izoprenoidowych (Madeja Z, Rak M, Wybieralska E, Różański I, Masnyk M, Chmielewski M, Lysek R, Chojnacki T, Jankowski W, Ciepichal E, Swiezewska E, Tekle M, Dallner G, New cationic polyprenyl derivative proposed as a lipofecting agent, Acta Biochim Pol. 2007 54(4): 873-6, patent: Chojnacki T, Ciepichal E, Jankowski W, Kula-Świeżewska E, Chmielewski M, Masnyk M, Łysek, Madeja Z, Rak M, Trimetyloaminowe pochodne poli-cis ipoli-trans liniowych oligomerówizoprenowych, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie, PL 211824 B1). Znane są ze stanu techniki kationowe pochodne poliprenoli o aktywności lipofekcyjnej
PL 230 096 Β1 (Madeja Z, Rak M, Wybieralska E, Różański I, Masnyk M, Chmielewski M, Lysek R, Chojnacki T, Jankowski W, Ciepichal E, Swiezewska E, Tekle M, DallnerG, Newcationicpolyprenylderivativeproposed as a lipofecting agent, Acta Biochim Pol. 2007 54(4): 873-6, patent: Chojnacki T, Ciepichal E, Jankowski W, Kula-Świeżewska E, Chmielewski M, Masnyk M, Łysek, Madeja Z, Rak M, Trimetyloaminowe pochodne poli-cis i poli-trans liniowych oligomerów izoprenowych, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie) jednak zaproponowane rozwiązanie uniemożliwia użycie w warunkach surowiczych (w obecności surowicy), co znacznie ogranicza ich aplikację - przede wszystkim nie rokuje dobrze do zastosowań in vivo (Simberg D, Weisman S, Talmon Y, Faerman A, Shoshani T, Barenholz Y, The role of organ vascularization and lipoplex-serum initial contact in intravenous murine lipofection, J Biol Chem. 2003; 10;278(41): 39858-65). Ponadto, zaproponowany sposób przygotowania mieszaniny transfekcyjnej nie był korzystny do wygodnego przygotowania odczynnika działającego skutecznie przez dłuższy okres czasu, chronionego przed zakażeniem bakteryjnym.
Nieoczekiwanie okazało się, że przy zastosowaniu niniejszego wynalazku możliwe jest dostarczenie nowego systemu nośników lipidowych do transfekcji komórek, który nie posiada powyższych ograniczeń.
Nieoczekiwanie zatem wynalazek pozwala na uzyskanie odpowiednio prostego i skutecznego systemu modyfikowalnych nośników opartych na kationowych pochodnych poliprenoli realizujących zapotrzebowanie w dziedzinie wprowadzania kwasów nukleinowych do różnych typów komórek w warunkach bezsurowiczych i surowiczych (mniej sprzyjających wysokiej wydajności transfekcji niż bezsurowicze - Li S, Tseng WC, Stolz DB, Wu SP, Watkins SC, Huang L, Dynamie changes in the characteristics of cationic lipidic vectors after exposure to mouse serum: implications for intravenous lipofection, Gene Ther. 1999; 6(4):585-94; Zelphati O, Uyechi LS, Barron LG, Szoka FC Jr, Effect of serum components on the physico-chemical properties of cationic lipid/oligonucleotide complexes and on their interactions with cells, Biochim Biophys Acta. 1998; 16; 1390(2): 119-33), bezpiecznych dla erytrocytów krwi ludzkiej, łatwych do modyfikacji i przechowywania bez utraty właściwości transfekcyjnych (stabilnych podczas przechowywania, co znacznie ułatwia wygodne wykorzystanie bez konieczności każdorazowego sporządzania bezpośrednio przed użyciem), odpornych na zakażenia bakteryjne. Nieoczekiwanie, zmiana składu i przygotowania kompozycji zawierających kationowe pochodne poliprenoli, doprowadziła do otrzymania nośników o takich właśnie niezwykle istotnych i korzystnych cechach.
Przedmiotem wynalazku jest system nośników kwasów nukleinowych w postaci kompozycji opartych na kationowych pochodnych poliprenoli, zawierających jako nośniki kwasów nukleinowych kationowe pochodne poliprenoli, o różnej długości łańcucha poliprenylowego, przedstawione wzorem 1,
wzór 1 w którym n wynosi od 11 do 15 reszt izoprenowych, oraz lipidy pomocnicze wybrane z grupy obejmującej DOPE (1,2-dioleilo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloamina), cholesterol, DC-cholesterol [chlorowodorek {33-[/V-(/V,/V-dimetyloaminoetan)-karbamoilo]cholesterolu}], DOPC: (1,2-dioleilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina), DLPC (1,2-dilaurylo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina), DMPC (1,2-dimirystylo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina) oraz, że zawiera etanol, którego stężenie jest zawarte w przedziale 48,5 do 73,5%, zaś pozostałą część stanowi roztwór wodny, oraz że ewentualnie, zawiera substancje modyfikujące powierzchnię lipopleksów.
Korzystnie, gdy system w warunkach surowiczych jako lipidy pomocnicze zawiera DOPE, DOPE+DC-cholesterol lub DOPE+DC-cholesterol+DOPC.
Korzystnie, gdy roztwór wodny stanowi standardowe medium do hodowli komórek.
Korzystnie, gdy substancje modyfikujące powierzchnię lipopleksów stanowi glikol polietylenowy (PEG).
PL 230 096 Β1
Korzystnie, gdy system przeznaczony jest do wprowadzania DNA i/lub RN A komórek eukariotycznych zarówno w warunkach surowiczych i bezsurowiczych, bez uszkadzania erytrocytów krwi ludzkiej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowywania systemu nośników kwasów nukleinowych określonego powyżej, charakteryzujący się tym, że nośniki kwasów nukleinowych kationowych pochodnych poliprenoli, o różnej długości łańcucha poliprenylowego, przedstawione wzorem 1,
w którym n wynosi od 11 do 15 reszt izoprenowych i lipidy pomocnicze rozpuszcza się w etanolu, po czym miesza z roztworem wodnym do uzyskania homogennego roztworu, przy czym stężenie etanolu w uzyskanych preparatach do wprowadzania DNA i/lub RN A zawarte jest w przedziale od 48,5 do 73,5%.
Korzystnie, gdy roztwór wodny stanowi standardowe medium do hodowli komórek.
Korzystnie, gdy system uzupełnia się o substancje modyfikujące powierzchnię lipopleksów, korzystnie glikol polietylenowy (PEG).
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie systemu określonego powyżej do otrzymywania preparatów do wprowadzania DNA i/lub RNA do komórek eukariotycznych w warunkach surowiczych i/lub bezsurowiczych, bez uszkadzania erytrocytów krwi ludzkiej.
Przedmiot wynalazku w przykładzie realizacji jest uwidoczniony na rysunku, na którym:
Na fig. 1 przedstawiono wzór 1 kationowych pochodnych poliprenoli - soli trimetylopoliprenyloamoniowych.
Na fig. 2 przedstawiono wydajne działanie (wprowadzanie DNA do komórek) wybranych kompozycji - PTAI-11 (jodek trimetylopoliprenyloamoniowy o wzorze 1 gdzie n=11) + DOPE + DC-cholesterol oraz PTAI-11 + DOPE + DC-cholesterol + DOPC bezpośrednio po ich przygotowaniu oraz po 8 miesiącach przechowywania w4°C na modelowych komórkach nowotworu ludzkiej prostaty DU145 zarówno w warunkach bezsurowiczych, jak i w obecności surowicy.
Na fig. 3 przedstawiono efektywne działanie (wprowadzanie DNA do komórek) proponowanych kompozycji na różne typy komórek innych niż modelowe komórki linii DU 145 - komórki mysiego czerniaka B16-F10, szczurzego mięsaka XC oraz fibroblasty skóry ludzkiej.
Na fig. 4 przedstawiono brak właściwości hemolitycznych lipopleksów (kompleksów wybranych kompozycji z DNA) wobec erytrocytów krwi ludzkiej.
Na fig. 5 przedstawiono skuteczność wybranych kompozycji do wprowadzania RNA do komórek - na przykładzie shRNA wyciszającego ekspresję białka fluorescencyjnego EGFP w modelowych komórkach DU145.
Niniejszy wynalazek zobrazowano za pomocą poniższych przykładów wykonania:
Przykład I: Przygotowanie i wykorzystanie wybranych kompozycji do transfekcji komórek DU145 i porównanie ich wydajności w warunkach bezsurowiczych i w obecności surowicy
PTAI-11 i lipidy pomocnicze - DOPE, DC-cholesterol, DOPC zostały rozpuszczone w 99,8% etanolu w stężeniach odpowiednio - 10; 3,2; 3,2 lub 10; 15 mg/ml. Następnie zostały zmieszane z sobą w odpowiednich proporcjach w celu uzyskania stosunków molowych w mieszaninach:
PTAI-11 +DOPE+DC-cholesterol -1:1:1
PTAI-11+DOPE+DC-cholesterol+DOPC -1:1:1:1 a następnie zmieszane z medium DMEM F-12 HAM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Nutrient Mixture F-12 HAM) bez dodatku surowicy i antybiotyków i intensywnie worteksowane przez 3 min - stężenie etanolu w tak przygotowanych odczynnikach wynosi:
PTAI-11+DOPE+DC-cholesterol - 73,5%
PTAI-11+DOPE+DC-cholesterol+DOPC - 59,4%
PL 230 096 B1
Jest więc ono wystarczające, aby chronić przechowywane odczynniki przed zakażeniem bakteryjnym.
W celu przygotowania mieszaniny transfekcyjnej odpowiednią ilość przygotowanych kompozycji (taką, aby stosunek PTAI-11 + DOPE : plazmidowe DNA wynosił 3,7 pg PTAI-11+DOPE / 1 pg DNA) rozcieńczano w medium DMEM F-12 HAM. Plazmid pEGFP-Cl (o wielkości 4,7 kb) kodujący białko zielonej fluorescencji EGFP został rozpuszczony w DMEM F-12 HAM bez surowicy i antybiotyków w stężeniu 80 ng/pl. Równe objętości mieszaniny lipidów oraz plazmidowego DNA były mieszane, inkubowane przez 30 min w temperaturze pokojowej w celu otrzymania lipopleksów, a następnie rozcieńczane medium (1:4).
Komórki DU145 wysiewano na płytki 24-dołkowe w liczbie 8x104 komórek/dołek i hodowano przez 24 godziny w medium DMEM F-12 HAM z 10% dodatkiem surowicy bez antybiotyków, Medium usuwano i dodawano medium DMEM F-12 HAM bez surowicy i antybiotyków oraz lipopleksy (objętość mieszaniny transfekcyjnej - 400 μl) aby osiągnąć ilość kationowej pochodnej PTAI-11 + DOPE w mieszaninie transfekcyjnej równą 4 μg (procedura bezsurowicza) lub zostawiano 200 μl medium, w którym komórki zostały wysiane i dodawano lipopleksy (objętość mieszaniny transfekcyjnej - 400 μΙ, procedura transfekcji w obecności surowicy). Po 5 godzinach inkubacji w 37°C przy 5% CO2, dodawano 400 Φι medium DMEM F-12 HAM z 20% dodatkiem surowicy i podwójną ilością antybiotyków.
Wydajność transfekcji oceniano poprzez obserwację fluorescencji komórek po 24 godzinach od transfekcji.
Na fig. 2 przedstawiono wyniki, które wykazały wysoką wydajność kompozycji zarówno w warunkach bezsurowiczych, jak i w obecności surowicy.
P r z y k ł a d II: Porównanie wydajności wybranych kompozycji bezpośrednio po przygotowaniu oraz po długoterminowym przechowywaniu
Kompozycje przygotowane według przykładu I zostały użyte bezpośrednio po przygotowaniu oraz po 8 miesiącach przechowywania w 4°C do transfekcji komórek DU145 w różnych warunkach (bezsurowiczych i w obecności surowicy). Na fig. 2 przedstawiono wyniki, które wykazały wysoką wydajność kompozycji bezpośrednio po przygotowaniu (A) oraz po 8 miesiącach przechowywania w 4°C (B).
Wydajność transfekcji oceniano poprzez obserwację fluorescencji komórek po 24 godzinach od transfekcji. Wyniki przedstawiono w postaci zdjęć z mikroskopii kontrastowo-fazowej (KF) i fluorescencyjnej (EGFP).
P r z y k ł a d III: Przygotowanie, wykorzystanie i wydajność wybranych kompozycji do transfekcji różnych typów komórek, mysiego czerniaka B16-F10, szczurzego mięsaka XC oraz fibroblastów skóry ludzkiej
PTAI-15 (jodek trimetylopoliprenyloamomowy o wzorze 1 gdzie n=15) został rozpuszczony w 99,8% etanolu w stężeniu 10 mg/ml, natomiast PEG 8000 (glikol polietylenowy o masie cząsteczkowej 8000) w jałowej wodzie destylowanej w stężeniu 0,5 mg/ml. Pozostałe lipidy zostały przygotowane tak, jak opisano w przykładzie I, tj. DOPE, DC-cholesterol, DOPC zostały rozpuszczone w 99,8% etanolu w stężeniach odpowiednio - 3,2; 3,2 lub 10; 15 mg/ml. Następnie składniki zostały zmieszane ze sobą w odpowiednich proporcjach w celu uzyskania stosunków molowych w mieszaninach:
PTAI-11+DOPE+DC-cholesterol - 1:1:1
PTAI-11+DOPE+PEG; PTAI-11+DOPE - 1:1
PTAI-15+DOPE+DC-cholesterol+DOPC - 1:1:1:1 a następnie zmieszane z medium DMEM F-12 HAM bez dodatku surowicy i antybiotyków i intensywnie worteksowane - stężenie etanolu w tak przygotowanych odczynnikach wynosiło:
PTAI-11+DOPE+DC-cholesterol - 73,5%
PTAI-11 +DOPE+PEG - 48,5%
PTAI-15+DOPE+DC-cholesterol+DOPC - 58,9%
W celu przygotowania mieszaniny transfekcyjnej odpowiednią ilość przygotowanych odczynników (taką, aby stosunek PTAI + DOPE : plazmidowe DNA wynosił 3,7 μg PTAI-11 + DOPE i 4,2 μg PTAI-15 + DOPE / 1 μg DNA) rozcieńczano w medium hodowlanym bez dodatku surowicy i antybiotyków. Plazmid pEGFP-C1 kodujący białko zielonej fluorescencji EGFP został rozpuszczony w medium hodowlanym bez surowicy i antybiotyków w stężeniu 80 ng/μΗ Równe objętości mieszaniny lipidów oraz plazmidowego DNA były mieszane, inkubowane przez 30 min w temperaturze pokojowej w celu otrzymania lipopleksów, a następnie rozcieńczane medium (1:4). Na 5 min. przed końcem 30-minutowej inkubacji do wybranych lipopleksów dodawano PEG 8000, tak aby stanowił on 4% w/v.
PL 230 096 B1
Komórki wysiewano na płytki 24-dołkowe w liczbie 7x104 komórek/dołek (B16-F10), 8x104 komórek/dołek (XC); 3x104 komórek/dołek (fibroblasty skóry ludzkiej) i hodowano przez 24 godziny w medium EMEM (Minimal Essential Medium Eagle) (B16-F10, XC) lub DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; fibroblasty skóry ludzkiej) z 10% dodatkiem surowicy, bez antybiotyków. Zostawiano 200 pl medium i dodawano lipopleksy, aby osiągnąć ilości kationowych pochodnych PTAI-11/15 + DOPE w mieszaninach transfekcyjnych równe 4 pg PTAI-11+DOPE i 5 pg PTAI-15+DOPE / 400 pl mieszaniny transfekcyjnej. Po 5 godzinach inkubacji w 37°C przy 5% CO2, dodawano 400 pl odpowiedniego medium z 20% dodatkiem surowicy i podwójną ilością antybiotyków.
Wydajność transfekcji oceniano poprzez obserwację fluorescencji komórek po 24 godzinach od transfekcji.
Na fig. 3 przedstawiono wyniki, które wykazały wysoką wydajność proponowanych kompozycji w obecności surowicy na przykładzie wybranych typów komórek: linii komórek mysiego czerniaka B16-F10 i szczurzego mięsaka XC oraz fibroblastów skóry ludzkiej. Wyniki przedstawiono w postaci zdjęć z mikroskopii kontrastowo-fazowej (KF) i fluorescencyjnej (EGFP).
P r z y k ł a d IV: Bezpieczeństwo kompozycji względem erytrocytów krwi ludzkiej
Odczynniki PTAI-11/15+DOPE+DC-cholesterol+DOPC przygotowano i zastosowano do sporządzenia lipopleksów jak opisano w przykładach I i III.
Właściwości hemolityczne lipopleksów testowano na erytrocytach krwi ludzkiej (RBC) zawieszonych w PBS (buforowany fizjologiczny roztwór soli). RBC pozyskane od zdrowych dawców - ochotników oczyszczano przez trzykrotne wirowanie (1000xg, 10 min) i zawieszanie w podwójnej ilości PBS (w stosunku do początkowej objętości krwi pełnej), a następnie rozcieńczano 50-krotnie. Nośniki i lipopleksy w DMEM F-12 HAM bez dodatku czerwieni fenolowej dodawano do zawiesiny RBC, tak aby osiągnąć stężenia PTAI+DOPE podane na Fig. 4 (pg / 400 pl mieszaniny) i inkubowano przez 1 godzinę w 37°C delikatnie mieszając. Próbki wirowano (1000xg, 10 min) i nadsącze przenoszono do płytki 96-dołkowej w celu określenia stopnia hemolizy. Względne stężenie hemoglobiny określano korzystając z urządzenia Multiscan FC (Thermo Scientific) - mierzono absorbancję próbek przy długości fali równej 405 nm. RBC z dodatkiem 1% detergentu Triton X-100 stosowano jako kontrolę pozytywną (100% hemolizy).
Na fig. 4 przedstawiono wyniki, które wykazały brak właściwości hemolitycznych lipopleksów sporządzonych na bazie kompozycji stosowanych do wprowadzania plazmidowego DNA wobec erytrocytów krwi ludzkiej.
P r z y k ł a d V: Zastosowanie kompozycji do wprowadzania RNA do komórek
Odczynniki PTAI-11/15+DOPE+DC-cholesterol+DOPC i lipopleksy z RNA przygotowano tak jak opisano w przykładach I i III. Komórki DU145 wysiewano na płytki 24-dołkowe w liczbie 5x104 (24h), 2,5x104 (48h), 1,25x104 (72h), 104 (96h) komórek/dołek i hodowano przez 24 godziny w medium DMEM F-12 HAM z 10% dodatkiem surowicy, bez antybiotyków. Zastosowano po 100 pl lipopleksów dodawanych do 200 pl pożywki, w której komórki zostały wysiane. Do komórek wprowadzono shRNA wyciszające ekspresję białka fluorescencyjnego EGFP stosując mieszaniny transfekcyjne zawierające (w 300 pl):
- PTAI-11+DOPE+DC-cholesterol+DOPC (w ilości zawierającej 2,4 pg PTAI-11+DOPE) + 30 pmoli shRNA
- PTAI-15+DOPE+DC-cholesterol+DOPC (w ilości zawierającej 3 pg PTAI-11+DOPE) + 30 pmoli shRNA
Po 24 godzinach wprowadzono do komórek plazmid pEGFP-C1 za pomocą komercyjnie dostępnego odczynnika Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent (Life Technologies) stosując 1,25 pl Lipofectamine® 2000 + 1 pg plazmidowego DNA pEGFP-C1/ dołek płytki 24-dołkowej.
Na fig. 5 przedstawiono wyniki, które pokazują wydajne wprowadzenie shRNA do komórek i jego efekt - wyciszoną ekspresję EGFP w komórkach DU145.
Wyniki przedstawiono w postaci zdjęć z mikroskopii kontrastowo-fazowej (KF) i fluorescencyjnej (EGFP).
Claims (9)
1. System nośników kwasów nukleinowych w postaci kompozycji opartych na kationowych pochodnych poliprenoli, zawierających jako nośniki kwasów nukleinowych kationowe pochodne poliprenoli, o różnej długości łańcucha poliprenylowego, przedstawione wzorem 1, wzór 1 w którym n wynosi od 11 do 15 reszt izoprenowych, oraz lipidy pomocnicze wybrane z grupy obejmującej DOPE (1,2-dioleilo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloamina), cholesterol, DC-cholesterol [chlorowodorek {33-[/V-(/V',/V'-dimetyloaminoetan)-karbamoilo]cholesterolu}], DOPC:(1,2-dioleilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina), DLPC (1,2-dilaurylo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina), DMPC (1,2-dimirystylo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina) oraz, że zawiera etanol, którego stężenie jest zawarte w przedziale 48,5 do 73,5%, zaś pozostałą część stanowi roztwór wodny, oraz że ewentualnie, zawiera substancje modyfikujące powierzchnię lipopleksów.
2. System według zastrz. 1, znamienny tym, że w warunkach surowiczych jako lipidy pomocnicze zawiera DOPE, DOPE+DC-cholesterol lub DOPE+DC-cholesterol+DOPC.
3. System według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór wodny stanowi standardowe medium do hodowli komórek.
4. System według zastrz. 1, znamienny tym, że substancje modyfikujące powierzchnię lipopleksów stanowi glikol polietylenowy (PEG).
5. System według zastrz. 1, znamienny tym, że przeznaczony jest do wprowadzania DNA i/lub RNA komórek eukariotycznych zarówno w warunkach surowiczych i bezsurowiczych, bez uszkadzania erytrocytów krwi ludzkiej.
6. Sposób przygotowywania systemu nośników kwasów nukleinowych określonego zastrzeżeniami 1 do 5, znamienny tym, że nośniki kwasów nukleinowych kationowych pochodnych poliprenoli, o różnej długości łańcucha poliprenylowego, przedstawione wzorem 1, w którym n wynosi od 11 do 15 reszt izoprenowych i lipidy pomocnicze rozpuszcza się w etanolu, po czym miesza z roztworem wodnym do uzyskania homogennego roztworu, przy czym stężenie etanolu w uzyskanych preparatach do wprowadzania DNA i/lub RNA zawarte jest w przedziale od 48,5 do 73,5%.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że roztwór wodny stanowi standardowe medium do hodowli komórek.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że system uzupełnia się o substancje modyfikujące powierzchnię lipopleksów, korzystnie glikol polietylenowy (PEG).
9. Zastosowanie systemu określonego zastrzeżeniami 1 do 5 do otrzymywania preparatów do wprowadzania DNA i/lub RNA do komórek eukariotycznych w warunkach surowiczych i/lub bezsurowiczych, bez uszkadzania erytrocytów krwi ludzkiej.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PLP-409298 | 2014-08-28 | ||
| PL40929814 | 2014-08-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL410078A1 PL410078A1 (pl) | 2016-02-29 |
| PL230096B1 true PL230096B1 (pl) | 2018-09-28 |
Family
ID=55361206
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL410063A PL231158B1 (pl) | 2014-08-28 | 2014-11-04 | Szczepionka, kompozycja farmaceutyczna, nośnik kwasów nukleinowych oraz innych substancji aktywnych biologicznie, zastosowanie kompozycji do wytwarzania szczepionki oraz zastosowanie kationowych pochodnych poliprenoli PTAI do wytwarzania substancji immunomodulujących |
| PL410078A PL230096B1 (pl) | 2014-08-28 | 2014-11-06 | System nośników kwasów nukleinowych, sposób przygotowania systemu oraz ich zastosowanie |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL410063A PL231158B1 (pl) | 2014-08-28 | 2014-11-04 | Szczepionka, kompozycja farmaceutyczna, nośnik kwasów nukleinowych oraz innych substancji aktywnych biologicznie, zastosowanie kompozycji do wytwarzania szczepionki oraz zastosowanie kationowych pochodnych poliprenoli PTAI do wytwarzania substancji immunomodulujących |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3185893B1 (pl) |
| PL (2) | PL231158B1 (pl) |
| WO (1) | WO2016032348A1 (pl) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10229872A1 (de) * | 2002-07-03 | 2004-01-29 | Curevac Gmbh | Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA |
| PL211824B1 (pl) | 2007-05-17 | 2012-06-29 | Inst Biochemii I Biofizyki Pan | Trimetyloaminowe pochodne poli-cis i poli-trans liniowych oligomerów izoprenowych, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie |
-
2014
- 2014-11-04 PL PL410063A patent/PL231158B1/pl unknown
- 2014-11-06 PL PL410078A patent/PL230096B1/pl unknown
-
2015
- 2015-06-12 WO PCT/PL2015/000093 patent/WO2016032348A1/en not_active Ceased
- 2015-06-12 EP EP15739689.6A patent/EP3185893B1/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3185893B1 (en) | 2023-07-05 |
| PL410063A1 (pl) | 2016-02-29 |
| PL410078A1 (pl) | 2016-02-29 |
| PL231158B1 (pl) | 2019-01-31 |
| WO2016032348A1 (en) | 2016-03-03 |
| EP3185893A1 (en) | 2017-07-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102674501B1 (ko) | 세포 내 동태를 개선한 신규 양이온성 지질 | |
| JP5480764B2 (ja) | 両性リポソーム及びその使用 | |
| US6008202A (en) | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production | |
| US7993672B2 (en) | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production | |
| AU2008309880B2 (en) | Amphoteric liposomes comprising neutral lipids | |
| US7858117B2 (en) | Amphoteric liposomes and their use | |
| JPH09510435A (ja) | 高度充填化ポリカチオン性アンモニウム、スルホニウムおよびホスホニウム脂質 | |
| JP2005526727A (ja) | ｐＨ感受性カチオン脂質、それを含有するリポソーム及びナノカプセル | |
| JPH10509418A (ja) | 細胞へのポリアニオン性材料の導入のための新規組成物 | |
| CN117105811A (zh) | 用于递送生物活性分子的膜融合化合物 | |
| CN113372226A (zh) | 一种脂质分子、脂质纳米粒及其制备方法和应用 | |
| US20240209397A1 (en) | Thermally Stable Lipid-Nucleic Acid Molecule Formulations Utilising Metal Organic Framework (MOF) Shells | |
| Trementozzi et al. | Liposome-mediated chemotherapeutic delivery is synergistically enhanced by ternary lipid compositions and cationic lipids | |
| EP3456714B1 (en) | Biodegradable compound, lipid particle, composition containing lipid particle and kit | |
| US6316260B1 (en) | Tetraether lipid derivatives and liposomes and lipid agglomerates containing tetraether lipid derivatives, and use thereof | |
| Pierrat et al. | Characterization of titratable amphiphiles in lipid membranes by fluorescence spectroscopy | |
| CN107441506A (zh) | 基因输送载体及其制备与应用 | |
| Wonder et al. | Assembly of building blocks by double-end-anchored polymers in the dilute regime mediated by hydrophobic interactions at controlled distances | |
| CA2269502C (en) | Tetraether lipid derivatives and liposomes and lipid agglomerates containing tetraetherlipid derivatives, and use thereof | |
| PL230096B1 (pl) | System nośników kwasów nukleinowych, sposób przygotowania systemu oraz ich zastosowanie | |
| Rak et al. | Boost of serum resistance and storage stability in cationic polyprenyl-based lipofection by helper lipids compositions | |
| JP2004536089A (ja) | 物質を細胞内に導入するための配合物及び方法 | |
| CN115872893B (zh) | 阳离子脂质化合物及其制备方法和应用 | |
| KR100428418B1 (ko) | 생리활성물질 또는 약물을 효과적으로 전달하는 요오드화오일 계열 지방유제 및 그 제조방법 | |
| RU2747559C1 (ru) | Незаряженный липид, композиция на его основе с поликатионным амфифилом и нейтральным фосфолипидом и способ ее получения для доставки нуклеиновых кислот in vitro |